BRPI0710414A2

BRPI0710414A2 - células hospedeiras microbianas recombinantes, método para produção de 2-butanol, método para produção de 2-butanona, 2-butanol e 2-butanona

Info

Publication number: BRPI0710414A2
Application number: BRPI0710414-6A
Authority: BR
Inventors: Gail K Donaldson; Andrew C Eliot; Lisa L Huang; Vasantha Nagarajan; Charles E Nakamura
Original assignee: Du Pont
Priority date: 2006-05-02
Filing date: 2007-05-02
Publication date: 2011-08-09
Also published as: US20120196341A1; EP2010664B1; CA2646641A1; BRPI0710412A2; AU2007248560C1; AU2007248560A1; ZA200807718B; EP2010643B1; NZ570930A; AU2007248557A1; MX2008013881A; AU2007248560B2; EP2010664A2; WO2007130521A2; US20070292927A1; US8206970B2; CA2645497A1; US20090239275A1; JP5315232B2; JP2009535062A

Abstract

CéLULAS HOSPEDEIRAS MICROBIANAS RECOMBINANTES, MéTODO PARA PRODUçAO DE 2-BUTANOL, METODO PARA PRODUçAO DE 2-BUTANONA, 2-BUTANOL E 2-BUTANONA. A presente invenção apresenta métodos para a produção fermentativa de álcoois de quatro carbonos. Especificamente butanol, de preferência 2-butanol, é produzido pelo crescimento fermentativo de bactérias recombinantes que expressam uma via biossintética de 2-butanol. Os microorganismos recombinantes e os métodos da invenção podem também ser adaptados para produzir 2-butanona, um intermediário nas vias biossintéticas do 2-butanol aqui apresentadas.

Description

"CÉLULAS HOSPEDEIRAS MICROBIANAS RECOMBINANTES, MÉTODOPARA PRODUÇÃO DE 2-BUTANOL, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE 2-BUTANONA, 2-BUTANOL E 2-BUTANONA"Referência Remissiva a Pedido Correlato

Este pedido reivindica a prioridade sujeita a 35 U.S.C. §119 dopedido provisório U.S. N0 de série 60/796816, depositado em 2 de maio de2006 e pedido provisório U.S. N0 de série 60/871156, depositado em 21 dedezembro de 2006.

Campo Da Invenção

A invenção refere-se ao campo de microbiologia industrial e àprodução de álcoois. Mais especificamente, 2-butanol é produzido viafermentação industrial de um microorganismo recombinante. Osmicroorganismos recombinantes e os métodos da invenção podem tambémser adaptados para produzir 2-butanona, um intermediário nas viasbiossintéticas do 2-butanol aqui apresentadas.

Antecedentes Da Invenção

O butanol é um importante produto químico, útil como aditivopara combustível, como matéria-prima química na indústria de plásticos, ecomo um extrator de grau alimentício na indústria de alimentos e de sabor earoma. A cada ano. 4,5 a 5,4 milhões de toneladas (10 a 12 bilhões de libras)de butanol são produzidos por meios petroquímicos e a necessidade por esteproduto químico irá provavelmente aumentar. O 2-butanona, tambémchamado de metil etil cetona (MEK), é um solvente usado amplamente e é amais importante cetona produzida comercialmente depois de acetona. Ele éusado como solvente para tintas, resinas e adesivos, e como um extratorseletivo e ativador de reações oxidantes.

Métodos para a síntese química de 2-butanona são conhecidos,como a desidrogenação de 2-butanol ou em um processo onde butano líquidoé oxidado cataliticamente formando 2-butanona e ácido acético (Ullmann'sEncyclopedia of Industrial Chemistry, 6th edition, 2003, WiIey-VCHVerIag GmbHand Co., Weinheim1 Germany1 Vol. 5, pp.727-732). O 2-butanona pode tambémser convertido quimicamente em 2-butanol por hidrogenação (Breen et al., J. orCatalysis 236: 270-281 (2005)). Métodos para a síntese química de 2-butanolsão conhecidos, como a hidratação do n-buteno (Ullmann's Encyclopedia ofIndustrial Chemistry, 6th edition, 2003, WiIey-VCHVerIag GmbH and Co.,Weinheim, Germany, Vol. 5, pp. 716-719). Estes processos usam matérias-primas derivadas de produtos petroquímicos e geralmente são caros, e não sãoambientalmente amigáveis. A produção de 2-butanona e 2-butanol a partir dematérias-primas derivadas de plantas minimizaria as emissões de gasesresponsáveis pelo efeito estufa, o que representaria um avanço na técnica.

Os métodos de produção de 2-butanol por biotransformação deoutros produtos químicos orgânicos também são conhecidos. Por exemplo,Stampfer et al. (WO 03/078615) descrevem a produção de álcooissecundários, como 2-butanol, pela redução de cetonas, que são catalisadaspor uma enzima álcool desidrogenase obtida a partir de Rhodococcus ruber.Semelhantemente, Kojima et al. (EP 0645453) descreve um método para apreparação de álcoois secundários, como 2-butanol, pela redução de cetonas,que são catalisadas por uma enzima álcool desidrogenase secundária obtida apartir de Candida parapsilosis. Adicionalmente, Kuehnle et al. (EP 1149918)descrevem um processo que produz 1-butanol e 2-butanol pela oxidação dehidrocarbonetos por diferentes cepas de Rhodoeoceus ruber. O processofavoreceu a produção de 1-butanol com uma seletividade de 93,8%.

A produção de 2-butanol por certas cepas de LactobaciHi tambémé conhecida (Speranza et. al. J. Agrie. Food Chem. (1997) 45:3476-3480). O 2-butanol é produzido pela transformação do meso-2,3-butanodiol. A produçãode 2-butanol a partir de acetolactato e acetoína por estas cepas de Lactobacillitambém foi demonstrada. No entanto, não houve relatos de ummicroorganismo recombinante projetado para produzir 2-butanol.

Existe uma necessidade, portanto, de processos para a produçãode 2-butanol e 2-butanona ambientalmente responsáveis e de baixo custo. Apresente invenção aborda esta necessidade e revela hospedeiros paraprodução microbiana recombinante que expressam 2-butanol e 2-butanona porvias biossintéticas.

Descrição Resumida Da Invenção

A invenção apresenta um microorganismo recombinante que tem

uma via biossintética do 2-butanol projetada. Também é fornecido ummicroorganismo recombinante que tem uma via biossintética do 2-butanonaprojetada, que é a mesma que a via biossintética de 2-butanol com a omissãoda última etapa. Os microorganismos projetados podem ser usados para aprodução comercial de 2-butanol ou 2-butanona.

Conseqüentemente, a invenção apresenta uma célula hospedeiramicrobiana recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNAque codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão deproduto selecionada do grupo formado por:

i) piruvato para alfa-acetolactato;

ii) alfa-acetolactato para acetoína;

iii) acetoína para 3-amino-2-butanol;

iv) 3-amino-2-butanol para fosfato de 3-amino-2-butanol;

v) fosfato de 3-amino-2-butanol para 2-butanona; e

vi) 2-butanona para 2-butanol;

sendo que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga à dita célulahospedeira microbiana e sendo que a dita célula hospedeira microbianaproduz 2-butanol.

Semelhantemente, a invenção apresenta uma célula hospedeiramicrobiana recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNAque codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão deproduto selecionada do grupo formado por:

i) piruvato para alfa-acetolactato;

ii) alfa-acetolactato para acetoína;

iii) acetoína para 3-amino-2-butanol;

iv) 3-amino-2-butanol para fosfato de 3-amino-2-butanol; e

v) fosfato de 3-amino-2-butanol para 2-butanona;

sendo que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga à dita célulahospedeira microbiana e sendo que a dita célula hospedeira microbianaproduz 2-butanona.

Em outra modalidade a invenção apresenta um método para aprodução de 2-butanol que compreende:

1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinanteque compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica umpolipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produtoselecionada do grupo consistindo em:

1) piruvato para alfa-acetolactato;ii) alfa-acetolactato para acetoína;

iii) acetoína para 3-amino-2-butanol;

iv) 3-amino-2-butanol para fosfato de 3-amino-2-butanol;

v) fosfato de 3-amino-2-butanol para 2-butanona; e

vi) 2-butanona para 2-butanol;

sendo que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga à dita célulahospedeira microbiana; e

2) colocar a célula hospedeira de (1) em contato com umsubstrato fermentável de carbono em um meio de fermentação nas condiçõesem que é produzido 2-butanol.Semelhantemente a invenção apresenta um método para aprodução de 2-butanona que compreende:

1) piruvato para alfa-acetolactato;

ii) alfa-acetolactato para acetoína;

iii) acetoína para 3-amino-2-butanol;

iv) 3-amino-2-butanol para fosfato de 3-amino-2-butanol; e

v) fosfato de 3-amino-2-butanol para 2-butanona;sendo que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga à dita célulahospedeira microbiana; e

2) colocar a célula hospedeira de (1) em contato com umsubstrato de carbono fermentável em um meio de fermentação nas condiçõesem que é produzido 2-butanona.

Em outra modalidade a invenção apresenta 2-butanol ou 2-butanona que contém um meio de fermentação de produto produzido pelosmétodos da invenção.

Breve Descrição das Figuras ε

Descrições de Seqüências

A invenção pode ser mais plenamente entendida a partir daseguinte descrição detalhada, figuras e descrições de seqüências anexas,que fazem parte do presente pedido.

A figura 1 mostra quatro vias diferentes para biosíntese de 2-butanona e 2-butanol.

As seguintes seqüências estão de acordo com o37 C.F.R. 1.821-1.825 (" Requirements for Patent Applications Contáining NucleotideSequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules") esão consistentes com a Organização Mundial da Propriedade Intelectual(OMPI) [World Intellectual Property Organization (WIPO)] padrão ST.25 (1998)e os requisitos para listagem de seqüência listados pela EPO e PCT (Regras5,2 e 49,5 (a -bis), e seção 208 e anexo C das instruções administrativas). Ossímbolos e formato usados para os dados de seqüência de aminoácidos e denucleotídeos estão de acordo com as regras estabelecidas no 37 CFR § 1.822.

Tabela 1

Sumário de Números de SEQID de Ácido Nucléico ε Proteína

<table>table see original document page 7</column></row><table><table>table see original document page 8</column></row><table><table>table see original document page 9</column></row><table><table>table see original document page 10</column></row><table>

SEQ ID n^oS 15 a 65 são as seqüências de nucleotídeos deoligonucleotídeo PCR, clonagem, triagem e iniciadores de seqüenciamentousados nos exemplos.

SEQ ID n° 66 é uma seqüência de nucleotídeos da região apagadado gene yqhD em E. coli cepa MG1655 ∆yqhCD, descrita no exemplo 11.

SEQ ID n° 67 é a seqüência de nucleotídeos de uma variante dopromotor de glicose isomerase 1,6GI.

SEQ ID n° 68 é a seqüência de nucleotídeos do promotor 1,5GI.

SEQ ID n° 69 é a seqüência de nucleotídeos do operon de dioldesidratase a partir de Klebsiella oxytoca.

SEQ ID n° 70 é a seqüência de nucleotídeos do fator dereativação operon de diol desidratase a partir de Klebsiella oxytoca.

SEQ ID n° 73 é a seqüência de nucleotídeos de pDCQ2, que édescrita no exemplo 9.

SEQ ID noS 127 a 132 são as seqüências de nucleotídeos deoligonucleotídeo adicional PCR e iniciadores de clonagem usados nos exemplos.

SEQ ID n° 155 é uma região de codificação do códon otimizadopara a aminoálcool quinase de Erwinia carotovora subespécie atroseptica.SEQ ID η° 156 é uma região de codificação do códon otimizadopara a aminoálcool O-fosfatoliase de Erwinia carotovora subespécie atroseptica.

SEQ ID noS 157 a 163 são as seqüências de nucleotídeos deoligonucleotídeo adicional PCR e iniciadores de clonagem usados nos exemplos.

SEQ ID n° 164 é a seqüência de nucleotídeos de um operon deErwinia carotovora subespécie atroseptica.

Tabela 2.

Grandes. Médias ε Pequenas Subunidades Adicionais de Glicerol ε DiolDesidratase

<table>table see original document page 11</column></row><table><table>table see original document page 12</column></row><table>

a Descrição: da anotação Genbank da seqüência e pode não ser correto incluir a designação doglicerol ou diol, ou pode não incluir informação da subunidade.

b Subunidade: identificada por homologia de seqüência com a grande, média ou pequenasubunidade da enzima KIebsieiIa oxytoca.

c Subunidades que são do mesmo organismo são mencionadas juntas e são consideradas amesma enzima, ou têm números Genbank próximos indicando proximidade no genoma.

Descrição Detalhada Da Invenção

A presente invenção refere-se aos métodos para a produção de 2-butanol que utilizam microorganismos recombinantes. A presente invenção atendeinúmeras necessidades comerciais e industriais. Butanol é um importante produtoquímico industrial com uma variedade de aplicações, onde o seu potencial comocombustível ou aditivo de combustível é particularmente significativo. Emboraapenas um álcool de quatro carbonos, o butanol tem um conteúdo energéticosemelhante ao da gasolina e pode ser misturado com qualquer combustível fóssil. Butanol é favorecido como combustível ou aditivo de combustível, uma vez que sóproduz CO2 e pouco ou nenhum SOx ou ΝΟχ quando queimado no motor padrãode combustão interna. Adicionalmente o butanol é menos corrosivo que o etanol, oaditivo preferencial de combustível até o momento.

Em adição ao seu uso como biocombustível ou aditivo para combustível, butanol tem o potencial de impactar problemas de distribuiçãode hidrogênio na emergente indústria de células de combustível. As célulasde combustível hoje são atormentadas pelas questões de segurançaassociadas ao transporte e distribuição de hidrogênio. Butanol pode ter seuconteúdo de hidrogênio facilmente mudado e pode ser distribuído através deestações de gás já existentes, na pureza exigida para os motores decombustão ou células de combustível em veículos.

Finalmente, a presente invenção produz 2-butanol a partir defontes de carbono derivadas de plantas, evitando o impacto ambiental negativoassociado aos processos petroquímicos padrões para produção de butanol.

A presente invenção também fornece os microorganismosrecombinantes e os métodos para produzir 2-butanona, um intermediário nasvias biossintéticas do 2-butanol aqui apresentadas. 2-butanona, tambémconhecido como metil etil cetona (MEK), é útil como um solvente em tintas eoutros revestimentos. Ele é também usado na indústria de borracha sintéticae na produção de cera de parafina.

As seguintes definições e abreviações são para ser usadas para ainterpretação das reivindicações e do relatório descritivo.

O termo "invenção" ou "presente invenção" para uso na presenteinvenção é um termo não-limitador e não pretende se referir a uma únicamodalidade particular da invenção , mas abrange todas as possíveismodalidades conforme descrito no relatório descritivo e nas reivindicações.

O termo "via biossintética de 2-butanol" refere-se a viasenzimáticas para produzir 2-butanol a partir de piruvato.

O termo "via biossintética de 2-butanona" refere-se a viasenzimáticas para produzir 2-butanona a partir de piruvato.

O termo "acetolactato sintase", também conhecido como "ácidoacetohidróxi sintase", refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos), com umaatividade enzimática que catalisa a conversão de duas moléculas de ácidopirúvico para uma molécula de alfa-acetolactato. Acetolactato sintase,conhecida como EC 2.2.1.6 [anteriormente 4.1.3.18] (Enzyme Nomenclature1992, Academic Press, San Diego) pode ser dependente do cofator tiaminapirofosfato para sua atividade. As enzimas acetolactato sintase adequadasestão disponíveis a partir de inúmeras fontes, por exemplo, Bacillus subtilis[GenBank n° AAA22222 NCBI (National Center for Biotechnology Information)seqüência de aminoácidos (SEQ ID n° 77), L04470 NCBI seqüência denucleotídeo (SEQ ID n° 76)], Klebsiella terrigena [GenBank noS AAA25055 (SEQ ID n° 79), L04507 (SEQ ID n° 78)], e Klebsiella pneumoniae [GenBanknoS AAA25079 (SEQ ID n° 4), M73842 (SEQ ID n° 3)].

O termo "acetolactato descarboxilase" refere-se a umpolipeptídeo (ou polipeptídeos) que tem uma atividade enzimática quecatalisa a conversão de aIfa-acetoIactato para acetoína. As acetolactato descarboxilases são conhecidas como EC 4.1.1.5 e estão disponíveis, porexemplo, a partir de Bacillus subtilis [GenBank noS AAA22223 (SEQ ID n° 81),L04470 (SEQ ID n° 80)], Klebsiella terrigena [GenBank n° AAA25054 (SEQID n° 83), L04507 (SEQ ID n° 82)] e Klebsiella pneumoniae [GenBank noSAAU43774 (SEQ ID n° 2), AY722056 (SEQ ID n° 1)].

O termo "acetoína aminase" ou "acetoína transaminase" refere-sea um polipeptídeo (ou polipeptídeos), que tem uma atividade enzimática quecatalisa a conversão de acetoína para 3-amino-2-butanol. Acetoína aminasepode utilizar o cofator piridoxal 5-fosfato ou NADH (nicotinamida adeninadinucleotídeo reduzida) ou NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida). O produto resultante pode ter (R) ou (S) estereoquímica na posição 3.As enzimas dependente do fosfato piridoxal podem utilizar um aminoácido comoalanina ou glutamato como doador de amino. As enzimas dependentes deNADH e NADPH podem utilizar amônia como um segundo substrato. Umexemplo de uma adequada aminase acetoína dependente de NADH, também conhecida como amino álcool desidrogenase, é descrito por Ito et al. (Patente U.S.Nº 6.432.688). Um exemplo de uma aminase acetoína dependente de piridoxal é aamina: piruvato aminotransferase (também chamada amina: piruvato transaminase)e descrita por Shin Kim (J. Org. Chem. 67:2848-2853 (2002)).O termo "butanol desidrogenase" refere-se a um polipeptídeo (oupolipeptídeos) que tem uma atividade enzimática que catalisa a interconversãode 2-butanona e 2-butanol. Butanol desidrogenases são um subconjunto de umavasta família de álcool desidrogenases. Butanol desidrogenase pode serdependente de NAD ou NADP. As enzimas dependentes de NAD sãoconhecidas como EC 1.1.1.1 e estão disponíveis, por exemplo, a partir deRhodococcus ruber [GenBank n° CAD36475 (SEQ ID n° 14), AJ491307 (SEQID n° 13)]. As enzimas dependentes de NADP são conhecidas como EC 1.1.1.2e estão disponíveis, por exemplo, a partir de Pyrococcus furiosus [GenBank n°AAC25556 (SEQ ID n° 91), AF013169 (SEQ ID n° 90)]. Adicionalmente, umabutanol desidrogenase está disponível a partir de Eseheriehia eoli [GenBank n°NP 417484 (SEQ ID n° 75), NC_000913 (SEQ ID n° 74)] e uma cicloexanoldesidrogenase está disponível a partir de Aeinetobaeter sp. [GenBank n°AAG10026 (SEQ ID n° 72), AF282240 (SEQ ID n° 71)].

O termo "acetoína quinase" refere-se a um polipeptídeo (oupolipeptídeos), que tem uma atividade enzimática que catalisa a conversão deacetoína a fosfato acetoína. Acetoína quinase pode usar ATP (adenosinatrifosfato) ou fosfoenolpiruvato como o doador de fosfato na reação. Apesar denão haver relatos de enzimas catalisando essa reação em acetoína, existemenzimas que catalisam a reação análoga no substrato semelhantedihidroxiacetona, por exemplo, enzimas conhecida como CE 2.7.1.29 (Garcia-Alles et al. (2004) Biochemistry 43: 13037-13046).

