CN111484997B

CN111484997B - 反式-l-羟脯氨酸的生产菌株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN111484997B
Application number: CN201910074717.3A
Authority: CN
Inventors: 孙际宾; 刘娇; 王兴初; 郭轩; 周文娟; 郑平; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: CN111484997A

Abstract

本发明公开了一种反式‑L‑羟脯氨酸生产菌株的构建方法，所述方法包括增强所述反式‑L‑羟脯氨酸生产菌株中SEQ ID NO:1、2或3所示核苷酸序列编码的转运蛋白的活性。本发明还公开了利用所述方法构建的反式‑L‑羟脯氨酸生产菌株和利用所述菌株制备反式‑L‑羟脯氨酸的方法。本发明构建的反式‑L‑羟脯氨酸生产菌株的反式‑L‑羟脯氨酸产量显著提高，并且为构建反式‑L‑羟脯氨酸生产菌株开拓了新的思路。

Description

反式-L-羟脯氨酸的生产菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及反式-L-羟脯氨酸生产菌株、这种生产菌株的构建方法和应用。

背景技术

反式-L-羟脯氨酸是胶原中的主要氨基酸，又作为弹性蛋白的构成成分广泛存在于自然界中。作为天然存在的反式-L-羟脯氨酸，按照羟基位置的不同，又分为反式-4-羟基-L-脯氨酸和反式-3-羟基-L-脯氨酸。反式-4-羟基-L-脯氨酸在自然界中普遍存在，广泛应用于医药、食品添加剂、动物饲料和美容业等领域，由于价格昂贵目前主要用于合成碳青霉烯类(第三代，抗生素最后一道防线)抗生素的侧链。第三代抗生素是抗菌谱最广的一类非典型β-内酰胺类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，全球总体市场已超过了30亿美元。反式-3-羟基-L-脯氨酸最早于1968年从地中海海绵的水解产物中被分离出来(Sheehan et al.1968)，由于其特有的生理活性，近年来在医药行业逐渐被利用。天然存在的反式-3-羟基-L-脯氨酸含量极低，其分离难度大。

反式-4-羟基-L-羟脯氨酸的主要生产方法是化学提取法和微生物发酵法，由于化学提取法污染严重成本高，已无市场竞争力。上世纪90年代日本协和发酵获得了微生物法特异性羟化脯氨酸制备羟脯氨酸的方法。近年来，本领域对反式-L-羟脯氨酸的代谢途径相关酶研究得比较透彻，在相关代谢途径的改造方面也多有报道(Gene.1988 Apr 29；64(2):199-205；J Biosci Bioeng.2000,90 5:522-525；NCBI-GI:16128228；NCBI-GI:16128229)，想在代谢途径之外再寻找到新的可提高产能的位点十分困难。

而目前反式-3-羟基-L-脯氨酸的生产方法主要为化学法或酶法，化学法存在手性中心选择、涉及剧毒物质、步骤繁琐等缺点，而酶法通常以精氨酸为底物，价格昂贵(Huang，2004；Hara，2015)。本发明的发明人在以往的研究中发现了催化性能较好的脯氨酸3-羟化酶，实现了以脯氨酸或更廉价的葡萄糖为原料生产反式-3-羟基脯氨酸，但其产量有待进一步提高，从而降低生产成本，实现反式-3-羟基-L-脯氨酸的工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的反式-L-羟脯氨酸生产菌株、构建这种反式-L-羟脯氨酸生产菌株的方法以及利用所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株制备反式-L-羟脯氨酸的方法和应用。

在第一方面，本发明提供一种反式-L-羟脯氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，增强所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株中转运蛋白ProP、ProY和ProU中的一个或多个的活性。

在优选的实施方式中，在不外源性添加脯氨酸的条件下，相比于转运蛋白活性未增强的反式-L-羟脯氨酸生产菌株，所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株的反式-L-羟脯氨酸产量提高至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％。

在优选的实施方式中，增强转运蛋白的活性包括在所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株中引入外源性的转运蛋白ProP、ProY和ProU中的一个或多个的，或者增强所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株中内源性转运蛋白ProP、ProY和ProU中的一个或多个的活性。

在优选的实施方式中，增强转运蛋白的活性可通过以下方法之一或组合来实现：表达转运蛋白的同源或异源的编码基因，和/或增加所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在具体的实施方式中，所述转运蛋白是：

1)氨基酸序列由SEQ ID NO:1、2或3所示核苷酸序列编码的多肽；或者

2)具有1)所限定的序列，经过在两端添加一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基而形成的序列，且基本具有1)所限定的多肽功能的由1)衍生的多肽。

在具体的实施方式中，所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等；优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌；最优选大肠杆菌。

