CN111349640B - 反式-4-羟基-l-脯氨酸的生产菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸生产菌株的构建方法，所述方法包括增强所述反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸生产菌株中铵转运蛋白的活性。本发明还公开了利用所述方法构建的反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸生产菌株和利用所述菌株制备反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法。本发明构建的反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸生产菌株的反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸产量显著提高，并且为构建反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸生产菌株开拓了新的思路。

Description

反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株、这种生产菌株的构建方法和应用。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸是一种具有独特生理活性的氨基酸，广泛应用于医药、食品添加剂、动物饲料和美容业等领域，由于价格昂贵目前主要用于合成碳青霉烯类抗生素(第三代，抗生素的最后一道防线)的侧链。碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广的一类非典型β-内酰胺类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，全球总体市场已超过了30亿美元。

国内传统生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的主要方法是化学提取法，利用动物蛋白如明胶、猪皮为原料，经酸水解后提取反式-4-羟基-L-脯氨酸，该方法纯化步骤长，得率低(约4-7％)，生产成本高达30万/吨，且每生产1吨成品需要排放150至300吨高盐高氮废水及大量有毒的氧化氮废气。受环保压力影响，传统的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产企业都已停产。随着市场成熟度的提高，竞争加剧，碳青霉烯类抗生素侧链价格显著下降，如美罗培南侧链的市场售价由最初的数千元/公斤降至数百元/公斤，毛利率逐年显著下降，部分国内生产厂商由于工艺落后，无利可图，也已经停止生产此品。由此可见，发展绿色低成本的生物法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，既可以解决其高成本及严重环境污染问题，又可以保障我国第三代抗生素的原料安全。

国外以日本为代表，早在30年前就开始研究微生物法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。1991年日本协和发酵就获得了微生物法特异性羟化脯氨酸制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法。本发明人在前期的研究中也发现了多个新型的脯氨酸-4-羟化酶(CN105713883A、CN 107674863 A、CN 107674864 A)，这些羟化酶可以用于反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产，工程菌株摇瓶发酵产反式-4-羟基-L-脯氨酸含量可达0.65g/L(CN105713883A)。除了有效的新型的脯氨酸-4-羟化酶外，想要进一步提升工程菌株的性能，还需优化菌株中其他相关酶的表达，而反式-4-羟基-L-脯氨酸的代谢途径相关酶都已通过不同的方式进行了优化(Gene.1988 Apr 29,64(2):199-205；J Biosci Bioeng.2000,90(5):522-525)。

本领域对反式-4-羟基-L-脯氨酸的代谢途径相关酶研究得比较透彻，想在代谢途径之外再寻找到新的可提高产量的位点十分困难。因此，本领域需要一种全新的构建反式-4-羟基-L-脯氨酸高产菌株的思路，从而能够提供反式-4-羟基-L-脯氨酸的高产菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株、构建这种反式-4-羟基-L-脯氨酸高产菌株的方法以及利用所述反式-4-羟基-L-脯氨酸高产菌株制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法和应用。

在第一方面，本发明提供一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，增强所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中铵转运蛋白AmtB的活性。

在优选的实施方式中，增强铵转运蛋白AmtB的活性包括在所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中引入外源性的铵转运蛋白AmtB，或者增强所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中内源性铵转运蛋白AmtB的活性。

在一优选例中，增强铵转运蛋白AmtB的活性可通过以下方法之一或组合来实现：表达铵转运蛋白AmtB的同源或异源的编码基因，和/或增加所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在具体的实施方式中，所述铵转运蛋白AmtB是：

1)如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或

2)具有1)所限定的序列，在两端添加一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基而形成的序列，且基本具有1)所限定的多肽功能的由1)衍生的多肽。

在具体的实施方式中，所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、指孢囊菌(Dactylosporangium spp.)和拟无枝酸菌(Amycolatopsis spp.)等；优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌；最优选大肠杆菌。

在第二方面，本发明提供一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株，所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中铵转运蛋白AmtB的活性增强。

在优选的实施方式中，铵转运蛋白AmtB的活性增强包括在所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中引入外源性的铵转运蛋白AmtB，或者所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中内源性铵转运蛋白AmtB的活性增强。

