KR20180034280A

KR20180034280A - 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 미생물

Info

Publication number: KR20180034280A
Application number: KR1020170124176A
Authority: KR
Inventors: 이승구; 한귀환; 성원재; 이대희
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2016-09-26
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2018-04-04
Also published as: KR101863239B1; WO2018056794A1

Abstract

본 발명은 아세트산의 대사 능력이 향상된 미생물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 야생형 미생물에 patZ , cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 돌연변이되어 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 돌연변이 미생물, 바람직하게는 대장균에 관한 것이다. 본 발명의 돌연변이 미생물은 아세트산을 유일 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있을 뿐만 아니라, 아세트산으로부터 재조합 단백질 및 부탄올과 같은 산업적으로 유용한 목적 물질의 제조에도 유용하게 사용할 수 있다.

Description

아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 미생물{Microorganism Capable of Using Acetic Acid as Sole Carbon Source}

본 발명은 아세트산에 대한 대사 능력이 향상된 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아세트산의 세포 내 이용과 관련된 5종의 유전자 중 하나 이상이 돌연변이되어 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 미생물, 바람직하게는 대장균 균주에 관한 것이다.

대장균과 같은 미생물은 아세트산을 단독 혹은 혼합 탄소원으로 사용하여 배양할 경우 그 농도에 따라 대장균의 성장을 저해한다. 또한, 배양액 내 아세트산 농도가 증가할수록 미생물 생육의 유도기(lag phase)가 길어지고, 이로 인해 전체 배양 시간이 길어지는 문제가 있다(비특허문헌 1). 예컨대, 종래 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 대장균 균주가 공개되어 있으나, 상기 대장균 균주는 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 경우 성장이 현저하게 느려지는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 2).

이에, 아세트산의 대사 능력이 향상되어 저가의 아세트산을 유일 탄소원 또는 혼합 탄소원으로 이용하면서도 성장이 느려지지 않고, 또한 유전자 도입을 통해 산업적으로 유용한 바이오연료, 재조합 단백질 등을 생산할 수 있는 신규한 미생물의 개발이 요구되고 있다.

Holger Ebbighausen, et al., Arch. Microbiol., 1991, 155(5), 505-5101 Frank E. Dailey, et al., J. Bacteriol., 1986, 165(2), 453-460 Sara Castano-Cerezo, et al., Mol. Syst. Biol., 2014, 10, 762 Devashish Rath, et al., J. Bacteriol., 2006, 188(19), 6780-6785 Hironori Niki, et al., J. Bacteriol., 1986, 165(2), 453-460 Zhiqing SONG, et al., J. Radiat. Res., 2012, 53(6), 854-859

본 발명은 야생형 미생물 균주에 특정 유전자가 돌연변이되어 아세트산의 대사 능력이 향상되고 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 돌연변이 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 미생물에 patZ , cspC , mukB, lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 돌연변이되어 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 돌연변이 미생물을 제공한다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이 미생물은 patZ 유전자가 필수적으로 돌연변이되고, cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가적으로 돌연변이된 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이 미생물은 patZ, cspC , mukB , lomR 및 yhjE의 5종의 유전자가 모두 돌연변이된 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 patZ , cspC, mukB , lomR 및 yhjE 유전자는 각각 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어지는 염기서열을 갖는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이 미생물은 frdA , ldhA , adhE 및 pta로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 제거된 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 frdA , ldhA , adhE 및 pta 유전자는 각각 서열번호 6 내지 서열번호 9로 이루어지는 염기서열을 갖는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 patZ 유전자의 돌연변이는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 501번째 아미노산인 Trp가 Stop codon으로 돌연변이(Trp501Stop)되고, 상기 cspC 유전자의 돌연변이는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 58번째 아미노산인 Gln이 Stop codon으로 돌연변이(Gln58Stop)되고, 상기 mukB 유전자의 돌연변이는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 54번째 아미노산인 Asp가 Glu로 돌연변이(Asp54Glu)되고, 상기 lomR 유전자의 돌연변이는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 114번째 아미노산인 Pro가 Leu로 돌연변이(Pro114Leu)되고, 상기 yhjE 유전자의 돌연변이는 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 210번째 아미노산인 Ile가 Met로 돌연변이(Ile210Met)될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 본 발명의 돌연변이 미생물은 부탄올의 생합성 관련 유전자가 추가로 도입되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 부탄올의 생합성 관련 유전자는 3-히드록시부티릴-COA 디하이드로게나아제, 3-히드록시부티릴-CoA 디하이드라타아제, 트랜스-에노일-CoA 리덕타아제 및 알데히드 및 알코올 디하이드로게나아제일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 미생물은 기탁번호 KCTC13040BP로 기탁된 대장균 SBA01 균주인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 (1) patZ , cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 돌연변이되어 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 돌연변이 미생물을 제조하는 단계;

(2) 상기 돌연변이 미생물에 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 도입한 형질전환 미생물을 제조하는 단계; 및

(3) 상기 형질전환 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

(2) 상기 돌연변이 미생물에 3-히드록시부티릴-COA 디하이드로게나아제, 3-히드록시부티릴-CoA 디하이드라타아제, 트랜스-에노일-CoA 리덕타아제 및 알데히드 및 알코올 디하이드로게나아제 유전자를 도입한 형질전환 미생물을 제조하는 단계; 및

(3) 상기 형질전환 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 부탄올의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 형질전환 미생물은 frdA , ldhA , adhE 및 pta로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 제거된 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 아세트산에 대한 대사 능력이 향상된 미생물은 아세트산을 유일 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있을 뿐만 아니라, 아세트산으로부터 부탄올과 같은 산업적으로 유용한 목적 물질의 제조에도 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 글루코오스 또는 아세트산와 같은 탄소원으로부터 아세틸-CoA를 거쳐 부탄올 합성경로에 이르는 과정의 유전자의 종류를 보여주는 도면이다.
도 2는 대장균의 아세트산 대사과정 중에서의 아세틸-CoA의 합성 경로 및 이에 관여하는 유전자의 종류를 보여주는 도면이다.
도 3은 대장균 MG1655 △ frdA △ ldhA △pta △ adhE 균주의 배양 단계별 성장 곡선을 나타내는 그래프로써, "G"는 계대배양 회차를 나타낸다.
도 4는 patZ 유전자가 추가로 제거(knock-out)된 돌연변이 대장균 MG1655 △frdA △ ldhA △pta △ adhE △ patZ 균주 및 본 발명의 대장균 SBA01 균주의 성장을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 대장균 SBA01 균주의 아세트산에 대한 내성 실험 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 대장균 SBA01 균주(실험군)와 대조군의 전사체 비교 분석을 수행하여 각각 발현양이 증감된 상위 유전자들의 목록을 보여주는 표이고, 도 6c는 대장균의 대사 회로에서 발현이 증감된 유전자를 맵핑하여 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 자연연형 대장균 MG1655, 대조군 DSM01 및 본 발명의 SBA01 균주의 세포내 ATP 함량을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 형광 단백질로 형질전환된 본 발명의 대장균 SBA01 균주의 아세트산 최소배지에서 성장 및 형광 단백질의 발현을 보여주는 그래프 및 사진이다.
도 9는 부탄올 생합성 관련 유전자가 도입된 본 발명의 대장균 SBA01 균주의 성장 및 아세테이트, 포르메이트 이용을 나타내는 그래프이다.
도 10은 부탄올 생합성 관련 유전자가 도입된 본 발명의 대장균 SBA01 균주에서의 아세트산 최소배지에서 발효한 후 발효 생성물의 GC 및 GC/MS 분석 결과 부탄올이 생성되었음을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 야생형 미생물에 patZ , cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 돌연변이되어 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 돌연변이 미생물을 제공한다. 상기 patZ , cspC , mukB , lomR 및 yhjE 유전자는 각각 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어지는 염기서열을 가질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

