KR20110135261A - 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 n-butyrate를 기질로 하여 부탄올을 제조하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실; (b) 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 기존의 Clostridium acetobutylicum과 달리 성장이 용이하고, 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 유용하다.
Description
본 발명은 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 n-butyrate를 기질로 하여 부탄올을 제조하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
최근 고유가와 환경 문제로 인해 미생물을 이용한 바이오연료 생산이 큰 관심을 끌고 있다. 최근 바이오 부탄올이 휘발유의 대체 연료로 부상하면서 시장 규모가 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 현재 전세계적으로 연간 10~12 billion pound의 부탄올이 생산되고 있으며, 7~8.4 billion dollar의 시장규모를 이루고 있다 (Lee, S.Y. et al., Biotechnology and Bioengineering 101: 209, 2008). 특히, 바이오 부탄올은 에너지 밀도, 휘발성 제어, 충분한 옥탄가, 낮은 불순물 등 연료로서 적합한 특성을 가지며, 에탄올 보다 에너지 효율이 높고 휘발유와 더욱 잘 섞이며, 기존의 송유관이나 자동차 엔진 등을 그대로 사용할 수 있다는 장점을 지니고 있다. 따라서, 대체연료로 가장 적합한 부탄올을 미생물을 이용하여 대량 생산한다면, 원유 수입 대체 효과 및 온실 가스 배출 감소로 인한 환경적 효과 등을 가져올 수 있다.
부탄올은 Clostridial 균주의 혐기적 ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) fermentation에 의해 생물학적 방법으로 생산될 수 있는데 (Jones, D. T. and Woods, D. R., Microbiol. Rev., 50:484, 1986; Rogers, P., Adv. Appl. Microbiol., 31:1, 1986; Lesnik, E. A. et al., Necleic Acids Research, 29: 3583, 2001), 이러한 방법이 1950년대 까지만 해도 40년 이상에 걸쳐 부탄올과 아세톤의 주요 공급원이었다. Clostridial 균주는 성장 조건이 까다롭고 분자생물학적 tool 및 omics technology 등이 완전히 갖추어져 있지 않아서 추가 균주 개량에 어려움이 있다.
따라서, 성장이 우수하고 다양한 omics technology가 구비된 대장균 등에서의 부탄올 생산이 요구되고 있다. 특히, 대사공학 또는 omics technology 등을 이용한 균주 개발이 전무한 상태이므로 무한한 개발 잠재력이 있다고 하겠다.
Clostridium acetobutylicum에서의 부탄올 생성 pathway는 도 1에 나타난 바와 같다 (Lee, S.Y. et al., Biotechnology and Bioengineering 101: 209, 2008). 대장균에도 해당 pathway를 도입하여 부탄올 생산이 시도되었는데, 이 중 일부 효소들 (crotonase, β-hydroxybutyryl-coenzyme A dehydrogenase, butyryl-CoA dehydrogenase)의 활성이 매우 낮거나 거의 없어서 (Boynton, Z. L. et al., J. Biotechnol., 178: 3015-3024, 1996) Clostridium acetobutylicum에서처럼 효과적으로 해당 반응을 catalyze 하기는 어려운 문제점이 있었다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 부탄올 생합성 경로를 도입하여 부탄올 생성능을 가지는 재조합 박테리아를 제조하고, 이를 이용하여 부탄올 생산을 시도한 바 있으나, 그 생성량이 미미하였다 (US2007/0259419A1; US2007/0259411A1).
이에, 본 발명자들은 미생물을 이용하여 부탄올을 생산하는 새로운 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물을 제조한 후, 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시킬 경우 재조합 미생물의 부탄올 생성능이 증가된다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 부탄올의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물을 제조하는 단계; 및 (b) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계; 및 (b) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계; (b) 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균이 함유하고 있는 AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 변이 대장균을 제조하는 단계; 및 (c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실; (b) 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (c) AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (d) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물 또는 재조합 대장균을 배양한 다음, 상기 재조합 미생물 또는 재조합 대장균의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 n-butyrate를 기질로 하여 부탄올을 제조하는 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 기존의 Clostridium acetobutylicum과 달리 성장이 용이하고, 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 유용하다.