在一优选例中，铵转运蛋白AmtB的活性增强可通过以下方法之一或组合来实现：表达铵转运蛋白AmtB的同源或异源的编码基因，和/或增加所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在具体的实施方式中，所述铵转运蛋白AmtB是：

1)如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或

2)具有1)所限定的序列，在两端添加一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基而形成的序列，且基本具有1)所限定的多肽功能的由1)衍生的多肽。

在具体的实施方式中，所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、指孢囊菌(Dactylosporangium spp.)和拟无枝酸菌(Amycolatopsis spp.)等；优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌；最优选大肠杆菌。

在具体的实施方式中，所述菌株中的脯氨酸4-羟化酶的活性增强，和/或谷氨酸激酶不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱，和/或谷氨酸半醛脱氢酶活性增强，和/或脯氨酸脱氢酶活性的减弱或缺失。

在优选的实施方式中，不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱的所述谷氨酸激酶是proB74。

在第三方面，本发明提供一种反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备方法，所述方法包括：

1)培养第一方面所述的构建方法构建的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株、或第二方面所述的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株；和

2)任选地从步骤1)所得到的培养液中分离反式-4-羟基-L-脯氨酸。

在第四方面，本发明提供铵转运蛋白AmtB在构建反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株或制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的用途。

在一优选例中，所述铵转运蛋白AmtB是：

1)如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或

2)具有1)所限定的序列，在两端添加一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基而形成的序列，且基本具有1)所限定的多肽功能的由1)衍生的多肽。

在第五方面，本发明提供第一方面所述的构建方法构建的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株、或第二方面所述的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物中的应用。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现增强反式-4-羟基-L-脯氨酸的代谢通路无关的铵转运蛋白AmtB能够显著提高反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株产生反式-4-羟基-L-脯氨酸的能力，从而不仅提供了反式-4-羟基-L-脯氨酸高产菌株，还为反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的开发开创了新的思路。在此基础上完成了本发明。

术语定义

铵转运蛋白AmtB

铵转运蛋白AmtB是大肠杆菌铵通道转运家族的一员，在氮源含量较低的培养基中AmtB对铵的吸收功能直接影响大肠杆菌的生长。AmtB吸收进入胞内的铵，会快速参与到合成谷氨酸酰胺的反应中。amtB基因与glnK基因形成一个操纵子，在铵受限的情况下，该操纵子会启动表达(Heeswijk等，1996)。Coutts的研究证明，该操纵子响应铵含量变化的速度非常快(Coutts等，2002)。AmtB和GlnK蛋白以1:1的形式参与反应，该复合体需要ATP提供能量，并且对2-酮戊二酸的浓度很敏感(Durand和Merrick，2006)。

由于AmtB并不涉及反式-4-羟基-L-脯氨酸的代谢通路，因此，本领域技术人员很难将其与反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产联系在一起。目前尚无AmtB的表达可提高反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的报道。

具体地说，本文所用的术语“铵转运蛋白AmtB”是指将周质中的铵转运到胞内的蛋白。关于本发明，铵转运蛋白AmtB可以来源于大肠杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。然而，基于本发明的教导，本领域技术人员应该理解，具有与SEQ ID NO:1的活性等同的活性的任何序列也可包括在本发明的范围内，即便这些序列不是来源于大肠杆菌。例如，可包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的保守序列和在一个或多个位置的一个氨基酸或者几个氨基酸(可依据蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和类型的变化，优选2-20个，更优选2-10个，最优选2-6个氨基酸残基)的置换、缺失、插入、添加或倒位得到的氨基酸序列，只要能保持或提高其将周质中的铵转运到胞内的活性；还可以包括与SEQ ID NO:1具有一定同源性，例如同源性大于80％，优选90％，更优选95％、96％、97％、98％、99％以上且具有将周质中的铵转运到胞内活性的多肽；此外，氨基酸的置换、缺失、插入、添加或倒位还包括天然存在于具有铵转运蛋白活性的微生物中的突变序列或者人工修饰的序列。

本文所用的术语“自然状态”是指微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。

本文描述到“增强所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中铵转运蛋白AmtB的活性”。对此，本领域技术人员应该理解，所述“增强蛋白质的活性”指的是通过修饰蛋白来增强该蛋白在微生物中的胞内活性，以及与以自然状态具备的蛋白活性相比，提高细胞内活性。本文所用的术语“增强”不仅包括由于蛋白质自身活性的增加而带来的比原始功能更高的效果，还包括引入外源性的蛋白活性。所述“增强”可以通过选自如下的至少一种方法进行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、对编码蛋白质的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质的活性、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性；所述“增强”可以非限制性地包括任何已知的方法，只要与内源性活性相比能够增强蛋白的活性或引入蛋白的活性。