종래에는 아세트산을 유일 탄소원으로 이용하는 대장균 균주(Frank E. Dailey, et al., J. Bacteriol., 1986, 165(2), 453-460), 또는 patZ , cspC , mukB 또는 lomR 유전자가 돌연변이된 대장균 균주(Sara Castano-Cerezo, et al., Mol. Syst. Biol., 2014, 10, 762; Devashish Rath, et al., J. Bacteriol., 2006, 188(19), 6780-6785; Hironori Niki, et al., J. Bacteriol., 1986, 165(2), 453-460; Zhiqing SONG, et al., J. Radiat. Res., 2012, 53(6), 854-859)가 보고된 바 있으나, 상기 문헌들에는 상기 유전자들이 미생물, 바람직하게는 대장균에서 아세트산을 유일 탄소원으로 이용하는 것과 관련된 유전자임에 대해서는 개시 및 시사하고 있지 않다.

상기 patZ 유전자는 아세틸트랜스퍼라아제(acetyltransferase) 효소를 발현하고, cspC 유전자는 스트레스 단백질로서 MukB 저온 충격 단백질의 멀티카피 억제제를 발현하며, mukB 유전자는 염색체 파티션 단백질을 발현하고, lomR 유전자는 추정되는 외막 독성 단백질을 발현하며, yhjE 유전자는 내막 대사물 운반 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 돌연변이 미생물은 frdA , ldhA , adhE 및 pta로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 제거된 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 frdA , ldhA , adhE 및 pta 유전자는 각각 서열번호 6 내지 서열번호 9로 이루어지는 염기서열을 가질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 돌연변이의 결과로서 해당 유전자에 의해 발현되는 효소의 활성이 소실될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "돌연변이"란 용어는 유전정보가 기록된 DNA 분자가 여러가지 요인에 의하여 원래의 DNA와 그 서열이 달라지는 것을 의미하는 것으로서, 돌연변이가 일어나면 그 유전자에 의해 생산되는 단백질에 변화가 생기고, 이는 유전형질의 변화를 불러오게 되어, 해당 개체의 생물학적 특징 등에 변형시킬 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 돌연변이는 본 기술분야에서 돌연변이를 유발할 수 있는 것으로서 알려져 있는 임의의 화학적 수단 및/또는 물리적 수단을 미생물에 처리함으로써 도입될 수 있다. 상기 화학적 수단은 돌연변이를 유발하는 물질(돌연변이원)로써 유효한 구아니딘 유도체인 NTG(nitrosoguanidine), MMS(methyl methanesulfonate), EMS(ethyl methanesulfonate), 벤조피렌 등과 같은 화학물질을 들 수 있고, 상기 물리적 수단은 자외선, X-선, γ-선 등과 같은 방사선을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에서는 모균주로부터의 아세트산 적응 진화 실험을 통해 돌연변이 균주를 제조하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 patZ 유전자의 돌연변이는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 501번째 아미노산인 Trp가 Stop codon으로 돌연변이(Trp501Stop)된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 cspC 유전자의 돌연변이는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 58번째 아미노산인 Gln이 Stop codon으로 돌연변이(Gln58Stop)된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 mukB 유전자의 돌연변이는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 54번째 아미노산인 Asp가 Glu로 돌연변이(Asp54Glu)된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 lomR 유전자의 돌연변이는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 114번째 아미노산인 Pro가 Leu로 돌연변이(Pro114Leu)된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 yhjE 유전자의 돌연변이는 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 210번째 아미노산인 Ile가 Met로 돌연변이(Ile210Met)된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이 미생물은 patZ 유전자가 필수적으로 돌연변이되고, cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가적으로 돌연변이될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이 미생물은 patZ , cspC, mukB , lomR 및 yhjE의 5종의 유전자가 모두 돌연변이될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 미생물은 대장균일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이 미생물은 야생형 대장균 균주에 patZ , cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 돌연변이될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이 미생물은 야생형 대장균 균주에 patZ 유전자가 필수적으로 돌연변이되고, cspC , mukB, lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가적으로 돌연변이될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이 미생물은 야생형 대장균 균주에 patZ , cspC , mukB, lomR 및 yhjE의 5종의 유전자가 모두 돌연변이될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명자들은 상기 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 돌연변이 대장균 균주를 "대장균 SBA01" 균주로 명명하고, 2016년 6월 10일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호: KCTC13040BP).

본 발명의 한 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이 미생물은 부탄올의 생합성 관련 유전자가 추가로 도입되어 부탄올의 제조에 사용될 수 있다. 상기 부탄올의 생합성 관련 유전자는 3-히드록시부티릴-COA 디하이드로게나아제, 3-히드록시부티릴-CoA 디하이드라타아제, 트랜스-에노일-CoA 리덕타아제 및 알데히드 및 알코올 디하이드로게나아제일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은

(1) patZ , cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 돌연변이되어 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 돌연변이 미생물을 제조하는 단계;

또한, 본 발명은

(2) 상기 돌연변이 미생물에 3-히드록시부티릴-COA 디하이드로게나아제, 3-히드록시부티릴-CoA 디하이드라타아제, 트랜스-에노일-CoA 리덕타아제 및 알데히드 및 알코올 디하이드로게나아제 유전자를 도입한 형질전환 미생물을 제조하는 단계;

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 돌연변이 미생물은 frdA , ldhA , adhE 및 pta로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 제거되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 특별히 한정되는 것은 아니며, 예컨대, 산업적으로 유용한 임의의 재조합 단백질이 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이 미생물의 아세트산 대사능력 및 외래 단백질의 생산능력을 확인하기 위하여 대표적인 재조합 단백질의 하나로서 GFP(green fluorescent protein) 유전자를 도입한 형질전환 미생물을 제조한 결과, 상기 형질전환 미생물은 아세트산 최소 배지에서 외래 유래의 재조합 단백질인 GFP를 효과적으로 발현함을 확인하였다(도 8 참조).