도 1은 C. acetobutylicum ATCC 824 균주의 부탄올 생성 pathway를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 미생물의 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는 대사회로를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 pTrc99a_ptbbuk 플라스미드의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 pTac15k_adhE_bdhAB 플라스미드의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 미생물(WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk +pTac15k_adhE_bdhAB)의 부탄올 생성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 미생물의 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는 대사회로를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 pTrc99a_ptbbuk 플라스미드의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 pTac15k_adhE_bdhAB 플라스미드의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 미생물(WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk +pTac15k_adhE_bdhAB)의 부탄올 생성 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명에서는 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물을 제조한 후, 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시켜 제조한 재조합 미생물이 부탄올을 생성할 수 있는지를 확인하고자 하였다.
본원발명에서는 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, fadE 유전자를 결실시켜 부탄올 생합성의 중간체인 부티릴-CoA가 아세틸-CoA로 전환되지 않도록 하고, 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 억제하는 조절 유전자인 fadR을 결실시켜 glucose가 존재하는 조건에서도 지방산 대사회로가 작동되도록 하고, fadD 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 다른 억제 조절 유전자의 영향을 받지 않으면서, 강하게 발현되어 지방산이 아실-CoA로 전환되도록 한 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물을 제조한 후, 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자들을 제조된 변이 미생물에 도입시키면, 제조된 재조합 미생물의 부탄올 생성능이 향상될 것으로 예측하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 대장균 W3110의 fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter인 tac promoter로 치환시킨 WERPD3110을 제조하였다. 그리고, Clostridium acetobutylicum의 ptb, buk 유전자에 의해 n-butyrate가 butyryl-CoA로 전환된다는 사실(Journal of bacteriology, p. 4613-4618, 1988)에 근거하여 ptb(phosphate butyryltransferase를 코딩하는 유전자) 및 buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자)가 순차적으로 클로닝된 ptrc99a_ptbbuk 벡터와 adhE(butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자)를 도입시킨 벡터(pTac15k_adhE_bdhAB)를 제조한 후, 이를 WERPD3110에 도입시킴으로써 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물(WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk +pTac15k_adhE_bdhAB)을 제조하였고, 제조된 재조합 미생물의 부탄올 생성능이 향상되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물을 제조하는 단계; 및 (b) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, "지방산 대사경로"란 지방산(fatty acid)을 합성하거나 분해하는 반응이 일어나는 경로로써, 대부분의 미생물은 지방산 대사경로를 가지고 있다.
본 발명에서, "결실"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 해당 효소의 발현 또는 활성을 억제시키는 유전자, 효소 또는 화학물질을 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 억제시키는 것을 포괄하는 개념이다.
본 발명에서, 상기 지방산 대사경로를 가지는 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 상기 박테리아로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 대장균 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자는 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)이며, 상기 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 fadE는 acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자로써, 상기 fadE가 미생물내에 존재할 경우 부티레이트로부터 생성된 butyryl-CoA가 추가적인 대사(further metabolism) 과정을 거쳐 Acetyl-CoA로 전환된다. 따라서, 본 발명에서는 fadE 유전자를 결실시킴으로써, 부탄올 생산에 유용하게 이용되는 butyryl-CoA를 확보하는 것을 특징으로 한다.