O termo "acetoína fosfato aminase" refere-se a um polipeptídeo(ou polipeptídeos) com uma atividade enzimática que catalisa a conversão defosfoacetoína a 3-amino-2-butanol-0-fosfato. Acetoína fosfato aminase podeutilizar o cofator piridoxal 5-fosfato, NADH ou NADPH. O produto resultantepode ter (R) ou (S) estereoquímica na posição 3. As enzimas dependente dofosfato piridoxal podem utilizar um aminoácido como alanina ou glutamato. Asenzimas dependentes de NADH e NADPH podem utilizar amônia como umsegundo substrato. Apesar de não haver relatos de enzimas catalisando essareação em fosfoacetoína, existe uma enzima dependente de piridoxal fosfatoque se propõe para realizar a reação análoga no substrato semelhante serinolfosfato (Yasuta et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:4999-5009).

O termo "aminobutanol fosfato fosfoliase", também chamado de"álcool amino O -fosfato liase", refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos),que tem uma atividade enzimática que catalisa a conversão de 3-amino-2-butanol O-fosfato a 2 - butanona. Aminobutanol fosfato fosfoliase pode utilizar ocofator piridoxal 5-fosfato. Não existem relatos anteriores de enzimascatalisando essa reação em aminobutanol fosfato, embora existam relatos deenzimas que catalisam a reação análoga semelhante sobre o substrato 1-amino-2-propanol fosfato (Jones et al. (1973) Biochem J. 134: 167-182). Apresente invenção descrevem um identificado recentemente aminobutanolfosfato fosfoliase (SEQ ID n° 126) a partir do organismo Erwinia carotovora,com a atividade demonstrada em exemplo 15 da presente invenção.

O termo "aminobutanol quinase" refere-se a um polipeptídeo (oupolipeptídeos) que tem uma atividade enzimática que catalisa a conversão de3-amino-2-butanol a 3-amino-2-butanol O-fosfato aminobutanol quinase podeusar ATP como o doador de fosfato. Apesar de não haver relatos de enzimascatalisarem essa reação em 3-amino-2-butanol, há relatos de enzimas quecatalisam a reação análoga nos substratos semelhantes etanolamina e 1-amino-2-propanol (Jones et al., acima). A presente invenção descreve, noexemplo 14, um aminoálcool quinase de Erwinia carotovora subespécieatroseptica (SEQ ID n° 124). O termo "Butanodiol desidrogenase" tambémconhecido como "acetoína redutase" refere-se a um polipeptídeo (oupolipeptídeos), que tem uma atividade das enzimas que catalisa a conversãode acetoína a 2,3-Butanodiol. Butano diol desidrogenases são umsubconjunto de uma vasta família de álcoois desidrogenases. Enzimasbutanodiol desidrogenase podem ser específicas para a produção de (R) - ou(S)-estereoquímica no álcool produto. (S)-butanodiol desidrogenasesespecíficas são conhecidas como CE 1.1.1.76 e estão disponíveis, porexemplo, a partir de Klebsiella pneumoniae (GenBank n° s:BBA13085 (SEQID n° 6), D86412 (SEQ ID n° 5)). (R)-butanodiol desidrogenases específicassão conhecidas como EC 1.1.1.4 e estão disponíveis, por exemplo, a partir deBacillus cereus [GenBank N0. NP_830481 (SEQ ID n° 85), NC_004722 (SEQID n° 84); AAP07682 (SEQ ID n° 87), AE017000 (SEQ ID n° 86)] eLactococcus Iaetis [GenBank N°. AAK04995 (SEQ ID n° 89), AE006323 (SEQID n° 88)].

O termo "Butanodiol desidratase", também conhecido como "dioldesidratase" ou "propanodiol desidratase" refere-se a um polipeptídeo (oupolipeptídeos), com uma atividade enzimática que catalisa a conversão de 2,3-butanodiol em 2-butanona. Butano diol desidratase pode usar o cofatoradenosil cobalamina (vitamina B12). Enzimas dependente de adenosilcobalamina são conhecidos como CE 4.2.1.28 e estão disponíveis, porexemplo, a partir de Klebsiella oxytoca [GenBank n° s: BAA08099 (alfasubunidade) (SEQ ID n° 8), D45071 (SEQ ID n° 7); BAA08100 (subunidadebeta) (SEQ ID n° 10), D45071 (SEQ ID n° 9); e BBA08101 (gama subunidade)(SEQ ID n° 12), D45071 (SEQ ID n° 11) (note que as três subunidades sãonecessárias para a atividade)] e Klebsiella pneumoniae [GenBank n°AAC98384 (subunidade alfa) (SEQ ID n° 105), AF102064 (SEQ ID n° 104);GenBank n° AAC98385 (subunidade beta) (SEQ ID n° 107), AF102064 (SEQID n° 106), GenBank n° AAC98386 (subunidade gama) SEQ ID n° 109),AF102064 (SEQ ID n° 108)]. Outros diol desidratases adequados incluem, masnão se limitam a, diol desidratases dependentes de B12 disponíveis a partir deSalmonella typhimurium [GenBank n° AAB84102 (subunidade grande) (SEQID n° 93), AF026270 (SEQ ID n° 92); GenBank n° ΑΑΒ84103 (subunidademédia) (SEQ ID n° 95), AF026270 (SEQ ID n° 94); GenBank n° AAB84104(subunidade pequena) (SEQ ID n° 97), AF026270 (SEQ ID n° 96)] eLactobacillus collinoides [GenBank n° CAC82541 (subunidade grande) (SEQID n° 99), AJ297723 (SEQ ID n° 98); GenBank n° CAC82542 (subunidademédia) (SEQ ID n° 101); AJ297723 (SEQ ID n° 100); GenBank n° CAD01091(subunidade pequena) (SEQ ID n° 103), AJ297723 (SEQ ID n° 102)] e enzimasa partir de Lactobacillus brevis (particularmente cepas CNRZ 734 e CNRZ 735,Speranza et al., acima), e seqüência de nucleotídeo que codificam as enzimascorrespondentes. Métodos de isolamento de gene de diol desidratase são bemconhecidos na técnica (por exemplo, patente U.S. N0 5.686.276).

O termo "glicerol desidratase" refere-se a um polipeptídeo (oupolipeptídeos) que tem uma atividade enzimática que catalisa a conversão deglicerol a 3-hidroxipropionaldeído. Glicerol desidratases dependentes deadenosil cobalamina são conhecidas como CE 4.2.1.30. As gliceroldesidratases da CE 4.2.1.30 são similares às diol desidratases na seqüênciae no fato de terem três subunidades. Os glicerol desidratases também podemser usados para converter 2,3-butanodiol em 2-butanona. Alguns exemplos deglicerol desidratases da CE 4.2.1.30 incluem Klebsiella pneumoniae(subunidade alfa, SEQ ID n° 145, que codifica região e SEQ ID n° 146,proteína; subunidade beta, SEQ ID n° 147, região de codificação e SEQ ID n°148, proteína; e subunidade gama SEQ ID n° 149, região de codificação eSEQ ID n° 150, proteína); a partir de Clostridium pasteurianum [GenBank n°3360389 (subunidade alfa, SEQ ID n° 135), 3360390 (subunidade beta, SEQID n° 136), e3360391 (subunidade gama, SEQ ID n° 137)]; a partir deEscheriehia blattae [GenBank n° 60099613 (subunidade alfa, SEQ ID n°138), 57340191 (subunidade beta, SEQ ID n° 139), e 57340192 (subunidadegama, SEQ ID n° 140)]; e a partir de Citrobaeter freundii [GenBank n°1169287 (subunidade alfa, SEQ ID n° 141), 1229154 (subunidade beta, SEQID n° 142), e 1229155 (subunidade gama, SEQ ID n° 143)]. Note que todas astrês subunidades são necessárias para atividade. Adicionais gliceroldesidratases estão listadas na tabela 2.

Diol e glicerol desidratases podem sofrer inativação suicidadurante catálise. Uma proteína fator reativante, também aqui referida como"reativase", pode ser usada para reativar as enzimas inativas (Mori et al., J.Biol.Chem. 272:32034 (1997)). Preferencialmente, o fator de reativação éobtido a partir da mesma fonte que o diol ou glicerol desidratase usados. Porexemplo, adequados fatores de reativação de diol desidratase estãodisponíveis a partir de Klebsiella oxytoca [GenBank n° AAC15871 (subunidadegrande) (SEQ ID n° 111), AF017781 (SEQ ID n° 110); GenBank n° AAC15872(subunidade pequena) (SEQ ID n° 113), AF017781 (SEQ ID n° 112)];Salmonella typhimurium [GenBank n° AAB84105 (subunidade grande) (SEQID n° 115), AF026270 (SEQ ID n° 114), GenBank n° AAD39008 (subunidadepequena) (SEQ ID n° 117), AF026270 (SEQ ID n° 116)] e Lactobacilluscollinoides [GenBank n° CAD01092 (subunidade grande) (SEQ ID n° 119),AJ297723 (SEQ ID n° 118); GenBank n° CAD01093 (pequena subunidade)(SEQ ID n° 121), AJ297723 (SEQ ID n° 120)]. Ambas as pequenas e grandessubunidades são necessárias para atividade. Por exemplo, fatores reativantesadequados de glicerol desidratase estão disponíveis a partir de Klebsiellapneumoniae (subunidade grande, SEQ ID n° 151, que codifica região e SEQ IDn° 152, proteína, e pequena subunidade, SEQ ID n° 153, região de codificaçãoe SEQ ID n° 154, proteína).

O termo "um anaeróbico facultativo" refere-se a um microrganismoque pode crescer em ambos os ambientes aeróbico e anaeróbico.

O termo "substrato de carbono" ou "substrato de carbonofermentável" refere-se a uma fonte de carbono capaz de ser metabolizadapelos organismos hospedeiros da presentes invenção e especialmente fontesde carbono selecionadas do grupo formado por monossacarídeos,oligossacarídeos, polissacarídeos e um substrato de carbono ou misturas dosmesmos.

O termo "gene" refere-se a um fragmento de ácido nucléico que écapaz de ser expresso como uma proteína específica, opcionalmente, incluindoseqüências reguladoras que precedem (seqüências 5' η ão codificantes ) eseguem (seqüências 3' não codificantes) a seqüência de codificação."Genenativo" refere-se a um gene como encontrado na natureza com as suaspróprias seqüências reguladoras."Gene quimérico" refere-se a qualquer geneque não é um gene nativo, compreendendo seqüências reguladoras e decodificação que não são encontradas juntas na natureza. Conseqüentemente,um gene quimérico pode compreender seqüências reguladoras e deseqüências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ouseqüências reguladoras e seqüências de codificação obtidas a partir da mesmafonte, mas organizadas de uma forma diferente do que aquela encontrada nanatureza. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo na sua naturallocalização no genoma de um organismo. Um gene "estrangeiro" ou"heterólogo" refere-se a um gene que normalmente não se encontra noorganismo hospedeiro, mas que é introduzida no mesmo por transferência degenes. Os genes estrangeiros podem compreender os genes nativos inseridosem um organismo não-nativo, ou genes quiméricos. Um "transgene" é um geneque foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação.

Para uso na presente invenção, um "fragmento isolado de ácidonucléico" ou "molécula isolada de ácido nucléico" ou "construção genética"serão utilizados indiferentemente e significarão um polímero de DNA ou RNAde fita simples- ou duplo, opcionalmente contendo bases de nucleotídeosalteradas, não naturais ou sintéticas. Um fragmento isolado de ácido nucléico,sob a forma de um polímero de DNA1 pode compreender um ou maissegmentos do cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

Um fragmento de ácido nucléico é "hibridizável" para outrofragmento de ácido nucléico, como um cDNA, DNA genômico ou moléculaRNA1 quando uma única forma de fita simples do fragmento de ácido nucléicopode anelar os outros fragmentos de ácido nucléico sob as condiçõesapropriadas de temperatura e força iônica da solução. As condições dehibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook1J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989), especialmentecapítulo 11 e tabela 11.1 neste (integralmente incorporadas neste documentopor referência). As condições de temperatura e força iônica determinar a"estringência" da hibridização. As condições de estringência podem serajustadas para testar por fragmentos moderadamente semelhantes (comoseqüências homólogas de organismos aparentados de forma distante), e atépor fragmentos muito semelhantes (como os genes que duplicam enzimasfuncionais de organismos estreitamente aparentados). As lavagenspós-hibridização determinam as condições de estringência. Um conjunto decondições preferenciais utiliza uma série de lavagens começando com 6X SSC,0,5% SDS1 à temperatura ambiente durante 15 minutos, em seguida, repetindocom 2X SSC, 0,5% SDS a 45°C por 30 minutos, e, em seguida, repetindo duasvezes com 0,2X CCD, 0,5% SDS, a 50°C por 30min. Um conjunto preferencialde condições de estringência utiliza altas temperaturas nas quais as lavagenssão idênticas às acima exceto que a temperatura das duas lavagens finais de30 minutos em 0,2X CCD1 0,5% SDS, foi aumentada para 60°C. Outro conjuntopreferencial de condições altamente estrigentes usa duas lavagens no final0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C. Um conjunto adicional de condições deestringência incluem hibridização a 0,1 X SSC, 0,1% SDS, 65°C e lavagenscom 2X SSC1 0,1 % SDS 0,1X seguido pelo CCD1 O11 % SDS1 por exemplo.

A hibridização exige que os dois ácidos nucléicos contenhamseqüências complementares, embora dependendo da estringência dahibridização, falta de correlação entre as bases são possíveis. A estringênciaadequada para hibridização de ácidos nucléicos depende do comprimento dosácidos nucléicos e do grau de complementação, variáveis bem conhecidas naarte. Quanto maior for o grau de semelhança ou de homologia entre duasseqüências de nucleotídeos, maior o valor de Tm para híbridos de ácidosnucléicos que têm essas seqüências. A relativa estabilidade (o que corresponde àmaior Tm) de hibridizações de ácido nucléico decresce na seguinte ordem:RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para os híbridos de mais de 100 nucleotídeosde comprimento, equações para calcular Tm foram derivadas (consulte Sambrooket al., acima, 9,50-9,51). Para hibridizações mais curtas com ácidos nucléicos, ouseja, oligonucleotídeos, a posição da falta de correlação se torna mais importantee, o comprimento do oligonucleotídeo determina a sua especificidade (verSambrook et al., acima, 11,7-11,8). Em uma modalidade o comprimento de umácido nucléico hibridizável é pelo menos de cerca de 10 nucleotídeos.Preferencialmente, um mínimo comprimento de um ácido nucléico hibridizável épelo menos de cerca de 15 nucleotídeos; com mais preferência pelo menos cercade 20 nucleotídeos; e com a máxima preferência o comprimento é de pelo menoscerca de 30 nucleotídeos. Além disso, o técnico qualificado irá reconhecer que atemperatura e a concentração de sal da solução de lavagem podem ser ajustadosconforme necessário, de acordo com fatores como o comprimento da sonda.

Uma "parte substancial" de um aminoácido ou seqüência denucleotídeos é a parte que compreende o suficiente da seqüência deaminoácidos de um polipeptídeo ou da seqüência de nucleotídeos de um genepara identificar putativamente que polipeptídeo ou gene, ou por avaliaçãomanual da seqüência por um técnico no assunto, ou pela comparação eidentificação seqüencial automática por computador, utilizando algoritmos comoBLAST (Altschul, SF1 et al„ J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)). Em geral, umaseqüência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou trinta ou mais nucleotídeosé necessária a fim de putativamente identificar uma seqüência de polipeptídeosou de ácido nucléico como homóloga a uma proteína ou um gene conhecido.Além disso, no que diz respeito às seqüências de nucleotídeos, sondas deoligonucleotídeo de genes específicos compreendendo 20 a 30 nucleotídeoscontíguos podem ser utilizadas nos métodos de identificação dependentes deidentificação de gene da seqüência (por exemplo, "Southern hybridization") e deisolamento (por exemplo, hibridização "in situ" de colônias bacterianas ou placasbacteriófagos). Adicionalmente, bases de curtos oligonucleotídeos de 12 a15podem ser utilizados como iniciadores de amplificação da PCR, a fim de obterum determinado fragmento do ácido nucléico compreendendo os iniciadores.Conseqüentemente, uma "parte substancial" de uma seqüência de nucleotídeoscompreende bastante da seqüência para identificar especificamente e/ou isolarum fragmento do ácido nucléico compreendendo a seqüência. O presenterelatório descritivo ensina a completa seqüência de aminoácidos e nucleotídeoscodificando particulares proteínas fúngicas. O versado na técnica, tendo obenefício das seqüências como aqui relatadas, pode agora usar a totalidade ouuma parte substancial das seqüências divulgadas, para fins conhecidos pelosversados nesta arte. Conseqüentemente, a presente invenção compreende ascompletas seqüências como relatado na lista de seqüências anexa, bem comoporções significativas dessas seqüências como definido acima.

O termo "complementar" é utilizado para descrever a relaçãoentre as bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar uma à outra.Por exemplo, no que diz respeito ao DNA, adenosina é complementar à timinae citosina é complementar à guanina.

Os termos "homologia" e "homólogo" são usados de maneiraintercambiável neste documento. Eles se referem a fragmentos de ácidosnucléicos em que mudanças em uma ou mais bases de nucleotídeos nãoafetam a habilidade do fragmento de ácido nucléico de mediar expressãogênica ou produzir um determinado fenótipo. Estes termos também se referemàs alterações dos fragmentos do ácido nucléico da presente invenção, como asupressão ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alteremsubstancialmente as propriedades funcionais do fragmento resultante de ácidonucléico em relação ao fragmento inicial sem modificação. É, portanto,entendido, como aqueles versados na arte irão apreciar, que a invençãoabrange mais do que as seqüências exemplificadoras específicas.

Além disso, o versado na técnica reconhece que as seqüênciasde ácidos nucléicos homólogas abrangidas por essa invenção também sãodefinidas pela sua capacidade de hibridizar sob moderadamente severascondições (por exemplo, 0,5 X SSC, 0,1% SDS, 60°C) com as seqüênciasexemplificadas aqui, ou para qualquer parte do seqüências de nucleotídeosapresentadas aqui e que são funcionalmente equivalentes a qualquer uma dasseqüências de ácidos nucléicos apresentadas neste documento.

"Degenerescência do códon" refere-se à natureza no códigogenético que permite a variação da seqüência de nucleotídeos sem afetar aseqüência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. O versado na técnicaestá bem consciente da "preferência do códon (codon-bias)" exibidas por umadeterminada célula hospedeira no uso de códons de nucleotídeos paraespecificar um determinado aminoácido. Por isso, quando sintetizando um genepara a melhoria da expressão gênica em uma célula hospedeira, é desejável queo design do gene seja tal que a sua freqüência de uso do códon seja próxima dafreqüência preferencial de uso do códon da célula hospedeira.

O termo "porcentagem de identidade", conforme é conhecido naarte, é um relacionamento entre duas ou mais seqüências de polipeptídeos ouduas ou mais seqüências de polinucleotídeos, conforme determinado porcomparação das seqüências. Na arte, a "identidade" significa também o graude parentesco entre as seqüências de polipeptídeos ou polinucleotídeos,conforme o caso, como determinado pela correspondência entre cadeias detais seqüências. "Identidade" e "similaridade" podem ser facilmente calculadospor métodos conhecidos, incluindo mas não limitados aos descritos em: 1.)Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY(1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Proiects (Smith, D. W., Ed.)Academic: NY (1993); 3.) Computer Analvsis of Sequence Data, Part I (Griffin,A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4.) Seauence Analvsis inMolecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); e 5.) SequenceAnalysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).