본 발명에 있어서, 상기 배지는 세포 배양용으로 통상적으로 사용되는 임의의 배지가 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 배지는 질소원, 무기염류 등을 포함할 수 있고, 필요에 따라 생리활성물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 질소원으로는 펩톤 등의 단백질, 아미노산, 요소 등의 유기 질소원과 질산염, 암모늄염 등의 무기 질소원이 사용될 수 있고, 상기 무기염류에는 Na⁺, K⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Cl^- 등이 사용될 수 있으며, 상기 생리활성물질에는 비타민 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 배지에는 효모 추출물, 맥아(malt) 추출물 등이 포함될 수 있고, 세포 배양용으로 시판되는 RPMI(Rosewell Park Memorial Institute), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimum Essential Medium) 등의 배양 배지들도 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 탄소원으로는 아세트산, 전분, 포도당, 설탕 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 배양은 소정의 온도 및 pH 조건하에 행해질 수 있다. 상기 온도는 20 내지 50℃, 바람직하게는 25 내지 40℃, 보다 바람직하게는 28 내지 35℃일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 pH는 4 내지 9의 범위, 바람직하게는 5 내지 8의 범위일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 아세트산이 유일 탄소원 또는 혼합 탄소원으로 제공되는 경우에 있어서의 아세트산의 효율적인 이용이 가능한 미생물, 바람직하게는 대장균 균주를 제공한다. 이를 위하여, 본 발명의 한 구현예에서는 아세트산 대사 촉진을 위한 진화 실험을 수행하여 아세트산 대사 능력이 향상된 진화 미생물을 분리 동정, 특성을 확인하고, 아세트산 대사 능력이 향상된 미생물, 바람직하게는 대장균을 활용한 재조합 단백질 또는 유용 화합물 생산성을 확인하였다.

본 발명의 한 구현예에서는 대장균에서의 아세트산 진화 실험을 통해 아세트산의 대사 능력이 향상된 대장균 균주를 분리 동정하였고(도 3 참조), 이 돌연변이 대장균 균주의 전체 유전자 서열 분석을 통해 유전학적 변화를 조사하였으며, 아미노산 서열에 있어서의 변화가 일어난 5종의 유전자를 확인하였다(표 2 참조). 또한, 분리된 대장균 균주를 이용하여 아세트산 유일 탄소원으로부터 형광 단백질 또는 바이오연료인 부탄올을 생산함으로써 개발한 대장균 균주의 응용 예를 제공하였다(도 8 내지 도 10 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 대장균 MG1655 △ frdA △ ldhA △pta △ adhE 균주의 아세트산 대사능력 개선

본 발명에서 사용한 대장균 MG1655 △ frdA △ ldhA △pta △ adhE 균주(Jang-mi Baek et al., Biotechnology and bioengineering, 2013, 110(10), 2790-2794) 는 숙신산, 젖산, 아세트산, 알코올 생산 대사회로 중 각각 frdA, ldhA, pta, adhE 유전자가 제거된 대장균 균주로서, 글루코오스 등과 같은 탄소원으로부터 아세틸-CoA를 다량으로 생산할 수 있도록 개량된 균주이다(도 1). 대장균의 경우 아세트산을 탄소원으로 이용하여 성장하기 위해서는 도 2에 나타낸 두 가지 경로를 통해 아세트산으로부터 아세틸-CoA를 합성한 후 성장에 필요한 에너지를 합성하여 성장하게 된다.

본 발명에서 사용한 대장균 MG1655 △ frdA △ ldhA △pta △ adhE 균주는 유일 탄소원으로 제공되는 아세트산의 대사 효율이 매우 낮아 외부로부터 제공되는 아세트산의 효율적인 이용이 불가능하였고, 이에 따라 본 발명자들은 상기 대장균 균주의 아세트산 대사 능력을 개선하기 위하여 상기 미생물의 아세트산 적응 진화 실험을 통해 아세트산 대사 능력이 향상된 미생물을 선별하였다.

실시예 2. 대장균 MG1655 △ frdA △ ldhA △pta △ adhE 균주의 아세트산 적응 진화 실험

아세트산 적응 진화 실험을 위하여, 표 1에 기재된 아세트산 최소 배지에 대장균 MG1655 △ frdA △ ldhA △pta △ adhE 균주를 배양하여 성장 속도의 변화를 측정하였다. 이를 위하여, 100㎖의 아세트산 최소 배지에 LB 배지에서 배양된 상기 대장균 균주를 1% 접종하여 37℃, 200rpm의 조건으로 진탕배양기를 이용하여 배양하였다. 또한, 배양 시작 후 미생물의 후기지수성장기(late exponential phase)에서 새로운 배지에 계대배양을 반복 수행하였으며, 각 반복 회차마다 매 12시간 간격으로 600nm에서 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하여 대장균의 성장을 조사하였다.

아세트산 최소 배지의 조성

성분	함량
M9 염 용액(10X)	100 ㎖
Na₂HPO₄-2H₂O	33.7 mM
KH₂PO₄	22.0 mM
NaCl	8.55 mM
NH₄Cl	9.35 mM
1 M MgSO ₄ -7H ₂ O	1 ㎖
1 M CaCl ₂	0.3 ㎖
미량 원소 용액(100X)	10 ㎖
EDTA	13.4 mM
FeCl₃-6H₂O	3.1 mM
ZnCl₂	0.62 mM
CuCl₂-2H₂O	76 μM
CoCl₂-2H₂O	42 μM
H₃BO₃	162 μM
MnCl₂-4H₂O	8.1 μM
1 M 나트륨 아세트산	50 ㎖
멸균수	837.7 ㎖
합계	1,000 ㎖

대장균 MG1655 △ frdA △ ldhA △pta △ adhE 균주의 1차 배양 결과, 배양 시간 192시간 후 0.312의 흡광도를 나타내었다. 1차 배양액 1%를 새로운 아세트산 최소 배지에 접종하여 동일 시간(192시간) 동안 2차 배양을 수행한 결과, 0.455 흡광도를 나타내어 해당 균주의 성장속도가 소폭 증가하였음을 확인하였다. 상기와 동일한 방법으로 각 배양 단계에서 후기지수성장기의 배양액을 새로운 배지에 접종하여 총 10회의 계대배양을 수행하였다.

총 10회의 계대배양 결과, 반복 회차에 따라 대장균의 성장 속도가 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 구체적으로는 계대배양 초기(G1-G3)의 경우 대장균 성장속도가 소폭 증가하였으나, 계대배양 중반(G4-G6)의 경우 배양 50시간 이후부터 지수성장을 시작하여 최종 흡광도 약 0.9까지 대장균의 성장 속도가 증가되었다. 이후, 계대배양 G7-G9 단계를 거치면서 대장균의 성장 속도가 지속적으로 증가되었고, 최종 10회 반복(G10) 단계에서 배양 60시간 후 흡광도가 1.66을 나타내었다. 즉, 대장균 MG1655 △ frdA △ ldhA △pta △ adhE 균주의 아세트산 적응 진화 실험 결과, 미생물의 성장이 0.312에서 1.66으로 급격히 증가됨을 확인하였다(도 3).