상기 fadR은 지방산 대사(fatty acid metabolism) 관련 모든 유전자의 발현을 조절하는 global regulator이다. 예를들어 E.coli는 glucose 혹은 다른 에너지원이 충분할 경우 fadR이 지방산 대사가 일어나지 않도록 지방산 대사 관련 유전자를 강하게 repression한다. 그러나 glucose 등 에너지원이 고갈되어 더 이상 탄소원(carbon source)이 없을 경우 지방산을 분해하여 acetyl-CoA로 전환시켜 에너지 원으로 사용한다. 이때 지방산을 분해하기 위해서 fadR의 repression이 풀리게되고 관련 유전자들이 모두 발현된다. 따라서, 본 발명에서는 fadR 유전자를 결실시킴으로써, glucose가 존재하는 조건에서도 지방산 대사가 일어날 수 있도록 하는 것을 특징으로 한다. 그러나, 앞서기재한 바와 같이, fadE 유전자를 결실시켰기 때문에 지방산은 중간에서 대사가 멈추게 된다. 즉 uptake된 부티레이트는 butyryl-CoA까지만 전환되고, 이후 acetyl-CoA로는 전환되지 않는다.
상기 fadD는 acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자로써, 지방산에 CoA를 붙여서 세포가 에너지 원으로 사용할 수 있는 형태로 전환 시켜준다. 즉, 지방산 대사의 시작단계에 관여하는 유전자이다. 본 발명에서는 fadD 유전자의 Native promoter를 strong promoter로 치환시켜 발현이 강하게 일어나도록 하였고, native promoter상에 위치하는 fadR 이외의 다른 repression factor(ompR 등)가 결합되지 않도록 한 것을 특징으로 한다. 상기 fadD가 발현되면 부티레이트를 부티릴-CoA로 전환시키는데 관여하는 효소인 ptbbuk의 성능을 보완시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter, trp promoter 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 부티레이트를 부티릴-포스페이트(butyryl-phosphate)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 부티릴-포스페이트를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 부티릴-CoA를 부티르알데하이드(butyraldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 부티레이트를 부티릴-포스페이트(butyryl-phosphate)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 부티릴-포스페이트를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 부티릴-CoA를 부티르알데하이드(butyraldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자)이며, 상기 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)이다.
상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutyricum 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다.
또한, 상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 strong promoter에 포함되어 도입되는 것이 바람직하다. 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter, trp promoter 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 방법은 상기 (a) 단계의 개량된 변이 미생물이 함유하고 있는 AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter를 strong promoter로 치환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
야생형 대장균은 atoDAEB operon을 가지고 있다. atoD는 acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase, alpha subunit을 코딩하는 유전자이고, atoA는 acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase, beta subunit을 코딩하는 유전자이고, atoE는 short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자이며, atoB acetyl-CoA acetyltransferase를 코딩하는 유전자로 알려져 있다.
즉, atoDA는 미생물의 butyrate metabolism에 속해 있는 유전자로써 butyrate를 butyryl-CoA로 전환시키는 역할을 하고, atoE는 short chain fatty acid를 uptake하는 역할을 한다. 따라서, atoDA 및 atoE 유전자의 promoter를 발현이 강한 strong promoter로 치환시킬 경우, 부탄올 생성능을 높일 수가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 개량된 변이 미생물이 함유하는 atoDAEB operon은 미생물이 본래 가지고 있거나, 외부로부터 도입되어 있는 것 모두 포함한다.
본 발명은 다른관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계; 및 (b) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계; (b) 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균이 함유하고 있는 AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 변이 대장균을 제조하는 단계; 및 (c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실; (b) 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (c) AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (d) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균에 관한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 미생물의 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는 대사회로를 나타낸 것이다.
상기 재조합 미생물 및 재조합 대장균은 앞서 기재한 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에서는 WERPD3110에 ptrc99a_ptbbuk 벡터 및 pTac15k_adhE_bdhAB벡터를 도입시켜 제조한 재조합 미생물(WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk +pTac15k_adhE_bdhAB)을 글루코스 및 부티레이트를 함유하는 배지에서 배양한 결과, 부탄올이 고농도로 생성되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실; (b) 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 배양한 다음, 상기 재조합 미생물의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 배양한 다음, 상기 재조합 대장균의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (c) AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (d) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 배양한 다음, 상기 재조합 대장균의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 재조합 변이 미생물의 배양 및 부탄올 회수 과정은 종래 발효 공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 알코올의 분리 정제 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 아울러, 상기 부탄올의 회수는 배양이 완료된 이후에 수행하는 것이 일반적이나, 생산성을 높기기 위하여 gas-stripping 방법(Thaddeus et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 27:207, 2005)등을 이용하여 배양도중에 회수할 수도 있다. 즉, 배양중에 생성된 부탄올을 회수하면서 계속 배양하는 것도 본 발명의 범위에 속한다.
