CN117802020A - 一种提高缬氨酸产量的工程菌、生物材料及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高缬氨酸产量的工程菌、其生物材料及其应用。本发明通过筛选得到能够耐受高浓度缬氨酸的菌株，对其基因组进行测序和蛋白序列分析后发现，该菌株中的一些蛋白发生了点突变，这些突变体能提高缬氨酸的产量。为了进一步提高缬氨酸的产量，本发明在出发菌中对fadR、PanD、uspA、cg0109基因表达的蛋白序列进行改造。这些改造使得获得的工程菌与出发菌相比具有更高的缬氨酸产量。在规模化生产的情况下，30L发酵罐中缬氨酸产量达到109.88g/L，糖酸转化率53.8％。相比原始菌，缬氨酸的产量提升了1.27倍；糖酸转化率提高了1.2倍。本发明的生物材料及其应用属于分子生物学技术领域，具有广泛的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种提高缬氨酸产量的工程菌、生物材料及其应用。
背景技术
缬氨酸是人体必需的三种支链氨基酸之一，在生命代谢过程中起着非常重要的作用，广泛应用于食品、医药及饲料等行业。缬氨酸主要采用微生物发酵法生产。目前，多数企业使用的L-缬氨酸生产菌来自于反复诱变，因而其遗传背景不明，很难通过进一步诱变来提高L-缬氨酸产量。近年来，随着谷氨酸棒杆菌全基因组测序及基因功能注释的完成，代谢工程已被于构建L-缬氨酸生产菌，通过使用各种分子生物学技术控制生物体内的代谢途径，优化用于生产目标物质的代谢流，可以实现生态友好和可再生的基于生物质的生产系统的构建。随着合成生物学手段的不断发展，越来越多的代谢工程策略应用于构建L-缬氨酸高效生产的细胞工厂。然而，关注于代谢途径的理性改造虽然目的明确，效果显著，但由于微生物是一个复杂的系统，已知的代谢网络或改造思路并不能进一步达到快速提高产量的目的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过对菌株的耐受性筛选获得了一株能够耐受高浓度缬氨酸的菌株，在对菌株的基因组测序并对蛋白序列进行分析后，发现该菌株中的一些蛋白发生了点突变，并且这些突变体能够提高缬氨酸的产量。本发明通过诱发菌株产生与目标氨基酸合成的主要代谢途径以及糖酵解途径不相关的突变，获得了具有优良性质的菌株。然而，由于生物体的代谢网络具有高度的复杂性，本发明所获得的突变结果存在较高的不确定性，且难以在研究初期进行准确的预测与调控。本领域技术人员通常不会想到这些蛋白的改造是否对缬氨酸的生产有利。
本申请第一方面在于保护一种提高缬氨酸产量的工程菌，其经过对出发菌的uspA、cg0109、fadR和/或PanD表达盒进行直接改造，或将改造后的uspA、cg0109、fadR和/或PanD表达盒导入所述出发菌，获得缬氨酸产量提高的工程菌；任何能够强化uspA蛋白、cg0109蛋白、uspAA49I，N86S，Q101K突变蛋白或cg0109R17K，I44S，Q280K突变蛋白功能应用的方法及其组合，和/或任何能够弱化fadR蛋白、PanD蛋白或fadRD20E，R78K蛋白表达水平的方法及其组合。
对于上文所述的技术方案而言，进一步优选的，所述的改造方式选自下述至少一种技术手段：
a在所述出发菌中，对所述uspA和/或cg0109蛋白进行的改造，选自如下任一方法：
(a1)对uspA蛋白进行三个氨基酸位点的突变，分别是A49I，N86S，Q101K，获得突变蛋白uspAA49I，N86S，Q101K，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(a2)对cg0109蛋白进行三个氨基酸位点的突变，分别是R17K，I44S，Q280K，获得突变蛋白cg0109R17K，I44S，Q280K，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(a3)以高拷贝质粒为载体，对uspA蛋白、cg0109蛋白、uspAA49I，N86S，Q101K突变蛋白和/或cg0109R17K，I44S，Q280K突变蛋白的编码基因进行过表达；
(a4)将基因组中uspA蛋白、cg0109蛋白、uspAA49I，N86S，Q101K突变蛋白和/或cg0109R17K，I44S，Q280K突变蛋白编码基因的启动子替换为强启动子；
(a5)提高uspA蛋白、cg0109蛋白、uspAA49I，N86S，Q101K突变蛋白和/或cg0109R17K ，I44S，Q280K突变蛋白编码基因转录的mRNA的稳定性；
b在所述出发菌中，对所述fadR和/或PanD蛋白进行的改造，选自如下任一方法：
(b1)敲除出发菌中fadR和/或PanD蛋白的编码基因；
(b2)对fadR蛋白进行两个氨基酸位点的突变，分别对应D20E和R78K，获得fadR的突变蛋白fadRD20E，R78K，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(b3)在基因组上将fadR蛋白、PanD蛋白和/或fadRD20E，R78K突变蛋白编码基因的启动子替换为弱启动子；