실시예 3. 전체 게놈 유전자 분석

상기 실시예 2에서 회수한 대장균(실험군)의 전체 유전자 염기서열을 해독하기 위하여, 상기 균주를 배양용 아세트산 최소 배지에 1% 접종하고, 37℃, 200rpm의 조건으로 60시간 동안 배양하였다. 회수된 균주로부터 분리된 게놈 DNA 전체 유전자 서열을 분석하였고, 최종적으로 아세트산을 유일 탄소원으로 성장할 수 있는 돌연변이 균주를 대장균 SBA01이라 명명하였으며, 2016년 6월 20일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 13040BP).

실험에 사용한 대조군 대장균 MG1655 △ frdA △ ldhA △pta △ adhE 균주와 아세트산 적응 진화를 통해 선별한 본 발명의 대장균 SBA01 균주의 전체 유전자 서열을 비교한 결과, patZ(pka, acetyltransferase), cspC(stress protein, multicopy suppressor of mukB cold shock protein), mukB(Chromosome partition protein), lomR(putative outer membrane virulence protein) 및 yhjE(Inner membrane metabolite transport protein)의 5종의 유전자가 코딩하는 단백질의 아미노산 서열의 변화가 확인되었다(표 2).

대장균 SBA01의 돌연변이 유전자

유전자	기능	서열 변화
patZ	acetyltransferase	Trp501Stop (G→A)
cspC	stress protein, multicopy suppressor of mukB cold shock protein	Gln58Stop (G→A)
mukB	Chromosome partition protein	Asp54Glu (C→A)
lomR	putative outer membrane virulence protein	Pro114Leu (C→T)
yhjE	Inner membrane metabolite transport protein	Ile210Met (T→G)

실시예 4. patZ 결실 균주의 제조 및 아세트산 배지에서의 성장 비교

실시예 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 대장균 SBA01 균주의 전체 유전자 염기서열 분석 결과, 아세트산 대사과정 중 아세틸-CoA 신타아제(synthase)(ACS)의 아세틸화에 관여하는 patZ(ack) 유전자의 아미노산 서열의 돌연변이를 확인하였다. 이에, 상기 patZ 유전자가 대장균의 아세트산 대사 과정에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 대조군 대장균 MG1655 △ frdA △ ldhA △pta △adhE 의 게놈에 존재하는 patZ 유전자를 제거한 후 아세트산 최소 배지에서 배양함으로써 본 발명의 대장균 SBA01 균주와의 성장을 비교하였다.

그 결과, 본 발명의 대장균 SBA01 균주의 경우 대조군 대비 성장 속도가 약 22배 증가된 것과 대조적으로, 대장균 MG1655 △ frdA △ ldhA △pta △ adhE 균주에서 patZ 유전자만을 추가로 제거한 미생물의 경우에는 대조군 대비 성장 속도가 7배 증가되었다(도 4). 상기 결과로부터, 아세트산의 효과적인 이용을 위해서는 patZ 유전자뿐만 아니라 cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 상기 4종의 유전자가 모두 돌연변이되는 복합적인 효과에 의해 아세트산 유일 탄소원 하에서의 SBA01 균주의 성장 속도가 매우 높아진 것임을 확인하였다.

실시예 5. 본 발명의 대장균 SBA01 균주의 아세트산에 대한 내성 실험

본 발명의 대장균 SBA01 균주의 아세트산에 대한 내성 실험을 수행하였다. 이를 위하여, 표 1에 기재된 아세트산 최소 배지의 아세트산 농도를 각각 10, 20, 100, 150, 200 및 250 mM로 조정한 후, 각각의 배지에 대장균 SBA01 균주 1%를 접종하여 37℃, 200 rpm의 조건으로 진탕배양기를 이용하여 배양하였다. 각 반복 회차마다 매 6시간 간격으로 600 nm에서 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하여 대장균의 성장을 조사하였다.

그 결과, 본 발명의 대장균 SBA01 균주는 50 mM 아세트산이 포함된 배지에서 가장 높은 성장도를 나타내었고, 100 mM 및 150 mM 아세트산이 포함된 배지에서도 성장이 우수한 것으로 측정되었으며, 200 mM 이상의 아세트산이 포함된 배지에서는 성장이 감소되었다(도 5). 상기 결과로부터, 본 발명의 SBA01 균주는 아세트산의 효과적인 이용뿐만 아니라 고농도의 아세트산에 대한 내성이 증가되었음을 확인하였다.

실시예 6. 본 발명의 대장균 SBA01 균주의 전사체 비교 분석

본 발명의 대장균 SBA01 균주(실험군)와 대조군의 전사체 비교 분석을 수행하였다. 이를 위하여 본 발명의 SBA01(실험군) 및 대조군 균주를 글루코오스 0.4%가 포함된 최소 배지에서 각각 1%를 접종한 후, 37℃, 200 rpm의 조건으로 배양한 흡광도가 1.0 일 때 균주를 회수하였다. 회수한 실험군과 대조군 균주로부터 각각 mRNA를 추출하였고, 추출한 각각의 mRNA를 이용하여 RNA-SEQ 분석을 수행하였다(TruSeqStranded mRNA Sample Preparation Protocol). 상기 RNA-SEQ 분석의 경우 통상적으로 완전한 게놈 염기서열에 전사체 염기서열을 맵핑하여 발현양을 비교하지만, 본 발명에서는 대조군과 실험군의 발현양을 비교하여 아세트산에 대한 실험군의 발현양 증감을 분석하였다. 그 결과, mRNA의 발현량이 증가된 상위 28개의 유전자와 mRNA의 발현량이 감소된 상위 26개의 유전자 정보를 확인하였다(도 6a 및 도 6b).

또한, 대장균의 대사 회로에서 증감된 유전자를 맵핑하여 비교한 결과를 도 6c에 나타내었다. 그 결과, 발현량이 증가된 대사 회로의 유전자로는 아세테이트를 아세틸-CoA롤 전환하는 아세틸-CoA 신타아제가 약 7.05배 증가하였고, 세포내 ATP 합성에 관여하는 F1F0 ATP 신타아제 5.62배, 전자 전달계에 관여하는 시토크롬 bo3 5.79배가 증가되었다. 또한, TCA 회로를 구성하는 유전자인 시트레이트 신타아제, 아코니트라아제, 이소시트레이트 디히드로게나아제, α-케토글루타레이트 디히드로게나아제, 숙시닐-CoA 신타아제, 푸마라아제, 말레이트 디히드로게나아제, 이소시트레이트 라이아제의 발현량이 2.0에서 6.19배 증가되었다. 이와 대조적으로, 구리 이온의 세포내로 배출하는 구리 방출 펌프에 관여하는 유전자는 5.48배 감소되었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 SBA01 균주는 대조군 균주 대비 아세트산의 아세틸-CoA 전환, ATP 합성, TCA 회로(NADH 합성)에 관여하는 유전자의 발현량이 증가되었음을 확인하였다.