在第二方面，本发明提供一种反式-L-羟脯氨酸生产菌株，其特征在于，所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株中转运蛋白ProP、ProY和ProU中的一个或多个的活性增强。

在优选的实施方式中，转运蛋白的活性增强包括在所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株中引入外源性的转运蛋白，或者所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株中内源性转运蛋白的活性增强。

在优选的实施方式中，转运蛋白的活性增强可通过以下方法之一或组合来实现：表达转运蛋白的同源或异源的编码基因，和/或增加所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在具体的实施方式中，所述转运蛋白是：

在具体的实施方式中，所述菌株中的谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱，谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehydedehydrogenase)的活性增强、脯氨酸4-羟化酶或脯氨酸3-羟化酶的活性增强。

在优选的实施方式中，所述谷氨酸激酶不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱的谷氨酸激酶是指ProB74。

在第三方面，本发明提供一种反式-L-羟脯氨酸的制备方法，所述方法包括：

1)培养第一方面所述的构建方法构建的反式-L-羟脯氨酸生产菌株、或第二方面所述的反式-L-羟脯氨酸生产菌株；和

2)任选地从步骤1)所得到的培养液中分离反式-L-羟脯氨酸。

在第四方面，本发明提供转运蛋白在构建反式-L-羟脯氨酸生产菌株或制备反式-L-羟脯氨酸中的用途。

在具体的实施方式中，所述转运蛋白是：

在第五方面，本发明提供第一方面所述的构建方法构建的反式-L-羟脯氨酸生产菌株、或第二方面所述的反式-L-羟脯氨酸生产菌株在生产反式-L-羟脯氨酸中的应用。

在具体的实施方式中，所述反式-L-羟脯氨酸是指反式-4-羟基-L-脯氨酸或反式-3-羟基-L-脯氨酸。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

考虑到生物体的复杂性以及生物技术研发过程中的不确定性以及时间和物质上投入的程度，在利用工程菌株以葡萄糖为原材料发酵生产反式-L-羟脯氨酸的研发过程中，本领域技术人员的常规思路是提高底物(葡萄糖)的利用率来提高产物(反式-L-羟脯氨酸)的产量，以及提高中间限速步骤的酶活(例如脯氨酸4-羟化酶、脯氨酸3-羟化酶)以提高产物的产量。换言之，为提高反式-L-羟脯氨酸的产量，本领域的常规或理性的作法是对反式-L-羟脯氨酸代谢通路中所涉及的酶进行研究，以便最终提高反式-L-羟脯氨酸的产量。

通过文献阅读，发明人发现，在大肠杆菌中存在3种与渗透压调节剂的转运相关的转运蛋白。转运蛋白ProP属于协助转运蛋白超家族，是渗透保护剂和质子的共转运，可调节大肠杆菌胞内的渗透压。转运蛋白ProU属于ABC转运蛋白超家族，由三个亚基构成，其中ProV为ATP结合亚基，ProW为细胞膜上的亚基，ProX为细胞周质的结合蛋白。转运蛋白ProY，在大肠杆菌中的作用机制尚不明确。而本发明的发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现增强渗透压相关的转运蛋白ProP、ProY或ProU能够在不外源性添加脯氨酸的条件下显著提高反式-L-羟脯氨酸生产菌株产生反式-L-羟脯氨酸的能力，从而不仅提供了反式-L-羟脯氨酸生产菌株，还为反式-L-羟脯氨酸生产菌株的开发开创了新的思路。在此基础上完成了本发明。在具体的实施方式中，在不外源性添加脯氨酸的条件下，相比于转运蛋白活性未增强的反式-L-羟脯氨酸生产菌株，转运蛋白活性增强的反式-L-羟脯氨酸生产菌株中的反式-L-羟脯氨酸产量提高至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％。

术语定义

转运蛋白

本文所用的术语“转运蛋白”是指能将周质中的物质转运到胞内的蛋白。关于本发明，它可以来源于大肠杆菌，例如氨基酸序列由SEQ ID NO:1、2或3所示核苷酸序列编码的多肽。然而，基于本发明的教导，本领域技术人员知晓具有与SEQ ID NO:1、2或3所示核苷酸序列编码的多肽的活性等同或相似的任何多肽也包括在本发明的范围内，即便它不是来源于大肠杆菌。例如，可包括SEQ ID NO:1、2或3所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:1、2或3所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的保守序列和在一个或多个位置的一个氨基酸或者几个氨基酸(可依据蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和类型的变化，优选2-20个，更优选2-10个，最优选2-6个氨基酸残基)的置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，只要能保持或提高其将周质中的脯氨酸转运到胞内的活性；还可以包括与SEQID NO:1、2或3所示核苷酸序列编码的多肽序列同源性大于80％，优选90％，更优选95％以上且具有将周质中的脯氨酸转运到胞内活性的多肽，并且氨基酸的置换、缺失、插入、添加或倒位还包括天然存在于具有转运蛋白活性的微生物中的突变序列或者人工修饰的序列。

