CN117802021A - 一种提高色氨酸产量的工程菌、生物材料及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高色氨酸产量的工程菌、其生物材料及其应用。本发明通过筛选得到能够耐受高浓度色氨酸的菌株，对其基因组进行测序和蛋白序列分析后发现，该菌株中的一些蛋白发生了点突变，这些突变体能提高色氨酸的产量。为了进一步提高色氨酸的产量，本发明在出发菌中对fadR基因表达的蛋白序列或pepD基因表达的蛋白序列进行改造。这些改造使得获得的工程菌与出发菌相比具有更高的色氨酸产量。在规模化生产的情况下，5L发酵罐中色氨酸产量达到62.38±5.80g/L，糖酸转化率24.1％。相比原始菌，色氨酸的产量提升了1.48倍；糖酸转化率提高了1.26倍。本发明的生物材料及其应用属于分子生物学技术领域，具有广泛的实际应用价值。

Description

一种提高色氨酸产量的工程菌、生物材料及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种提高色氨酸产量的工程菌、生物材料及其应用。
背景技术
L-色氨酸广泛应用于食品、饲料和医药等领域，是一种必需氨基酸。色氨酸的生物合成主要包括三个模块：中心碳代谢途径(CCM)、莽草酸(SHIK)途径和分支酸(CHA)途径，其生产途径较长，所需要的前体多，反馈抑制强，生产效率相对低，工业成熟菌株的产率很难满足市场的需求；随着合成生物学手段的不断发展，越来越多的代谢工程策略应用于构建L-色氨酸高效生产的细胞工厂。然而，关注于代谢途径的理性改造虽然目的明确，效果显著，但由于微生物是一个复杂的系统，已知的代谢网络或改造思路并不能进一步达到快速提高产量的目的。首尔大学Seokhee Kim等在Nucleic Acids Research发表文章“Development of a genome-targeting mutator for the adaptive evolution ofmicrobial cells”，开发了一种用于体内诱变的新突变体，可以直接修饰基因组DNA。该方法不依赖于参与高保真DNA复制的基因的显性抑制。先前的报道显示，胞苷脱氨酶的表达仅略微增加突变率。受启发于胞苷脱氨酶与T7 RNA聚合酶融合的突变系统，作者发现胞苷脱氨酶与大肠杆菌RNA聚合酶的α亚基融合,可以将突变加速到支持大肠杆菌有效适应性进化的水平且不降低细胞活力。诱变进化在工业上是一种快速的提升菌株生产能力的手段，配合基因组测序等先进技术，可以将提高生产能力和原理探究相结合，为后续的理性改造提供依据和思路，同时提高菌株的生产水平，增强国际竞争力。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过对菌株的耐受性筛选获得了一株能够耐受高浓度色氨酸的菌株，在对菌株的基因组测序并对蛋白序列进行分析后，发现该菌株中的一些蛋白发生了点突变，并且这些突变体能够提高色氨酸的产量。本发明通过诱发菌株产生与目标氨基酸合成的主要代谢途径以及糖酵解途径不相关的突变，获得了具有优良性质的菌株。然而，由于生物体的代谢网络具有高度的复杂性，本发明所获得的突变结果存在较高的不确定性，且难以在研究初期进行准确的预测与调控。本领域技术人员通常不会想到这些蛋白的改造是否对色氨酸的生产有利。
第一方面，本发明要求保护一种色氨酸产量提高的工程菌，经过对出发菌进行如下改造，获得色氨酸产量提高的工程菌，所述改造包括：
对出发菌内源的pepD和/或fadR蛋白进行直接改造，或对外源的pepD和/或fadR蛋白进行改造后导入所述出发菌；其中，所述的改造方式选自下述至少一种技术手段：
a在所述出发菌中，对所述pepD蛋白进行的改造可为如下任一：
(a1)对pepD蛋白进行三个氨基酸位点的突变，分别是S21T、G225A和A484K，获得突变蛋白pepD，后文简称为突变蛋白pepDS21T,G225A,A484K，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
(a2)以高拷贝质粒为载体，对pepD蛋白或pepDS21T,G225A,A484K突变蛋白的编码基因进行过表达；
(a3)将基因组pepD蛋白或pepDS21T,G225A,A484K突变蛋白的编码基因的启动子替换为强启动子；
(a4)提高pepD蛋白或pepDS21T,G225A,A484K突变蛋白的编码基因转录的mRNA的稳定性；
(a5)任何能够上调pepD蛋白或pepDS21T,G225A,A484K突变蛋白的编码基因表达水平的方法及其组合；
b在所述出发菌中，对所述fadR蛋白进行的改造可为如下任一：
(b1)敲除出发菌中的fadR蛋白的编码基因；
(b2)对fadR蛋白的编码基因进行两个核苷酸位点的突变，分别是A140T和L171I，获得fadR的突变蛋白，后文简称为突变蛋白FadRA140T,L171I，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
(b3)在基因组上将FadR蛋白或FadRA140T,L171I突变蛋白的编码基因的启动子替换为弱启动子；
(b4)抑制FadR蛋白或FadRA140T,L171I突变蛋白的编码基因转录得到的mRNA的翻译效率或降低其稳定性；