실시예 7. 세포내 ATP 함량 측정

세포 내 ATP 함량을 측정하기 위하여 자연형 대장균 MG1655, 대조군 DSM01 및 본 발명의 SBA01 균주를 글루코오스 0.4%가 포함된 최소 배지에서 각각 1%를 접종하였고, 37℃, 200 rpm의 조건으로 배양한 흡광도가 1.0 일 때 균주를 회수하였다. 회수한 균주를 시그마 사의 ATP 분석 키트를 활용하여 세포내 ATP 양을 측정하였다.

그 결과, 자연형 균주는 0.3264±0.0776 nmol/㎕, 대조군 DSM01 균주는 0.3031±0.0346 nmol/㎕, 본 발명의 SBA01 균주는 0.4814±0.0544 nmol/㎕의 ATP가 측정되어, 본 발명의 SBA01 균주의 경우 대조군 대비 세포내 ATP 함량이 약 40% 증가되었음을 확인하였다(도 7). 실시예 6의 전사체 분석 결과 및 상기의 ATP 함량 측정의 결과로부터, 본 발명의 SBA01 균주는 세포내 ATP 합성 효율이 대조군에 비해 증가되었음을 확인하였다.

실시예 8. GFP 단백질의 발현

대장균 SBA01 균주의 아세트산 대사능력 및 외래 단백질의 생산능력을 확인하기 위하여 대표적인 재조합 단백질의 하나인 GFP의 발현 여부를 관찰하였다. 이를 위하여, 대장균 내에서 형광 단백질의 발현이 가능하도록 제작된 pUCBB-eGFP 벡터를 본 발명의 대장균 SBA01 균주에 형질전환시킨 후, 각각의 균들을 아세트산 최소 배지에 48시간 동안 배양시키고, 글리세롤 농도가 10%가 되게 보관용 균액으로 만든 다음 -80℃에서 배양실험 때까지 저장하였다. 상기 보관용 균액 1㎖을 250㎖ 플라스크에 들어있는 앰피실린(50㎍/㎖)이 첨가된 50㎖의 아세트산 최소 배지에 접종하여 48시간 동안 배양한 후, 형광광학측정기(fluorescence spectrophotometer)를 이용하여 조사(excitation) 395 ㎚, 방출(emission) 509 ㎚의 조건에서 형광을 측정하였다.

그 결과, 대조군의 경우 균체의 성장이 거의 이루어지지 않은 반면, 본 발명의 SBA01 균주는 600nm에서 2.0의 흡광도를 나타내는 것으로 보아 형광 단백질이 발현됨을 확인하였다(도 8).

실시예 9. 바이오 부탄올의 생산

실시예 8에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 대장균 SBA01 균주는 아세트산를 기질로 이용하여 재조합 단백질의 합성이 가능함을 확인하였다. 이와 더불어 본 발명의 대장균 SBA01 균주를 이용한 고부가 화학물질의 생산 가능성을 확인하기 위하여, 상기 대장균 SBA01 균주에 부탄올 합성 대사회로를 도입하여 부탄올 합성 여부를 확인하였다. 부탄올 합성 대사회로는 Clostridium acetobutylicum 및 Treponema denticola 유래의 아세틸-CoA 및 부티릴-CoA 합성 경로에 관여하는 4종의 효소인 3-히드록시부티릴-CoA 디하이드로게나아제, 3-히드록시부티릴-CoA 디하이드라타아제, 트랜스-에노일-CoA 리덕타아제 및 알데히드 및 알코올 디하이드로게나아제를 이용하여 재조합 벡터를 구성하였다. 또한, 부탄올 합성경로에서 필요한 NADH의 공급을 위하여 포르메이트 디하이드로게나아제의 발현이 가능한 벡터를 추가로 구성하였다. 상기 두 가지 벡터를 본 발명의 SBA01 균주에 형질전환시킨 후, 각각의 균들을 아세트산 최소 배지에 48시간 동안 배양하였고, 글리세롤 농도가 10%가 되게 보관용 균액으로 만든 후, -80℃에서 배양실험 때까지 저장하였다.

부탄올 발효는 아세트산 최소 배지가 포함된 1 L 발효기를 이용하였다. 배양용 아세트산 최소 배지에 형질전환된 대장균 SBA01 균주를 1% 접종하여 37℃, 200 rpm의 조건으로 94시간 동안 배양하였다. 배양 초기 24시간은 호기성 상태를 유지하기 위하여 1vvm의 속도로 공기를 주입한 후, 배양 24시간 이후 0.02vvm으로 공기 주입량을 줄여 반혐기성 조건을 조성하였다. 형질전환된 대장균 SBA01 균주의 생장 곡선을 도 9에 나타내었다.