(b4)抑制fadR蛋白、PanD蛋白和/或fadRD20E，R78K突变蛋白编码基因转录得到的mRNA的翻译效率和/或降低其稳定性。
对于上文所述的技术方案而言，进一步优选的，所述的出发菌选自谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母细胞中任意一种。
对于上文所述的技术方案而言，进一步优选的，所述的出发菌选自菌株谷氨酸棒杆菌IBCVQ，谷氨酸棒杆菌IBCVQ686，谷氨酸棒杆菌ATCC13002，大肠杆菌W3110，大肠埃希菌Nissle1917，大肠杆菌BL21，大肠杆菌HB101，大肠杆菌JM109，大肠杆菌DH10B或大肠杆菌MG1655中的一种。
本申请的另一方面在于保护一种生物材料，选自下述中的至少一种：
(I)蛋白：uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白；
(II)基因：uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白的编码基因；
(III)表达盒：含有所述uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白的编码基因的表达盒或者含有所述DNA片段的表达盒；
(IV)重组载体：含有所述uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白的编码基因的重组载体或含有所述DNA片段的重组载体；
(V)重组菌：含有所述uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白的编码基因的重组菌或含有所述DNA片段的重组菌；
(VI)利用上文获得的工程菌。
此外，本申请还保护上文所述生物材料的应用，所述的应用选自下述中的至少一种：
(a)上文所述的生物材料在提高出发菌缬氨酸产量中的应用；
(b)上文所述的生物材料在生产缬氨酸中的应用；
(c)uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白在提高出发菌缬氨酸产量中的应用；
(d)uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白在生产缬氨酸中的应用。
对于上文所述的技术方案中，进一步优选的，所述生物材料fadRD20E，R78K突变体蛋白具体为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白或，所述生物材料cg0109R17K，I44S，Q280K突变体蛋白具体为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
或，所述生物材料uspAA49I，N86S，Q101K突变体蛋白具体为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
对于上文所述的技术方案中，进一步优选的，对应于基因水平，所述fadRD20E，R78K、突变体蛋白的编码基因具体为与fadRD20E，R78K突变体蛋白的编码基因限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述fadRD20E，R78K突变体蛋白的DNA分子。
对于上文所述的技术方案中，进一步优选的，对应于基因水平，所述uspAA49I ，N86S，Q101K、突变体蛋白的编码基因具体为与uspAA49I，N86S，Q101K突变体蛋白的编码基因限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述uspAA49I，N86S，Q101K突变体蛋白的DNA分子。
对于上文所述的技术方案中，进一步优选的，对应于基因水平，所述cg0109R17K ，I44S，Q280K突变体蛋白的编码基因具体为与cg0109R17K，I44S，Q280K突变体蛋白的编码基因限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述cg0109R17K，I44S，Q280K突变体蛋白的DNA分子。
在本发明中，所述生产缬氨酸具体为当菌株在培养中被培养时能够产生缬氨酸并且能够积累缬氨酸。
本文所用的术语“本发明的蛋白”具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
本发明的“uspA蛋白突变体”是通过针对SEQ ID No.7所示氨基酸序列进行突变获得的。具体地，本发明的uspA蛋白氨基酸序列在第49位丙氨酸、第86位天冬酰胺和第101位谷氨酰胺分别被异亮氨酸、丝氨酸和赖氨酸所替代。另外，本发明的范围还涵盖了与SEQ IDNo.3具有大于80％，优选90％，更优选95％，最优选99％以上同源性的来源于大肠杆菌且具有分解N端未被阻断的二肽的功能的酶也在本发明的范围内。