(b5)任何能够弱化FadR蛋白或FadRA140T,L171I突变蛋白的编码基因表达水平的方法及其组合；
进一步地，在本发明的具体实施方式中，所述的出发菌为色氨酸生产菌株；所述的出发菌选自大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母细胞等中任意一种；当出发菌为大肠杆菌时，进一步优选自菌株IBEWQ，突变菌株IBEWQ-62，突变菌株IBEWQ-624-，大肠埃希菌Nissle1917，大肠杆菌BL21，大肠杆菌HB101，大肠杆菌JM109，大肠杆菌DH10B或大肠杆菌MG1655中的一种。
在本发明的具体实施方式中，所述突变菌株IBEWQ-624为在IBEWQ菌株的基因组上敲除fadR蛋白的编码基因，并将pepD蛋白的编码基因突变为pepDS21T,G225A,A484K蛋白的编码基因的同时，将pepDS21T,G225A,A484K基因的启动子替换为PJ23119强启动子。
第二方面，本发明要求保护如下任一生物材料，可用于提高色氨酸产量：
(I)蛋白：pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白；
(II)基因：pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白的编码基因；
(III)表达盒：含有所述pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白的编码基因的表达盒或者含有所述DNA片段的表达盒；
(IV)重组载体：含有所述pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白的编码基因的重组载体或含有所述DNA片段的重组载体；
(V)重组菌：含有所述pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白的编码基因的重组菌或含有所述DNA片段的重组菌；
(VI)利用前文第一方面所述方法制备得到的工程菌。
第三方面，本发明要求保护如下任一应用：
(a)权利要求2中所述的生物材料在提高出发菌色氨酸产量中的应用；
(b)第二方面中所述的生物材料在生产色氨酸中的应用；
(c)pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白在提高出发菌色氨酸产量中的应用；
(d)pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白在生产色氨酸中的应用。
在上述各方面中，所述pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白具体可为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
在上述各方面中，所述fadRA140T,L171I突变体蛋白具体可为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
对应于基因水平，所述pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白的编码基因具体可为与pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白的编码基因限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白的DNA分子。
对应于基因水平，所述fadRA140T,L171I突变体蛋白的编码基因具体为与fadRA140T ,L171I突变体蛋白的编码基因限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述fadRA140T,L171I突变体蛋白的DNA分子。
在本发明中，所述生产色氨酸具体为当菌株在培养中被培养时能够产生色氨酸并且能够积累色氨酸。
本文所用的术语“本发明的蛋白”具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
本发明的“pepD蛋白突变体”是通过针对SEQ ID No.4所示氨基酸序列进行突变获得的。具体地，本发明的pepD蛋白突变体是在对应于SEQ ID No.4所示氨基酸序列的第21位、第225位和第484位分别被苏氨酸、丙氨酸和赖氨酸所替代。另外，本发明的范围还涵盖了与SEQ ID No.1具有大于80％，优选90％，更优选95％，最优选99％以上同源性的来源于大肠杆菌且具有分解N端未被阻断的二肽的功能的酶，也属于本发明的范围。
同样的，本发明的“fadR蛋白突变体”是通过针对SEQ ID No.5所示氨基酸序列进行突变获得的。具体地，本发明的fadR蛋白突变体是在对应于SEQ ID No.5所示氨基酸序列的第140位和第171位分别被苏氨酸和异亮氨酸所替代。另外，本发明的范围还涵盖了与SEQID No.2具有大于80％，优选90％，更优选95％，最优选99％以上同源性的来源于大肠杆菌且具有双重DNA结合转录调节因子活性的蛋白，也属于本发明的范围。
本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，包括但不限于通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的酶的编码基因，从而在该菌株中表达该酶，则该酶对于该菌株是“外源性”的。