ProP的DNA序列(SEQ ID NO:1):

ProU(proV、proW、proX)的DNA序列(SEQ ID NO:2):

ProY的DNA序列(SEQ ID NO:3):

本文所用的术语“自然状态”是指微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。

本文描述到“增强所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株中转运蛋白的活性”。对此，本领域技术人员应该理解，所述“与自然状态相比增强蛋白质的活性”指的是通过修饰蛋白来增强该蛋白在微生物中的胞内活性，以及与以自然状态具备的蛋白活性相比，提高细胞内活性。本文所用的术语“增强”不仅包括由于蛋白质自身活性的增加而带来的比原始功能更高的效果，还包括引入外源性的蛋白活性。所述“增强”可以通过选自如下的至少一种方法进行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、对编码蛋白质的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质的活性、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性；所述“增强”可以非限制性地包括任何已知的方法，只要与内源性活性相比能够增强蛋白的活性或引入蛋白的活性。

本文所用的术语“引入蛋白的活性”具有本领域技术人员常规理解的含义，并且可以通过本领域已知的方法实施，包括但不限于，如：将包含编码蛋白的多核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体上，和/或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，和/或在染色体上行直接增加该多核苷酸的拷贝数，和/或改造具有编码蛋白的多核苷酸的多核苷酸启动子以增强转录启动速度，和/或对编码蛋白的多核苷酸的转录进行修饰以增强其活性，和/或修改携带有所述编码蛋白的多核苷酸的信使RNA的翻译调控序列以增强翻译强度，和/或修改编码蛋白的多核苷酸本身以增强mRNA稳定性、蛋白稳定性、解除蛋白的反馈抑制等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白活性的方法。

如上面所述，调控序列包括能够起始转录的启动子，用于转录调控的任何操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合结构域的序列，调控转录和翻译终止的序列。对调控序列的修改包括但不限于，如：在多核苷酸序列中缺失、插入、保守突变或非保守突变、或其组合引入修改，也可以通过用具有增强活性的多核苷酸序列置换原始的多核苷酸序列。载体是包括编码靶蛋白的多核苷酸的多核苷酸序列的DNA构建体，其被可操作地链接至合适的调控序列以使靶蛋白可在宿主细胞中表达。载体在被转入合适的宿主细胞后可独立于宿主细胞基因组复制或起作用，或可以被整合到宿主的基因组上。这些载体可以不特别地限制，只要该载体在宿主细胞中是可复制的，并且其可以使用本领域已知的热河载体构建。载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、pET、pUC载体等。另外，通过将载体插入到宿主细胞的染色体上，可以将染色体上编码内源靶蛋白的多核苷酸替换成为修饰的多核苷酸。将多核苷酸插入染色体可以使用本领域已知的任何方法进行，包括但不限于，如：通过同源重组。多核苷酸包括编码的靶蛋白的DNA和RNA，其可以以任何形式插入到宿主细胞的染色体上，只要其能够在宿主细胞中表达。包括但不限于，如：多核苷酸可以以原始状态、和/或表达盒的形式引入宿主细胞。表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体，也可以是能够自我复制的表达载体，可以包括可操作地结合至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。

本发明的反式-L-羟脯氨酸菌株及其构建方法

本发明公开了一种反式-L-羟脯氨酸生产菌株的构建方法，该方法通过增加转运蛋白的活性从而增强菌株的反式-L-羟脯氨酸生产能力，特别是能够在不外源性添加脯氨酸的条件下，增强菌株的反式-L-羟脯氨酸生产能力。本发明还公开了利用上述生产菌株生产反式-L-羟脯氨酸的方法以及应用。

本发明采用的转运蛋白可以来自各种具体的物种，包括但不限于来自大肠杆菌的转运蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1、2或3所示核苷酸序列编码的多肽。基于本发明的教导，本领域技术人员可以理解本发明的构建反式-L-羟脯氨酸生产菌株的方法可以应用于已经能够产生反式-L-羟脯氨酸的菌株，即已经包括反式-L-羟脯氨酸合成途径的菌株；本发明的构建反式-L-羟脯氨酸生产菌株的方法也可以应用于从头构建反式-L-羟脯氨酸生产菌株，即，增强转运蛋白活性的同时在菌株中导入外源性的反式-L-羟脯氨酸合成途径(包括但不限于不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)、谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase)、脯氨酸4-羟化酶或脯氨酸3-羟化酶)。因此，本发明构建的反式-L-羟脯氨酸生产菌株是可以以葡萄糖为底物生产反式-L-羟脯氨酸的菌株。