本文所用的术语“引入蛋白的活性”具有本领域技术人员常规理解的含义，并且可以通过本领域已知的方法实施，包括但不限于，如：将包含编码蛋白的多核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体上，和/或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，和/或在染色体上行直接增加该多核苷酸的拷贝数，和/或改造具有编码蛋白的多核苷酸的多核苷酸启动子以增强转录启动速度，和/或对编码蛋白的多核苷酸的转录进行修饰以增强其活性，和/或修改携带有所述编码蛋白的多核苷酸的信使RNA的翻译调控序列以增强翻译强度，和/或修改编码蛋白的多核苷酸本身以增强mRNA稳定性、蛋白稳定性、解除蛋白的反馈抑制等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白活性的方法。

如上所述，调控序列包括能够起始转录的启动子，用于转录调控的任何操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合结构域的序列，调控转录和翻译终止的序列。对调控序列的修改包括但不限于，如：在多核苷酸序列中缺失、插入、保守突变或非保守突变、或其组合引入修改，也可以通过用具有增强活性的多核苷酸序列置换原始的多核苷酸序列。载体是包括编码靶蛋白的多核苷酸的多核苷酸序列的DNA构建体，其被可操作地链接至合适的调控序列以使靶蛋白可在宿主细胞中表达。载体在被转入合适的宿主细胞后可独立于宿主细胞基因组复制或起作用，或可以被整合到宿主的基因组上。这些载体可以不特别地限制，只要该载体在宿主细胞中是可复制的，并且其可以使用本领域已知的热河载体构建。载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、pET、pUC载体等。另外，通过将载体插入到宿主细胞的染色体上，可以将染色体上编码内源靶蛋白的多核苷酸替换成为修饰的多核苷酸。将多核苷酸插入染色体可以使用本领域已知的任何方法进行，包括但不限于，如：通过同源重组。多核苷酸包括编码的靶蛋白的DNA和RNA，其可以以任何形式插入到宿主细胞的染色体上，只要其能够在宿主细胞中表达。包括但不限于，如：多核苷酸可以以原始状态、和/或表达盒的形式引入宿主细胞。表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体，也可以是能够自我复制的表达载体，可以包括可操作地结合至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。

本发明的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株及其构建方法

本发明公开了一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的构建方法，该方法通过增强铵转运蛋白AmtB的活性从而提高菌株的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产能力。本发明还公开了利用上述生产菌株生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法以及应用。

本发明采用的铵转运蛋白可以来自各种具体的物种，包括但不限于来自肠杆菌的铵转运蛋白AmtB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。基于本发明的教导，本领域技术人员可以理解本发明的构建反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的方法可以是在已经可以生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株基础上增强铵转运蛋白的活性从而提高菌株的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产能力，即可以在天然能够生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株如指孢囊菌(Dactylosporangium spp.)和拟无枝酸菌(Amycolatopsis spp.)等基础上增强铵转运蛋白的活性从而提高菌株的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产能力；也可以在天然不能生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株如大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)等中先导入外源性的反式-4-羟基-L-脯氨酸合成途径(包括但不限于：导入脯氨酸4-羟化酶，和/或解除或减弱谷氨酸激酶的L-脯氨酸反馈抑制，和/或增强谷氨酸激酶和谷氨酸半醛脱氢酶的活性，和/或脯氨酸脱氢酶活性的减弱或缺失)的基础上增强铵转运蛋白的活性从而提高菌株的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产能力。因此，本发明构建的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株是能够利用葡萄糖等为底物生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株，优选高产菌株。

在优选的实施方式中，本发明的反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产菌株中的谷氨酸激酶不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱，和谷氨酸激酶、谷氨酸半醛脱氢酶、脯氨酸4-羟化酶的活性增强，脯氨酸脱氢酶活性的减弱或缺失。在进一步优选的实施方式中，不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱的谷氨酸激酶是proB74。