Os métodos preferenciais para determinar identidade sãoprojetados para proporcionar a melhor comparação entre as seqüênciastestadas. Os métodos para determinar identidade e similaridade são codificadosem programas de computador disponíveis publicamente. As seqüência dealinhamentos e cálculos de percentagens de identidade podem ser realizadosutilizando o programa MegAlign™ da LASERGENE bioinformatics computingsuite (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Os múltiplos alinhamentos das seqüênciassão realizados usando-se "método de alinhamento Clustal", que abrange váriasvariedades do algoritmo incluindo o "método de alinhamento Clustal V"correspondente ao método de alinhamento identificado como Clustal V (descritopor Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput.Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) e encontrado no programa MegAlign™ doLASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc.). Para múltiplosalinhamentos, os valores pré-estabelecidos correspondem a GAP PENALTY=10e GAP LENGTH PENALTY=10. Os parâmetros pré-estabelecidos paraalinhamento em pares e cálculos de porcentagem de identidade de seqüênciasde proteína usando o método Clustal são KTUPLE=I, GAP PENALTY=3,WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucléicos esses parâmetrossão KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4.Após o alinhamento das seqüências usando o programa Clustal V, é possívelobter uma "porcentagem de identidade" visualizando a tabela "distância daseqüência" no mesmo programa. Adicionalmente o "método de alinhamentoClustal W" está disponível e corresponde ao método de alinhamento identificadocomo Clustal W (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989);Higgins1 D.G. et al., Comput Appl. Biosci. 8:189-191(1992)) e encontrado noprograma MegAIign™ v6.1 de LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.). Os parâmetros pré-estabelecidos para múltiplos alinhamentos(GAP PENALTY= 10, GAP LENGTH PENALTY=0,2, Delay DivergenSeqs(%)=30, DNA Transition Weight=O,5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series,DNA Weight Matrix=IUB). Após o alinhamento das seqüências usando oprograma Clustal W, é possível obter uma "porcentagem de identidade"visualizando a tabela "distância da seqüência " no mesmo programa.

É bem entendido pelo versado na técnica que muitos níveis deidentidade de seqüência são úteis na identificação de polipeptídeos, a partir deoutras espécies, onde tais polipeptídeos têm a mesma ou similar função ouatividade. Exemplos úteis de porcentagens de identidades incluem, mas não estãolimitados a: 24%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,85%, 90% ou 95%, ou qualquer inteiro percentual de 24% a 100% podem serúteis na descrição da presente invenção, como 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%,31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%,45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%,59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%,73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% Ou 99%. Osfragmentos de ácido nucléico adequados não somente tem as homologias acima,mas tipicamente codificam um polipeptídeo que tem pelo menos 50 aminoácidos,de preferência pelo menos 100 aminoácidos, com mais preferência pelo menos150 aminoácidos, ainda com mais preferência pelo menos 200 aminoácidos e,com a máxima preferência, pelo menos 250 aminoácidos.

O termo "software de análise de seqüências" refere-se a qualqueralgoritmo computadorizado ou programa de software que é útil para a análisede seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos. "Software de análise deseqüências" pode estar disponível comercialmente ou desenvolvidoindependentemente. Típicos Softwares de análise de seqüências, incluem, masnão estão limitados a: 1.) Software integrado de programas GCG (WisconsinPackage Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wl); 2.)BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al„ J. Moi Biol., 215:403-410 (1990));3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, Wl); 4.) Sequencher (Gene CodesCorporation, Ann Arbor, Ml); e 5.) O programa FASTA incorporando o algoritmoSmith-Waterman (W. R. Pearson, Comput Methods Genome Res., [Proc. Int.Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum:New York, NY). No contexto deste pedido, será entendido que onde o softwarede análise seqüencial é utilizado para a análise, os resultados da análise serãobaseados nos "valores pré-determinados" do programa referenciado, salvodisposição em contrário. Para uso na presente invenção, "valores pré-determinados" significará qualquer conjunto de valores ou parâmetros que vemcom o software quando o mesmo é inicializado pela primeira vez.

Para uso na presente invenção o termo "seqüência de codificação"ou "CDS" refere-se a uma seqüência de DNA que codifica uma específicaseqüência de aminoácidos. "Seqüências reguladoras adequadas" referem-se aseqüências de nucleotídeos localizadas a montante (não uma seqüência 5'codificante ), no interior, ou a jusante (não uma seqüência 3' codificante ) de umaseqüência de codificação e que influenciam a transcrição, processamento ouestabilidade de RNA1 ou tradução da associada seqüência de codificação. Asseqüências reguladoras podem incluir promotores, seqüências de iniciação detradução, íntrons, seqüências de reconhecimento de poliadenilação, sítio deprocessamento de RNA1 sítio de ligação efetor e estrutura de haste e laço.

O termo "promotor" refere-se a uma seqüência de DNA capaz decontrolar a expressão de uma seqüência de codificação ou RNA funcional. Emgeral, uma seqüência de codificação está situada a 3' de uma seqüênciapromotora. Os promotores poderão ser derivados na sua totalidade a partir deum gene nativo, ou seja composto por vários elementos derivados dediferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreendesegmentos de DNA sintéticos. Entende-se por aqueles versados na técnica quediferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentestipos de células ou tecidos, ou em diferentes fases de desenvolvimento, ou emresposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Os promotores quecausam a um gene ser expresso na maioria dos tipos de células, na maioriadas vezes, são comumente denominados "promotores constitutivos". É aindareconhecido que, uma vez que na maioria dos casos os exatos limites dasseqüências reguladoras não foram completamente definidos, os fragmentos deDNA de diferentes comprimentos podem ter idêntica atividade promotora.

O termo "ligada de maneira funcional" refere-se à associação dasseqüências de ácido nucléico em um único fragmento de ácidos nucléicos demodo que a função de um é afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor estáligado de maneira funcional com uma seqüência de codificação quando écapaz de viabilizar a expressão da seqüência de codificação (ou seja, aseqüência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). Asseqüências de codificação podem ser ligados de maneira funcional aseqüências reguladoras na orientação senso ou anti-senso.O termo "expressão", conforme usado neste documento, refere-seà transcrição e acúmulo estável de RNA senso (mRNA) ou anti-sensoderivados do fragmento de ácido nucléico da invenção. Expressão podetambém referir-se a tradução de mRNA em um polipeptídeo.

Conforme utilizado aqui o termo "transformação" refere-se àtransferência de um fragmento de ácido nucléico em um organismo hospedeiro,resultando em herança geneticamente estável. Os organismos hospedeirosque contêm os fragmentos de ácido nucléico transformados são referidos comoorganismos "transgênicos", "recombinantes" ou "transformados".

Os termos "plasmídeo" e "vetor" referem-se a um elemento extracromossômico muitas vezes transportando genes que não fazem parte dometabolismo central da célula e, geralmente, sob a forma de fitas duplas circularesde fragmentos de DNA. Esses elementos podem ser seqüências livrementereplicadas, seqüências integradoras de genoma, seqüências de nucleotídeos oude fagos, circulares ou lineares, de fitas de DNA ou RNA simples ou duplo,provenientes de qualquer fonte, na qual uma série de seqüências de nucleotídeosforam ligadas ou recombinadas em uma única construção que é capaz deintroduzir um fragmento de promotor e seqüência de DNA para um geneproduzido juntamente com uma adequada seqüência de 3' não-traduzida em umacélula. "Vetor de transformação" refere-se a um vetor específico contendo umgene estrangeiro e tendo elementos em adição ao gene estrangeiro que facilitama transformação de uma determinada célula hospedeira.

Para uso na presente invenção o termo "degenerescência docódon" refere-se à natureza no código genético que permite a variação daseqüência de nucleotídeos sem afetar a seqüência de aminoácidos de umpolipeptídeo codificado. O versado na técnica está bem consciente da"preferência do códon (codon-bias)" exibidas por uma determinada célulahospedeira no uso de códons de nucleotídeos para especificar umdeterminado aminoácido. Por isso, quando sintetizando um gene para amelhoria da expressão gênica em uma célula hospedeira, é desejável que odesign do gene seja tal que a freqüência de uso do códon seja próxima dafreqüência preferencial de uso do códon da célula hospedeira.

O termo "códon otimizado" ao se referir a genes ou regiões decodificação de moléculas de ácidos nucléicos para transformação de várioshospedeiros, refere-se à alteração de códons no gene ou nas regiões decodificação das moléculas de ácido nucléico para refletir o uso típico do códondo organismo hospedeiro, sem alterar o polipeptídeo codificado pelo DNA.

O termo "meio de fermentação de produto" refere-se a um meiono qual a fermentação ocorreu de tal forma que o produto é presente no meio.

As técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem molecularutilizadas aqui são bem conhecidas na arte e são descritas por Sambrook, J.,Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, SecondEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)(deste ponto em diante do presente documento "Maniatis"); e por Silhavy, T.J., Bennan, M. L. e Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); e porAusubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado porGreene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience (1987).

A Via Biossintética de 2-Butanona ε 2-Butanol

Os carboidratos utilizando microorganismos empregam a viaEmbden-Meyerhof-Parnas (EMP), a via Entner-Doudoroff e o ciclo fosfatopentose como as vias centrais metabólicas para fornecer energia e precursorescelulares para o crescimento e manutenção. Estas vias têm em comum ointermediário gliceraldeído-3-fosfato e, finalmente, piruvato é formadodiretamente ou em combinação com a via EMP. As reações combinados deconversão de açúcar a piruvato para produzir energia (por exemplo, adenosina5' trifosfato, ATP) e reduzindo equivalentes (por exemplo, nicotinamida adeninadinucleotídeo reduzida, NADH [nicotinamide adenine dinucleotide], enicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida, NADPH [nicotinamideadenine dinucleotide phosphate]). NADH e NADPH precisam ser recicladospara suas formas oxidadas (NAD+ e NADP+, respectivamente). Na presença deelétrons inorgânicos receptores(por exemplo O2, NO3" e SO42"), os equivalentesreduzidos podem ser usados para aumentar a concentração de energia;Alternativamente, um subproduto de carbono reduzido pode ser formado.

A invenção permite a produção de 2-butanona ou 2-butanol apartir de fontes de carboidratos com microrganismos recombinantes,fornecendo uma completa via biossintética a partir de piruvato até 2-butanonaou 2-butanol. Três vias adicionais são descritas. Embora 2-butanol, pelo que sesabe, não é o principal produto de qualquer fermentação bacteriana, há umnúmero de possíveis vias para a produção de 2-butanol através de conhecidostipos de reações bioquímicas. Estas vias são mostradas na figura 1. As letras ealgarismos romanos citados abaixo correspondem às letras e algarismosromanos na figura 1, que são usados para descrever as etapas de conversão eprodutos, respectivamente. Conforme descrito abaixo, 2-butanona é umintermediário em todas destas vias biossintética de 2-butanol.

Todas as vias iniciam-se com a reação de duas moléculas depiruvato para produzir alfa-acetolactato (I), mostrado como o substrato para oproduto da conversão (a) na figura 1. A partir de alfa-acetolactato, existem 4possíveis vias para 2-butanona (V), aqui referidas como vias biossintética de2-butanona:

via 1) I--->II--->III--—>IV--->V (substrato para conversões deproduto b,c,d,e); Esta é a via da presente invenção.

2) I--->II--->III--—>IV--->V (substrato para conversões de produtob,g,h,e)3) I—>ll—>VIII—>V (substrato para conversões de produto b,i,j):

4) I—>IX—>X—>V (substrato para conversões de produto k,l,m)

A via biossintética de 2-butanol conclui-se com a conversão de 2-

butanona (V) em 2-butanol (VI). Uma discussão detalhada do substrato paraconversões de produto em cada via é dada abaixo.

Via 1:

(a) Piruvato para Alfa-Acetolactato:

O primeiro passo na via 1 é a conversão de duas moléculas depiruvato para uma molécula de alfa-acetolactato (composto I na figura 1) e umamolécula de dióxido de carbono catalisada por uma enzima dependente detiamina pirofosfato. As enzimas que catalisam este substrato para conversõesde produto (genericamente chamado ou acetolactato sintase ou sintase deácido acetohidróxi; CE 2.2.1.6 [mudado de 4.1.3.18, em 2002]) são bemconhecidas, e elas participam na via biossintética para os aminoácidosproteinogênicos Ieucina e valina, bem como na via fermentativa de produção de2,3-butanodiol e acetoína de uma série de organismos.

O versado na técnica vai apreciar o fato que os polipeptídeos tendoatividade da acetolactato sintase isolada de uma variedade de fontes serão muitoúteis na presente invenção independente da homologia da seqüência. Algunsexemplos de enzimas adequadas de acetolactato sintase estão disponíveis junto ainúmeras fontes, por exemplo, Bacillus subtilis [GenBank n° AAA22222 NCBI(National Center for Biotechnology Information) seqüência de aminoácidos (SEQID n° 77), L04470 NCBI seqüência de nucleotideos (SEQ ID n° 76)], Klebsiellaterrigena [GenBank n° AAA25055 (SEQ ID n° 79), L04507 (SEQ ID n° 78)], eKlebsiella pneumoniae [GenBank n° AAA25079 (SEQ ID n° 4), M73842 (SEQ IDn° 3)]. As enzimas preferenciais para acetolactato sintase são aquelas que têmpelo menos 80% a 85% de identidade com SEQ ID's N0 4, 77 e 79, onde pelomenos 85% a 90% de identidade é mais preferível e onde pelo menos 95% deidentidade baseada no método de alinhamento Clustal W usando os parâmetrospré-estabelecidos GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,1 e séries dematriz de peso de proteína Gonnet 250, é de máxima preferência.

f b) Alfa-Acetolactato para Acetoína:

Alfa-acetolactato (I) é convertido para acetoína (II) pela ação de umaenzima como acetolactato descarboxilase (EC 4.1.1.5). Como a acetolactatosintase, esta enzima é dependente de tiamina pirofosfato e é, também, parte naprodução de 2,3-butanodiol e acetoína por inúmeros organismos. As enzimas dediferentes fontes variam muito em tamanho (25 a 50 kilodaltons), oligomerização(dímer-hexâmero), localização (intracelular ou extracelular), e regulação alostérica(por exemplo: ativação por aminoácidos de cadeia ramificada). Para o propósitoda presente invenção, uma localização intracelular é preferível a extracelular, masoutras variações são geralmente aceitáveis.

O versado na técnica vai apreciar o fato que os polipeptídeos tendoatividade de acetolactato descarboxilase isolada de uma variedade de fontesserão muito úteis na presente invenção independente da homologia da seqüência.Alguns exemplos de enzimas adequadas de acetolactato descarboxilase estãodisponíveis junto a inúmeras fontes, por exemplo, Bacillus subtilis [GenBank n°AAA22223 (SEQ ID n° 81), L04470 (SEQ ID n° 80)], Klebsiella terrígena [GenBankn° AAA25054 (SEQ ID n° 83), L04507 (SEQ ID n° 82)] e Klebsiella pneumoniae[GenBank n° AAU43774 (SEQ ID n° 2), AY722056 (SEQ ID n° 1)].

As enzimas preferenciais para acetolactato descarboxilase sãoaquelas que têm pelo menos 80% a 85% de identidade com SEQ ID's N0 2, 81 e83 onde pelo menos 85% a 90% de identidade é mais preferível e onde pelomenos 95% de identidade baseada no método de alinhamento Clustal W usandoos parâmetros pré-estabelecidos GAP PENALTY=10, GAP LENGTHPENALTy=O, 1 e séries de matriz de peso de proteína Gonnet 250, é de máximapreferência.(c) Acetoína para 3-Amino-2-Butanol:

Existem dois tipos de reações bioquímicas conhecidas quepoderiam afetar o substrato para conversão do produto de acetoína (II) a 3-amino-2-butanol (III)1 especificamente, transaminação dependente de piridoxalfosfato utilizando um doador acessório de amino e aminação redutora diretacom amônia. Neste último caso, os equivalentes reduzidos são oferecidos naforma de um cofator reduzido de nicotinamida (NADH ou NADPH). Umexemplo de uma enzima dependente de NADH que catalisa essa reação comacetoína como um substrato é relatado por Ito et al. (Patente US N0 6.432.688).Qualquer estereoespecificidade desta enzima não foi avaliada. Um exemplo deum piridoxal dependente de fosfato transaminase que catalisa a conversão deacetoína a 3-amino-2-butanol tem sido relatado por Shin e Kim (acima). Estaenzima foi aqui mostrada no exemplo 13 para converter tanto o isômero (R) deacetoína para o isômero (2R,3S) de 3-amino-2-butanol e o isômero (S) deacetoína para o isômero (2S,3S) de 3-amino-2-butanol. Qualquer tipo deenzima (isto é, transaminase ou aminase reduzida) é considerado para ser umaacetoína aminase e pode ser utilizado na produção de 2-butanol. Outrasenzimas neste grupo podem ter diferentes estereoespecificidades.

O versado na técnica vai apreciar o fato que os polipeptídeos tendoatividade da acetoína aminase isolada de uma variedade de fontes serão muitoúteis na presente invenção independente da homologia da seqüência. Umexemplo desta atividade foi aqui descrito e é identificado como SEQ ID n° 122.Conseqüentemente, as enzimas preferenciais para acetoína aminase sãoaquelas que têm pelo menos 80% a 85% de identidade com SEQ ID's N0 2, eonde pelo menos 85% a 90% de identidade é mais preferível e onde pelo menos95% de identidade baseada no método de alinhamento Clustal W usando osparâmetros pré-estabelecidos GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,1e séries de matriz de peso de proteína Gonnet 250, é de máxima preferência.(d) 3-Amino-2-Butanol para 3-Amino-2-Butanol O-Fosfato:

Não existem enzimas conhecidas na técnica que catalisam osubstrato para conversão do produto de 3-amino-2-butanol (III) a fosfato de 3-amino-2-butanol (IV). No entanto, foi demonstrado que algumas espécies dePseudomonas e Erwinia expressam etanolamina quinase dependente de ATP (EC2.7.1.82) que lhes permitem utilizar etanolamina ou 1-amino-2-propanol como umafonte de nitrogênio (Jones et al. (1973) Biochem. J. 134:167-182). É provável queesta enzima também tenha atividade para 3-amino-2-butanol ou possa serprojetada para fazê-lo, proporcionando assim uma aminobutanol quinase. Apresente invenção descreve, no exemplo 14, um gene de Erwinia carotovorasubespécie atroseptica (SEQ ID n° 123) que codifica uma proteína (SEQ ID n° 24).Esta proteína foi identificada como um aminoálcool quinase. Esta enzima pode serusada para converter 3-amino-2-butanol a 3-amino-2-butanol O-fosfato.

O versado na técnica vai apreciar o fato que os polipeptídeos tendoatividade de aminobutanol quinase isolada de uma variedade de fontes serãomuito úteis na presente invenção independente da homologia da seqüência. Umexemplo desta atividade foi aqui descrito e é identificado como SEQ ID n° 124.Conseqüentemente, as enzimas preferenciais para aminobutanol quinase sãoaquelas que têm pelo menos 80% a 85% de identidade com SEQ ID n° 124, eonde pelo menos 85% a 90% de identidade é mais preferível e onde pelo menos95% de identidade baseada no método de alinhamento Clustal W usando osparâmetros pré-estabelecidos GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,1e séries de matriz de peso de proteína Gonnet 250, é de máxima preferência.