本发明的“cg0109蛋白突变体”是通过针对SEQ ID No.6所示氨基酸序列进行突变获得的。具体地，本发明的cg0109蛋白氨基酸序列在第17位精氨酸、第44位异亮氨酸和第280位谷氨酰胺分别被赖氨酸、丝氨酸和赖氨酸所替代。另外，本发明的范围还涵盖了与SEQID No.2具有大于80％，优选90％，更优选95％，最优选99％以上同源性的来源于大肠杆菌且具有分解N端未被阻断的二肽的功能的酶。
同样的，本发明的“fadR蛋白突变体”是通过针对SEQ ID No.5所示氨基酸序列进行突变获得的。具体地，本发明的fadR蛋白缺失或氨基酸序列在第20位天冬氨酸和第78位精氨酸分别被谷氨酸和赖氨酸所替代。另外，本发明的范围还涵盖了与SEQ ID No.1具有大于80％，优选90％，更优选95％，最优选99％以上同源性的来源于大肠杆菌且具有双重DNA结合转录调节因子活性的蛋白。
本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，包括但不限于通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的酶的编码基因，从而在该菌株中表达该酶，则该酶对于该菌株是“外源性”的。
本文所用的术语“强化”不仅包括由于蛋白质自身活性的增加而带来的比原始功能更高的效果，而且其可以通过选自如下的至少一种方法进行：增加编码蛋白质的核苷酸的拷贝数、对编码蛋白质的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质的活性、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性，也可以非限制性地包括任何已经的方法，只要与内源性活性相比能够增强蛋白质的活性或增强引入蛋白质的活性。
本文所用的术语“引入蛋白质的活性”具有本领域技术人员常规理解的含义，并且可以通过本领域已知的方法实施，包括但不限于，如：将包含编码蛋白质的多核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体上，和/或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，和/或在染色体上行直接增加该多核苷酸的拷贝数，和/或改造具有编码蛋白质的多核苷酸启动子以增强转录启动速度，和/或对编码蛋白质的多核苷酸的转录进行修饰以增强其活性，和/或修改携带有所述编码蛋白质的多核苷酸的信使RNA的翻译调控序列以增强翻译强度，和/或修改编码蛋白质的多核苷酸本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白质活性的方法。
载体是包括编码靶蛋白的多核苷酸序列的DNA构建体，其被可操作地链接至合适的调控序列以使靶蛋白可在宿主细胞中表达。载体在被转入合适的宿主细胞后可独立于宿主细胞基因组复制或起作用，或可以被整合到宿主的基因组上。这些载体可以不特别地限制，只要该载体在宿主细胞中是可复制的。载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、pET、pUC载体等。另外，通过将载体插入到宿主细胞的染色体上，可以将染色体上编码内源靶蛋白的多核苷酸替换成为修饰的多核苷酸。将多核苷酸插入染色体可以使用本领域已知的任何方法进行，包括但不限于，如：通过同源重组。多核苷酸包括编码的靶蛋白的DNA和RNA，其可以以任何形式插入到宿主细胞的染色体上，只要其能够在宿主细胞中表达。包括但不限于，如：多核苷酸可以以原始状态、和/或表达盒的形式引入宿主细胞。表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体，也可以是能够自我复制的表达载体，可以包括可操作地结合至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。
类似地，本文所用的术语“弱化”是指降低、削弱、减小或完全消除某种蛋白，例如酶的活性。在具体的实施方式中，减弱酶的活性可以通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定、通过sRNA对基因进行调控等方法或其组合来实现，包括但不限于以上方法。