本领域技术人员知道许多菌株可以用于产生反式-4-羟基-L-脯氨酸。这些菌株虽然不同，但它们合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的合成体系、途径却是类似的。基于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员可以采用各种合适的菌株实施本发明，所述菌株包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、指孢囊菌(Dactylosporangium spp.)和拟无枝酸菌(Amycolatopsis spp.)等；优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，最优选大肠杆菌。

在本发明的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的基础上，本发明还提供了一种产生反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，所述方法包括：发酵培养本发明的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株，从而得到反式-4-羟基-L-脯氨酸；和任选从获得的发酵培养体系中获得反式-4-羟基-L-脯氨酸。

除了高水平地获得反式-4-羟基-L-脯氨酸，本领域技术人员还会知晓，本发明的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株还可用于产生以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体下游产物，例如(包括但不限于)以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物等等。

本发明的优点：

1.本发明在反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株构建方面提出了全新的技术思路；

2.本发明的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够高水平地生产反式-4-羟基-L-脯氨酸；

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。

实施例1：构建大肠杆菌amtB基因的表达载体

铵转运蛋白AmtB的序列如SEQ ID NO:1所示，为了提高大肠杆菌中的铵转运蛋白AmtB的表达，需要向细胞中引入提高amtB基因表达的表达载体。首先以E.coli MG1655基因组为模板，以amtB-F：CTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGCTCTCTGGCACACAGCAACAGGAAC(SEQ IDNO:3)和amtB-R：TTACGCGTTATAGGCATTCTCGCCG(SEQ ID NO:4)为引物，扩增带有自身SD序列的amtB基因(amtB基因序列如SEQ ID NO:2所示)。再以pSB4K5-I52002(GenBank号:EU496099.1)质粒为模板，以pSB4K5-F：TGTACCTAGGACTGAGCTAGCCGTAAAGAATTCGAGTCACTAAGGGTTAAC(SEQ ID NO:5)和pSB4K5-R：AGAATGCCTATAACGCGTAACTGCAGGAGTCACTAAGGGTTAG(SEQ ID NO:6)为引物，扩增pSB4K5质粒骨架。表达amtB基因的启动子序列如下：TTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGC(SEQ ID NO:7)，该启动子序列分别部分添加在amtB-F和pSB4K5-F引物上。由于扩增的引物同时加入了克隆所需序列，扩增的amtB基因和pSB4K5质粒骨架可采用重组克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，

II OneStep Cloning Kit)进行连接，获得pSB4K5-amtB表达载体，命名为pSLP1。

实施例2：构建增强AmtB表达的产反式-4-羟基-L-脯氨酸大肠杆菌

根据文献(Gene.1988Apr 29；64(2):199-205.Nucleotide sequence of amutation in the proB gene of Escherichia coli that confers prolineoverproduction and enhanced tolerance to osmotic stress)报道，大肠杆菌的谷氨酸激酶ProB(Glutamate-5-kinase，GenBank号：NP_414777.1)的107位Asp突变为Asn，即ProB74突变体可以解除L-脯氨酸对ProB的反馈抑制。根据文献(Shibasaki T,HashimotoS,Mori H等,Construction of a novel hydroxyproline-producing recombinantEscherichia coli by introducing a proline 4-hydroxylase gene.[J].J BiosciBioeng.2000,90 5:522-525)报道，在大肠杆菌中过表达谷氨酸激酶ProB74、谷氨酸半醛脱氢酶ProA(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase,GenBank号:NP_414778.1)和来源于指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟基化酶(L-proline 4-hydroxylase,GenBank号:BAA20094.1)，同时敲除脯氨酸脱氢酶PutA(proline dehydrogenase，GenBank号:NP_415534.1)的编码基因可以生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。因此发明人按照上述文献的相同策略，构建本发明的生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株。首先在一个P15A复制原点并具有四环素抗性的质粒上基础上构建了过表达ProB74、ProA和指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟基化酶的编码基因的质粒pSLP2。pSLP2质粒导入E.coli MG1655ΔputA获得可以生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的E.coli MG1655ΔputA(pSLP2)菌株。再将pSLP1质粒导入E.coli MG1655ΔputA(pSLP2)菌株，获得E.coli MG1655ΔputA(pSLP2+pSLP1)；同时将pSB4K5空质粒导入E.coli MG1655(pSLP2)菌株，获得E.coli MG1655ΔputA(pSLP2+pSB4K5)对照菌株。