íe) Fosfato de 3-Amino-2-Butanol a 2-Butanona:

Embora não existam enzimas conhecidas para catalisar osubstrato para produzir a conversão do 3-amino-2-butanol fosfato (IV) para2-butanona (V), o substrato é muito semelhantes aos utilizados pelaenzima piridoxal dependente de fosfato fosfoetanolamina fosfoliase, quetem sido encontrada em um pequeno número de espécies dePseudomonas e Erwinia. Estas enzimas têm atividade dirigida afosfoetanolamina e a ambos os enantiômeros de fosfo-1-2-aminopropano(1973) Biochem. J. 134:167-182), e pode, também ter atividade dirigida a3-amino-2-butanol O-fosfato. Identificado na presente invenção é um genede Erwinia carotovora subespécie atroseptica (SEQ ID n° 125) que codificauma proteína (SEQ ID n° 126) com homologia para as aminotransferasesclasse III. O exemplo 15 demonstra que esta enzima é ativa em ambossubstratos de fosfato de aminopropanol e fosfato de aminobutanol. Aenzima recém-identificada e caracterizada foi capaz de catalisar aconversão de uma mistura de (f?)-3-amino-(SJ-2-butanol e (SJ-S-amino-fRJ-2-butanol O-fosfato, e uma mistura de (7?)-3-amino-(R,)-2-butanol e (S)-3-amino-(S,)-2-butanol O-fosfato a 2-butanona. A enzima recém-identificadae caracterizada foi também capaz de catalisar a conversão de ambos (R) e(S)-2-amino-l-propanol fosfato a propanona, com uma preferência por (S)-2-amino-1-propanol fosfato. A maior atividade foi observada com osubstrato natural proposto DL-1-amino-2-propanol fosfato, que foiconvertido para propionaldeído.

O versado na técnica vai apreciar o fato que os polipeptídeos tendoatividade de aminobutanol fosfato fosfoliase isolada de uma variedade de fontesserão muito úteis na presente invenção independente da homologia da seqüência.Um exemplo de uma adequada enzima aminobutanol fosfato fosfoliase é descritana presente invenção como SEQ ID n° 126. Conseqüentemente, as enzimaspreferenciais para aminobutanol fosfato fosfoliase são aquelas que têm pelomenos 80% a 85% de identidade com SEQ ID n° 126, e onde pelo menos 85% a90% de identidade é mais preferível e onde pelo menos 95% de identidadebaseada no método de alinhamento Clustal W usando os parâmetros pré-estabelecidos GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,1 e séries de< matriz de peso de proteína Gonnet 250, é de máxima preferência.

(f) 2-Butanona a 2-Butanol:

A etapa final em todas as vias para produzir 2 - butanol a partirde ácido pirúvico é a redução de 2-butanona (V) em 2-butanol (VI). Estesubstrato para conversão do produto é catalisado por alguns membros daclasse ampla de álcoois desidrogenases (formas utilizando tanto NADH ouNADPH como fonte de hidreto, dependendo da enzima) que podem serchamadas de butanol desidrogenases. As enzimas de cada tipo que catalisama redução de 2-butanona são bem conhecidas, como descrito acima, nadefinição de butanol desidrogenase.

O versado na técnica vai apreciar o fato que os polipeptídeostendo atividade de butanol desidrogenase isolada de uma variedade de fontesserão muito úteis na presente invenção independente da homologia daseqüência. Alguns exemplos de enzimas adequadas de butanoldesidrogenase estão disponíveis junto a inúmeras fontes, por exemplo,Rhodococcus ruber [GenBank n° CAD36475 (SEQ ID n° 14), AJ491307 (SEQID n° 13)]. As enzimas dependentes de NADP são conhecidas como EC1.1.1.2 e estão disponíveis, por exemplo, a partir de Pyrococcus furiosus[GenBank n° AAC25556 (SEQ ID n° 91), AF013169 (SEQ ID n° 90)].Adicionalmente, uma butanol desidrogenase está disponível a partir deEseheriehia eoli [GenBank n° NP_417484 (SEQ ID n° 75), NC_000913 (SEQID n° 74)] e uma cicloexanol desidrogenase está disponível a partir deespécimes de Aeinetobaeter [GenBank n° AAG10026 (SEQ ID n° 72),AF282240 (SEQ ID n° 71)]. As enzimas preferenciais para butanoldesidrogenase são aquelas que têm pelo menos 80% a 85% de identidadecom SEQ ID's N0 14, 91, 75 e 72, onde pelo menos 85% a 90% de identidadeé mais preferível e onde pelo menos 95% de identidade baseada no métodode alinhamento Clustal 72 W usando os parâmetros pré-estabelecidos GAPPENALTY=101 GAP LENGTH PENALTY=0,1 e séries de matriz de peso deproteína Gonnet 250, é de máxima preferência.

Via 2:

(a) Piruvato a Alfa-Acetolactato:

Este substrato para conversão do produto é o mesmo descritoacima para a via 1.

(b) Alfa-Acetolactato a Acetoína:Este substrato para conversão do produto é o mesmo descritoacima para a via 1.

(g) Acetoína a Fosfoacetoína:

Embora as enzimas que catalisam o substrato à conversão doproduto de acetoína (II) para fosfoacetoína (VII) não foram descritas, aestrutura do substrato acetoína é muito semelhante a da dihidróxi acetona, e,portanto, acetoína pode ser um substrato aceitável para dihidróxi acetonaquinase (CE 2.7.1.29), uma enzima que catalisa fosforilação de dihidróxiacetona. Técnicas de engenharia de proteína para a alteração deespecificidade do substrato das enzimas são bem conhecidas (Antikainen andMartin (2005) Bioorg. Med. Chem. 13:2701-2716) e podem ser usadas paragerar uma enzima com a especificidade necessária. Nesta conversão, a porçãode fosfato pode ser fornecida por qualquer doador de fosfato de alta energiabiológica, com o substrato comum sendo fosfoenolpiruvato (como na E. colidihidroacetona quinase) e ATP (como na Citrobacter freundii dihidroacetonaquinase) (Garcia-Alles et al. (2004) Biochemistry 43:13037-13045).

(h) Fosfoacetoína a 3-Amino-2-Butanol O-Fosfato:

Embora as enzimas que catalisam o substrato à conversão doproduto de fosfoacetoína (VII) para 3-amino-2-butanol O-fosfato (IV) não foramdescritas, a estrutura do substrato é muito semelhante a do fosfato de dihidróxiacetona um substrato para o proposto serinol fosfato aminotransferasecodificadas através da porção 5' do gene da rtxA em algumas espécies deBradyrhizobium (Yasuta et al., acima). Assim, uma serinol fosfatoaminotransferase pode ser funcional nesta etapa.

fe) 3-Amino-2-Butanol O-Fosfato a 2-Butanona:

Este substrato para conversão do produto é o mesmo descritoacima para via 1.

(f) 2-Butanona a 2-Butanol:

Este substrato para conversão do produto é o mesmo descritoacima para via 1.

Via 3:

(a) Piruvato a Alfa-Acetolactato :

Este substrato para conversão do produto é o mesmo descritoacima para via 1. (b) alfa-acetolactato a acetoína:

Este substrato para conversão do produto é o mesmo descritoacima para via 1.

íi) Acetoína a 2,3-Butanodiol:

O substrato para conversão de produto de acetoína (II) de 2,3-butanodiol (VIII) pode ser catalisado por uma butanodiol desidrogenase, quetanto podem utilizar NADH ou NADPH como a fonte de equivalentesreduzidos durante a realização de reduções. Enzimas com atividade dirigida aacetoína participam na via para a produção de 2,3-butanodiol em organismosque produzem esse composto. As enzimas relatadas aqui (por exemplo,BudC de Klebsiella pneumoniae (Ui et al. (2004) Letters in AppliedMicrobiology 39:533-537) geralmente utilizam NADH. Qualquer cofator éaceitável para utilização na produção de 2-butanol por esta via.

(i) 2,3-Butanodiol a 2-Butanona:

O substrato para conversão de produto de 2,3-butanodiol (VIII) em2-butanona (V) pode ser catalisada por enzimas desidratase diol (CE 4.2.1.28) eenzimas glicerol desidratase (EC 4.2.1.30). A melhor caracterizada dioldesidratase é a coenzima dependente de B12 da enzima Klebsiella oxytoca, masenzimas similares são encontrados em um número de bactérias entéricas. Foimostrado que a enzima K. oxytoca aceita meso-2,3-butanodiol como umsubstrato (Bachovchin et al. (1977) Biochemistry 16:1082-1092), produzindo oproduto desejado 2-butanona. O exemplo 17 mostra que a glicerol desidrataseKlebsiella pneumoniae foi capaz de converter meso-2,3-butanodiol em 2-butanona. As três subunidades da glicerol desidratase Klebsiella pneumoniae(alfa: SEQ ID n° 145 (região de codificação) e 146 (proteína); beta: SEQ ID n°147 (região de codificação) e 148 (proteína); e gama: SEQ ID n° 149 (região decodificação) e 150 (proteína)) foram expressos em conjunto com as duassubunidades da Klebsiella pneumoniae glicerol desidratase reativase, SEQ ID n°151 (região de codificação) e 152 (proteína); e pequena subunidade, SEQ ID n°153 (região de codificação) e 154 (proteína)) para fornecer atividade.

Existem também relatos na literatura de um independente B12diol desidratase a partir de Clostridium glycolicum (Hartmanis et al. (1986)Arch. Biochem. Biophys. 245:144-152). Esta enzima tem atividade para 2,3-butanodiol, embora esta atividade seja inferior a 1% da atividade dirigida aetanodiol, mas a enzima pode ser projetada para melhorar essa atividade. Amelhor caracterizada desidratase independente de B12 é o gliceroldesidratase de Clostridium butyricum (0'Brien et al. (2004) Biochemistry43:4635-4645), que tem uma alta atividade para 1,2-propanodiol, bem comopara glicerol. Esta enzima usa S-adenosil metionina como uma fonte deradical adenosil. Não há relatos de atividade para 2,3-butanodiol, mas essaatividade, se já não estiver presente, pode eventualmente ser manipulada.

(f) 2-Butanona a 2-Butanol:

Este substrato para conversão do produto é o mesmo descritoacima para via 1.Via 4:

(a) Piruvato a Alfa-Acetolactato:

Este substrato para conversão do produto é o mesmo descritoacima para via 1.

(k) Alfa-Acetolactato a Ácido 2.3-Di-hidróxi-2-Metil-butanóico:

O substrato para conversão do produto de acetolactato (I) a ácido2,3-di-hidróxi-2-metil-butanóico (IX) não é conhecido na técnica. Entretanto, oproduto desta conversão foi relatado como um componente dos meios d efermentação (Ziadi et al. (1973) Comptes Rendus des Seances de !'Academiedes Sciences, Serie D: Sciences Naturelles 276:965-8), mas o mecanismo deformação é desconhecido. O provável mecanismo de formação é a redução deacetolactato com o NADH ou NADPH como o doador de elétrons. Para utilizaresta via para a produção de 2-butanol, uma enzima catalisando essa reaçãoprecisa ser identificada ou produzida. Entretanto, o precedente para reduçãoenzimática de cetonas a alcoóis está bem estabelecida.

(I) Ácido 2.3-Di-hidróxi-2-Metil-butanóico a Ácido 2-Hidróxi-2-Metil-3-Fosfobutanóico:

Não existem enzimas conhecidas que catalisam o substrato paraa conversão do produto de ácido 2,3-di-hidróxi-2-metil-butanóico (IX) a ácido 2-hidróxi-2-metil-3-fosfobutanóico (X). Entretanto, há um grande número dequinases na natureza que possuem especificidades variadas. Por conseguinte,é provável que uma enzima possa ser isolada ou produzida com essaatividade.

(m) ácido 2-hidróxi-2-metil-3-fosfobutanóico a 2-butanona:

Não existem enzimas conhecidas que catalisam o substrato paraconversão de produto de ácido 2-hidróxi-2-metil-3-fosfobutanóico (X) em 2-butanona (V). A combinação desta reação com a anterior, é muito parecidacom a reação multi-etapa catalisada por mevalonato-5-pirofosfato (M5PP)descarboxilase, que consiste na fosforilação inicial da M5PP a 3-fosfomevalonato-5-ΡΡ, seguido de decarboxilação dependente da eliminaçãode fosfato (Alvear et al. (1982) Biochemistry 21:4646-4650).

(f) 2-Butanona a 2-Butanol:

Este substrato para conversão do produto é o mesmo descritoacima para via 1.

Assim, quando se fornece múltiplas vias recombinantes a partir depiruvato para 2-butanol, existe uma série de opções para atender as etapas deconversão individuais, e o versado na técnica será capaz de utilizar seqüênciaspublicamente disponíveis e seqüências divulgadas aqui para construir as vias deinteresse. Uma listagem de um número representativo de genes conhecidos natécnica e úteis na construção de vias biossintéticas de 2-butanol é dada sobretudonas tabelas 1 e 2.

Hospedeiros Microbianos para Produção de 2-Butanol ε 2-Butanona

Os hospedeiros microbianos para produção de 2-butanol e 2-butanona podem ser selecionados a partir de bactérias, cianobactérias,fungos filamentosos e leveduras. Os hospedeiros microbianos para produçãode 2-butanol e 2-butanona devem ser tolerantes ao produto produzido, demodo que a produtividade não é limitada pela toxicidade do produto para ohospedeiro. A seleção de um hospedeiro microbiano para produção de 2-butanol é descrita em detalhe abaixo. Os mesmos critérios são aplicáveis àseleção de um hospedeiro para produção de 2-butanona.

Os micróbios que são metabolicamente ativos em altos níveis detitulagem de 2-butanol não são bem conhecidas na técnica. Embora mutantestolerantes a butanol fossem isolados de solventogenic Clostridia, existe poucainformação disponível sobre a tolerância de butanol de outras cepas bacterianaspotencialmente úteis. A maioria dos estudos sobre a comparação da tolerância deálcool em bactérias sugerem que butanol é mais tóxico do que etanol (de Cavalhoet al., Microsc. Res. Tech. 64:215-22 (2004) e Kabelitz et al., FEMS Microbioi Lett.220:223-227 (2003)). Tomas et al. (J. Bacteriol. 186:2006-2018 (2004)) afirmamque o rendimento de 1-butanol durante a fermentação em Clostridiumacetobutylicum pode ser limitada pela toxicidade ao butanol. O principal efeito do1-butanol sobre Clostridium acetobutylicum é o interrupção das funções damembrana (Hermann et al., Appl. Environ. Microbiol. 50:1238-1243 (1985)).

Os hospedeiros microbianos selecionados para a produção de 2-butanol devem ser tolerantes ao 2-butanol e deverão ser capazes deconverter carboidratos a 2-butanol utilizando a via biossintética introduzidas.Os critérios para seleção de hospedeiros microbianos adequados incluem oseguinte: a tolerância intrínseca ao 2-butanol, alta taxa de utilização decarboidratos, a disponibilidade de ferramentas genéticas para a manipulaçãogenética e a capacidade de gerar alterações cromossômicas estáveis.

As cepas hospedeiras adequadas com uma tolerância para 2-butanol podem ser identificadas pelo teste com base na intrínseca tolerância dacepa. A tolerância intrínseca dos micróbios ao 2-butanol pode ser medida peladeterminação da concentração de 2-butanol que é responsável por 50% deinibição da taxa de crescimento (IC50), quando cultivado em um meio mínimo.Os valores de IC50 podem ser determinados usando métodos conhecidos natécnica. Por exemplo, os micróbios de interesse podem ser cultivados napresença de várias quantidades de 2-butanol e a taxa de crescimentomonitorada pela medição da densidade óptica em nanômetros 600. O tempopara duplicar pode ser calculado a partir da parte logarítmica da curva decrescimento e utilizada como uma medida da taxa de crescimento. Aconcentração de 2-butanol que produz 50% de inibição de crescimento podeser determinada a partir de um gráfico da porcentagem de inibição decrescimento versus a concentração de 2-butanol. Preferencialmente, cepahospedeira deveria ter uma IC50 para 2-butanol de mais de cerca de 0,5%.Mais adequado é uma cepa hospedeira com uma IC50 para 2-butanol que émaior do que cerca de 1,5%. Particularmente adequado é uma cepahospedeira com uma IC50 para 2-butanol que é maior do que cerca de 2,5%.

O hospedeiro microbiano para produção de 2-butanol tambémdeve utilizar glicose e/ou outros carboidratos em uma taxa alta. A maioria dosmicróbios são capazes de utilizar carboidratos. Entretanto, certos micróbiosambientais não podem usar eficientemente os carboidratos, e portanto nãoseriam hospedeiros adequados.

A habilidade de modificar geneticamente o hospedeiro éessencial para a produção de qualquer microorganismo recombinante. Modosde tecnologia de transferência de gene que podem ser utilizados incluem poreletroporação, conjugação, transdução ou transformação natural. Uma amplagama de plasmídeos conjugativos hospedeiros e de marcadores resistentes amedicamentos estão disponíveis. Os vetores de clonagem usados com umorganismo são personalizados para o organismo hospedeiro com base nanatureza dos marcadores resistentes a antibióticos que podem funcionarneste hospedeiro.

O hospedeiro microbiano pode, também, ser manipulado parainativar vias concorrentes para fluxo de carbono pela ativação de váriosgenes. Isto exige a disponibilização de ou transpósons ou vetores deintegração cromossômicos para inativação direta. Adicionalmente, oshospedeiros de produção que são propensos a mutagênese química podesofrer aprimoramento na intrínseca tolerância a 2-butanol através demutagênese química e triagem de mutantes.

Com base nos critérios acima descritos, hospedeiros microbianosadequados para a produção de 2-butanol e 2-butanona incluem, mas não estãolimitados a, os membros do gênero Clostrídium, Zymomonas, Escherichia,Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus,Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter,Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula e Saccharomyces.Hospedeiros preferenciais incluem: Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus,Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis,Pseudomonas putida, Lactobacillus plantamm, Enteroeoceus faeeium,Enteroeoceus gallinarium, Enteroeoceus faecalis, Pediococcus pentosaceus,Pediococcus acidilactici, Bacillus subtilis e Saccharomyces cerevisiae.

Construção de Hospedeiro de Produção

Os organismos recombinantes contendo os genes necessáriosque codificam a via enzimática para a conversão de um substrato de carbonofermentável para 2-butanol ou 2-butanona podem ser construídos com técnicasbem conhecidas na técnica. Na presente invenção, os genes que codificamenzimas da via biossintética 1 do 2-butanol: acetolactato sintase, acetolactatodescarboxilase, acetoína aminase (ou amina: piruvato transaminase),aminobutanol quinase, aminobutanol O-fosfato Iiase e butanol desidrogenaseou via 1 biossintética de 2-butanona omitindo o butanol desidrogenase, podemser isoladas a partir de várias fontes, como descrito acima.

Métodos para obtenção dos genes desejados de um genomabacteriano são comuns e bem conhecidas na técnica de biologia molecular. Porexemplo, se a seqüência do gene é conhecida, iniciadores podem ser projetadose a pretendida seqüência amplificada utilizando-se métodos de amplificaçãopadrão de iniciador direcionados como a reação em cadeia da polimerase(Patente U.S. N0 4.683.202) para obter quantidades de DNA adequadas paraclonagem em vetores de expressão. Se um gene que é heterólogo para umaseqüência conhecida deve ser isolado, bibliotecas genômicas adequadas podemser criadas pela digestão da endonuclease de restrição e pode ser testada comsondas tendo seqüência complementar para a desejada seqüência genética.

Uma vez que a seqüência é isolada, o DNA pode ser amplificado utilizando-semétodos de amplificação padrão de iniciador direcionados como a reação emcadeia da polimerase (Patente U.S. N0 4.683.202) para obter quantidades deDNA adequadas para clonagem em vetores de expressão, que são entãotransformados em células hospedeiras adequadas.

Além disso, dada a seqüência de aminoácidos de uma proteína comatividade enzimática desejada, a seqüência de codificação pode ser verificadapela tradução reversa da seqüência de proteína. Um fragmento de DNA contendoa seqüência de codificação pode ser preparado sinteticamente e clonado em umvetor de expressão, e então transformado na célula hospedeira desejada.

Ao preparar um fragmento de DNA sintético contendo umaseqüência de codificação, esta seqüência pode ser otimizada para expressãona célula hospedeira procurada. As ferramentas para otimização do códon paraexpressão em um hospedeiro heterólogo estão prontamente disponíveis.Algumas ferramentas de otimização do códon estão disponíveis baseadas noconteúdo GC do organismo hospedeiro. O conteúdo GC de alguns hospedeirosmicrobianos exemplificadores são dados na tabela 3.