在优选的实施方式中，本发明的反式-L-羟脯氨酸生产菌株中的谷氨酸激酶不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱，谷氨酸半醛脱氢酶的活性增强，脯氨酸4-羟化酶或脯氨酸3-羟化酶的活性增强。在进一步优选的实施方式中，所述不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱的谷氨酸激酶是proB74。

本领域技术人员知道许多菌株可以用于产生反式-L-羟脯氨酸。这些菌株虽然不同，但它们合成反式-L-羟脯氨酸的合成体系、途径却是类似的。基于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员可以采用各种合适的菌株实施本发明，所述菌株包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等；优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，最优选大肠杆菌。

在本发明的反式-L-羟脯氨酸生产菌株的基础上，本发明还提供了一种产生反式-L-羟脯氨酸的方法，所述方法包括：发酵培养本发明的反式-L-羟脯氨酸生产菌株，从而得到反式-L-羟脯氨酸；和任选从获得的发酵培养体系中获得反式-L-羟脯氨酸。

除了高水平地获得反式-L-羟脯氨酸，本领域技术人员还会知晓，本发明的反式-L-羟脯氨酸生产菌株还可用于产生以反式-L-羟脯氨酸为前体下游产物，例如(包括但不限于)以反式-L-羟脯氨酸为前体的下游产物等等。

本发明的优点：

1.本发明的反式-L-羟脯氨酸生产菌株能够高水平地生产反式-L-羟脯氨酸；

2.本发明的反式-L-羟脯氨酸生产菌株能够在无需外源性添加脯氨酸的基础上实现反式-L-羟脯氨酸的高产，从而显著降低生产成本；和

3.本发明为本领域技术人员改造反式-L-羟脯氨酸生产菌株提供了新的思路。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。

实施例1.构建大肠杆菌转运蛋白基因的表达载体

大肠杆菌中的转运蛋白如下所述：ProP的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；ProU由3个亚基组成，编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；ProY的编码核苷酸序列如SEQID NO:3所示。为了提高大肠杆菌中的转运蛋白ProP、ProU、ProY的表达，需要向细胞中引入提高proP、proU、proY基因表达的表达载体。首先以E.coli MG1655基因组为模板，分别以proP-1/prop-2、proU-1/proU-2、proY-1和proY-2为引物，扩增带有自身SD序列的proP、proU、proY基因。再以pSB4K5-I52002(GenBank号:EU496099.1)质粒为模板，分别以pSB4K5-1/pSB4K5-2、pSB4K5-1/pSB4K5-3、pSB4K5-1/pSB4K5-4为引物，扩增proP、proU、proY基因对应的pSB4K5质粒骨架。表达proP、proU和proY基因的启动子序列如下：TTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATTATGCTAGC，对应的启动子序列分别部分添加在引物上。由于扩增的引物同时加入了克隆所需序列，扩增的proP、proU、proY基因和对应的pSB4K5质粒骨架可采用重组克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，

II One Step Cloning Kit)进行连接，分别获得pSB4K5-proP、pSB4K5-proU、pSB4K5-proY质粒表达载体。

表1

实施例2.构建增强转运蛋白表达的产反式-4-羟基-L-脯氨酸大肠杆菌

根据文献(Gene.1988 Apr 29；64(2):199-205.Nucleotide sequence of amutation in the proB gene of Escherichia coli that confers prolineoverproduction and enhanced tolerance to osmotic stress)报道，大肠杆菌的谷氨酸激酶ProB(Glutamate-5-kinase，GenBank号：NP_414777.1)的107位Asp突变为Asn，即ProB74突变体可以解除L-脯氨酸对ProB的反馈抑制。根据文献(Shibasaki T,HashimotoS,Mori H等,Construction of a novel hydroxyproline-producing recombinantEscherichia coli by introducing a proline 4-hydroxylase gene.[J].JBiosciBioeng.2000,90 5:522-525)报道，在大肠杆菌中过表达谷氨酸激酶ProB74、谷氨酸半醛脱氢酶ProA(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase,GenBank号:NP_414778.1)和来源于指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟基化酶(L-proline 4-hydroxylase,GenBank号:BAA20094.1)，同时敲除脯氨酸脱氢酶PutA(proline dehydrogenase，GenBank号:NP_415534.1)的编码基因可以生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。因此发明人按照上述文献的相同策略，构建本发明的生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株。首先在一个P15A复制原点并具有四环素抗性的质粒上基础上构建了过表达ProB74、ProA和指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟化酶的编码基因的质粒pSLP1。pSLP1质粒导入E.coli MG1655ΔputA获得可以生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的E.coli MG1655ΔputA(pSLP1)菌株。再将pSB4K5-proP、pSB4K5-proU、pSB4K5-proY质粒分别导入E.coli MG1655ΔputA(pSLP1)菌株，分别获得E.coli MG1655ΔputA(pSLP1+pSB4K5-proP)、E.coli MG1655 ΔputA(pSLP1+pSB4K5-proU)、E.coli MG1655ΔputA(pSLP1+pSB4K5-proY)；同时将pSB4K5空质粒导入E.coli MG1655ΔputA(pSLP1)菌株，获得E.coli MG1655 ΔputA(pSLP1+pSB4K5)菌株。