本文所用的术语“强化”不仅包括由于蛋白质自身活性的增加而带来的比原始功能更高的效果，而且其可以通过选自如下的至少一种方法进行：增加编码蛋白质的核苷酸的拷贝数、对编码蛋白质的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质的活性、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性，也可以非限制性地包括任何已经的方法，只要与内源性活性相比能够增强蛋白质的活性或增强引入蛋白质的活性。
本文所用的术语“引入蛋白质的活性”具有本领域技术人员常规理解的含义，并且可以通过本领域已知的方法实施，包括但不限于，如：将包含编码蛋白质的多核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体上，和/或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，和/或在染色体上行直接增加该多核苷酸的拷贝数，和/或改造具有编码蛋白质的多核苷酸启动子以增强转录启动速度，和/或对编码蛋白质的多核苷酸的转录进行修饰以增强其活性，和/或修改携带有所述编码蛋白质的多核苷酸的信使RNA的翻译调控序列以增强翻译强度，和/或修改编码蛋白质的多核苷酸本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白质活性的方法。
载体是包括编码靶蛋白的多核苷酸序列的DNA构建体，其被可操作地链接至合适的调控序列以使靶蛋白可在宿主细胞中表达。载体在被转入合适的宿主细胞后可独立于宿主细胞基因组复制或起作用，或可以被整合到宿主的基因组上。这些载体可以不特别地限制，只要该载体在宿主细胞中是可复制的。载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、pET、pUC载体等。另外，通过将载体插入到宿主细胞的染色体上，可以将染色体上编码内源靶蛋白的多核苷酸替换成为修饰的多核苷酸。将多核苷酸插入染色体可以使用本领域已知的任何方法进行，包括但不限于，如：通过同源重组。多核苷酸包括编码的靶蛋白的DNA和RNA，其可以以任何形式插入到宿主细胞的染色体上，只要其能够在宿主细胞中表达。包括但不限于，如：多核苷酸可以以原始状态、和/或表达盒的形式引入宿主细胞。表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体，也可以是能够自我复制的表达载体，可以包括可操作地结合至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。
类似地，本文所用的术语“弱化”是指降低、削弱、减小或完全消除某种蛋白，例如酶的活性。在具体的实施方式中，减弱酶的活性可以通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定、通过sRNA对基因进行调控等方法或其组合来实现，包括但不限于以上方法。
本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即含有蛋白或其蛋白突变体的菌株。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要所述细胞中含有目标蛋白或其突变体且能够生产色氨酸的细胞。所述宿主细胞可以来自优选大肠杆菌(E.Coli)。具体地，本发明所述的宿主是指能够生产色氨酸的菌株，即，当细菌在培养中被培养时能够产生色氨酸并且能够积累色氨酸，或者能够将色氨酸分泌到培养基中，也就是能够得到胞外的游离色氨酸，特别是指与野生型菌株或者亲本菌株相比，能够积累更多色氨酸的能力。为了赋予菌株产色氨酸的能力，可以采用传统的育种方法，比如培育营养缺陷型的突变株、抗类似物的菌株，或者能够产色氨酸的代谢控制突变株，以及培育氨基酸生物合成相关酶活性提高的重组菌株的方法，或者以上方法的组合。
本文所用的术语“含有本发明的pepD和/或fadR蛋白突变体”具有本领域技术人员常规理解的含义，并且可以通过本领域已知的方法实施，包括但不限于，如：将包含编码蛋白的多核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体上，和/或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，和/或在染色体上行直接增加该多核苷酸的拷贝等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白活性的方法。
本领域技术人员知晓，为提升活性而对野生型多肽进行突变，找到能实现所需目的的位点更为重要。因此，基于本发明的教导，本领域技术人员会对pepD蛋白所示氨基酸序列的第21位丝氨酸被苏氨酸替代，第225位甘氨酸被丙氨酸替代，以及第484位丙氨酸被赖氨酸替代、fadR蛋白所示氨基酸序列的第140位丙氨酸被苏氨酸代替，171位亮氨酸被异亮氨酸，并检测突变体的相关活性。
此外，本领域普通技术人员也不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。