实施例3:增强AmtB表达的大肠杆菌生产反式-4-羟基-L-脯氨酸

种子培养基：酵母提取物5g/L；胰蛋白胨10g/L；氯化钠10g/L。发酵培养基：葡萄糖10g/L；鱼粉蛋白胨8g/L；硫酸铵5g/L；磷酸氢二钾1g/L；氯化钠2g/L；硫酸镁0.5g/L；硫酸亚铁0.278g/L；氯化钙0.015g/L；MOPS 40g/L，pH7.0。250mL三角瓶装30mL种子培养基，添加15mg/L四环素和25mg/L卡那霉素，再接入适量甘油保存菌液，37℃培养过夜。培养好的种子液，按照5％接种量转接至装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶，33℃，220rpm，发酵24h。发酵终点液测定反式-4-羟基-L-脯氨酸的浓度，反式-4-羟基-L-脯氨酸的检测方法参考国标GB/T 9695.23-2008。各菌株的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量如表1所示。与对照菌株相比，增强AmtB表达的E.coli MG1655ΔputA(pSLP2+pSLP1)可以分别提高31.6-44.6％的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量。

表1.

本发明所用的序列

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产菌株及其构建方法和应用

<130> P2018-1940

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 428

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

Met Lys Ile Ala Thr Ile Lys Thr Gly Leu Ala Ser Leu Ala Met Leu

1 5 10 15

Pro Gly Leu Val Met Ala Ala Pro Ala Val Ala Asp Lys Ala Asp Asn

20 25 30

Ala Phe Met Met Ile Cys Thr Ala Leu Val Leu Phe Met Thr Ile Pro

35 40 45

Gly Ile Ala Leu Phe Tyr Gly Gly Leu Ile Arg Gly Lys Asn Val Leu

50 55 60

Ser Met Leu Thr Gln Val Thr Val Thr Phe Ala Leu Val Cys Ile Leu

65 70 75 80

Trp Val Val Tyr Gly Tyr Ser Leu Ala Phe Gly Glu Gly Asn Asn Phe

85 90 95

Phe Gly Asn Ile Asn Trp Leu Met Leu Lys Asn Ile Glu Leu Thr Ala

100 105 110

Val Met Gly Ser Ile Tyr Gln Tyr Ile His Val Ala Phe Gln Gly Ser

115 120 125

Phe Ala Cys Ile Thr Val Gly Leu Ile Val Gly Ala Leu Ala Glu Arg

130 135 140

Ile Arg Phe Ser Ala Val Leu Ile Phe Val Val Val Trp Leu Thr Leu

145 150 155 160

Ser Tyr Ile Pro Ile Ala His Met Val Trp Gly Gly Gly Leu Leu Ala

165 170 175

Ser His Gly Ala Leu Asp Phe Ala Gly Gly Thr Val Val His Ile Asn

180 185 190

Ala Ala Ile Ala Gly Leu Val Gly Ala Tyr Leu Ile Gly Lys Arg Val

195 200 205

Gly Phe Gly Lys Glu Ala Phe Lys Pro His Asn Leu Pro Met Val Phe

210 215 220

Thr Gly Thr Ala Ile Leu Tyr Ile Gly Trp Phe Gly Phe Asn Ala Gly

225 230 235 240

Ser Ala Gly Thr Ala Asn Glu Ile Ala Ala Leu Ala Phe Val Asn Thr

245 250 255

Val Val Ala Thr Ala Ala Ala Ile Leu Gly Trp Ile Phe Gly Glu Trp

260 265 270

Ala Leu Arg Gly Lys Pro Ser Leu Leu Gly Ala Cys Ser Gly Ala Ile

275 280 285

Ala Gly Leu Val Gly Val Thr Pro Ala Cys Gly Tyr Ile Gly Val Gly

290 295 300

Gly Ala Leu Ile Ile Gly Val Val Ala Gly Leu Ala Gly Leu Trp Gly

305 310 315 320

Val Thr Met Leu Lys Arg Leu Leu Arg Val Asp Asp Pro Cys Asp Val

325 330 335

Phe Gly Val His Gly Val Cys Gly Ile Val Gly Cys Ile Met Thr Gly

340 345 350

Ile Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gly Gly Val Gly Phe Ala Glu Gly Val