배양 종료 후 배양액 내 부탄올의 농도를 측정하기 위하여 가스크로마토그래피(GC) 분석을 수행한 결과, 11.1 ㎎/L의 부탄올을 생산하였으며, 동일 시료를 GC/MS 분석한 결과 생산된 물질이 부탄올임을 확인하였다(도 10).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Microorganism Capable of Using Acetic Acid as Sole Carbon Source <130> 2017-DPA-2419 <150> KR 10-2016-0123301 <151> 2016-09-26 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2661 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgagtcagc gaggactgga agcactactg cgaccaaaat cgatagcggt aattggcgcg 60 tcgatgaaac ccaatcgcgc aggttacctg atgatgcgta acctgctggc gggaggcttt 120 aacggaccgg tactcccggt gacgccagcc tggaaagcgg tgttgggtgt gttggcctgg 180 ccggatattg ccagcttgcc ctttacaccc gaccttgcgg ttttatgtac caatgccagc 240 cgtaatcttg ctcttctgga agagctcggc gagaaaggct gtaaaacctg cattattctt 300 tccgccccgg catcgcaaca cgaagatctc cgcgcctgcg ccctgcgcca taacatgcgc 360 ctgcttggac caaacagtct gggtttactg gctccctggc aaggtctgaa tgccagcttt 420 tcgcctgtgc cgattaaacg cggcaagctg gcgtttattt cgcaatcggc tgccgtctcc 480 aacaccatcc tcgactgggc gcaacagcgt aagatgggct tttcctactt tattgcgctc 540 ggcgacagcc tggatatcga cgttgatgaa ttgcttgact atctggcacg cgacagtaaa 600 accagcgcca 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Ser Ala Pro Ala Ser Gln His Glu Asp Leu Arg Ala 100 105 110 Cys Ala Leu Arg His Asn Met Arg Leu Leu Gly Pro Asn Ser Leu Gly 115 120 125 Leu Leu Ala Pro Trp Gln Gly Leu Asn Ala Ser Phe Ser Pro Val Pro 130 135 140 Ile Lys Arg Gly Lys Leu Ala Phe Ile Ser Gln Ser Ala Ala Val Ser 145 150 155 160 Asn Thr Ile Leu Asp Trp Ala Gln Gln Arg Lys Met Gly Phe Ser Tyr 165 170 175 Phe Ile Ala Leu Gly Asp Ser Leu Asp Ile Asp Val Asp Glu Leu Leu 180 185 190 Asp Tyr Leu Ala Arg Asp Ser Lys Thr Ser Ala Ile Leu Leu Tyr Leu 195 200 205 Glu Gln Leu Ser Asp Ala Arg Arg Phe Val Ser Ala Ala Arg Ser Ala 210 215 220 Ser Arg Asn Lys Pro Ile Leu Val Ile Lys Ser Gly Arg Ser Pro Ala 225 230 235 240 Ala Gln Arg Leu Leu Asn Thr Thr Ala Gly Met Asp Pro Ala Trp Asp 245 250 255 Ala Ala Ile Gln Arg Ala Gly Leu Leu Arg Val Gln Asp Thr His Glu 260 265 270 Leu Phe Ser Ala Val Glu Thr Leu Ser His Met Arg Pro Leu Arg Gly 275 280 285 Asp Arg Leu Met Ile Ile Ser Asn Gly Ala Ala Pro Ala Ala Leu Ala 290 295 300 Leu Asp Ala Leu Trp 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Tyr Pro Val Ala Leu Lys Leu Arg Ser Pro Asp 515 520 525 Ile Pro His Lys Ser Glu Val Gln Gly Val Met Leu Tyr Leu Arg Thr 530 535 540 Ala Asn Glu Val Gln Gln Ala Ala Asn Ala Ile Phe Asp Arg Val Lys 545 550 555 560 Met Ala Trp Pro Gln Ala Arg Val His Gly Leu Leu Val Gln Ser Met 565 570 575 Ala Asn Arg Ala Gly Ala Gln Glu Leu Arg Val Val Val Glu His Asp 580 585 590 Pro Val Phe Gly Pro Leu Ile Met Leu Gly Glu Gly Gly Val Glu Trp 595 600 605 Arg Pro Glu Asp Gln Ala Val Val Ala Leu Pro Pro Leu Asn Met Asn 610 615 620 Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Ile Lys Ser Lys Lys Ile Arg 625 630 635 640 Ala Arg Ser Ala Leu Arg Pro Leu Asp Val Ala Gly Leu Ser Gln Leu 645 650 655 Leu Val Gln Val Ser Asn Leu Ile Val Asp Cys Pro Glu Ile Gln Arg 660 665 670 Leu Asp Ile His Pro Leu Leu Ala Ser Gly Ser Glu Phe Thr Ala Leu 675 680 685 Asp Val Thr Leu Asp Ile Ser Pro Phe Glu Gly Asp Asn Glu Ser Arg 690 695 700 Leu Ala Val Arg Pro Tyr Pro His Gln Leu Glu Glu Trp Val Glu Leu 705 710 715 720 Lys Asn Gly Glu Arg Cys Leu Phe Arg Pro Ile Leu Pro Glu Asp Glu 725 730 735 Pro Gln Leu Gln Gln Phe Ile Ser Arg Val Thr Lys Glu Asp Leu Tyr 740 745 750 Tyr Arg Tyr Phe Ser Glu Ile Asn Glu Phe Thr His Glu Asp Leu Ala 755 760 765 Asn Met Thr Gln Ile Asp Tyr Asp Arg Glu Met Ala Phe Val Ala Val 770 775 780 Arg Arg Ile Asp Gln Thr Glu Glu Ile Leu Gly Val Thr Arg Ala Ile 785 790 795 800 Ser Asp Pro Asp Asn Ile Asp Ala Glu Phe Ala Val Leu Val Arg Ser 805 810 815 Asp Leu Lys Gly Leu Gly Leu Gly Arg Arg Leu Met Glu Lys Leu Ile 820 825 830 Thr Tyr Thr Arg Asp His Gly Leu Gln Arg Leu Asn Gly Ile Thr Met 835 840 845 Pro Asn Asn Arg Gly Met Val Ala Leu Ala Arg Lys Leu Gly Phe Asn 850 855 860 Val Asp Ile Gln Leu Glu Glu Gly Ile Val Gly Leu Thr Leu Asn Leu 865 870 875 880 Ala Gln Arg Glu Glu Ser 885 <210> 11 <211> 69 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 11 Met Ala Lys Ile Lys Gly Gln Val Lys Trp Phe Asn Glu Ser Lys Gly 1 5 10 15 Phe Gly Phe Ile Thr Pro Ala Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val His 20 25 30 Phe Ser Ala Ile Gln Gly Asn Gly Phe Lys Thr Leu Ala Glu Gly Gln 35 40 45 Asn Val Glu Phe Glu Ile Gln Asp Gly Gln Lys Gly Pro Ala Ala Val 50 55 60 Asn Val Thr Ala Ile 65 <210> 12 <211> 1486 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 12 Met Ile Glu Arg Gly Lys Phe Arg Ser Leu Thr Leu Ile Asn Trp Asn 1 5 10 15 Gly Phe Phe Ala Arg Thr Phe Asp Leu Asp Glu Leu Val Thr Thr Leu 20 25 30 Ser Gly Gly Asn Gly Ala Gly Lys Ser Thr Thr Met Ala Ala Phe Val 35 40 45 Thr Ala Leu Ile Pro Asp Leu Thr Leu Leu His Phe Arg Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Arg Asp Lys Gly Leu His Gly Lys 65 70 75 80 Leu Lys Ala Gly Val Cys Tyr Ser Met Leu Asp Thr Ile Asn Ser Arg 85 90 95 His Gln Arg Val Val Val Gly Val Arg Leu Gln Gln Val Ala Gly Arg 100 105 110 Asp Arg Lys Val Asp Ile Lys Pro Phe Ala Ile Gln Gly Leu Pro Met 115 120 125 Ser Val Gln Pro Thr Gln Leu Val Thr Glu Thr Leu Asn Glu Arg Gln 130 135 140 Ala Arg Val Leu Pro Leu Asn Glu Leu Lys Asp Lys Leu Glu Ala Met 145 150 155 160 Glu Gly Val Gln Phe Lys Gln Phe Asn Ser Ile Thr Asp Tyr His Ser 165 170 175 Leu Met Phe Asp Leu Gly Ile Ile Ala Arg Arg Leu Arg Ser Ala Ser 180 185 190 Asp Arg Ser Lys Phe Tyr Arg Leu Ile Glu Ala Ser Leu Tyr Gly Gly 195 200 205 Ile Ser Ser Ala Ile Thr Arg Ser Leu Arg Asp Tyr Leu Leu Pro Glu 210 215 220 Asn Ser Gly Val Arg Lys Ala Phe Gln Asp Met Glu Ala Ala Leu Arg 225 230 235 240 Glu Asn Arg Met Thr Leu Glu Ala Ile Arg Val Thr Gln Ser Asp Arg 245 250 255 Asp Leu Phe Lys His Leu Ile Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Val Ala Ala 260 265 270 Asp Tyr Met Arg His Ala Asn Glu Arg Arg Val His Leu Asp Lys Ala 