因此，对本发明的pepD和/或fadR蛋白及其突变体作进一步突变而得到仍具备相应功能和活性的进一步突变体是显而易见的。例如，本领域技术人员公知在多肽的任一端增加或减少数个氨基酸残基，例如优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基不会影响得到的突变体的功能。例如，为便于纯化，技术人员往往在得到的蛋白的任一端带上6×His标签，而这种蛋白与不具备6×His标签的蛋白具有相同的功能。因此，本发明应包括在本发明基础上得到的保守性突变体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明在出发菌中，对fadR基因表达的蛋白序列或pepD基因表达的蛋白序列进行改造，获得与所述出发菌相比色氨酸产量提高的工程菌；所述出发菌为色氨酸生产菌株；所述对fadR基因进行的改造为降低其表达水平或蛋白活性，甚至敲除；所述对pepD基因进行的改造为对其进行突变，以及提高其表达水平或蛋白活性。在规模化生产的情况下，5L发酵罐中色氨酸产量达到62.38±5.80g/L，糖酸转化率24.1％。相比原始菌，色氨酸的产量提升了1.48倍；糖酸转化率提高了1.26倍。
附图说明
图1为IBEWQ-62菌株以及对fadR进行不同程度弱化，或/和将pepD进行不同程度强化后的菌株的色氨酸发酵水平，其结果表明，对pepD基因的强化表达对于发酵效果的提升是明显的，对fadR的减弱调控，具体最佳的方案为敲除fadR基因。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
实施例1筛选在色氨酸发酵液中生长速度加快的耐受性菌株
胞苷脱氨酶与大肠杆菌RNA聚合酶的α亚基融合,可以将突变加速到支持大肠杆菌有效适应性进化的水平且不降低细胞活力。
用引物RNAPα-F/R、CDA-F/R扩增出发菌株基因组上的RNA聚合酶的α亚基和胞苷脱氨酶的基因序列，再以RNAPα-F和CDA-R为引物将两端序列融合表达后用EcoRI和NcoI酶进行双酶切后，连接到同样双酶切的温度敏感型质粒pKD46(GenBank accession no.:MF287367)上，构建出的质粒命名为pKAP，其上含有阿拉伯糖诱导型启动子，调控RNA聚合酶的α亚基和胞苷脱氨酶基因的表达。
质粒pKAP构建所使用的引物序列：
RNAPα-F：GAATTCatgcagggttctgtgacag；SEQ ID No.6
RNAPα-R：CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCctcgtcagcgatgcttgccggtg；SEQ IDNo.7
CDA-F：GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGcatccacgttttcaaaccgc；SEQ ID No.8
CDA-R：CCATGGttaagcgagaagcactcgg；SEQ ID No.9。
实施例2
(1)出发菌株IBEWQ的构建：
所述出发菌株IBEWQ为以大肠杆菌W3110(可在多家生物试剂公司购买到其感受态细胞产品)为出发菌，在tnaA位点用tac启动子串联表达trpES40F,M1293TDCBA基因，在trpR位点表达来源于大肠杆菌K12的AroFP148L,Q152I,N8K、AorGL76V,P150L,D146N、tktA和ppsA基因，在tyrR位点表达来源于枯草芽孢杆菌的SerA基因；同时将tyrA和pheA基因的启动子替换为PJ23114启动子。
(2)获得突变株IBEWQ-62：
将pKAP电转化到IBEWQ菌株中获得IBEWQ-pKAP。以此菌株为出发菌株，在含不同色氨酸浓度的种子培养液(加入氨苄抗性)中连续传代培养进化。培养12h后稀释2倍检测生物量。
表1不同浓度色氨酸添加量的生物量检测值
将高浓度色氨酸培养液中生长速度加快的菌株在发酵培养基中以37℃进行培养，丢失质粒pKAP，经过平板分纯，将其中一株产量明显提升的突变株，命名为IBEWQ-62。
种子培养基：2.4g/L K2HPO4，9.6g/L KH2PO4，15g/L酵母粉，10g/L米糠，5.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/L MgSO4·7H2O，20g/L葡萄糖，自然pH。
摇瓶发酵培养基：20g/L葡萄糖，3.0g/L酵母浸粉，30g/L米糠，1.6g/L(NH4)2SO4，2.0g/L柠檬酸，5.6g/L K2HPO4，2.0g/L MgSO4·7H2O，80mg/L FeSO4·7H2O、4.0mg/LCoCl2·6H2O、0.6mg/L CuSO4·5H2O、6.5mg/L ZnSO4·7H2O、20mg/LNa2SO4、4.5mg/L MnSO4·H2O，20g/L碳酸钙，pH 7.2。
实施例3、突变株发酵产色氨酸和基因组测序分析
对出发菌株IBEWQ和IBEWQ-62进行发酵。首先，将甘油菌在斜面培养基上活化，转接入种子培养基过夜培样IBEWQ和IBEWQ-62，获得的种子接种到含有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中，220rpm，37℃培养，取样检测葡萄糖剩余量和色氨酸的产量。历经45h发酵结束，IBEWQ-62的产酸水平明显高于出发菌株。