[실시예]
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 대장균 W3110을 숙주 미생물로 이용하였으나, 다른 대장균이나, 박테리아, 효모 및 곰팡이를 사용하여 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량시키고, 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시킨 다음, 이를 이용하여 부탄올을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 도입 대상 유전자로 특정 균주 유래인 것만을 예시하였으나, 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
아울러, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이, 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것 (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72: 41, 2001)도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물의 제조
1-1:
fadE
유전자의 결실 (WE3110)
서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6; 97(12): 6640-6645, 2000)을 이용하여, 대장균 W3110(ATTC 39936)에서 fadE 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하여 WE3110 균주를 제조하였다.
[서열번호 1] WfadE k/o F : 5'-atgatgattttgagtattctcgctacggttgtcctgctcgg cgcgttgttgtgtaggctggagctgcttc-3`
[서열번호 2] WfadE k/o R: 5`-actgggcataagccgagaactccagcccgccgtactc ttttttgatgatccatatgaatatcctccttag-3`
1-2:
fadR
유전자의 결실 (WER3110)
서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6; 97(12): 6640-6645, 2000)을 이용하여, 1-1의 대장균 WE3110에서 fadR 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하여 WER3110 균주를 제조하였다.
[서열번호 3] WfadRk/oF: 5'-atggtcattaaggcgcaaagcccggcgggtttcgcggaa gagtacattatgtgtaggctggagctgcttc-3'
[서열번호 4] WfadRk/oR: 5'-ccggattggcgaaatagtgacgaccaatacgcgtatacag ccctttcatc catatgaatatcctccttag-3'
1-3:
fadD
의 native promoter에 있는 attenuator sequence의 tac promoter로 치환(WERPD3110)
1-2에서 제조된 대장균 WER3110에서, fadD promoter 상에 위치하는 전사조절 기작에 관여하는 attenuator sequence를 강력한 promoter인 tac promoter로 치환하였다.
먼저, attenuator sequence의 치환을 위해, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용해 상기 유전자 제거와 동일한 방법으로, attenuator를 포함하는 native promoter를 tac promoter로 치환하여 WERPD3110 균주를 제조하였다.
[서열번호 5] WfadDpchF: 5'-gtataatcccggccccgcgagagtacaaacagttgtaact gaataattgccgcgtcatacacatacgatt-3'
[서열번호 6] WfadDpchR: 5'-ttgatctccgtcggaacgtccgcgggataacggttaagcc aaaccttcttcatggtctgtttcctgtgtg-3'
실시예 2: 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 벡터의 제조
2-1: pTrc99a_ptbbuk 벡터의 제조
C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 7와 8의 프라이머로 PCR을 수행하여, phosphate butyryltransferase 와 butyrte kinase를 코딩하는 ptbbuk 유전자 절편을 제조하였다.
[서열번호 7] bukptbF: 5'-tatagaattcgtgattaagagttttaatga-3'
[서열번호 8] bukptbR: 5'-tattgagctcttatttgtattccttagctt-3'
다음으로, 상기 제조된 ptbbuk 절편을 trc 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTrc99a 플라스미드(Phamacia, Biotech, Uppsala, Sweden)에 제한효소(EcoRI 및 SacI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 ptbbuk 절편 및 pTrc99a 플라스미드를 접합시킴으로써, 복제율이 높은(high copy number) 재조합 플라스미드인 pTrc99a_ptbbuk를 제조하였다(도 3).