实施例3:增强转运蛋白表达的大肠杆菌生产反式-4-羟基-L-脯氨酸

种子培养基：酵母提取物5g/L；胰蛋白胨10g/L；氯化钠10g/L。发酵培养基：葡萄糖10g/L；鱼粉蛋白胨8g/L；硫酸铵5g/L；磷酸氢二钾1g/L；氯化钠2g/L；硫酸镁0.5g/L；硫酸亚铁0.278g/L；氯化钙0.015g/L；MOPS 40g/L，pH7.0。250mL三角瓶装30mL种子培养基，添加15mg/L四环素和25mg/L卡那霉素，再接入适量甘油保存菌液，37℃培养过夜。培养好的种子液，按照5％接种量转接至装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶，33℃，220rpm，发酵24h。发酵终点液测定反式-4-羟基-L-脯氨酸的浓度，反式-4-羟基-L-脯氨酸的检测方法参考国标GB/T 9695.23-2008。各菌株的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量如表2所示。与对照菌株相比，增强ProP、ProU、ProY表达可以分别提高49.5％、16.7％、33.3％反式-4-羟基-L-脯氨酸产量。

表2

实施例4.构建增强转运蛋白表达的产反式-3-羟基-L-脯氨酸大肠杆菌

首先参照实施例2中的方法构建一个产反式-3-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌。首先在一个P15A复制原点并具有四环素抗性的质粒上基础上构建了谷氨酸激酶ProB74、谷氨酸半醛脱氢酶ProA和脯氨酸3-羟基化酶的编码基因的过表达质粒pSLP2。将pSLP2质粒导入E.coli MG1655ΔputA获得E.coli MG1655 ΔputA(pSLP2)菌株，再将pSB4K5-proP、pSB4K5-proU、pSB4K5-proY质粒分别导入E.coli MG1655ΔputA(pSLP2)菌株，分别获得E.coli MG1655 ΔputA(pSLP2+pSB4K5-proP)、E.coli MG1655 ΔputA(pSLP2+pSB4K5-proU)、E.coli MG1655ΔputA(pSLP2+pSB4K5-proY)；同时将pSB4K5空质粒导入E.coliMG1655ΔputA(pSLP2)菌株，获得E.coli MG1655 ΔputA(pSLP2+pSB4K5)菌株。

实施例5:增强转运蛋白表达的大肠杆菌生产反式-3-羟基-L-脯氨酸

种子培养基：酵母提取物5g/L；胰蛋白胨10g/L；氯化钠10g/L。发酵培养基：葡萄糖10g/L；鱼粉蛋白胨8g/L；硫酸铵5g/L；磷酸氢二钾1g/L；氯化钠2g/L；硫酸镁0.5g/L；硫酸亚铁0.278g/L；氯化钙0.015g/L；MOPS 40g/L，pH7.0。250mL三角瓶装30mL种子培养基，添加15mg/L四环素和25mg/L卡那霉素，再接入适量甘油保存菌液，37℃培养过夜。培养好的种子液，按照5％接种量转接至装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶，33℃，220rpm，发酵24h。

各菌株的反式-3-羟基-L-脯氨酸产量如表3所示。与对照菌株相比，增强ProP、ProU、ProY表达可以分别提高35.5％、21.5％、26.4％反式-3-羟基-L-脯氨酸产量。

表3

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 反式-L-羟脯氨酸的生产菌株及其构建方法和应用

<130> P2018-2096

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1503

<212> DNA

<213> 大肠杆菌 (Escherichia coli)