本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即含有蛋白或其蛋白突变体的菌株。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要所述细胞中含有目标蛋白或其突变体且能够生产缬氨酸的细胞。所述宿主细胞可以来自优选谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌。具体地，本发明所述的宿主是指能够生产缬氨酸的菌株，即，当细菌在培养中被培养时能够产生缬氨酸并且能够积累缬氨酸，或者能够将缬氨酸分泌到培养基中，也就是能够得到胞外的游离缬氨酸，特别是指与野生型菌株或者亲本菌株相比，能够积累更多缬氨酸的能力。为了赋予菌株产缬氨酸的能力，可以采用传统的育种方法，比如培育营养缺陷型的突变株、抗类似物的菌株，或者能够产缬氨酸的代谢控制突变株，以及培育氨基酸生物合成相关酶活性提高的重组菌株的方法，或者以上方法的组合。
本文所用的术语“含有本发明的uspA、cg0109、fadR、PanD蛋白突变体”具有本领域技术人员常规理解的含义，并且可以通过本领域已知的方法实施，包括但不限于，如：将包含编码蛋白的多核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体上，和/或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，和/或在染色体上行直接增加该多核苷酸的拷贝等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白活性的方法。
本领域技术人员知晓，为提升活性而对野生型多肽进行突变，找到能实现所需目的的位点更为重要。因此，基于本发明的教导，本领域技术人员会对uspA蛋白所示氨基酸序列的第49位丙氨酸被异亮氨酸替代，第86被天冬酰胺被丝氨酸替代，以及101位谷氨酰胺被赖氨酸替代、对cg0109蛋白所示氨基酸序列的第17位精氨酸被赖氨酸替代，第44位异亮氨酸被丝氨酸替代，以及第280位谷氨酰胺被赖氨酸替代；fadR蛋白缺失或所示氨基酸序列的第20位天冬氨酸被谷氨酸替代，第78位精氨酸被赖氨酸替代，PanD蛋白缺失或功能弱化，并检测突变体的相关活性。
此外，本领域普通技术人员也不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。
因此，对本发明的uspA、cg0109、fadR、PanD蛋白及其突变体作进一步突变而得到仍具备相应功能和活性的进一步突变体是显而易见的。例如，本领域技术人员公知在多肽的任一端增加或减少数个氨基酸残基，例如优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基不会影响得到的突变体的功能。例如，为便于纯化，技术人员往往在得到的蛋白的任一端带上6×His标签，而这种蛋白与不具备6×His标签的蛋白具有相同的功能。因此，本发明应包括在本发明基础上得到的保守性突变体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明在出发菌中，对fadR、PanD基因表达的蛋白序列或uspA、cg0109基因表达的蛋白序列进行改造，获得与所述出发菌相比缬氨酸产量提高的工程菌；所述出发菌为缬氨酸生产菌株；所述对fadR、PanD基因进行的改造为降低其表达水平或蛋白活性，甚至敲除；所述对uspA、cg0109基因进行的改造为对其进行突变，以及提高其表达水平或蛋白活性。在规模化生产的情况下，30L发酵罐中缬氨酸产量达到109.88±5.80g/L，糖酸转化率53.8％。相比原始菌，缬氨酸的产量提升了1.27倍；糖酸转化率提高了1.20倍。
附图说明
图1为对出发菌中fadR、PanD进行不同程度弱化，或/和将uspA、cg0109进行不同程度强化后的菌株的缬氨酸发酵水平；其结果表明，对uspA、cg0109基因的强化表达、对PanD的减弱调控，敲除fadR基因对于发酵效果的提升是明显的。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
实施例1筛选在缬氨酸发酵液中生长速度加快的耐受性菌株
据报道，谷氨酸棒杆菌中DNA聚合酶IIIα亚单位DnaE1和错配特异性核酸内切酶的nucS的二元突变体能够加速DNA复制过程中的错误率(“Engineering oftheDNAreplication and repair machinery to develop binary mutators for rapidgenome evolution of Corynebacteriumglutamicum”)从而使得菌株更容易发生自发突变，适应外界不利环境。通过基因合成公司合成扩增谷氨酸棒杆菌来源的DnaE1D26R变体和NucSE111L变体，PCR获得pKmob18质粒的sacB基因，将三者连入pXMJ19质粒上，得到载体pXMJ19-DnaE1D20R-sacB-NucSE111L，命名为pDN，质粒中含有IPTG诱导型启动子，调控DNA聚合酶IIIα亚单位DnaE1和错配特异性核酸内切酶的NucS的表达。
质粒构建所使用的引物序列：
SEQ ID No.8，DnaE1D26R-F：gaattaattaagcttatggctagactgtcccacatg