Tabela 3

Conteúdos GC de Hospedeiros Microbianos

<table>table see original document page 46</column></row><table>Uma vez que os genes relevantes para a via são identificado eisolados eles podem ser transformados em hospedeiros de expressãoadequados por meios bem conhecidos na técnica. Os vetores úteis para atransformação de uma grande variedade de células hospedeiras são comuns ecomercialmente disponíveis a partir de empresas como EPICENTRE®(Madison, Wl), Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA), Stratagene (La Jolla, CA) eNew England Biolabs1 Inc. (Beverly, MA). Tipicamente o vetor contém ummarcador selecionável e seqüências que permitem a replicação autônoma ouintegração cromossômica no hospedeiro desejado. Além disso, vetoresadequados compreendem uma região promotora que abriga controles deiniciação transcricional e uma região de controle transcricional de terminação,entre os quais um fragmento de DNA da região de codificação pode serinserido, para fornecer a expressão da região de codificação inserida. Ambasas regiões de controle podem ser derivadas a partir de genes homólogos àcélula hospedeira transformada, embora deve ser entendido que tais regiõesde controle também podem ser derivadas de genes que não são nativos paraas espécies específicas escolhidas como hospedeiros de produção.

As regiões de controle de iniciação ou promotores, os quais sãoúteis para dirigir a expressão relevante nas regiões de codificação da via dacélula hospedeira pretendida, são numerosos e familiares para os versados natécnica. Virtualmente qualquer promotor capaz de acionar estes elementosgenéticos é adequado para a presente invenção, incluindo, mas não limitado a,promotores derivados dos seguintes genes:CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1,PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1 TPI, CUPI, FBA, GPDe GPM (útil para expressão em Saccharomyces); AOX1 (útil para expressão emPichia)] bem como os promotores Iac1 ara, tet, trp, IPL, IPr, T7, tac, e trc (útil paraexpressão em Eseheriehia eoli, Alealigenes e Pseudomonas); os promotoresamy, apr e npr e vários fagos e promotores úteis para expressão em Bacillussubtilis, Bacillus Iicheniformis e Paenibacillus macerans; nisA (útil para expressãode Gram-positive bactéria, Eichenbaum et ai. Appl. Environ. Microbioi64(8):2763-2769 (1998)); e o promotor sintético P11 (útil para expressão emLactobacillus plantarum, Rud et al., Microbiology 152:1011-1019 (2006)).

As regiões de controle de terminação podem, também, serderivadas de vários genes nativos para os hospedeiros preferenciais.Opcionalmente, um sítio de terminação pode ser desnecessário, Entretanto,se incluído, isto é de máxima preferência.

Certos vetores são capazes de replicarem em uma ampla gamade bactérias hospedeiras e podem ser transferidos por conjugação. Aseqüência completa e anotada de pRK404 e três vetores relacionados,pRK437, pRK442 e pRK442(H), estão disponíveis. Essas derivações provaramser valiosas ferramentas para a manipulação genética em bactérias gram-negativas (Scott et al., Plasmid 50(1):74-79 (2003)). Vários plasmídeosderivados da ampla faixa de hospedeiros Inc P4 plasmídeo RSF1010 tambémestão disponíveis com os promotores que podem funcionar em uma variedadede bactérias gram-negativas. Os plasmídeos pAYC36 e pAYC37, têm ativospromotores junto com os múltiplos locais de clonagem para permitir a genesheterólogos a expressão genética em bactérias gram-negativas.

As ferramentas cromossômicas de substituição genética tambémestão,amplamente disponíveis. Por exemplo, uma variante termosensível daampla faixa de hospedeiros replicon pWV101 foi alterado de modo a construirum plasmídeo pVE6002 que pode ser utilizado para produzir substituiçãogenética em uma faixa de bactérias Gram-positivas (Maguin et al., J. Baeteriol.1 74(17):5633-5638 (1992)). Adicionalmente, transposons in vitro estãodisponíveis junto a fontes comerciais como EPICENTRE® para criar mutaçõesaleatórias em diversos genomas.

A expressão de uma via biossintética de 2-butanol em várioshospedeiros preferenciais microbianos é descrita com mais detalhes abaixo.Para a expressão de uma via biossintética de 2-butanona, a mesma descriçãose aplica, mas o substrato final para conversão do produto de 2-butanonapara 2-butanol é omitido.

Expressão da Via Biossintética de 2-Butanol ou 2-Butanona em E. Coli

Os vetores úteis para a transformação de E. coli são comuns ecomercialmente disponíveis a partir das empresas listadas acima. Por exemplo,os genes de uma via biossintética de 2-butanol podem ser isolados a partir devárias fontes, como descrito acima, clonados em um vetor pUC19 modificado etransformados em E. coli NM522, conforme descrito nos exemplos 6 e 7.

Alternativamente, os genes que codificam uma via biossintética de 2-butanolpodem ser divididos em múltiplos operons, clonados para expressão devetores, e transformados em diversas cepas E. coli, conforme descrito nosexemplos 9, 10 e 11. A via biossintética de 2-butanona pode ser expressa deforma semelhante, omitindo o butanol desidrogenase.

Expressão da Via Biossintética de 2-Butanol ou 2-Butanona emRhodococcus Erythropolis

Uma série de vetores de transferência de E. coli-Rhodococcusestão disponíveis para expressão em R. erythropolis, incluindo, mas não selimitando a pRhBR17 e pDA71 (Kostichka et al., Appi Microbioi Biotechnol.62:61-68 (2003)). Adicionalmente, uma série de promotores estão disponíveispara expressão de gene heterólogo em R. erythropolis (consulte por exemploNakashima et ai, Appl. Environ. Microbioi 70:5557-5568 (2004), e Tao et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, DOI 10.1007/s00253-005-0064). Asrupturas de gene visadas nos genes cromossômicos do R. erythropolis podemser criadas utilizando os métodos descritos por Tao et al. acima, e Brans et al.(Appl. Envion. Microbiol. 66: 2029-2036 (2000)).

Os genes heterólogos necessários para a produção de 2-butanol,como descrito acima, podem ser clonados inicialmente em pDA71 ou pRhBR71e transformados em E. coli. Os vetores podem então ser transformado em R.erythropolis por eletroporação, conforme descrito por Kostichka et al., acima.Os recombinantes podem ser cultivados em meio sintético contendo glicose e aprodução de 2-butanol pode acontecer ao se usar métodos de fermentaçãoconhecidos na técnica. A via biossintética de 2-butanona pode ser expressa deforma semelhante, omitindo o butanol desidrogenase.Expressão da Via Biossintética de 2-Butanol ou 2-Butanona em B. SubtilisOs métodos para a expressão dos genes e criação de mutaçõesem B. subtilis também são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, os genesde uma via biossintética de 2-butanol podem ser isolados a partir de váriasfontes, como descrito acima, clonados em um vetor de transformação modificadaE. coli-BacilIus e transformados em Bacillus subtilis BE1010, conforme descritono exemplo 8. Os genes desejados podem ser clonados em um vetor deexpressão Bacillus e transformados em uma cepa para fazer um hospedeiro deprodução. Alternativamente, os genes podem ser integrados no cromossomoBacillus utilizando replicons condicionais ou vetores suicidas que são conhecidaspara o versado na técnica. Por exemplo, o "Bacillus Genetic Stock Center"possui numerosos vetores de integração. A via biossintética de 2-butanona podeser expressa de forma semelhante, omitindo o butanol desidrogenase.

Expressão da Via Biossintética de 2-Butanol ou 2-Butanona em b.

Licheniformis

A maioria dos plasmídeos e vetores de transferência que replicamem B. subtilis pode m ser usados para transformar B. Iicheniformis por outransformação por protoplastos ou por eletroporação. Os genes necessáriospara a produção de 2-butanol podem ser clonados em plasmídeos pBE20 oupBE60 derivados (Nagarajan et al., Gene 114:121-126 (1992)). métodos paratransformar B. Iieheniformis são conhecidas na técnica (por exemplo consulteFleming et al. Appl. Environ. Microbiol., 61(11):3775-3780 (1995)). Osplasmídeos construídos para a expressão em B. subtilis podem sertransformados em B. Iicheniformis para produzir um hospedeiro microbianorecombinante que produz 2-butanol. A via biossintética de 2-butanona pode serexpressa de forma semelhante, omitindo o butanol desidrogenase.

Expressão da Via Biossintética de 2-Butanol ou 2-Butanona em

Paenibacillus Macerans

Os plasmídeos podem ser construídos como descrito acima para aexpressão em B. subtilis e utilizados para transformar Paenibacillus maceranspela transformação protoplasta para a produção um hospedeiro microbianorecombinante que produz 2-butanol. A via biossintética de 2-butanona pode serexpressa de forma semelhante, omitindo o butanol desidrogenase.

Expressão da Via Biossintética de 2-Butanol ou 2-Butanona emAlcaligenes (Ralstonia) Eutrophus

Os métodos para a expressão dos genes e criação de mutações naAlcaligenes eutrophus são conhecidos na técnica (consulte por exemplo Taghaviet al., Appl. Environ. Mierobiol., 60(10):3585-3591 (1994)). Os genes para umavia biossintética de 2-butanol podem ser clonados em qualquer um dos vetoresda ampla faixa de hospedeiros descrita acima, e através de eletroporação emAlealigenes eutrophus gerar recombinantes que produzem 2-butanol. A poli via(hidroxibutirato) em Alealigenes tem sido descrita em pormenor, uma variedadede técnicas genéticas para modificar o genoma do Alealigenes eutrophus sãoconhecidas, e essas ferramentas podem ser aplicadas para projetar uma viabiossintética de 2-butanol. A via biossintética de 2-butanona pode ser expressade forma semelhante, omitindo o butanol desidrogenase.

Expressão da Via Biossintética de 2-Butanol ou 2-Butanona empseudomonas putida

Os métodos para expressão genética em Pseudomonas putidasão conhecidos na técnica (consulte por exemplo Ben-Bassat et al., PatenteU.S. N0 6.586.229, que é aqui incorporada, por referência). Os genes de umavia biossintética de 2-butanol podem ser inseridos em pPCU18, e este DNAligado pode ser eletroporado em células eletrocompetentes de Pseudomonasputida D0T-T1 C5aAR1 para gerar recombinantes que produzem 2-butanol. Avia biossintética de 2-butanona pode ser expressa de forma semelhante,omitindo o butanol desidrogenase.

Expressão da Via Biossintética de 2-Butanol ou 2-Butanona em

Lactobacillus Plantarum

O gênero Lactobacillus pertence à família Lactobacillales e muitosplasmídeos e vetores utilizados na transformação de Bacillus subtilis eStreptococcus podem ser usados para Laetobaeillus. Alguns exemplos não-Iimitadores de vetores adequados incluem pAMâl e derivados dessassubstâncias (Renault et al., Gene 183:175-182 (1996); e O1SuIIivan et al., Gene137:227-231 (1993)); pMBB1 e pHW800, um derivado de pMBB1 (Wyckoff etal. Appl. Environ. Mierobiol. 62:1481-1486 (1996)); pMG1, um plasmídeoconjugativo (Tanimoto et al., J. Baeteriol. 184:5800-5804 (2002)); pNZ9520(Kleerebezem et al., Appl. Environ. Mierobiol. 63:4581-4584 (1997)); pAM401(Fujimoto et al., Appl. Environ. Mierobiol. 67:1262-1267 (2001)); e pAT392(Arthur et al., Antimierob. Agents Chemother. 38:1899-1903 (1994)). Váriosplasmídeo a partir de Laetobaeillus plantarum têm também sido divulgados (vanKranenburg et al., Appl. Environ. Mierobiol. 71 (3): 1223-1230 (2005)).

Os vários genes para uma via biossintética de 2-butanol podem sermontados em qualquer vetor adequado, como aqueles descritos acima. Oscódons podem ser otimizados para expressão com base no índice de códondeduzido a partir de seqüências de genoma de Laetobaeillus plantarum ouLaetobaeillus arizonensis. Os plasmídeos podem ser introduzidos em uma célulahospedeira usando-se métodos conhecidos na técnica, como eletroporação(Cruz-Rodz et al. Molecular Genetics and Genomics 224:1252-154 (1990),Bringel, et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 664-670 (1990), Alegre et al.,FEMS Microbiology Ietters 241:73-77 (2004)), e conjugação (Shrago et al., Appl.Environ. Microbiol. 52:574-576 (1986)). Osgenes da via biossintética de 2-butanol podem também ser integrados no cromossomo de Lactobacillus usandovetores de integração (Hols et al., Appl. Environ. Microbiol. 60:1401-1403 (1990),Jang et al., Micro. Lett. 24:191-195 (2003)). A via biossintética de 2-butanonapode ser semelhantemente expressa omitindo a butanol desidrogenase.

Expressão da Via Biossintética de 2-Butanol ou 2-Butanona emEnterococcus faecium. Enterococcus Gallinarium ε Enterococcus Faecalis

O gênero Enterococcus pertence à família Lactobacillales emuitos plasmídeos e vetores utilizados na transformação de Lactobacillus,Bacillus subtilis e Streptococcus, descritos acima, podem ser usados paraEnterococcus. Os vetores de expressão para E. faecalis usando o gene nisA apartir de Lactococcus podem também ser usados (Eichenbaum et al., Appl.Environ. Microbiol. 64:2763-2769 (1998). Adicionalmente, vetores desubstituição genética no cromossomo E. faecium podem ser usados(Nallaapareddy et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:334-345 (2006)).

Os vários genes para uma via biossintética de 2-butanol podemser montados em qualquer vetor adequado, como aqueles descritos acima. Oscódons podem ser otimizados para expressão com base no índice de códondeduzido a partir de seqüências de genoma de Enterococcus faecalis ouEnterococcus faecium. Os plasmídeos podem ser introduzidos na célulahospedeira por meio de métodos conhecidos na técnica, como a eletroporação,conforme descrito por Cruz-Rodz et al. (Molecular Genetics and Genomics224:1252-154 (1990)) ou conjugação, conforme descrito por Tanimoto et al. (J.BacterioL 184:5800-5804 (2002)) e Grohamann et al. (Microbiol. Mol Biol. Rev.67:277-301 (2003)). A via biossintética de 2-butanona pode ser expressa deforma semelhante, omitindo o butanol desidrogenase.Expressão da Via Biossintética de 2-Butanol ou 2-Butanona em PediococcusPentosaceus ε Pediococcus Acidilactici.

O gênero Pediococcus pertence à família Lactobacillales e muitosplasmídeos e vetores utilizados na transformação de Bacillus subtilis eStreptococeus, descritos acima, podem ser usados para Pediococcus. Umexemplo não-limitador de um vetor adequado é pHPS9 (Bukhtiyarova et al.Appl. Environ. Mierobioi 60:3405-3408 (1994)). Vários plasmídeos a partir dePediococcus têm também sido divulgados (Alegre et al., FEMS Mierobioi Lett.250:151-156 (2005); Shareck et al. Crit. RevBiotechnoi 24:155-208 (2004)).

Os genes para uma via biossintética de 2-butanol podem sermontados em qualquer vetor adequado, como aqueles descritos acima. Oscódons podem ser otimizados para expressão com base no índice de códondeduzido a partir de seqüências de genoma de Pediococcus pentosaceus. Osplasmídeos podem ser introduzidos na célula hospedeira por meio demétodos conhecidos na técnica, como eletroporação (consulte por exemplo,Osmanagaoglu et al., J. Basic Microbiol. 40:233-241 (2000); Alegre et al.,FEMS Microbiol. Lett. 250:151-156 (2005)) e conjugação (Gonzalez andKunka, Appl. Environ. Microbiol. 46:81-89 (1983)). Os genes da viabiossintética de 2-butanol podem também ser integrados no cromossomo dePediococcus usando vetores de integração (Davidson et al. Antonie vanLeeuwenhoek 70:161-183 (1996)). A via biossintética de 2-butanona pode serexpressa de forma semelhante, omitindo o butanol desidrogenase.

Meio de Fermentação

O meio de fermentação da presente invenção precisa contersubstratos adequados de carbono. Os substratos adequados podem incluir masnão estão limitados a monossacarídeos como a glicose e a frutose,oligossacarídeos como a Iactose ou sacarose, polissacarídeos como o amido oucelulose, ou misturas dos mesmos, e misturas não purificadas a partir de fontesrenováveis de matérias primas, como queijo e soro de leite permeado, água demaceração de milho ("comsteep Iiquor"), melaço de açúcar de beterraba e maltede cevada. Além disso, o substrato de carbono pode também ser um substrato decarbono como o dióxido de carbono, ou metanol para o qual a conversãometabólica em intermediários bioquímicos vitais foi demonstrada. Além desubstratos de um e dois carbonos, organismos metilotróficos são tambémconhecidos por utilizar uma série de outros compostos que contêm carbono, comoa metilamina, glucosamina e uma variedade de aminoácidos para a atividademetabólica. Por exemplo, leveduras metilotróficas são conhecidas por utilizar ocarbono de metilamina para formar trealose ou glicerol (Bellion et al., Microb.Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32, Editor(s): Murrell1 J. Collin;Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK). Semelhantemente, váriasespécies de Candida metabolizarão alanina ou ácido oléico (Sulter et al., Arch.Microbiol. 153:485-489 (1990)). Por isso é que se espera uma fonte de carbonopara utilização na presente invenção que possa abranger uma grande variedadede substratos que contêm carbono e apenas seja limitada pela escolha doorganismo.

Embora seja esperado que todos os substratos de carbonoacima mencionados e suas misturas sejam adequados para a presenteinvenção, substratos preferenciais de carbono são a glicose, frutose esacarose, assim como as misturas de quaisquer destes açúcares. A sacarosepode ser obtida a partir de matérias primas como cana de açúcar, açúcaresde beterraba, mandioca e sorgo doce. A glicose e a dextrose podem serobtidas através de sacarificação do amido baseado em matérias primasincluindo grãos como milho, trigo, centeio, cevada e aveia.

Além disso, açúcares fermentáveis podem ser obtidos a partir decelulose e biomassa lignocelulósica através de processos de tratamento prévio esacarificação, como descrito, por exemplo, no pedido de patenteUS20070031918A1, que é co-propriedade e co-pendente, o qual está aquiincorporado por referência. A biomassa refere-se a qualquer material celulósicoou lignocelulósico e inclui materiais que compreendem celulose, e opcionalmentecompreendendo, ainda, hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/oumonossacarídeos. E Ia pode, também, compreender componentes adicionais,como proteína e/ou lipídio. A biomassa pode ser derivada de uma fonte única, ouela pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte; Porexemplo, a biomassa pode compreender uma mistura de sabugos de milho epalha de milho, ou uma mistura de grama e folhas. Ela inclui, mas não se limitaa, colheitas usadas para bioenergia, resíduos agrícolas, resíduos sólidosurbanos, resíduos industriais sólidos, lamas provenientes de fábricas papel,resíduos de jardim, madeira e resíduos florestais. Exemplos de biomassaincluem, mas não estão limitados a, grãos de milho, sabugos de milho, restos decolheitas, como cascas de milho, palha de milho, gramíneas, trigo, palha detrigo, cevada, palha de cevada, feno, palha de arroz, capim "switchgrass",resíduos de papel, bagaço de cana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidosa partir de moagem de grãos, árvores, galhos e raízes, folhas, madeira,serradura, arbustos e moitas, legumes, frutos, flores e estrume animal.

Além de uma adequada fonte de carbono, meios de fermentaçãoadequados devem conter minerais, sais, cofatores, tampões e outroscomponentes, conhecidas por aqueles pelos versados na técnica, adequadospara o crescimento das culturas e na promoção de uma via enzimáticanecessária para produção de 2-butanol ou 2-butanona.