<400> 1

atgctgaaaa ggaaaaaagt aaaaccgatt acccttcgtg atgtcaccat tattgatgac 60

ggtaaactgc gtaaagccat taccgcagca tcactgggta atgcaatgga atggttcgat 120

tttggtgttt atggttttgt tgcttacgca ttaggtaaag tttttttccc gggggctgac 180

cccagcgtgc agatggttgc tgcacttgcc actttctccg ttccctttct gattcgaccg 240

cttggcggac tcttctttgg tatgttgggc gataaatatg gtcgccagaa gatcctcgct 300

atcactattg tgattatgtc gatcagtacg ttctgtattg gcttaatacc gtcctacgac 360

acgattggta tttgggcacc gattctgctg ttgatctgta agatggcaca aggtttctcg 420

gtcggcggtg aatataccgg ggcgtcgata tttgttgcgg aatactcccc tgaccgtaaa 480

cgtggcttta tgggcagctg gctggacttc ggttctattg ccgggtttgt gctgggtgcg 540

ggcgtggtgg tgttaatttc gaccattgtc ggcgaagcga acttcctcga ttggggctgg 600

cgtattccgt tctttatcgc tctgccgtta gggattatcg ggctttacct gcgccatgcg 660

ctggaagaga ctccggcgtt ccagcagcat gtcgataaac tggaacaggg cgaccgtgaa 720

ggtttgcagg atggcccgaa agtctcgttt aaagagattg ccactaaata ctggcgcagc 780

ctgttgacat gtattggtct ggtaattgcc accaacgtga cttactacat gttgctgacc 840

tatatgccga gttatttgtc gcataacctg cattactccg aagaccacgg ggtgctgatt 900

attatcgcca ttatgatcgg tatgctgttt gtccagccgg tgatgggctt gctgagtgac 960

cgttttggcc gtcgtccgtt tgtgctactt ggtagtgttg ccctgtttgt gttggcgatc 1020

ccggcgttta ttctgattaa cagtaacgtc atcggcctga tttttgccgg gttactgatg 1080

ctggcggtga tccttaactg ctttacgggc gttatggctt ctaccttgcc agcgatgttc 1140

ccgacgcata tccgttacag cgcgctggcg gcggcattta atatttcggt gctggttgcc 1200

ggtctgacgc caacgctggc ggcctggctg gtcgaaagct cgcagaatct gatgatgcct 1260

gcctattacc tgatggtagt ggcggtggtt ggtttaatca ccggcgtaac catgaaagag 1320

acggcaaatc gtccgttgaa aggtgcgaca ccggcggcgt cagatataca ggaagcgaag 1380

gaaattctcg tcgagcatta cgataatatc gagcagaaaa tcgatgatat tgaccacgag 1440

attgccgatt tgcaggcgaa acgtacccgc ctggtgcagc aacatccgcg aattgatgaa 1500

taa 1503

<210> 2

<211> 3310

<212> DNA

<213> 大肠杆菌 (Escherichia coli)