355 360 365

Thr Met Gly His Gln Leu Leu Val Gln Leu Glu Ser Ile Ala Ile Thr

370 375 380

Ile Val Trp Ser Gly Val Val Ala Phe Ile Gly Tyr Lys Leu Ala Asp

385 390 395 400

Leu Thr Val Gly Leu Arg Val Pro Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gly Leu

405 410 415

Asp Val Asn Ser His Gly Glu Asn Ala Tyr Asn Ala

420 425

<210> 2

<211> 1287

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

atgaagatag cgacgataaa aactgggctt gcttcactgg cgatgcttcc gggactggta 60

atggctgcac ctgcggtggc cgataaagcc gacaatgcgt ttatgatgat ttgtactgcg 120

ctggtgctgt ttatgactat tccggggatt gccctgtttt acggtgggtt gattcgcggc 180

aaaaacgtgc tgtcgatgct gacgcaggtg acggtgacat ttgcactggt ctgtattctc 240

tgggtggttt acggttactc gctggcgttt ggtgagggca acaacttctt cggcaacatt 300

aactggttga tgctgaaaaa catcgaactg acggcggtga tgggcagcat ttatcagtat 360

atccacgtgg cgtttcaggg atcgtttgcc tgcattaccg tcggcttgat agttggggcg 420

ctggcggaac gaatccgctt ctcagctgtg ttgattttcg tggtggtatg gctgacgctc 480

tcttacattc cgattgcgca tatggtgtgg ggcggtggtt tgctggcttc tcacggtgcg 540

ctggatttcg cgggtggcac cgtggtgcac attaacgccg caatcgccgg tctggtgggc 600

gcgtatctga taggaaaacg cgtgggcttc ggtaaagagg cgtttaaacc gcacaacctg 660

ccgatggtct tcaccgggac tgccattctc tatatcggtt ggtttggctt taacgccggg 720

tcagcgggca cggcgaatga aatcgcggca ctggcatttg tgaatactgt ggtcgcaacg 780

gcggcggcaa ttcttggctg gatcttcggt gaatgggcgc tgcgtggtaa gccttcactg 840

ctgggggcgt gttctggcgc gattgccggt ctggtcggcg tgacgccagc ctgcggctac 900

attggggttg gcggcgcgtt gattatcggc gtggtagctg gtctggcggg cttgtggggc 960

gttaccatgc tcaaacgctt gctgcgggtg gatgatccct gcgatgtctt cggtgtgcac 1020

ggcgtttgtg gcattgtcgg ctgtatcatg accgggattt ttgccgccag ctcgctgggc 1080

ggcgtgggct tcgctgaagg tgtgacgatg ggccatcagt tgctggtaca gctggaaagc 1140

atcgccatta cgatcgtctg gtccggtgtt gtggcattta tcggctacaa attggcggat 1200

ctgacggttg gtctgcgtgt accggaagag caggagcgag aagggctgga tgtcaacagc 1260

cacggcgaga atgcctataa cgcgtaa 1287

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ctagctcagt cctaggtaca atgctagctc tctggcacac agcaacagga ac 52

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ttacgcgtta taggcattct cgccg 25

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tgtacctagg actgagctag ccgtaaagaa ttcgagtcac taagggttaa c 51

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

agaatgccta taacgcgtaa ctgcaggagt cactaagggt tag 43

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

tttacggcta gctcagtcct aggtacaatg ctagc 35

Claims (7)

1.一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，增强所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中铵转运蛋白AmtB的活性；

所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株是大肠杆菌(Escherichia coli)。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述铵转运蛋白AmtB的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株，其特征在于，所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中铵转运蛋白AmtB的活性增强；

所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株是大肠杆菌。

4.如权利要求3所述的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株，其特征在于，所述铵转运蛋白AmtB的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.如权利要求3或4所述的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株中的脯氨酸4-羟化酶的活性增强，和/或谷氨酸激酶不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱，和/或谷氨酸半醛脱氢酶活性增强，和/或脯氨酸脱氢酶活性的减弱或缺失。

6.一种反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备方法，所述方法包括：

1)培养权利要求3-5中任一项所述的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株；和

2)任选地从步骤1)所得到的培养液中分离反式-4-羟基-L-脯氨酸。

7.权利要求3-5中任一项所述的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物中的应用。