275 280 285 Leu Glu Phe Arg Arg Glu Leu His Thr Ser Arg Gln Gln Leu Ala Ala 290 295 300 Glu Gln Tyr Lys His Val Asp Met Ala Arg Glu Leu Ala Glu His Asn 305 310 315 320 Gly Ala Glu Gly Asp Leu Glu Ala Asp Tyr Gln Ala Ala Ser Asp His 325 330 335 Leu Asn Leu Val Gln Thr Ala Leu Arg Gln Gln Glu Lys Ile Glu Arg 340 345 350 Tyr Glu Ala Asp Leu Asp Glu Leu Gln Ile Arg Leu Glu Glu Gln Asn 355 360 365 Glu Val Val Ala Glu Ala Ile Glu Arg Gln Gln Glu Asn Glu Ala Arg 370 375 380 Ala Glu Ala Ala Glu Leu Glu Val Asp Glu Leu Lys Ser Gln Leu Ala 385 390 395 400 Asp Tyr Gln Gln Ala Leu Asp Val Gln Gln Thr Arg Ala Ile Gln Tyr 405 410 415 Asn Gln Ala Ile Ala Ala Leu Asn Arg Ala Lys Glu Leu Cys His Leu 420 425 430 Pro Asp Leu Thr Ala Asp Cys Ala Ala Glu Trp Leu Glu Thr Phe Gln 435 440 445 Ala Lys Glu Leu Glu Ala Thr Glu Lys Met Leu Ser Leu Glu Gln Lys 450 455 460 Met Ser Met Ala Gln Thr Ala His Ser Gln Phe Glu Gln Ala Tyr Gln 465 470 475 480 Leu Val Val Ala Ile Asn Gly Pro Leu Ala Arg Asn Glu Ala Trp Asp 485 490 495 Val Ala Arg Glu Leu Leu Arg Glu Gly Val Asp Gln Arg His Leu Ala 500 505 510 Glu Gln Val Gln Pro Leu Arg Met Arg Leu Ser Glu Leu Glu Gln Arg 515 520 525 Leu Arg Glu Gln Gln Glu Ala Glu Arg Leu Leu Ala Asp Phe Cys Lys 530 535 540 Arg Gln Gly Lys Asn Phe Asp Ile Asp Glu Leu Glu Ala Leu His Gln 545 550 555 560 Glu Leu Glu Ala Arg Ile Ala Ser Leu Ser Asp Ser Val Ser Asn Ala 565 570 575 Arg Glu Glu Arg Met Ala Leu Arg Gln Glu 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Val Leu Ser Glu Arg 785 790 795 800 Phe Ala Thr Leu Ser Phe Asp Val Gln Lys Thr Gln Arg Leu His Gln 805 810 815 Ala Phe Ser Arg Phe Ile Gly Ser His Leu Ala Val Ala Phe Glu Ser 820 825 830 Asp Pro Glu Ala Glu Ile Arg Gln Leu Asn Ser Arg Arg Val Glu Leu 835 840 845 Glu Arg Ala Leu Ser Asn His Glu Asn Asp Asn Gln Gln Gln Arg Ile 850 855 860 Gln Phe Glu Gln Ala Lys Glu Gly Val Thr Ala Leu Asn Arg Ile Leu 865 870 875 880 Pro Arg Leu Asn Leu Leu Ala Asp Asp Ser Leu Ala Asp Arg Val Asp 885 890 895 Glu Ile Arg Glu Arg Leu Asp Glu Ala Gln Glu Ala Ala Arg Phe Val 900 905 910 Gln Gln Phe Gly Asn Gln Leu Ala Lys Leu Glu Pro Ile Val Ser Val 915 920 925 Leu Gln Ser Asp Pro Glu Gln Phe Glu Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Ala 930 935 940 Tyr Ser Gln Gln Met Gln Arg Asp Ala Arg Gln Gln Ala Phe Ala Leu 945 950 955 960 Thr Glu Val Val Gln Arg Arg Ala His Phe Ser Tyr Ser Asp Ser Ala 965 970 975 Glu Met Leu Ser Gly Asn Ser Asp Leu Asn Glu Lys Leu Arg Glu Arg 980 985 990 Leu Glu Gln Ala Glu Ala Glu Arg Thr Arg Ala 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Ile Ile Arg Thr Asp Asp Pro Val Glu Ala Ile Glu Gln Met Glu 1205 1210 1215 Ile Glu Leu Ser Arg Leu Thr Glu Glu Leu Thr Ser Arg Glu Gln Lys 1220 1225 1230 Leu Ala Ile Ser Ser Arg Ser Val Ala Asn Ile Ile Arg Lys Thr Ile 1235 1240 1245 Gln Arg Glu Gln Asn Arg Ile Arg Met Leu Asn Gln Gly Leu Gln Asn 1250 1255 1260 Val Ser Phe Gly Gln Val Asn Ser Val Arg Leu Asn Val Asn Val Arg 1265 1270 1275 1280 Glu Thr His Ala Met Leu Leu Asp Val Leu Ser Glu Gln His Glu Gln 1285 1290 1295 His Gln Asp Leu Phe Asn Ser Asn Arg Leu Thr Phe Ser Glu Ala Leu 1300 1305 1310 Ala Lys Leu Tyr Gln Arg Leu Asn Pro Gln Ile Asp Met Gly Gln Arg 1315 1320 1325 Thr Pro Gln Thr Ile Gly Glu Glu Leu Leu Asp Tyr Arg Asn Tyr Leu 1330 1335 1340 Glu Met Glu Val Glu Val Asn Arg Gly Ser Asp Gly Trp Leu Arg Ala 1345 1350 1355 1360 Glu Ser Gly Ala Leu Ser Thr Gly Glu Ala Ile Gly Thr Gly Met Ser 1365 1370 1375 Ile Leu Val Met Val Val Gln Ser Trp Glu Asp Glu Ser Arg Arg Leu 1380 1385 1390 Arg Gly Lys Asp Ile Ser Pro Cys Arg Leu Leu Phe Leu Asp Glu Ala 1395 1400 1405 Ala Arg Leu Asp Ala Arg Ser Ile Ala Thr Leu Phe Glu Leu Cys Glu 1410 1415 1420 Arg Leu Gln Met Gln Leu Ile Ile Ala Ala Pro Glu Asn Ile Ser Pro 1425 1430 1435 1440 Glu Lys Gly Thr Thr Tyr Lys Leu Val Arg Lys Val Phe Gln Asn Thr 1445 1450 1455 Glu His Val His Val Val Gly Leu Arg Gly Phe Ala Pro Gln Leu Pro 1460 1465 1470 Glu Thr Leu Pro Gly Thr Asp Glu Ala Pro Ser Gln Ala Ser 1475 1480 1485 <210> 13 <211> 132 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 13 Phe Ser Tyr Ala Gly Asp Lys Asn Arg Gln Leu Thr Arg Tyr Ser Asp 1 5 10 15 Thr Arg Trp His Glu Asp Ser Val Arg Asn Arg Trp Phe Ser Val Met 20 25 30 Val Gly Pro Ser Val Arg Val Asn Glu Trp Phe Ser Ala Tyr Ala Met 35 40 45 Ala Gly Met Ala Tyr Ser Arg Val Ser Thr Phe Ser Gly Asp Tyr Leu 50 55 60 Arg Val Thr Asp Asn Lys Lys Gly Lys Thr His Asp Val Leu Thr Gly 65 70 75 80 Ser Asp Asp Gly Arg His Ser Asn Thr Ser Leu Ala Trp Gly Ala Gly 85 90 95 Val Gln Phe Asn Pro Thr Glu Ser Val Ala Ile Asp Ile Ala Tyr Glu 100 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Gly Thr Phe Leu Leu Leu Ser Trp Leu Leu Thr Asp Glu Gln 180 185 190 Phe Met Ser Trp Gly Trp Arg Val Pro Phe Ile Phe Ser Ala Val Leu 195 200 205 Val Ile Ile Gly Leu Tyr Val Arg Val Ser Leu His Glu Ser Pro Val 210 215 220 Phe Glu Lys Val Ala Lys Ala Lys Lys Gln Val Lys Ile Pro Leu Gly 225 230 235 240 Thr Leu Leu Thr Lys His Val Arg Val Thr Val Leu Gly Thr Phe Ile 245 250 255 Met Leu Ala Thr Tyr Thr Leu Phe Tyr Ile Met Thr Val Tyr Ser Met 260 265 270 Thr Phe Ser Thr Ala Ala Ala Pro Val Gly Leu Gly Leu Pro Arg Asn 275 280 285 Glu Val Leu Trp Met Leu Met Met Ala Val Ile Gly Phe Gly Val Met 290 295 300 Val Pro Val Ala Gly Leu Leu Ala Asp Ala Phe Gly Arg Arg Lys Ser 305 310 315 320 Met Val Ile Ile Thr Thr Leu Ile Ile Leu Phe Ala Leu Phe Ala Phe 325 330 335 Asn Pro Leu Leu Gly Ser Gly Asn Pro Ile Leu Val Phe Ala Phe Leu 340 345 350 Leu Leu Gly Leu Ser Leu Met Gly Leu Thr Phe Gly Pro Met Gly Ala 355 360 365 Leu Leu Pro Glu Leu Phe Pro Thr Glu Val Arg Tyr Thr Gly Ala Ser 370 375 380 Phe Ser Tyr Asn Val Ala Ser Ile Leu Gly Ala Ser Val Ala Pro Tyr 385 390 395 400 Ile Ala Ala Trp Leu Gln Thr Asn Tyr Gly Leu Gly Ala Val Gly Leu 405 410 415 Tyr Leu Ala Ala Met Ala Gly Leu Thr Leu Ile Ala Leu Leu Leu Thr 420 425 430 His Glu Thr Arg His Gln Ser Leu 435 440