SEQ ID No.9，DnaE1D26R-R：gaacggcaggtatatgtgtctagattaaccgaggatgcctggc
SEQ ID No.10，sacB-F：caggcatcctcggttaatctagacacatatacctgccgttcac
SEQ ID No.11，sacB-R：cgatgattaattgtcaacccgggttatttgttaactgttaattgtccttg
SEQ ID No.12，NucSE111L-F：gacaattaacagttaacaaataacccgggttgacaattaatcatcggctcg
SEQ ID No.13，NucSE111L-R：ccaaaacagccaagctgaattcttagaacaatgtcagctcattggac
实施例2
(1)出发菌株：
在模式菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13002(可在多家生物试剂公司购买到其感受态细胞产品)的基础上，按照常规的基因改造方案，进行如下改造获得谷氨酸棒杆菌IBCVQ，即：敲除模式菌株基因组上的ldh、brnQ基因，将ilvE替换为球形赖氨酸芽孢杆菌中的NADH依赖型亮氨酸脱氢酶(LeuDH)；合成ilvN突变体ilvNM(G20E，I21E，I22F，G156E)合成ilvC突变体ilvCM(S34G、L48E和R49F)并且在alaT位点用PgapA启动子表达ilvBNMCM；在ppc位点用Ptac启动子表达pfkA基因；在pta位点用Ptac启动子表达pyk基因。
(2)获得突变株谷氨酸棒杆菌IBCVQ-68
将实施例1制备获得的载体pDN在谷氨酸棒杆菌IBCVQ中表达，以此为出发菌株，在种子培养基(加入氯霉素抗性)中活化一代后，在发酵培养基中额外加入不同浓度的缬氨酸，连续传代培养进化。培养24h后稀释25倍检测生物量。
表1
将高浓度缬氨酸培养液中生长速度加快的菌株在发酵培养基中培养，其中加入10-15％的蔗糖，丢失质粒pDN的菌株，经过平板分纯，获得一株产量明显提升的突变株，命名为突变株IBCVQ-68。
种子培养基：2.5g/L尿素，5g/L(NH4)2SO4，0.5g/L KH2PO4，0.5g/L K2HPO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，1.8g/L酵母浸出粉，5g/L蛋白胨，6mg/LFeSO4·7H2O，4mg/LMnSO4·H2O，0.2mg/L生物素，0.2mg/L维生素B1，30g/L葡萄糖，10mL/L植物油。
摇瓶发酵培养基：8g/L(NH4)2SO4，1g/L KH2PO4，1g/LK2HPO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，3.5g/L酵母粉，10mg/L FeSO4·7H2O，4mg/L MnSO4·H2O，0.02mg/L生物素，2mg/L维生素B1，30mg/L维生素B3，8mg/L维生素B6，150g/L葡萄糖，20g/L蔗糖，植物油40mL/L，30g/L CaCO3。
实施例3、突变株发酵产缬氨酸和基因组测序分析
对出发菌株IBCVQ和突变菌IBCVQ-68进行发酵。首先，将甘油菌在斜面培养基上活化，转接入种子培养基过夜培养IBCVQ和IBCVQ-68，获得的种子接种到含有50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，220rpm，31℃培养，取样检测葡萄糖残余量和缬氨酸的产量。历经48h发酵结束，突变菌IBCVQ-68的产酸水平明显高于出发菌株。
提取突变菌IBCVQ-68基因组，对其进行全基因组测序，比较基因组分析发现，与出发菌株相比，突变菌IBCVQ-68基因组发生点突变，其中导致氨基酸发生突变的如表2所示。
表2IBCVQ-68相比较野生菌基因组上发生的突变
| 基因名称 | 突变情况 | 突变后序列 | 突变前序列 |
| 突变的fadR | D20E，R78K | SEQ ID No.1 | SEQ ID No.5 |
| 突变的cg0109 | R17K，I44S，Q280K | SEQ ID No2 | SEQ ID No6 |
| 突变的uspA | A49I，N86S，Q101K | SEQ ID No.3 | SEQ ID No.7 |
| 突变的PanD | 缺失 | SEQ ID No.4 |
fadR、uspA、cg0109的突变位点分别为：
对于突变的fadR，记为fadRD20E，R78K，发生了两个突变，分别是D20E，R78K。
对于突变的cg0109，记为cg0109R17K，I44S，Q280K，发生了三个突变，分别是R17K、I44S、Q280K。
对于突变的uspA，记为uspAA49I，N86S，Q101K，发生了三个突变，分别是A49I、N86S、Q101K。