Condições da Cultura

Tipicamente as células são cultivadas a uma temperatura nafaixa de cerca de 25°C a cerca de 40°C em um meio adequado. Os meios decrescimento adequados na presente invenção são comuns e comercialmentepreparados assim como meio de Luria Bertani (LB)1 meio de Sabourauddextrose (SD) ou meio de Yeast Médium [meio de levedura] (YM). Outrosmeios de crescimento definidos ou sintéticos podem também ser utilizados,bem como o meio adequado para o crescimento do microorganismoparticulares será conhecida por um técnico no assunto de microbiologia ouciência da fermentação. O uso de agentes conhecidos para modular arepressão de catabólito direta ou indiretamente, por exemplo, adenosinacíclico 2,:3'-monofosfato, também podem ser incorporadas na fermentaçãomédio.

A faixa de pH adequada para a fermentação está entre pH 5,0 epH 9,0, onde pH de 6,0 a pH 8,0 é preferencial como a condição inicial.

As fermentações podem ser realizadas sob condições aeróbicas eanaeróbicas, onde as condições anaeróbias ou microaeróbicas são preferenciais.

Fermentações Industriais Por Batelada ε Contínua

O presente processo emprega um método de fermentação porbatelada. Uma clássica fermentação por batelada é um sistema fechado emque a composição do meio é fixada no início da fermentação e não está sujeitaa alterações artificiais durante a fermentação Assim, no início da fermentação omeio é inoculado com o desejado organismo ou organismos, e a fermentaçãoocorre sem que se acrescente nada ao sistema. Entretanto, tipicamente umafermentação por "batelada" é batelada com relação à adição de fonte decarbono e muitas vezes são feitas tentativas para controlar fatores tais comopH e concentração de oxigênio. Nos sistemas de batelada, as composições debiomassa e metabolito do sistema mudam constantemente até o momento noqual a fermentação é interrompida. Dentro da batelada as culturas de célulasmoderam através de uma fase Iag estática para uma fase log de crescimentoelevado e finalmente para uma fase estacionária, onde a taxa de crescimento édiminuída ou interrompida. Se não tratadas, as células em fase estacionáriaeventualmente morrerão. As células em fase Iog geralmente são responsáveispela maior parte da produção do produto final ou intermediário.

Uma variação no sistema padrão por batelada é o sistemaalimentado por batelada. Os processos de fermentação alimentados porbatelada também são adequados na presente invenção e compreendem umsistema típico por batelada com a exceção de que o substrato é adicionado emincrementos enquanto a fermentação progride. Os sistemas alimentados porbatelada são úteis quando a repressão de catabolito é capaz de inibir ometabolismo da célula e quando é desejável se ter limitadas quantidades desubstrato no meio. A medição da concentração real de substrato em sistemasalimentados por batelada é difícil e, portanto, é estimada com base nasvariações dos fatores mensuráveis, como pH, oxigênio dissolvido e da pressãoparcial de resíduos de gases como o CO2. Bateladas e fermentaçõesalimentadas por bateladas são comuns e bem conhecidas na técnica eexemplos podem ser encontrados em Thomas D. Brock in Biotechnology: ATextbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates,Inc., Sunderland, MA., ou Despende, Mukund V., AppI. Biochem. Biotechnol.,36:227, (1992), aqui incorporado por referência.

Embora apresente invenção é realizada a modalidade debatelada, se espera que o método seja adaptável aos métodos defermentação contínuos. A fermentação contínua é um sistema aberto em queo meio de fermentação definido é adicionado continuamente para umbiorreator e igual quantidade de meio condicionado é removidosimultaneamente para processamento. A fermentação contínua geralmentemantém as culturas constantemente em alta densidade.

Ela permite a modulação de um fator ou de qualquer número defatores que afetam o crescimento celular ou a concentração do produto final.Por exemplo, um método irá manter um nutriente limitante, como a fonte decarbono ou nível de nitrogênio a uma taxa fixa e permitir que todos os outrosparâmetros a variar moderadamente Em outros sistemas, uma série de fatoresque afetam o crescimento podem ser modificados continuamente enquanto aconcentração de células, medida pela turvação do meio de cultura, é mantida constante. Os sistemas contínuos se esforçam para manter um regimepermanente de crescimento e, portanto, a perda de células devido ao meiosendo retirado deve ser balanceada com a taxa de crescimento celular nafermentação. Os métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimentopara os processos de fermentação contínuos, como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto são bem conhecidos na técnica de microbiologiaindustrial e uma variedade de métodos são detalhados por Brock, acima.

A presente invenção, espera-se, pode ser praticada usando ouprocessos por batelada, ou processos alimentados por batelada, ou processoscontínuos e qualquer modo conhecido de fermentação pode ser adequado.Além disso, espera-se que as células possam ser imobilizadas em umsubstrato como catalisador da célula inteira, e submetida às condições defermentação para produção de 2-butanol e 2-butanona.

Métodos para Isolamento de 2-Butanol ε 2-Butanona do Meio de

Fermentação

O 2-butanol bioproduzido pode ser isolado do meio de fermentaçãousando métodos conhecidos na técnica de fermentações ABE(consulte porexemplo, Durre, Appi Microbiol. Biotechnol. 49:639-648 (1998), Groot et al.,Process Biochem. 27:61-75 (1992), e referências neste). Por exemplo, sólidospodem ser removidos do meio de fermentação por centrifugação, filtração,decantação ou similares. Em seguida, o 2-butanol pode ser isolado do meio defermentação usando métodos como a destilação, destilação azeotrópica,extração líquido-líquido, adsorção, arraste gasoso (gas stripping), evaporaçãopor membrana ou pervaporação. Estes mesmos métodos podem ser adaptadospara isolar 2-butanona bioproduzida do meio de fermentação.

Exemplos

A presente invenção está adicionalmente definida nos exemplos aseguir. Deve ficar entendido que estes exemplos, apesar de indicarem umamodalidade preferencial da invenção, são dados apenas a título de ilustração.A partir da discussão acima e destes exemplos, um versado na técnica podeconhecer as características essenciais desta invenção e, sem que se desvie docaráter e âmbito da mesma, podemos fazer várias alterações e modificaçõesna invenção para adaptá-la às suas diferentes utilizações e condições.

Métodos Gerais

As técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem moleculardescritas nos exemplos são bem conhecidas na arte e são descritas porSambrook, J., Fritsch1 E. F. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A LaboratoryManual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, (1989)(Maniatis) e por T. J. Silhavy, M. L. Bennan, e L. W. Enquist, Experiments withGene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1984) e por Ausubel, F. M. et ai, Current Protocols in Molecular Biology,publicado por Greene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience (1987).

Os materiais e métodos adequados para a manutenção e ocrescimento de culturas de bactérias são bem conhecidos na técnica. Astécnicas adequadas para utilização nos seguintes exemplos podem serencontradas de acordo com o Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, WillisA. Wood, Noel R. Krieg e G. Briggs Phillips, eds), American Society forMicrobiology, Washington, DC. (1994)) ou por Thomas D. Brock emBiotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, SinauerAssociates, Inc., Sunderland, MA (1989). Todos os reagentes, enzimas derestrição e materiais descritos para o crescimento e manutenção das célulasbacterianas foram obtidos de Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wl), BDDiagnostic Systems (Sparks, MD), Life Technologies (Rockville, MD) ou SigmaChemical Company (St. Louis, MO) a não ser que indicado de outra forma. Ascepas bacterianas são obtidas a partir da "American Type Culture Collection"(ATCC, Manassas1 VA) exceto onde especificado em contrário.

Os Iniciadores Oligonucleotídeos Descritos nos Exemplos a Seguir sãoApresentados na Tabela 4. Todos os Iniciadores Oligonucleotídeos ForamSintetizados por Sigma-Genosys (Woodlands. TX). Tabela 4

Iniciadores de Clonagem ε Triagem

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Tabela 5

Iniciadores de Seqüenciamento

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Métodos para a Determinação da Concentração de 2-Butanol ε 2-Butanona no Meio de Cultura

A concentração de 2-butanol e 2-butanona no meio de culturapode ser determinada por inúmeros métodos conhecidos na técnica. Porexemplo, um método específico de cromatografia líquida de alta eficiência(HPLC-high performance Iiquid chromatography) utilizando uma coluna ShodexSH-1011 com uma coluna de segurança Shodex SH-G1 ambas compradas deWaters Corporation (Milford, MA), com detecção de índice de refração (IR). Aseparação cromatográfica foi obtida usando-se H2SO4 0,01 M como a fasemóvel, com um fluxo de 0,5 mL/min e uma temperatura de coluna de 50°C. Nascondições usadas, 2-butanona e 2-butanol tiveram tempos de retenção de 39,5e 44,3 min, respectivamente. Alternativamente, métodos de cromatografiagasosa (GC-gas chromatography) estão disponíveis. Por exemplo, umdeterminado método GC utilizado um coluna HP-INNOWax (30 m χ 0,53 mmID, 1 pm de espessura de filme, Agilent Technologies, Wilmington, DE), comum detector por ionização de chama (FID - flame ionization detector). O gás dearraste foi hélio com um fluxo de 4,5 ml_ / min, medido a 150°C, com pressãoconstante de entrada; O injetor tinha um "split" de 1:25 a 200°C; A temperaturado forno foi 45°C durante 1 minuto, 45 para 220°C a 10°C/min, e 220°C durante5 minutos; e detecção de FID foi empregada tendo hélio a 240°C com26 mL/min como gás de compensação. Os tempos de retenção de 2-butanonae 2-butanol foram de 3,61 e 5,03 min, respectivamente.

A 2-Butanona também pode ser detectada por derivatização com3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona (MBTH - 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazoné). Uma solução aquosa contendo 2-butanona é misturada com umvolume igual de uma solução aquosa de 6 m/mL de MBTH em 375 mM deglicina-HCI (pH 2,7) e incubados a 100°C por 3 min. As amostras resultantes dederivatizado de MBTH são analisadas em uma coluna(Supelco) com 25 cm χ4,6 mm (id) Supelosil LC-18-D5 5 μηι utilizando uma fase móvel de 55% deacetonitrila em água a um fluxo de 1 ml_ / min. Os derivados de 2-butanonaaparecem como dois picos (isômeros eis e trans), com tempos de retenção decerca de 12,3 e 13,3 min e absorbância máxima de 230 e 307 nm.

O significado das siglas é o seguinte: "s" significa segundo(s),"min" significa minuto(s), "h" significa hora(s), "psi" significa libras por polegadaquadrada, "nm" significa nanômetros, "d" significa dia(s), "μΙ_" significamicrolitro(s), "mL" significa mililitro(s), "L" significa litro(s), "mm" significamilímetros(s), "nm" significa nanômetros, "Mm" significa millimolar, "M" significamolar, "mmol" significa milimole(s), "pmol" significa micromole(s), "g" significagrama(s), "mg" significa micrograma (s) e "Ng" significa nanogramas(s), "PCR"significa reação em cadeia da polimerase, "DO" significa densidade óptica,"DO600". a densidade óptica medida no comprimento de onda de 600 nm,"kDa" significa kilodaltons, "g", a constante gravitacional, "pb" significa base depar(es), "kpb" significa kilobase de par(es), "% w/v" significa porcentagem empeso/volume, % v/v" significa porcentagem em volume/volume, "wt%" significaporcentagem em peso, "HPLC" significa cromatografia líquida de alta eficiência,e "GC" significa cromatografia gasosa. O termo "seletividade molar" é o númerode moles de produto produzidos por mol de substrato de açúcar consumido esão relatados como uma porcentagem.

Exemplo 1

Clonagem ε Expressão de Acetolactato Sintase

O objetivo do presente exemplo foi clonar e expressar em E. colio gene budB que codifica a enzima acetolactato sintase. O gene budB foiamplificado a partir do DNA genômico de Klebsiella pneumoniae cepa ATCC25955 usando PCR.

A seqüência budB que codifica acetolactato sintase foi amplificada apartir do DNA genômico de Klebsiella pneumoniae (ATCC 25955) por PCRusando o par iniciador B1 (SEQ ID n° 15) e B2 (SEQ ID n° 16). Outros reagentesde amplificação PCR (por exemplo Kod HiFi DNA polimerase (Novagen Inc.,Madison, Wl; catalog N0 71805-3)) foram fornecidos em kits dos fabricantes eutilizados de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA genômico de Klebsiellapneumoniae foi preparado usando o kit Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc.,Minneapolis, MN; número de catálogo D-5000A). A amplificação foi executada emum termociclador de DNA GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems, Foster city,CA). A seqüência de nucleotídeos do quadro de leitura aberto (ORF - openreading frame) e da seqüência de aminoácidos predita da Enzima são dadascomo SEQ ID n° 3 e SEQ ID n° 4, respectivamente.

Para os estudos de expressão a tecnologia de clonagem Gateway(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) foi usada. O vetor de entrada pENTR/SD/D-TOPO permite clonagem direciona! e forneceu uma seqüência Shine-Dalgarnopara o gene de interesse. O vetor de destino pDEST14 usou um promotor T7para expressão do gene sem identificação. O iniciador forward incorporou quatrobases (CACC), imediatamente adjacente ao códon de partida translacionalpermitir a clonagem direcional da região de codificação budB de acetolactatosintase do produto da PCR em pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), gerando oplasmídeo pENTRSDD-TOPO budB. O pENTR construído foi transformado emcélulas E. coli TopIO (Invitrogen) e chapeado de acordo com as recomendaçõesdo fabricante. Os transformantes foram cultivados de um dia para o outro e oDNA do plasmídeo foi preparado utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen,Valencia, CA; catálogo N0 27106) de acordo com as recomendações dofabricante. Para criar um clone de expressão, a região codificante budB depENTRSDD-TOPObudB foi transferida para o vetor pDEST 14 por recombinaçãoin vitro usando a mistura LR Clonase (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA). O vetorresultante, pDEST14budB, foi transformado em células de BL-21-AI (InvitrogenCorp.). As células BL-21-AI transportam uma cópia cromossômica da polimeraseT7 RNA sobre o controle do promotor arabinose-induzível araBAD.

Os transformantes são inoculados no meio LB suplementado com50 Mg/mL de ampicilina e cultivados de um dia para o outro. Uma alíquota dacultura é usada para inocular 50 mL de meio LB suplementado com 50 pg/mLde ampicilina. A cultura é incubada a 37°C com agitação até a D06oo atingir 0,6a 0,8. A cultura é dividida em duas porções de 25-mL e arabinose é adicionadaa um dos frascos para uma concentração final de 0,2% de peso por volume. Ofrasco de controle negativo não é induzido com arabinose. Os frascos sãoincubas por 4 h a 37°C com agitação. As células são colhidas por centrifugaçãoe as péletes das células estão ressuspensos em Mops 50 mM, tampão pH 7,0.As células são perturbados, quer por sonicação ou por uma passagem atravésde uma prensa francesa (French Pressure Cell). Cada Iisado celular écentrifugado produzindo o sobrenadante e o pélete da fração insolúvel. Umaalíquota de cada fração (toda a célula lisata, a partir de células induzidas e decontrole, é ressuspensa na SDS (MES) carga de tampão (Invitrogen), aquecidaa 85°C por 10 min e submetidas à análise SDS-PAGE (NuPAGE 4 a 12% BisTris-Gel1 catálogo número NP0322Box, Invitrogen). A proteína de pesomolecular esperado, como deduzida a partir da seqüência de ácido nucléico,está presente na cultura induzida mas não no controle não induzido.

A atividade de acetolactato sintase nos extratos livres da célula émedida usando-se o método descrito por Bauerle et al. (Bauerle et al. (1964)Biochim. Biophys. Acta 92:142-149). A concentração protéica é medida oupelo método Bradford ou pelo Kit Bicinchoninic (Sigma, catálogo N0 BCA-1;St. Louis, MO) usando albumina sérica bovina (BSA) (Bio-Rad, Hercules, CA)como o padrão.

Exemplo 2

Clonagem ε Expressão de Acetolactato Descarboxilase

O objetivo do presente exemplo foi clonar e expressar em E. colio gene budB que codifica a enzima acetolactato descarboxilase. O gene budBfoi amplificado a partir do DNA genômico de Klebsiella pneumoniae cepaATCC 25955 usando PCR.

A seqüência budA que codifica acetolactato descarboxilase, foiclonada da mesma maneira descrita para budB em exemplo 1, com a exceçãode que os iniciadores usados para amplificação de PCR foram B3 (SEQ ID n°17) e B4 (SEQ ID n° 18). A seqüência de nucleotídeos do quadro de leituraaberto (ORF - open reading frame) e da seqüência de aminoácidos predita daEnzima são dadas como SEQ ID n° 1 e SEQ ID n° 2, respectivamente. Oplasmídeo resultante foi chamado pENTRSDD-TOPObudA.

A atividade de acetolactato descarboxilase nos extratos livres dacélula é medida usando-se o método descrito por Bauerle et al., acima.

Exemplo 3 (Profilático)

Clonagem ε Expressão de Butanodiol Desidrogenase

O propósito deste exemplo profilático é para descrever comoclonar e expressar em Ε. coli o gene budC que codifica a enzima butanodioldesidrogenase. O gene budC foi amplificado a partir do DNA genômico deKlebsiella pneumoniae cepa IAM1063 usando PCR.

A seqüência budC codificando butanodiol desidrogenase éclonada e expressa da mesma maneira conforme descrito para budA noexemplo 1, exceto que os iniciadores usados para amplificação de PCR são B5(SEQ ID n° 19) e B6 (SEQ ID n° 20) e o modelo de DNA genômico é daKlebsiella. pneumoniae IAM1063 (a qual é obtida na coleção de culturas doInstituto de microbiologia aplicada, Tóquio, Japão). O DNA genômico deKlebsiella pneumoniae IAM1063 é preparado usando-se o kit Gentra PuregenePuregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catálogo D-5000A). A seqüência de nucleotídeos do quadro de leitura aberto (ORF - openreading frame) e da seqüência de aminoácidos predita da Enzima são dadascomo SEQ ID n° 5 e SEQ ID n° 6, respectivamente.

A atividade de butanodiol desidrogenase nos extratos livres dacélula é medida espectrofotometricamente através do consumo de NADH emuma absorbância de 340 nm.

Exemplo 4 (Profilático)Clonagem ε Expressão de Butanodiol Desidratase

O propósito deste exemplo profilático é para descrever como clonare expressar em E. coli os genes pddA, pddB e pddC que codifica a enzimabutanodiol desidratase. Os genes pddA, pddB e pddC foram amplificados a partirdo DNA genômico de Klebsiella oxytoca ATCC 8724 usando PCR.

As seqüências pddA, pddB e pddC codificando butanodioldesidratase são clonadas e expressas da mesma maneira conforme descritopara budA no exemplo 1, exceto que o modelo genômico de DNA é de Klebsiellaoxytoca ATCC 8724, e os iniciadores usados são B7 (SEQ ID n° 21) e B8 (SEQID n° 22).O DNA genômico de Klebsiella oxytoca foi preparado usando o kitGentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis1 MN; catalognumber D-5000A). Um produto PCR único incluindo todos os três quadros deleitura aberto (ORFs) é clonado, de modo que todas as três regiões decodificação são expressas como um operon a partir de um promotor único noplasmídeo de expressão. As seqüências de nucleotídeos dos quadros de leituraaberto (ORFs) para as três subunidades são dadas como SEQ ID n° 7, 9 e 11,respectivamente, e as seqüências de aminoácidos preditas das três subunidadesda enzima são dadas como SEQ ID n° 8, 10 e 12, respectivamente.

A atividade de butanodiol desidatase nos extratos livres da célula émedida pela derivação do produto de cetona com 2,4-dinitrofenilhidrazina(DNPH). Resumidamente, IOOpL da mistura de reação, extrato de célulascontendo aproximadamente 0,0005 unidades de enzima, tampão de fosfato depotássio 40 mM (pH 8,0), 2 pg de adenosilcobalamina, 5 pg de 2,3,-butanodiol e1 pg de albumina sérica bovina, são bruscamente arrefecidas pela adição de umvolume igual de 0,05%, em peso, de DNPH em HCI 1,0 N. Depois de 15 minutosem temperatura ambiente, a cor é desenvolvido pela adição de 100 pL de NaOH4 Ν. A quantidade do produto é determinada a partir da absorbância da soluçãofinal a 550 nm, em comparação com uma curva padrão preparada com 2-butanona. Todas as reações são executadas a 37°C sobre luz vermelha mortiça.