2-2: pTac15k_adhE_bdhAB 벡터의 제조
C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9의 프라이머와 서열번호 10의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이로부터 확보된 adhE 절편을 pTac15k 플라스미드에 제한효소(SacI 및 XbaI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 adhE 절편 및 pTac15k 플라스미드를 접합시킴으로써, pTac15k_adhE를 제조하였다.
다음으로, C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11의 프라이머와 서열번호 12의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이로부터 확보된 bdhAB 절편을 pTac15k_adhE 플라스미드에 제한효소(BamHI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 bdhAB 절편 및 pTac15k_adhE 플라스미드를 접합시킴으로써, pTac15k_adhE_bdhAB를 제조하였다(도 4).
[서열번호 9] adhEfn: 5'-acgcgagctcatgaaagttacaaatcaaaa-3'
[서열번호 10] adhErs: 5'-acgttctagaatagtctatgtgcttcatga-3'
[서열번호 11] bdhfst: 5'-atgcggatctcaacgaaaaattcaccccct-3'
[서열번호 12] bdhrst: 5'-acgtggatctccggtaggtttacacagatt-3'
실시예 3: 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물 (WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB)의 제조 및 부탄올 생성능 확인
실시예 1에서 제조된 WERPD3110에 실시예 2에서 제조된 pTrc99a_ptbbuk 벡터 및 pTac15k_adhE_bdhAB를 도입하여 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물 (WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB)을 제조하였다.
제조된 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 엠피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)이 각각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼낸 100㎖ LB를 함유한 250㎖ 플라스크에 glucose (5g/L)를 첨가하고 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 31℃에서 10시간 배양하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g glucose, 13.5g KH2PO4, 4.0 g (NH4)2HPO4, 1.7g citric acid, 1.4g MgSO4ㆍ7H2O, 3g yeast extract, 10㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10㎖ 함유)의 성분으로 구성된 배지 2.0 리터를 함유한 5.0 리터 발효기(LiFlus GX, Biotron Inc., Korea)를 121℃에서 15분간 멸균한 후 실온까지 온도를 낮추었다. 상기 발효기에 상기 전배양액을 접종하여, 31℃, 200rpm에서 anaerobic 조건으로 배양하였고, optical density(OD)가 0.7 일 때 IPTG 1mM을 처리하였다. butyrate는 NaOH를 이용하여 pH를 5로 조정하였고, 멸균된 증류수로 1/10 로 희석하여 50초 한번씩 1초 동안 feeding 하였다. 배양액의 pH는 50%(v/v) NH4OH의 automatic feeding에 의해 5.5로 유지하였고, Nitrogen (N2) 으로 charging 하여 anaerobic 조건을 유지시켰다.
상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer(STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 부탄올 농도를 packed column (Supelco CarbopackTM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m ㅧ 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography (Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
도 5는 재조합 미생물(WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk +pTac15k_adhE_bdhAB)의 부탄올 발효 결과를 나타낸 그래프로서, 배양시간에 따라 부티레이트의 농도는 점차 감소되면서, 부탄올이 생성되는 것을 알 수 있었다.
| Strain | Butanol (mg/L) |
| W3110 | ND1 |
| WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB | 466.4 |
표 1에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 W3110에서는 부탄올이 생성되지 않은 반면, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 466.4mg/L 의 부탄올을 생성하였다.
이 결과로부터, 본 발명에서의 ptbbuk, adhE 및 bdhAB 유전자들의 과발현으로 인해 부티레이트로부터 부탄올이 성공적으로 생성되었음을 확인 할 수 있었다.