斜面培养基：2.5g/L尿素，5g/L(NH4)2SO4，0.5g/L KH2PO4，0.5g/L K2HPO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，1.8g/L酵母浸出粉，5g/L蛋白胨，6mg/LFeSO4·7H2O，4mg/LMnSO4·H2O，0.2mg/L生物素，0.2mg/L维生素B1，40g/L葡萄糖，15g/L琼脂粉。
实施例4、突变基因强启动子或弱启动子替换菌株构建
在IBCVQ菌株中分别将产生氨基酸序列突变基因(fadR、PanD、uspA、cg0109)的启动子进行不同强度的替换，比较各个突变体对缬氨酸发酵产量的影响。
按照常规的基因编辑过程，将各个基因的启动子替换为弱启动子Ptpx；按照常规的基因编辑过程，将fadR、PanD、uspA、cg0109各个基因的启动子替换为强启动子Peftu。构建后验证正确的菌株在种子培养基中活化12-16h，次日转接入发酵培养基中。
发酵结束后，各个生产菌株的缬氨酸生产结果如表3所示。
表3
从发酵结果可见，fadR、PanD突变基因的弱化对于缬氨酸的产量提升大有助益，而uspA、cg0109突变基因则是需要强化方能对缬氨酸的产量有利。
实施例5、突变基因过表达或弱化质粒的构建
以IBCVQ-68基因组为模板，扩增得到uspAA49I，N86S，Q101K和cg0109R17K，I44S，Q280K基因突变后的序列以及fadRD20E，R78K突变后序列。
在IBCVQ中，将uspA、cg0109基因的表达盒替换为以Peftu为启动子的uspAA49I ，N86S，Q101K基因序列和为以Peftu为启动子的cg0109R17K，I44S，Q280K基因序列，记为IBCVQ-681；
在IBCVQ中，构建弱化表达系统，将fadR基因的表达盒替换为以Ptpx为启动子的fadRD20E，R78K基因序列，记为IBCVQ-682；实施例中所述将PanD基因的启动字替换为Ptpx的菌株记为IBCVQ-683；
在IBCVQ基因组上分别敲除fadR和panD，记为IBCVQ-684和IBCVQ-685。
产酸情况如图1所示，可见，uspA、cg0109基因的强化表达对于发酵效果的提升是明显的，fadR的抑制表达不如敲除的效果理想，panD的抑制表达比敲除的效果略佳。由此构建了组合的突变菌株IBCVQ-686；所述的IBCVQ-686为在IBCVQ-68菌株中，在基因组上敲除fadR，并在PanD基因的编码区表达在启动子Ptpx下启动的PanD基因，同时将uspAA49I ，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K基因的启动子替换为Peftu。
IBCVQ-686的发酵水平达到78.72±2.43g/L，糖酸转化率52.48％。由此可见，对fadR、PanD的减弱调控，具体最佳的方案为敲除fadR基因，减弱PanD基因的表达。
实施例6、放大验证：
对IBCVQ和IBCVQ-686进行放大发酵.将IBCVQ和IBCVQ-686的斜面菌苔接四环于3L摇瓶中，将其置于120r/min、30℃条件下培养16-18h至OD562＝15左右，得到摇瓶种子液，备用。按照10％(V/V)接种量将摇瓶种子液接入30L发酵罐发酵培养基中，0h-20h培养条件为：温度30℃，罐压0.02～0.03Mpa，溶氧自然下降至20％左右后，通过调整转速和通气，控制溶解氧不低于20％；20h-48h培养条件为：温度31℃，罐压0.04～0.08Mpa，通过调整转速和通气，控制溶解氧为1％±0.1％。发酵过程中控制残糖浓度为20～30g/L。发酵16h后，每2～4h取一次样进行测定，发酵进行48h后，出发菌株IBCVQ的缬氨酸产量达到86.3±3.40g/L，糖酸转化率44.8％；突变菌株IBCVQ-686的缬氨酸产量达到109.88±5.80g/L，糖酸转化率53.8％。缬氨酸产量提高了1.27倍，糖酸转化率提高了1.20倍。
发酵培养基：8g/L(NH4)2SO4，1g/L KH2PO4，1g/L K2HPO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，3.5g/L酵母粉，10mg/L FeSO4·7H2O，4mg/L MnSO4·H2O，0.02mg/L生物素，2mg/L维生素B1，30mg/L维生素B3，8mg/L维生素B6，90g/L葡萄糖，植物油40mL/L。
补料培养基：400g/L葡萄糖。
实施例7、改造方式在其他菌株中的应用
(1)大肠杆菌中相关基因的弱化和过表达
上述实施例表明，对fadR、PanD的减弱调控，以及对uspA、cg0109等的强化能够提高缬氨酸的生产水平。为了验证这四个基因对于发酵水平的影响，在能够高产缬氨酸的大肠杆菌中进行改造。在出发菌株IBEVQ中的fecE基因敲除位点用强启动子PJ23119表达uspA和cg0109，敲除fadR，将panD的启动子替换为弱启动子J23119，得到工程菌IBEVQ-202。