Exemplo 5 (Profilatico)

Clonagem ε Expressão de Butanol DesidrogenaseO propósito deste exemplo profilático é para descrever comoclonar e expressar em E. coli o gene sadh que codifica butanoldesidrogenase. O gene sadh foi amplificado a partir do DNA genômico deRhodococcus ruber cepa 219 usando PCR.

A seqüência sadh codificando butanol desidrogenase é clonada eexpressa da mesma maneira conforme descrito para budA no exemplo 1, excetoque o modelo de DNA genômico é Rhodococcus ruber cepa 219 (Meens, Institutfuer Mikrobiologie, Universitaet Hannover1 Hannover, Alemanha) e os iniciadoressão B9 (SEQ ID n° 23) e B10 (SEQ ID n° 24).O DNA genômico do Rhodococcusruberé preparado usando o Kit Ultra Clean™ Microbial DNA Isolation (MO BIOLaboratories Inc., Carlsbad, Califórnia), de acordo com o protocolo do fabricante.

A seqüência de nucleotídeos do quadro de leitura aberto (ORF - open readingframe) e da seqüência de aminoácidos predita da enzima são dadas como SEQIDn0 13 e SEQ IDn0 14, respectivamente.

A atividade da butanol desidrogenase em extratos livres de célulasé medida através do aumento da absorbância a 340 nm resultante da conversãodo NADH para NAD quando a enzima é incubada com NAD e 2-butanol.

Exemplo 6 (Profilático)Construção de um Vetor de Transformação para os

Genes em uma Via Biossintética de 2-ButanolO propósito deste exemplo profilático é para descrever apreparação de um vetor de transformação para os genes na via biossintética de2-butanol (isto é, via 3 conforme descrito acima). Como a maioria dosorganismos, E. coli converte glicose inicialmente para ácido pirúvico. Asenzimas necessárias para converter ácido pirúvico a 2-butanol seguindo a via3, isto é, acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase, butanodioldesidrogenase, butanodiol desidratase e butanol desidrogenase, sãocodificados pelos genes budA, budB, budC, pddA, pddB, pddC e sadh. Parasimplificar a construção da via biossintética de 2-butanol em um organismorecombinante, os genes que codificam as 5 etapas da via são divididos em doisoperons. A parte superior da via compreende as três primeiras etapascatalisadas por acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase e butanodioldesidrogenase. A parte inferior da via compreende as duas últimas etapascatalisadas por butanodiol desidratase e butanol desidrogenase.

As seqüências de codificação são amplificadas pela PCR com osiniciadores que incorporam locais de restrição para clonagem posterior e osiniciadores forwards contêm um sítio de ligação otimizado no ribossomo de E.coli (AAAGGAGG). Os produtos PCR são Topo clonados no vetor pCR4Blunt-TOPO e transformados em células TopIO (Invitrogen). O DNA do Plasmídeo épreparado a partir dos clones TOPO, e a seqüência do fragmento clonado PCRé verificada. As enzimas de restrição e T4 DNA Iigase (New England Biolabs1Beverly, MA) são usados de acordo com as recomendações do fabricante.Para experimentos de clonagem, os fragmentos de restrição são purificadospor gel utilizando-se kit de extração QIAquick Gel (Qiagen).

Após a confirmação da seqüência, as regiões de codificação sãosubclonadas em um vetor pUC19 modificado como uma plataforma declonagem. O vetor pUC19 é modificado por uma digestão com Hindlll/SAPI,seguido de tratamento com polimerase Klenow DNA para preencher asextremidades. O fragmento de vetor 2,4 kB é purificado por gel e religadocriando pUC19dHS. Alternativamente, o vetor pUC19 é modificado por umadigestão com Sphl/SAPI, seguido de tratamento com polimerase Klenow DNApara embotar as extremidades. O fragmento de vetor 2,4 kB é purificado por gele religado criando pUC19dSS. A digestão remove o promotor Iac adjacente aoMCS (sites de clonagem múltiplas [multiple cloning sites]), impedindo atranscrição de operons do vetor.

Via Superior:

As regiões de codificação do budABC são amplificadas a partirde DNA genômico da Klebsiella pneumoniae por PCR usando pares deiniciadores B11 e B12 (tabela 4), dadas como SEQ ID n° 25 e 26,respectivamente. Os iniciadores forward incorporam um sítio de restriçãoEcoRI e um sítio de ligação de ribossoma (RBS - ribosome binding site). Oiniciador reverse incorpora um sítio de restrição Sphl. O produto PCR éclonado em pCR4 BIunt-TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-budABC.Para construir a via superior, operon pCR4 Blunt-TOPO-budABCé digerido com EcoRI e Sphl liberando um fragmento budABC 3,2 KBP. Ovetor pUC19dSS também é digerido com EcoRI e Sphl1 liberando umfragmento de vetor KBP 2,0. O fragmento budABC e os fragmentos do vetorsão ligados juntos usando-se T4 DNA Iigase (New England Biolabs) paraformar pUC19dSS-budABC.

Via Inferior:

As regiões de codificação pddABC são amplificadas a partir deDNA genômico de Klebsiella oxytoca ATCC 8724 por PCR usando iniciadoresB13 e B14 (tabela 4), dadas como SEQ ID N0 s: 27 e 28, respectivamente,criando um produto 2,9 KBP. Os iniciadores forward incorporam locais derestrição EcoRI e Pmel e um sítio de ligação de ribossoma (RBS - ribosomebinding site). O iniciador reverse incorpora um sítio de restrição BamHI. Oproduto PCR é clonado em pCRBIunt II-TOPO criando pCRBIuntll-pdd.

O gene sadh gene é amplificado a partir de DNA genômico deRhodococcus ruber cepa 219 por PCR usando iniciadores B15 e B16 (tabela4), dadas como SEQ ID N0 s: 29 e 30, respectivamente, criando um produto1,0 KBP. Os iniciador forward incorpora um sítio de restrição BamHI e umsítio de ligação de ribossoma (RBS - ribosome binding site). O iniciadorreverse incorpora um sítio de restrição Xbal. O produto PCR é clonado empCRBIunt II-TOPO criando pCRBIuntll-sadh.

Para construir o operon do percurso inferior, um fragmento deBamHI de 2,9 KBP EcoRI e pCRBIuntll-pdd, um fragmento de 1,0 KBP BamHIe Xbal a partir de pCRBIuntll-sadh, e o fragmento maior a partir de umdigerido EcoRI e Xbal de pUC19dHS são ligados juntos. A ligação de três viascria pUC19dHS-pdd-sadh.

O vetor pUC19dSS-budABC é digerido com Pmel e Hindlll,liberando um fragmento de 3,2 kbp que é clonado em pBenBP, um vetor detransformação E.coli-B. subtilis. O plasmídeo pBenBP é criado pelamodificação do vetor pBE93, que é descrito por Nagarajan (WO 93/2463,exemplo 4). Para gerar pBenBP, a seqüência de sinais de Bacillusamyloliquefaciens promotor protease neutra (NPR) e o gene phoA sãoremovidos do pBE93 com um Ncol/Hindlll digerido. O promotor NPR é PCRamplificado a partir de pBE93 por iniciadores BenF e BenBPR1 dados pela SEQID n° 31 e 32, respectivamente. O iniciador BenBPR incorpora BstEII1 Pmel eHindlll, locais a jusante do promotor. O produto PCR é digerido com Ncol eHindlll, e o fragmento é clonado nos locais correspondentes do vetor pBE93para criar pBenBP. O fragmento superior do operon é subclonado no locaisPmel e Hindlll em pBenBP criando pBen-budABC.

O vetor pUC19dHS-pdd-sadh é digerido com Pmel e Hindlll,liberando um fragmento de 3,9 kbp que é clonado em locais Pmel e Hindlll depBenBP, criando pBen-pdd-sadh.

Exemplo 7 (Profilático)

Expressão da Via Biossintética de 2-Butanol em E. Cou

O propósito deste exemplo profilático é para descrever comoclonar e expressar a via biossintética de 2-butanol em E. coli.

Os plasmídeos pBen-budABC e pBen-pdd-sadh, preparadosconforme descrito no exemplo 6, são separadamente transformados em E.coli NM522 (ATCC N0 47000), e expressão dos genes em cada operon émonitorada pela análise SDS-PAGE e teste de enzima. Depois daconfirmação da expressão de todos os genes, pBen-budABC é digerido comEcoRI e Hindlll para liberar o promotor NPR e o fragmento budABC. Ofragmento tem a extremidade embotada usando o fragmento Klenow depolimerase DNA (New England Biolabs1 catalog no. M0210S). O plasmídeopBen-pdd-sadh é digerido com EcoRI e semelhantemente embotado paracriar um Iinearizado fragmento de vetor de extremidade embotada. O vetor eos fragmentos NPR-budABC são ligados, criando p2B0H. O plasmídeo étransformado em E.coli NM522 para fornecer E. coli NM522/p2BOH, e aexpressão dos genes é monitorada conforme anteriormente descrito.

E. coli NM522/p2BOH é inoculado em um frasco de mistura de250 mL contendo 50 mL do meio e agitado a 250 rpm e 35°C. O meio é compostode: dextrose, 5 g/L; MOPS1 0,05 M; sulfato de amônio, 0,01 M; fosfato de potássio,monobásico, 0,005 M; S10 mistura de metais, 1% (v/v); extrato de levedura, 0,1%(peso por volume); ácidos casamino, 0,1% (peso por volume); tiamina, 0,1 mg/L;prolina, 0,05 mg/L; e biotina 0,002 mg/L, e é titulado para pH 7,0 com KOH. S10mistura de metais contém: MgCI2, 200 mM; CaCI2, 70 mM; MnCI2, 5 mM; FeCh,0,1 mM; ZnCI2, 0,1 mM; cloridrato de tiamina, 0,2 mM; CuSO4, 172 μΜ; CoCI2,253 μΜ; e Na2MoO4, 242 μΜ. Depois de 18 h, 2-butanol é detectado por HPLC ouanálise por cromatografia a gás usando métodos que são bem conhecidos natécnica, por exemplo, conforme descrito na seção de métodos geral acima.

Exemplo 8 (Profilático)

Expressão da Via Biossintética de 2-butanol em E. ColiO propósito deste exemplo profilático é para descrever comoclonar e expressar a via biossintética de 2-butanol em Bacillus subtilis.

Os plasmídeos pBen-budABC e pBen-pdd-sadh, preparadoconforme descrito no exemplo 6, são separadamente transformados em Bacillussubtilis BE1010 (J. Bacteríol. 173:2278-2282 (1991)) e a expressão dos genes emcada operon é monitorada conforme descrito no exemplo 7. O plasmídeo pBen-budABC é digerido com EcoRI e Hindlll para liberar o fragmento do promotor NPRe budABC. O fragmento tem a extremidade embotada usando o fragmentoKlenow de polimerase DNA (New England Biolabs, catalog no. M0210S). Oplasmídeo pBen-pdd-sadh é digerido com EcoRI e semelhantemente embotadopara criar um Iinearizado fragmento de vetor de extremidade embotada. O vetor eos fragmentos NPR-budABC são ligados, criando p2BOH. O plasmídeo étransformado em Bacillus subtilis BE1010 para fornecer Bacillus subtilis BE1010/p2BOH, e a expressão dos genes é monitorada conforme anteriormente descrito.

O Bacillus subtilis BE1010 /p2BOHé inoculado em um frasco demistura de 250 ml_ contendo 50 mL do meio e agitado a 250 rpm e 35°C por18 horas. O meio é composto de: dextrose, 5 g/L; MOPS1 0,05 M; ácidoglutâmico, 0,02 M; sulfato de amônio, 0,01 M; fosfato de potássio, monobásico,0,005 M; S10 mistura de metais (conforme descrito em exemplo 7), 1% (v/v);extrato de levedura, 0,1% (peso por volume); ácidos casamino, 0,1% (peso porvolume); triptofano, 50 mg/L; metionina, 50 mg/L; e lisina, 50 mg/L, e é tituladoaté pH 7,0 com KOH. Depois de 18 h, 2-butanol é detectado por HPLC ouanálise por cromatografia a gás usando métodos que são bem conhecidos natécnica, por exemplo, conforme descrito na seção de métodos geral acima.

Exemplo 9

Construção de um Vetor de Transformação para os Genes em uma

Via Biossintética de 2-Butanol

O propósito deste exemplo foi preparar um hospedeirorecombinante E. coli transportando os genes em uma via biossintética de 2-butanol (isto é, via 3 conforme descrito acima). Como a maioria dos organismos,E. coli converte glicose inicialmente para ácido pirúvico. As enzimas necessáriaspara converter ácido pirúvico a 2-butanona seguindo a via 3, isto é, acetolactatosintase, acetolactato descarboxilase, butanodiol desidrogenase e butanodioldesidratase, são codificados pelos genes budA, budB, budC, pddA, pddB epddC. Na última etapa da via, uma butanol desidrogenase converte 2-butanonapara 2-butanol. As desidrogenases que executam esta última etapa sãopromíscuas e pode ser encontradas em muitos organismos. Para simplificar aconstrução da via biossintética de 2-butanol em um organismo recombinante, osgenes que codificam as 5 etapas da via foram divididos em múltiplos operons. Aparte superior da via compreende as três primeiras etapas catalisadas poracetolactato sintase, acetolactato descarboxilase e butanodiol desidrogenase efoi clonada em um vetor de expressão. A parte inferior da via compreende asduas últimas etapas catalisadas por butanodiol desidratase incluindo o fator dereativação (Mori et al., J. Bioi Chem. 272:32034 (1997)) e uma butanoldesidrogenase. O diol desidratase pode sofrer inativação suicida durantecatálise. A proteína codificada pelo fator de reativação ddrA e cWrfi(GenBankAF017781, SEQ ID n° 70) reativa a enzima inativa. Os genes ddrA e ddrBflanqueiam o operon diol desidratase. Os operons para a desidratase/fator dereativação e o butanol desidrogenase foram ou clonados em outro vetor deexpressão ou o operon desidratase/fator de reativação foi clonado isoladamentepara um outro vetor de expressão e a última etapa foi fornecida por umaatividade endógena no hospedeiro demonstrativo.

Construção do Vetor pTrc99a-budABC:As regiões de codificação budAB são amplificadas a partir deDNA genômico de K. pneumoniae ATCC 25955 por PCR usando o par deiniciadores BABC F e BAB R, dados como SEQ ID n° 33 e 34, respectivamente(vide tabela 4), criando um produto 2,5 kpb Os iniciadores forward incorporamlocais de restrição Sacl e EcoRI e um sítio de ligação de ribossoma (RBS -ribosome binding site). O iniciador reverse incorpora um sítio de restrição Spel.O produto PCR foi clonado em pCR4 BIunt-TOPO criando pCR4 BIunt-TOPO-budAB. O plasmídeo de DNA foi preparado a partir de clones TOPO e aseqüência dos genes foi verificada com os iniciadores forward M13 (SEQ ID n°35), reverse M13 (SEQ ID n° 36), N83 SeqF2 (SEQ ID n° 37), N83 SeqF3(SEQ ID n° 38) e N84 SeqR4 (SEQ ID n° 39) (ver Tabela 5).

As região de codificação budC foi amplificada a partir de DNAgenômico de K. pneumoniae ATCC 25955 por PCR usando o par de iniciadoresBC Spe F e BC Xba R dados como SEQ ID n° 40 e 41, respectivamente, criandoum produto 0,8 kbp. O iniciador forward incorporou um sítio de restrição Spel, umRBS e modificou o CDS mudando o segundo e terceiro códons de AAA para AAG.O iniciador reverse incorpora um sítio de restrição Xbal. O produto PCR foiclonado em pCR4 BIunt-TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-budC. O plasmídeo deDNA foi preparado a partir de clones TOPO e a seqüência dos genes foi verificadacom os iniciadores forward M13 (SEQ ID n° 35) e reverse M13 (SEQ ID n° 36).

Para construir o operon budABC, pCR4 Blunt-TOPO-budC foidigerido com SnaBI e Xbal liberando um fragmento budC I1Okbp. O vetorpTrc99a (Amann et al., Gene 69(2):301-315 (1988)) foi digerido com Smal eXbal criando um fragmento de vetor Iinearizado 4,2 kbp. O vetor e o fragmentobudC foram ligados para criar pTrc99a-budC e transformados em células E. coliTop 10 (Invitrogen). Os transformantes foram analisados pela amplificação dePCR com iniciadores Trc F (SEQ ID n° 42) e Trc R (SEQ ID n° 43) para umproduto 1,2 kbp para confirmar a presença do elemento de inserção budC. Osgenes budAB foram subclonados a partir de pCR4 Blunt-TOPO-budAB comoum fragmento 2,5 kbp EcoRI/Spel. O vetor pTrc99a-budC foi digerido comEcoRIand e Spel e o fragmento de vetor resultante 5,0 kbp foi purificado porgel. O vetor purificado e o elemento de inserção budAB foram ligados etransformados em células E. coli Top 10. Os transformantes foram testadospela amplificação PCR com iniciadores Trc F (SEQ ID n° 42) e N84 Seq R2(SEQ ID n° 65) para confirmar a criação de pTrc99a-budABC. Nesteplasmídeo, as regiões de codificação bud A, B e C são adjacentes uma a outra,nesta ordem, e entre o promotor Trc e a seqüência de terminação rrnB.

Resultados:

Foram examinadas três E. coli Top 10/pTrc99a-budABCindependente e isolados para a produção de butanodiol, usando-se E. coli Top10/pCL1925-Kodd-ddr (descritas abaixo) como controle negativo. As cepas foramcultivadas em meio LB contendo 100pg/mL de carbenicilina. As célulasresultantes foram usadas para inocular frascos de agitação (aproximadamente175 mL de volume total) contendo 125 mL de TM3a/meio de glicose com100Mg/ml_ de carbenicilina. Além disso, os frascos inoculados com cepastransportam pTrc99a-budABC contendo isopropil β-D-l-tiogalactopiranoside(IPTG) 0,4 mM. O meio de TM3a/glicose contém (por litro): 10 g de glicose, 13,6 gde KH2PO4, 2,0 g de monohidrato de ácido cítrico, 3,0 g de (NH4)2SO4, 2,0 g deMgSO4TH2O, 0,2 g de CaCI2 ·2Η20, 0,33 g de citrato férrico de amônio, 1,0 mg detiamina-HCI, 0,50 g de extrato de levedura e 10mL de solução de traços deelementos, ajustado o pH para 6,8 com NH4OH. A solução de traços de elementoscontém: ácido CitriCoH2O (4,0 g/L), MnSO4H2O (3,0 g/L), NaCI (1,0 g/L),FeSO4TH2O (0,10 g/L), CoCI26H20 (0,10 g/L), ZnSO4TH2O (0,10 g/L),CuSO4·5Η20 (0,010 g/L), H3BO3 (0,010 g/L), e Na2Mo04-2H20 (0,010 g/L). Osfrascos, tampados com tampas com respiro, foram inoculados a uma DOeoo inicialde aproximadamente 0,03 unidades e incubado a 0C com agitação a 300 rpm.

Aproximadamente 23 h depois da indução, uma alíquota do caldofoi analisada por HPLC (coluna Shodex Sugar SH1011) e cromatografia gasosaGC (HP-INNOWax)1 usando os mesmos métodos descritos na seção geral demétodos para 2-butanol e 2-butanona. Os resultados da análise são dados natabela 6. Os três clones de E. coli converteram glicose para acetoína e meso-2,3-butanodiol, os intermediários desejados da via, com uma seletividade molarde 14%. Esta seletividade foi aproximadamente 35 vezes mais alta que aobservada com a cepa de controle E. coli sem budABC.