Claims

야생형 미생물에 patZ , cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 돌연변이되어 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 돌연변이 미생물.
청구항 1에 있어서,
patZ 유전자가 필수적으로 돌연변이되고, cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가적으로 돌연변이된 돌연변이 미생물.
청구항 1에 있어서,
patZ , cspC , mukB , lomR 및 yhjE의 5종의 유전자가 모두 돌연변이된 돌연변이 미생물.
청구항 1에 있어서,
상기 patZ , cspC , mukB , lomR 및 yhjE 유전자는 각각 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어지는 염기서열을 갖는 돌연변이 미생물.
청구항 1에 있어서,
frdA , ldhA , adhE 및 pta로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 제거된 돌연변이 미생물.
청구항 5에 있어서,
상기 frdA , ldhA , adhE 및 pta 유전자는 각각 서열번호 6 내지 서열번호 9로 이루어지는 염기서열을 갖는 돌연변이 미생물.
청구항 1에 있어서,
상기 patZ 유전자의 돌연변이는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 501번째 아미노산인 Trp가 Stop codon으로 돌연변이(Trp501Stop)되고, 상기 cspC 유전자의 돌연변이는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 58번째 아미노산인 Gln이 Stop codon으로 돌연변이(Gln58Stop)되고, 상기 mukB 유전자의 돌연변이는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 54번째 아미노산인 Asp가 Glu로 돌연변이(Asp54Glu)되고, 상기 lomR 유전자의 돌연변이는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 114번째 아미노산인 Pro가 Leu로 돌연변이(Pro114Leu)되고, 상기 yhjE 유전자의 돌연변이는 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 효소의 210번째 아미노산인 Ile가 Met로 돌연변이(Ile210Met)되는 돌연변이 미생물.
청구항 1에 있어서,
부탄올의 생합성 관련 유전자가 추가로 도입된 돌연변이 미생물.
청구항 8에 있어서,
상기 부탄올의 생합성 관련 유전자는 3-히드록시부티릴-COA 디하이드로게나아제, 3-히드록시부티릴-CoA 디하이드라타아제, 트랜스-에노일-CoA 리덕타아제 및 알데히드 및 알코올 디하이드로게나아제인 돌연변이 미생물.
청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미생물은 대장균인 돌연변이 미생물.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미생물은 기탁번호 KCTC13040BP로 기탁된 대장균 SBA01 균주인 돌연변이 미생물.
(1) patZ , cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 돌연변이되어 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 돌연변이 미생물을 제조하는 단계;
(2) 상기 돌연변이 미생물에 3-히드록시부티릴-COA 디하이드로게나아제, 3-히드록시부티릴-CoA 디하이드라타아제, 트랜스-에노일-CoA 리덕타아제 및 알데히드 및 알코올 디하이드로게나아제 유전자를 도입한 형질전환 미생물을 제조하는 단계;
(3) 상기 형질전환 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 부탄올의 제조 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 형질전환 미생물은 frdA , ldhA , adhE 및 pta로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 제거된 부탄올의 제조 방법.
청구항 12 또는 청구항 13에 있어서,
상기 미생물은 대장균인 부탄올의 제조 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 돌연변이 미생물은 기탁번호 KCTC13040BP로 기탁된 대장균 SBA01 균주인 부탄올의 제조 방법.
(1) patZ , cspC , mukB , lomR 및 yhjE로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 돌연변이되어 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 돌연변이 미생물을 제조하는 단계;
(2) 상기 돌연변이 미생물에 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 도입한 형질전환 미생물을 제조하는 단계; 및
(3) 상기 형질전환 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조 방법.
청구항 16에 있어서,
상기 형질전환 미생물은 frdA , ldhA , adhE 및 pta로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 제거된 재조합 단백질의 제조 방법.
청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
상기 미생물은 대장균인 재조합 단백질의 제조 방법.
청구항 16에 있어서,
상기 돌연변이 미생물은 기탁번호 KCTC13040BP로 기탁된 대장균 SBA01 균주인 재조합 단백질의 제조 방법.