참고로, 본 출원인의 선행특허(출원번호:10-2009-0059560)에서 제조된 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate를 중간체로 하여 부탄올을 생합성하는 재조합 미생물[Val(△ilvE)+pKBRilvBNCD-ptac-adhEbdhAB+ pTac15KlpdVbkdA1-ptac-bkdA2BicmAB]은 117.9mg/L의 부탄올을 생성하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology
<120> Recombinant Microorganisms Producing Butanol and Method for
Preparing Butanol Using the Same
<160> 12
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WfadE k/o F
<400> 1
atgatgattt tgagtattct cgctacggtt gtcctgctcg gcgcgttgtt gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WfadE k/o R
<400> 2
actgggcata agccgagaac tccagcccgc cgtactcttt tttgatgatc catatgaata 60
tcctccttag 70
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WfadRk/o F
<400> 3
atggtcatta aggcgcaaag cccggcgggt ttcgcggaag agtacattat gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WfadRk/o R
<400> 4
ccggattggc gaaatagtga cgaccaatac gcgtatacag ccctttcatc catatgaata 60
tcctccttag 70
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WfadDpch F
<400> 5
gtataatccc ggccccgcga gagtacaaac agttgtaact gaataattgc cgcgtcatac 60
acatacgatt 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WfadDpch R
<400> 6
ttgatctccg tcggaacgtc cgcgggataa cggttaagcc aaaccttctt catggtctgt 60
ttcctgtgtg 70
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bukptb F
<400> 7
tatagaattc gtgattaaga gttttaatga 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bukptb R
<400> 8
tattgagctc ttatttgtat tccttagctt 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adhEfn
<400> 9
acgcgagctc atgaaagtta caaatcaaaa 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adhErs
<400> 10
acgttctaga atagtctatg tgcttcatga 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bdhfst
<400> 11
atgcggatct caacgaaaaa ttcaccccct 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bdhrst
<400> 12
acgtggatct ccggtaggtt tacacagatt 30
Claims (30)
- 다음 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 방법:
(a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물을 제조하는 단계; 및
(b) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 개량된 변이 미생물이 함유하고 있는 AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter를 strong promoter로 치환하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 지방산 대사경로를 가지는 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자는 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)이며, 상기 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 부티레이트를 부티릴-포스페이트(butyryl-phosphate)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 부티릴-포스페이트를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 부티릴-CoA를 부티르알데하이드(butyraldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 부티레이트를 부티릴-포스페이트(butyryl-phosphate)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 부티릴-포스페이트를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 부티릴-CoA를 부티르알데하이드(butyraldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자)이며, 상기 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutyricum 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 strong promoter에 포함되어 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법:
(a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계; 및
(b) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계.
- 다음 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법:
(a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계;
(b) 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균이 함유하고 있는 AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 변이 대장균을 제조하는 단계; 및
(c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실;
(b) 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및
(c) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
- 제15항에 있어서, AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter가 strong promoter로 추가로 치환되어 있는 것을 특징으로 재조합 미생물.
- 제15항에 있어서, 상기 지방산 대사경로를 가지는 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제17항에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제15항에 있어서, 상기 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자는 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)이며, 상기 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제15항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제15항에 있어서, 상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 부티레이트를 부티릴-포스페이트(butyryl-phosphate)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 부티릴-포스페이트를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 부티릴-CoA를 부티르알데하이드(butyraldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제21항에 있어서, 상기 부티레이트를 부티릴-포스페이트(butyryl-phosphate)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 부티릴-포스페이트를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 부티릴-CoA를 부티르알데하이드(butyraldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자)이며, 상기 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제15항에 있어서, 상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutyricum 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제15항에 있어서, 상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 strong promoter에 포함되어 도입되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제24항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실;
(b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및
(c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균.
- (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실;
(b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환;
(c) AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter가 strong promoter로 치환; 및
(d) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제15항 내지 제25항중 어느 한 항의 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 배양한 다음, 상기 재조합 미생물의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
- 제26항 내지 제28항중 어느 한 항의 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 배양한 다음, 상기 재조합 대장균의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
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| KR1020100055069A KR101758910B1 (ko) | 2010-06-10 | 2010-06-10 | 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법 |
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|---|---|---|---|---|
| US9121042B2 (en) | 2012-07-30 | 2015-09-01 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Enzyme used in biosynthesis of 1, 4-BDO and screening method of the same |
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