其中，出发菌株是在大肠杆菌W3110的基因组中进行了一系列改造而得，具体为：敲除fecE基因，表达谷氨酸棒杆菌来源的brnFE基因，敲除lacI基因，将ilvC、ilvDE的天然启动子替换为强启动子PJ23119，在yeeL位点用强启动子PJ23119过表达PdhR因子，将brnQ替换为RpoS基因，在trpR基因位点表达用强启动子PJ23119过表达edd-eda基因。
将IBEVQ和IBEVQ-202接种到含有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，并在37℃、220rpm的条件下培养12-16h，OD600值为11-13时，以体积比12％的接种量接入3L发酵罐培养基中，维持温度在37℃±0.5℃，发酵过程中通过流加氨水控制pH 6.8±0.2，0-24h通过调节转速和风量，控制溶解氧不低于20％。24-48h，隔绝空气厌氧发酵。初糖耗尽之后，通过蠕动泵加入补料培养基，使得发酵过程中控制残糖浓度在3g/L附近波动。约48h发酵结束后，出发菌株缬氨酸的产量达到81.6g/L，糖酸转化率42.8％；改造后工程菌株的产量达到99.3g/L，糖酸转化率达到49.7％。缬氨酸产量提高了1.22倍，糖酸转化率提高了1.16倍。
可见，该对fadR、PanD的减弱调控，以及对uspA、cg0109等的强化是一种能够提高菌株产酸的可行思路。
其中，种子培养基：5g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，1.2g/L KH2PO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O；10mg/L MnSO4·H2O，1mg/L维生素B1，0.2mg/L维生素H，90g/L葡萄糖，植物油20mL/L。
发酵培养基：2g/L酵母提取物，2g/L柠檬酸，7g/L KH2PO4，3g/L(NH4)2SO4，10mg/LMnSO4·7H2O，30mg/L FeSO4·7H2O，1mg/L MgSO4·7H2O，0.5mg/L维生素B1，1mg/L维生素H，0.5mg/L维生素B3，0.5mg/L维生素B6，0.5mg/L维生素B12，30mL/L植物油，10g/L葡萄糖。
补料培养基：600g/L葡萄糖
(2)以大肠杆菌BL21，HB101，JM109，DH10B，MG1655为出发菌株，也能达到1.2倍左右的产量提升效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种提高缬氨酸产量的工程菌，其特征在于：经过对出发菌的uspA、cg0109、fadR和/或PanD表达盒进行直接改造，或将改造后的uspA、cg0109、fadR和/或PanD表达盒导入所述出发菌，获得缬氨酸产量提高的工程菌；任何能够强化uspA蛋白、cg0109蛋白、uspAA49I ，N86S，Q101K突变蛋白或cg0109R17K，I44S，Q280K突变蛋白功能应用的方法及其组合，和/或任何能够弱化fadR蛋白、PanD蛋白或fadRD20E，R78K蛋白表达水平的方法及其组合。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述的改造方式选自下述至少一种技术手段：
a在所述出发菌中，对所述uspA和/或cg0109蛋白进行的改造，选自如下任一方法：
(a1)对uspA蛋白进行三个氨基酸位点的突变，分别是A49I，N86S，Q101K，获得突变蛋白uspAA49I，N86S，Q101K，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(a2)对cg0109蛋白进行三个氨基酸位点的突变，分别是R17K，I44S，Q280K，获得突变蛋白cg0109R17K，I44S，Q280K，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(a3)以高拷贝质粒为载体，对uspA蛋白、cg0109蛋白、uspAA49I，N86S，Q101K突变蛋白和/或cg0109R17K，I44S，Q280K突变蛋白的编码基因进行过表达；
(a4)将基因组中uspA蛋白、cg0109蛋白、uspAA49I，N86S，Q101K突变蛋白和/或cg0109R17K ，I44S，Q280K突变蛋白编码基因的启动子替换为强启动子；
(a5)提高uspA蛋白、cg0109蛋白、uspAA49I，N86S，Q101K突变蛋白和/或cg0109R17K，I44S，Q280K突变蛋白编码基因转录的mRNA的稳定性；
b在所述出发菌中，对所述fadR和/或PanD蛋白进行的改造，选自如下任一方法：
(b1)敲除出发菌中fadR和/或PanD蛋白的编码基因；