<400> 2

atggcaatta aattagaaat taaaaatctt tataaaatat ttggcgagca tccacagcga 60

gcgttcaaat atatcgaaca aggactttca aaagaacaaa ttctggaaaa aactgggcta 120

tcgcttggcg taaaagacgc cagtctggcc attgaagaag gcgagatatt tgtcatcatg 180

ggattatccg gctcgggtaa atccacaatg gtacgccttc tcaatcgcct gattgaaccc 240

acccgcgggc aagtgctgat tgatggtgtg gatattgcca aaatatccga cgccgaactc 300

cgtgaggtgc gcagaaaaaa gattgcgatg gtcttccagt cctttgcctt aatgccgcat 360

atgaccgtgc tggacaatac tgcgttcggt atggaattgg ccggaattaa tgccgaagaa 420

cgccgggaaa aagcccttga tgcactgcgt caggtcgggc tggaaaatta tgcccacagc 480

tacccggatg aactctctgg cgggatgcgt caacgtgtgg gattagcccg cgcgttagcg 540

attaatccgg atatattatt aatggacgaa gccttctcgg cgctcgatcc attaattcgc 600

accgagatgc aggatgagct ggtaaaatta caggcgaaac atcagcgcac cattgtcttt 660

atttcccacg atcttgatga agccatgcgt attggcgacc gaattgccat tatgcaaaat 720

ggtgaagtgg tacaggtcgg cacaccggat gaaattctca ataatccggc gaatgattat 780

gtccgtacct tcttccgtgg cgttgatatt agtcaggtat tcagtgcgaa agatattgcc 840

cgccggacac cgaatggctt aattcgtaaa acccctggct tcggcccacg ttcggcactg 900

aaattattgc aggatgaaga tcgcgaatat ggctacgtta tcgaacgcgg taataagttt 960

gtcggcgcag tctccatcga ttcgcttaaa accgcgttaa cgcagcagca aggtcttgat 1020

gcggcgctga ttgatgcgcc gttagcagtc gatgcacaaa cgcctcttag cgagttgctc 1080

tctcatgtcg gacaggcacc ctgtgcggtg cccgtggtcg acgaggacca acagtatgtc 1140

ggcatcattt cgaaaggaat gctgctgcgc gctttagatc gtgagggggt aaataatggc 1200

tgatcaaaat aatccgtggg ataccacgcc agcggcggac agtgccgcgc aatccgcaga 1260

cgcctggggt acaccgacga ctgcaccgac tgacggcggt ggtgctgact ggctgaccag 1320

tacgcctgcg ccaaacgtcg agcattttaa tattctcgat ccgttccata aaacgctgat 1380

cccgctcgac agttgggtca ctgaagggat cgactgggtc gttacccatt tccgtcccgt 1440

cttccagggc gtgcgcgttc cggttgatta tatcctcaac ggtttccagc aattgctgct 1500

gggtatgccc gcaccggtgg cgattatcgt tttcgctctc atcgcctggc agatttccgg 1560

ggtcggaatg ggtgtggcga cgctggtttc gctgattgcc atcggcgcaa tcggtgcctg 1620

gtcgcaggca atggtgactc tggcgctggt gttaaccgcc ctgctgttct gtatcgtcat 1680

cggtttgccg ttggggatat ggctggcgag aagtccgcga gcggcgaaaa ttattcgtcc 1740

actgcttgat gccatgcaga ccacgccagc gtttgtttat ctggtgccaa tcgtcatgct 1800

atttggtatc ggtaacgtgc cgggcgtggt ggtgacgatc atctttgctc tgccgccgat 1860

tatccgtctg accattctgg ggattaacca ggttccggcg gatctgattg aagcctcgcg 1920

ctcattcggt gccagcccgc gccagatgct gttcaaagtt cagttaccgc tggcgatgcc 1980

gaccattatg gcgggcgtta accagacgct gatgctggcc ctttctatgg tggtcatcgc 2040

ctcgatgatt gccgtcggcg ggttgggtca gatggtactt cgcggtatcg gtcgtctgga 2100

tatggggctt gccaccgttg gcggcgtcgg gattgtgatc ctcgccatta tcctcgatcg 2160

tctgacgcag gccgttgggc gcgactcacg cagtcgcggc aaccgtcgct ggtacaccac 2220

tggccctgtt ggtctgctga cccgcccatt cattaagtaa ctctgcactt gcccggtgac 2280

gccgggcatt atcaccctgc caaaaaaagg aataacaatg cgacatagcg tactttttgc 2340

gacagcgttt gccacgctta tctctacaca aacttttgct gccgatctgc cgggcaaagg 2400

cattactgtt aatccagttc agagcaccat cactgaagaa accttccaga cgctgctggt 2460

cagtcgtgcg ctggagaaat taggttatac cgtcaacaaa cccagcgaag tagattacaa 2520

cgttggctac acctcgcttg cttccggcga tgcaaccttc accgccgtga actggacgcc 2580

actgcatgac aacatgtacg aagctgccgg tggcgataag aaattttatc gtgaaggggt 2640

atttgttaac ggcgcggcac agggttacct gatcgataag aaaaccgccg accagtacaa 2700

aatcaccaac atcgcacaac tgaaagatcc gaagatcgcc aaactgttcg ataccaacgg 2760

cgacggaaaa gcggatttaa ccggttgtaa ccctggctgg ggctgcgaag gtgcgatcaa 2820

ccaccagctt gccgcgtatg aactgaccaa caccgtgacg cataatcagg ggaactacgc 2880

agcgatgatg gccgacacca tcagtcgcta caaagagggc aaaccggtgt tttattacac 2940

ctggacgccg tactgggtga gtaacgaact gaagccgggc aaagatgtcg tctggttgca 3000

ggtgccgttc tccgcactgc cgggcgataa aaacgccgat accaaactgc cgaatggtgc 3060

gaattatggc ttcccggtca gcaccatgca tatcgttgcc aacaaagcct gggccgagaa 3120

aaacccggca gcagcgaaac tgtttgccat tatgcagttg ccagtggcag atattaacgc 3180

ccagaacgcc attatgcatg acggcaaagc ctcagaaggc gatattcagg gacacgttga 3240

tggttggatc aaagcccacc agcagcagtt cgatggctgg gtgaatgagg cgctggcagc 3300

gcagaagtaa 3310

<210> 3

<211> 1374

<212> DNA

<213> 大肠杆菌 (Escherichia coli)