提取IBEWQ-62基因组，对其进行全基因组测序，比较基因组分析发现，与出发菌株相比，IBEWQ-62基因组发生点突变，其中导致氨基酸发生突变的如表2所示。
表2 IBEWQ-62相比较野生菌基因组上发生的突变
基因名称 突变情况 突变后的序列 突变前的序列
突变的pepD基因 S21T,G225A,A484K SEQ ID No.1 SEQ ID No.4
突变的FadR基因 A140T,L171I SEQ ID No.2 SEQ ID No.5
突变的map基因 V94L,Q182N SEQ ID No.3 SEQ ID No.6
pepD、FadR和map的突变位点分别为：
对于突变的pepD基因，记为pepDS21T,G225A,A484K，发生了三个突变，分别是S21T、G225A和A484K。
对于突变的FadR基因，记为FadRA140T,L171I，发生了两个突变，分别是A140T和L171I。
对于突变的map基因，记为mapV94L，Q182N，发生了两个突变，即V94L和Q182N。
实施例4、突变基因对发酵效果的影响
在原始菌株中分别将产生氨基酸序列突变基因(FadR、pepD和map基因)的启动子进行不同强度的替换，比较各个突变体对缬氨酸发酵产量的影响。
按照常规的基因编辑过程，在IBEWQ菌株中分别将pepD、FadR和map基因的启动子替换为强启动子PJ23119；按照常规的基因编辑过程，将pepD、FadR和map启动子替换为弱启动子PJ23114。构建后验证正确的菌株在种子培养基中活化12-16h，次日转接入发酵培养基中。
发酵结束后，各个生产菌株的色氨酸生产结果如表3所示。
表3
从发酵结果可见，fadR突变基因的弱化对于色氨酸的产量提升大有助益，而PepD突变基因则是需要强化方能对色氨酸的产量有利，map突变体对于色氨酸的生产没有影响。
实施例5、突变基因过表达或弱化质粒的构建
在IBEWQ-62菌株中，将fadRA140T,L171I基因的启动子替换为PJ23114，记为IBEWQ-621；
将pepDS21T,G225A,A484K基因的启动子替换为PJ23119，记为IBEWQ-622；
在IBEWQ-62基因组上敲除fadRA140T,L171I，记为IBEWQ-623。
产酸情况如图所示，可见，pepD基因的强化表达对于发酵效果的提升是明显的，fadR的弱化至完全敲除的效果是最佳的。由此构建了组合菌株IBEWQ-624，所述的IBEWQ-624为在IBEWQ-62菌株中，基因组上敲除fadR，并将pepDS21T,G225A,A484K基因的启动子替换为PJ23119。
IBEWQ-624的发酵水平达到4.91±0.28g/L，糖酸转化率24.5％。由此可见，对fadR的减弱调控，具体最佳的方案为敲除fadR基因。
实施例6、放大验证
将出发菌株IBEWQ和突变菌株IBEWQ624分别接种到含有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，并在37℃、200rpm的条件下培养12-16h，OD600值为11-13。以1.5vvm初始通气比、400rpm初始转速将培养好的种子液按10％(体积比)的接种量接种于5L发酵罐中。发酵过程中流加25％氨水控制pH为7.0；发酵温度控制为37±0.5℃；手动调节转速与通气，维持溶氧在20％-30％。接种6h左右，溶氧骤升，初始葡萄糖耗尽，启动自动补料模式，通过流加800g/L葡萄糖控制发酵液中葡萄糖浓度在1g/L以内。
发酵16h后，每2～4h取一次样进行测定，发酵进行48h后，出发菌株IBEWQ的色氨酸产量达到42.12±4.61g/L，糖酸转化率19.1％；突变菌株IBEWQ-624的色氨酸产量达到62.38±5.80g/L，糖酸转化率24.1％。
实施例7改造方式在其他菌株中的应用
以大肠埃希菌Nissle1917为出发菌株，在其基因组上敲除fadR基因，并将pepD基因突变为pepDS21T,G225A,A484K，其启动子替换为PJ23119，得到重组菌N-RD。摇瓶发酵40h后，出发菌株大肠埃希菌Nissle1917的发酵液中能够检测到0.97±0.06g/L的色氨酸，重组菌的发酵液的色氨酸产量能够达到1.28±0.03g/L，产量提升了1.32倍。
摇瓶发酵培养基：10g/L葡萄糖，5.0g/L酵母浸粉，10g/L米糠，6.0g/L(NH4)2SO4，3.0g/L柠檬酸钠，2.0g/L L-谷氨酰胺，1.0g/L L-丝氨酸，5.6g/L K2HPO4，3.0g/L MgSO4·7H2O，65mg/LFeSO4·7H2O，20g/L碳酸钙，pH 7.2。
以大肠杆菌BL21，HB101，JM109，DH10B，MG1655为出发菌株，也能达到1.3-1.5倍产量提升的效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种提高色氨酸产量的工程菌，其特征在于：经过对出发菌的pepD和/或fadR表达盒进行直接改造，或将改造后的pepD和/或fadR表达盒导入所述出发菌，获得色氨酸产量提高的工程菌；所述改造为任何能够强化pepD蛋白功能应用的方法及其组合和/或任何能够弱化FadR蛋白表达水平的方法及其组合。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述的改造方式选自下述至少一种技术手段：