(b2)对fadR蛋白进行两个氨基酸位点的突变，分别对应D20E和R78K，获得fadR的突变蛋白fadRD20E，R78K，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(b3)在基因组上将fadR蛋白、PanD蛋白和/或fadRD20E，R78K突变蛋白编码基因的启动子替换为弱启动子；
(b4)抑制fadR蛋白、PanD蛋白和/或fadRD20E，R78K突变蛋白编码基因转录得到的mRNA的翻译效率和/或降低其稳定性。
3.根据权利要求1所述的工程菌；其特征在于：所述的出发菌选自谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母细胞中任意一种。
4.根据权利要求1所述的工程菌；其特征在于：所述的出发菌选自菌株谷氨酸棒杆菌IBCVQ，谷氨酸棒杆菌IBCVQ686，谷氨酸棒杆菌ATCC13002，大肠杆菌W3110，大肠埃希菌Nissle1917，大肠杆菌BL21，大肠杆菌HB101，大肠杆菌JM109，大肠杆菌DH10B或大肠杆菌MG1655中的一种。
5.一种生物材料，其特征在于：选自下述中的至少一种：
(I)蛋白：uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白；
(II)基因：uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白的编码基因；
(III)表达盒：含有所述uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白的编码基因的表达盒或者含有所述DNA片段的表达盒；
(IV)重组载体：含有所述uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白的编码基因的重组载体或含有所述DNA片段的重组载体；
(V)重组菌：含有所述uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白的编码基因的重组菌或含有所述DNA片段的重组菌；
(VI)利用权利要求1获得的工程菌。
6.一种生物材料的应用，其特征在于：选自下述中的至少一种：
(a)权利要求5中所述的生物材料在提高出发菌缬氨酸产量中的应用；
(b)权利要求5中所述的生物材料在生产缬氨酸中的应用；
(c)uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白在提高出发菌缬氨酸产量中的应用；
(d)uspAA49I，N86S，Q101K、cg0109R17K，I44S，Q280K和/或fadRD20E，R78K突变体蛋白在生产缬氨酸中的应用。
7.根据权利要求6中所述的应用，其特征在于：
所述生物材料fadRD20E，R78K突变体蛋白具体为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白或，所述生物材料cg0109R17K，I44S，Q280K突变体蛋白具体为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
或，所述生物材料uspAA49I，N86S，Q101K突变体蛋白具体为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
8.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于：对应于基因水平，所述fadRD20E，R78K、突变体蛋白的编码基因具体为与fadRD20E，R78K突变体蛋白的编码基因限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述fadRD20E，R78K突变体蛋白的DNA分子。
9.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于：对应于基因水平，所述uspAA49I，N86S，Q101K、突变体蛋白的编码基因具体为与uspAA49I，N86S，Q101K突变体蛋白的编码基因限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述uspAA49I ，N86S，Q101K突变体蛋白的DNA分子。
10.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于：对应于基因水平，所述cg0109R17K ，I44S，Q280K突变体蛋白的编码基因具体为与cg0109R17K，I44S，Q280K突变体蛋白的编码基因限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述cg0109R17K，I44S，Q280K突变体蛋白的DNA分子。
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