<400> 3

atggaaagta agaacaagct aaagcgtggg ctaagtaccc gccacatacg ctttatggca 60

ctgggttcag caattggcac cgggctgttt tacggttcgg cagacgccat caaaatggcc 120

ggtccgagcg tgttgttggc ctatattatc ggtggtatcg cggcgtatat cattatgcgt 180

gcgctggggg aaatgtcggt acataacccg gccgccagct ctttctcgcg ttatgcgcag 240

gaaaacctcg gcccgctggc aggttacatt accggctgga cctactgctt tgaaatcctt 300

attgtcgcca tcgccgatgt gaccgctttt ggtatctata tgggtgtctg gttcccgacg 360

gtgccgcact ggatttgggt actgagcgtg gtgctgatca tttgcgccgt aaacctgatg 420

agcgtgaagg tattcggtga gctggaattc tggttctcgt tctttaaagt cgccaccatc 480

atcatcatga ttgtcgccgg tttcggcatc atcatctggg ggattggcaa cggcgggcaa 540

ccgaccggta ttcataacct gtggagcaac ggcggcttct tcagtaacgg ctggcttggc 600

atggtaatgt cgttgcaaat ggtgatgttt gcttacggtg ggatcgaaat tatcgggatt 660

accgccggtg aagcgaaaga tcctgagaaa tcgataccgc gtgcgattaa ctccgtgccg 720

atgcgtattc tggtgttcta cgtcggtacg ctgttcgtca ttatgtctat ctacccgtgg 780

aatcaggttg gcactgccgg tagcccgttc gtgctgacgt tccagcatat gggcattacc 840

tttgccgcca gcattcttaa ctttgttgtg ctgactgctt cgctgtcggc aattaacagt 900

gatgtatttg gcgtaggccg tatgctccac ggtatggcag agcagggcag cgcgccgaaa 960

attttcagca aaacgtcgcg tcgcggtatt ccgtgggtta cggtgctggt gatgactacc 1020

gcgctgctgt ttgcggtgta tctgaactac atcatgccgg aaaacgtctt cctggtgatc 1080

gcttcgctgg caaccttcgc cacggtgtgg gtgtggatta tgatcctgct gtcgcaaatt 1140

gccttccgtc gccgtttgcc gccagaagaa gttaaggcgc tgaaatttaa agtgccgggt 1200

ggggtagcaa cgaccatcgg cgggctgatt ttcctgctct ttattatcgg gttgattggt 1260

tatcacccgg atacgcgtat ctcgctgtat gtcggtttcg cgtggattgt tgtgctgttg 1320

attggctgga tgtttaaacg ccgccacgat cgtcagctgg ctgaaaacca gtaa 1374

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<400> 4

aatacctagg actgagctag ctgtaaagaa ttcgagtcac taagggttaa c 51

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<400> 5

atccgcgaat tgatgaataa ctgcaggagt cactaagggt tag 43

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<400> 6

ctagctcagt cctaggtatt atgctagccc aactctgcga ggaaagctat gc 52

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<400> 7

ttattcatca attcgcggat gttgctg 27

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<400> 8

cgctggcagc gcagaagtaa ctgcaggagt cactaagggt tag 43

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<400> 9

ctagctcagt cctaggtatt atgctagcta aaggaatctt tctattgcat ggc 53

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<400> 10

ttacttctgc gctgccagcg cctca 25

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<400> 11

agctggctga aaaccagtaa ctgcaggagt cactaagggt tag 43

<210> 12

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<400> 12

ctagctcagt cctaggtatt atgctagcta ttgtgttgat gggttaggaa ttgatgg 57

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<400> 13

ttactggttt tcagccagct gacg 24

Claims

1.一种反式-L-羟脯氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，增强所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株中转运蛋白ProP、ProY和ProU中的一个或多个的活性，和所述生产菌株是大肠杆菌 (Escherichia coli)；

所述转运蛋白ProP编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；

所述转运蛋白ProU编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

所述转运蛋白ProY编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。

2. 一种反式-L-羟脯氨酸生产菌株，其特征在于，所述反式-L-羟脯氨酸生产菌株中转运蛋白ProP、ProY和ProU中的一个或多个的活性增强，和所述生产菌株是大肠杆菌(Escherichia coli)；

所述转运蛋白ProP编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；

所述转运蛋白ProU编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

所述转运蛋白ProY编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。

3. 如权利要求2所述的反式-L-羟脯氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株中的谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱，谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase)活性增强、脯氨酸4-羟化酶或脯氨酸3-羟化酶的活性增强。

4. 一种反式-L-羟脯氨酸的制备方法，所述方法包括：

1) 培养权利要求2或3所述的反式-L-羟脯氨酸生产菌株；和

2) 任选地从步骤1)所得到的培养液中分离反式-L-羟脯氨酸。

5.转运蛋白ProP、ProY和ProU中的一个或多个在构建反式-L-羟脯氨酸生产菌株或制备反式-L-羟脯氨酸中的用途；

所述转运蛋白ProP编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；

所述转运蛋白ProU编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

所述转运蛋白ProY编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。

6.权利要求2或3所述的反式-L-羟脯氨酸生产菌株在生产反式-L-羟脯氨酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反式-L-羟脯氨酸是反式-4-羟基-L-脯氨酸或反式-3-羟基-L-脯氨酸。