a在所述出发菌中，对所述pepD蛋白进行的改造为如下任一：
(a1)对pepD蛋白进行三个氨基酸位点的突变，分别是S21T、G225A和A484K，获得突变蛋白pepDS21T,G225A,A484K，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(a2)以高拷贝质粒为载体，对pepD蛋白或pepDS21T,G225A,A484K突变蛋白的编码基因进行过表达；
(a3)将基因组中pepD蛋白或pepDS21T,G225A,A484K突变蛋白编码基因的启动子替换为强启动子；
(a4)提高pepD蛋白或pepDS21T,G225A,A484K突变蛋白编码基因转录的mRNA的稳定性；
b在所述出发菌中，对所述fadR蛋白进行的改造为如下任一：
(b1)敲除出发菌中fadR蛋白的编码基因；
(b2)对fadR蛋白进行两个氨基酸位点的突变，分别对应A140T和L171I，获得fadR的突变蛋白FadRA140T,L171I，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(b3)在基因组上将FadR蛋白或FadRA140T,L171I突变蛋白编码基因的启动子替换为弱启动子；
(b4)抑制FadR蛋白或FadRA140T,L171I突变蛋白编码基因转录得到的mRNA的翻译效率或降低其稳定性。
3.根据权利要求1所述的工程菌；其特征在于：所述的出发菌选自大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母细胞中任意一种。
4.根据权利要求1所述的工程菌；其特征在于：所述的出发菌选自菌株IBEWQ，突变菌株IBEWQ-62，突变菌株IBEWQ-624，大肠埃希菌Nissle1917，大肠杆菌BL21，大肠杆菌HB101，大肠杆菌JM109，大肠杆菌DH10B或大肠杆菌MG1655中的一种。
5.一种生物材料，其特征在于：选自下述中的至少一种：
(I)蛋白：pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白；
(II)基因：pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白的编码基因；
(III)表达盒：含有所述pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白的编码基因的表达盒或者含有所述DNA片段的表达盒；
(IV)重组载体：含有所述pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白的编码基因的重组载体或含有所述DNA片段的重组载体；
(V)重组菌：含有所述pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白的编码基因的重组菌或含有所述DNA片段的重组菌；
(VI)利用权利要求1获得的工程菌。
6.一种生物材料的应用，其特征在于：选自下述中的至少一种：
(a)权利要求5中所述的生物材料在提高出发菌色氨酸产量中的应用；
(b)权利要求5中所述的生物材料在生产色氨酸中的应用；
(c)pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白在提高出发菌色氨酸产量中的应用；
(d)pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白和/或fadRA140T,L171I突变体蛋白在生产色氨酸中的应用。
7.根据权利要求6中所述的应用，其特征在于：所述生物材料pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白具体为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
8.根据权利要求6中所述的应用，其特征在于：所述生物材料fadRA140T,L171I突变体蛋白具体为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
9.根据权利要求8中所述的应用，其特征在于：对应于基因水平，所述pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白的编码基因具体为与pepDS21T,G225A,A484K突变体蛋白的编码基因限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述pepDS21T ,G225A,A484K突变体蛋白的DNA分子。
10.根据权利要求8中所述的应用，其特征在于：对应于基因水平，所述fadRA140T,L171I突变体蛋白的编码基因具体为与fadRA140T,L171I突变体蛋白的编码基因限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述fadRA140T,L171I突变体蛋白的DNA分子。
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