Tabela 6

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a Seletividade molar é (acetoína + meso-2,3-butanodiol)/(glicose consumida).

Construção de Vetor pCL1925-KoDD-ddr:

Os operons diol desidratase (GenBank D45071, SEQ ID n° 69) eo fator de reativação (GenBank AF017781, SEQ ID n° 70) foram amplificadosPCR a partir de Klebsiella oxytoca ATCC 8724 como uma única unidade cominiciadores DDo para(SEQ ID n° 44) e DDo Rev (SEQ ID n° 45). Os iniciadoresforward incorporam uma otimizada E. coli RBS e um sítio de restrição Hindlll. Oiniciador reverse inclui um sítio de restrição Xbal. O produto PCR 5318 bp foiclonado em pCR4Blunt-TOPO e clones do resultante pCR4Blunt-TOPO-Kodd-ddr foram seqüenciados com iniciadores M13 forward (SEQ ID n° 35), M13reverse (SEQ ID n° 36), DDko seq F2 (SEQ ID n° 46), DDko seq F5 (SEQ ID n°47), DDko seq F7 (SEQ ID n° 48), DDko seq F9 (SEQ ID n° 49), DDko seq R1(SEQ ID n° 50), DDko seq R3 (SEQ ID n° 51), DDko seq R7 (SEQ ID n° 52), eDDko seq R10 (SEQ ID n° 53). Um clone tendo o elemento de inserção com aseqüência esperada foi identificado.

Para expressão, o diol desidratase e os genes de fator dereativação foram subclonados em pCL1925 (Patente US N0 7074608), umabaixa cópia de um plasmídeo transportando o promotor de glicose isomeraseStreptomyces pCR4Blunt-TOPO-Kodd-ddr foi digerido com Hindlll e Xbal e oresultante fragmento Kodd-ddr 5,3 KBP foi purificado por gel. O vetor pCL1925foi digerido com Hindlll e Xbal e o fragmento de vetor resultante 4539 bp foipurificado por gel. O vetor e o fragmento Kodd-ddr foram ligados etransformados em Ε. coli Top10. Os transformantes foram testados por PCRcom iniciadores DDko Seq F7 (N0 SEQ ID:48) e DDko Seq R7 (SEQ ID n° 52).A ampliação do plasmídeo (pCL1925-Kodd-ddr) carregando o elemento deinserção resultou em um produto de aproximadamente 797 pb.

A atividade da diol desidratase na meso -2,3-butanodiol foimedida pela incubação de extrato de células (proteína total de aproximadamente0,8 mg / ml) com butanodiol coenzima B 1210 mM e 12 mM em HEPES 80 mM(pH 8,2) por 17 h à temperatura ambiente. A formação do esperado produto, 2-butanona, foi determinado por HPLC como descrito nos métodos gerais.

Construção do Vetor pCL1925-KoDD-ddr: T5 chnA ter:

Para proporcionar uma atividade heteróloga de álcooldesidrogenase, o gene chnA que codifica cicloexanol desidrogenase a partir deAcinetobacter sp. (Cheng et al., J. Bacterioi 182:4744-4751 (2000)) foi clonadono vetor pCL1925 com o operon diol desidratase, pCL1925-Kodd-ddr. O genechnA, dado como SEQ ID n° 71 (Genbank n° AF282240, SEQ ID n° 73) foiamplificado a partir pDCQ2, um cosmídeo transportando gene aglomerado decicloexanol a partir de Acinetobacter, com iniciadores ChnA F (SEQ ID n° 54) eChnA R (SEQ ID n° 55). O produto resultante da PCR 828 bp foi clonado empCR4Blunt-TOPO para criar pCR4Blunt-Topo-chnA e transformantes foramtestados pela colônia PCR com os iniciadores forward M13 (SEQ ID n° 35) ereverse M13 (SEQ ID n° 36). Os clones corretos produziram um produto PCRde cerca de 1 kbp e foram seqüenciados com os iniciadores forward M13 (SEQIDn0 35) e reverse M13 (SEQ IDn0 36).

Após o seqüenciamento de pCR4Blunt-Topo-chnA para confirmar acorreta seqüência, o gene chnA foi subclonado como um plasmídeo a partir deum fragmento 813 bp Mfel / Smal. O vetor de expressão pQE30 (Qiagen) foidigerido com Mfel e Smal e o fragmento do vetor resultante 3350 bp foipurificado por gel. O fragmento chnA e o vetor purificado foram ligados etransformados em células E. coli Top10. Os transformantes da colônia PCRforam testados com iniciadores chnSeq F1 (SEQ ID n° 56) e chnseq R1 (SEQID n° 57) para verificar a presença de um produto PCR 494 bp. Esta clonagemcolocou o gene chnA sob o controle do promotor T5 no plasmídeo, pQE30-chnA.

Para preparar o vetor pCL1925 para transportar dois operons,terminadores foram adicionados ao vetor. Um terminador tonB-mcs- trpAfragmento de terminador foi preparado por anelamento de oligonucleotídeocom iniciadores Top ter F1 (SEQ ID n° 58), Top terF2 (SEQ ID n° 59), Bot terR1 (SEQ ID n° 60) e Bot ter R2 (SEQ ID n° 61). O DNA anelado foi purificadopor gel em PAGE gel 6%(Embi-tec, San Diego, CA). O vetor pCL1925 foidigerido com Sacl e Xbal e purificado por gel. O DNA anelado e o fragmento devetor foram ligados para criar pCL1925-ter. Os transformantes foram testadospela amplificação da colônia de PCR com iniciadores pCL1925 vec F (SEQ IDn° 62) e pCL1925 vec R 1 (SEQ ID n° 63) para verificar a presença de umproduto PCR de aproximadamente 400 bp. Os clones positivos a partir do testecom PCR foram seqüenciados com os mesmos iniciadores.

O vetor pCL1925-ter foi digerido com Xhol e Pmel e o fragmentoresultante 4622 bp foi purificado por gel. O pQE30-chnA foi digerido com Ncole do DNA foi tratado com Klenow DNA polimerase para embotar asextremidades. O pQE30-chnA foi, então, digerido com Xhol e o fragmentopromotor chnA de vetor resultante 1,2 kbp T5 foi purificado por gel. O vetorpCL1925-ter e o fragmento de operon chnA e foram ligados para resultar empCL1925-ter-T5chnA e transformados em E. coli Top10. Os transformantesforam testados pela amplificação da colônia de PCR com iniciadores pCL1925 vec F (SEQ ID n° 64) e chnseq R1 (SEQ ID n° 59) para verificar a presençade um produto de aproximadamente 1 kpb.

Para concluir a construção da via do vetor, o plasmídeopCL1925-KoDD-ddr foi digerido com Xbal e Sacl e o fragmento do vetorresultante 9504 bp foi purificado por gel. O operon chnA ladeado porterminadores, com 3' do terminador trpA (Koichi et al. (1997) Volume 272,Number 51, pp. 32034-32041) para a seqüência de codificação chnA, depCL1925-ter-T5chnA, foi purificado por gel como um fragmento de 1271 pbXbal/Sacl. Depois da ligação dos fragmentos e transformação em E. coliTop10, os transformantes foram testados pela colônia PCR. Os iniciadoreschnSeq F1 (SEQ ID n° 58) e pCL1925 vec R2 (SEQ ID n° 64) amplificaramo esperado produto 1107 bp PCR no plasmídeo resultante, pCL1925-KoDD-ddr:: ter-T5chnA.

Exemplo 10

Expressão de uma via Biossintética de 2-Butanol em e. coli comsüperexpressão de álcool desidrogenase endógeno

O propósito deste exemplo foi para expressar uma viabiossintética de 2-butanol em várias cepas E. coli.

Construção de Cepas de E. coli Expressando Constitutivamente yqhD:

A E. coli contém um gene nativo (yqhD) que foi identificadocomo uma 1,3-propanodiol desidrogenase (patente U.S. N0 6,514,733). Ogene yqhD, dado como SEQ ID n° 74, tem 40% de identidade com o geneadhB em Clostridium, uma butanol desidrogenase dependenteprovavelmente de NADH. O gene yqhD foi colocado sob a expressãoconstitutiva de uma variante do promotor 1,6GI de glicose isomerase (SEQID n° 67) em cepa de E. coli MG1655 1,6yqhD:: Cm (WO 2004/033646)usando λ Red technology (Datsenko e Wanner, Proc. Natl. Acad. Sei.U.S.A. 97:6640 (2000)). Semelhantemente, o promotor nativo foisubstituído pelo promotor 1,5GI (WO 2003/089621) (SEQ ID n° 68),criando cepas MG1655 1,5yqhD:: Cm, assim, substituindo o promotor 1,6GIde MG1655 1,6yqhD:: Cm com o promotor 1.5GI. Os promotores 1,5GI e1,6GI diferem por 1 pb na região -35, alterando, assim, a resistência dospromotores (WO 2004/033646). Durante a substituição do promotor nativoyqhD pelo promotor 1,5GI ou pelo promotor 1.6GI, o gene yqhC quecodifica os reguladores transcricionais putativos para o operon yqh foieliminado. A atividade enzimática de butanol desidrogenase foi confirmadapelo teste usando métodos que são bem conhecidas na técnica.

Transformação de Cepas E. Coli:As vias de plasmídeos pCL1925-Kodd-ddr e pTrc99a-budABC,descritas no exemplo 9, foram co-transformadas em cepas E. coli MG1655,MG1655 1,6yqhD e MG1655 1,5yqhD. As duas últimas cepassuperexpressam a 1,3-propanodiol desidrogenase, YqhD1 que tem tambématividade de butanol desidrogenase. As cepas foram examinadas para aprodução de 2-butanona e 2-butanol, essencialmente como descrito acima.As células foram inoculadas em frascos de agitação (volume total de cercade 175 ml_), contendo 50 ou 150 mL de TM3a/meio de glicose (comvitamina Bi2 0,1 mg /Le antibióticos adequados e IPT) para representar omeio e condições de baixas concentrações de oxigênio, respectivamente.Espectinomicina (50 mg / mL) e carbenicilina (100 mg / mL) foramutilizadas para plasmídeos pCL1925 -Kodd ddr e pTrc99a-budABC,respectivamente. Os frascos foram inoculados a uma ϋΟβοο inicial de <0,04 unidades e incubados a 34 0C com agitação a 300 rpm. Os frascoscontendo 50 mL do meio foram tampados com tampas com respiro; osfrascos contendo 150 mL, foram tampados com tampas sem respiro paraminimizar a troca de ar. IPTG estava presente no tempo zero a zero a umaconcentração de 0,04 mM. Os resultados analíticos para produção de 2-butanona e 2-butanol são apresentados na tabela 7. Todas as cepas de E.coli que compreendem uma via biossintética de 2-butanol produzem 2-butanona sob condições de baixas e médias concentrações de oxigênio eproduzem 2-butanol sob condições de baixas concentrações de oxigênio.Tabela 7

Produção de 2-Butanona ε 2-Butanol pelo e. coli MG1655 CepasHospedeiras via Plasmídeos pCL1925-Kodd-ddr ε pTrc99a-budABC

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a N°1 e N°2 representam isolados independentes.

b MG1655 é MG1655/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABCMG1655 1,6yqhD é MG1655 1,6yqhD/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a- budABCMG1655 1,6yqhD é MG1655 1,5yqhD/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC.

Exemplo 11

Expressão de uma via Biossintética de 2-Butanol em E. Coli comHeterólogo Álcool Desidrogenase

Os plasmídeos pCL1925-KoDD-ddr: ter-T5chnA e pTrc99a-budABC,descritos no exemplo 9, foram transformados em cepas de E. coli MG1655 eMG1655 Δ yqhCD para uma demonstração da produção de 2-butanol.

MG1655 Δ yqhCD carrega uma inativação yqhCD que foi feitousando o método de Datsenko e Wanner (Proc. Nati Acad. Sei. EUA.97(12):6640-6645 (2000)). Após a substituição da região com o cassete FRT-CmR-FRT de pKD3, o marcador de resistência a cloranfenicol foi removidousando a recombinase FLP. A seqüência da região apagada é dada comoSEQ ID n° 66.

As cepas MG1655/pTrc99a-budABC / pCL1925KoDD-ddr:: ter-T5 chnA e MG1655 Δ yqhCD/pTrc99a-budABC / pCL1925KoDD-ddr:: ter-T5chnA foram examinadas para a produção de 2-butanona e 2-butanol,essencialmente como descrito acima. A cepa MG1655 Δ yqhCD/pCL1925 foiusada como controle negativo. As células foram inoculadas em frascos deagitação (volume total de cerca de 175 mL), contendo 50 ou 150 mL deTM3a/meio de glicose (com vitamina B12 0,1 mg / L e antibióticos adequados)para representar o meio e condições de baixas concentrações de oxigênio,respectivamente. Espectinomicina (50 pg /mL) e ampicilina (100 pg / mL)foram usados para a seleção de plasmídeos baseados em pCL1925 epTrc99a-budABC, respectivamente. Os derivados da atividade enzimática apartir de pTrc99a-budABC foram detectados pelo teste de enzima naausência de indutor IPTG, assim, IPTG não foi adicionado ao meio. Osfrascos foram inoculados a uma OD6oo inicial de < 0,01 unidades e incubadosa 34 °C com agitação a 300 rpm durante 24 h. Os frascos contendo 50 mL domeio foram tampados com tampas com respiro; os frascos contendo 150 mL,foram tampados com tampas sem respiro para minimizar a troca de ar. Osresultados analíticos para produção de 2-butanona e 2-butanol sãoapresentados na tabela 8. Ambas cepas de E. coli compreendendo uma viabiossintética de 2-butanol produzindo 2-butanona sob condições de médias ebaixas concentrações de oxigênio e produzindo 2-butanol sob condições debaixas concentrações de oxigênio, enquanto a cepa de controle negativo nãoproduziram níveis detectáveis nem de 2-butanona nem de 2 -butanol.

Tabela 8

Produção de 2-Butanona ε 2-Butanol por Cepas de E. Coli

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a N° 1 e N0 2 representam isolados independentes.

Exemplo 12

Clonagem de Amino:Piruvato Transaminase (APT)

Uma amino:piruvato transaminase (APT) a partir de VibrioFluvialis JS17 foi identificada por Shin et ahj. (Appl. Microbiol Biotechnol.(2003) 61:463-471). Foi revelado que a seqüência de aminoácidos (SEQ ID n°122) tem significativa homologia com oü-aminoácido:piruvato transaminase(Shin e Kim (J. Org. Chem. 67:2848-2853 (2002)). Foi mostrado que o VibrioFluvialis APT tem atividade transaminase com respeito à acetoína.

Para expressão da enzima APT em E. coli, um códon otimizado

APT região de codificação (SEQ ID n° 144) foi projetado usando os códons E.coli preferenciais com adicionais considerações como estabilidade de códon emRNA, e sintetizado (por DNA2,0; Redwood City, CA). O fragmento da regiãode codificação do DNA foi subclonado no vetor pBAD.HisB (Invitrogen) entre oslocais Ncol e Hindlll e o plasmídeo resultante, a partir de agora chamado depBAD.APTI, foi transformada em células TOPIO.

Exemplo 13

Caracterização de Vibrio Fluvialis APT Atividade de Alanina:Acetoína

Aminotransferase

Um volume de 5 mL de caldo LB + 100 pg/mL de ampicilina foiinoculado com uma colônia nova de células TOP10/pBAD:APT1. A cultura foiincubada a 37°C por aproximadamente 16 h com agitação (225 rpm). Umaalíquota 300 pL desta cultura foi usada para inocular 300 mL do mesmo meio,que foi incubada a 37°C com agitação (225 rpm). Quando a cultura atingiu umaϋΟβοΟ de 0,8, L-arabinose foi adicionado para uma concentração final de 0,2%(peso por volume). A cultura foi incubada por mais 16 h e então colhida. Ascélulas foram lavadas uma vez com tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH7,8) e, então, congeladas e armazenadas a -80°C.

Para isolar a enzima, o pélete da célula foi descongelado eressuspenso em 8 mL de tampão de fosfato de potássio 100mM (pH 7)contendo etilenodiaminotetraacetate 0,2 mM, ditiotreitol 1 mM e 1 tablete decoquetel inibidor de protease (Roche; Indianápolis, IN, EUA). As células foramIisadas por dois passes através de uma prensa francesa (French Pressure Cell)a 6,2 MPa (900 psi), e o Iisado resultante foi clarificado por centrifugação por30 min a 17000 χ g. Sulfato de amônio foi adicionado até 35% de saturação, ea solução foi agitada por 30 min à temperatura ambiente, e então sólidosprecipitados removidos por centrifugação (30 min, 17000 χ g). Mais sulfato deamônio foi adicionado ao sobrenadante para se obter 55% de saturação, e asolução foi novamente agitada por 30 min à temperatura ambiente. Os sólidosprecipitados foram removidos por centrifugação (30 min, 17000 χ g) e, então,ressuspensos em 5 mL de tampão de fosfato de potássio 100mM (pH 7)contendo piridoxal 5'-fosfato 10 μΜ e ditiotreitol 1 mM. A solução foidesalinizada pela passagem através de uma coluna PD10 equilibrada comtampão A (tampão bis-tris propano 50 mM (pH 6) contendo piridoxal 5'-fosfato10 μΜ e ditiotreitol 1 mM). O extrato desalinizado foi, então, colocado em umacoluna de fluxo 20 mL Q-Fast pré-equilibrada com tampão A. O APT foi eluídacom um gradiente linear de NaCI 0-0,1 M em tampão A. A enzima foi detectadaem frações eluídas pela presença de uma proteína tamanho de banda deaproximadamente 50 kD quando analisada pela SDS-poliacrilamida geleletroforese e pela absorbância característica a 418 nm. Frações contendo aenzima eluída em NaCI ~ 0,3 M. Estas frações foram coligadas para produzirum total de 6 mL de uma solução de 5,45 mg/mL de enzima, que foi >90% depureza, como julgado pela SDS-poliacrilamida gel eletroforese.

A atividade alanina:acetoína aminotransferase de APT foiexaminada usando um teste lático desidrogenase acoplado. A mistura dereação contendo bis-tris propano 100mM (pH 9,0), piridoxal 5'-fosfato10 μΜ,acetoína 0-50 mM, L-alanina 0 a 5 mM, enzima purificada 0,14 ou 0,28 mg/mL,NADH 200 μΜ e lático desidrogenase 20 U/mL(Sigma; St. Louis, MO). Areação foi seguida pela medida da mudança em absorbância a 340 nm, queindica a oxidação de NADH. Sob estas condições, a kcJKm para acetoína foi10 M1 s"1 e aquela por L-alanina foi 400 M1 s"1.

A identidade do produto esperado de 3-amino-2-butanol foiconfirmado pela comparação a um padrão sintético. Uma mistura de (R,R)- e(S,S)-3-amino-2-butanol foi sintetizada pelo método de Dickey et al. [J AmerChem Soc 74:944 (1952)]: 5g de trans- 2,3-epoxibutano foi agitado vagarosamente em 150 mL NH4OH de frio (4°C). A reação foi aquecidavagarosamente para temperatura ambiente, lacrada e agitada à temperaturaambiente por mais 10 dias. Então, o excesso de amônia e água e epoxibutanoresidual foram removidos por evaporação rotativa sob vácuo a 40°C. O óleotransparente (2,9 g) resultante foi ressuspenso em água para uma concentraçãode 10% (peso por volume). A produção do produto desejado foi confirmado poranálise por RMN e comparação entre o espectro e aquele relatado por Levy etal. [Org. Magnetic Resonance 14:214 (1980)]. Uma mistura dos correspondentesisômeros (2R,3S)~ e (2S,3R)~ foi produzido usando o método idêntico com aexceção que o material de partida foi o eis- isômero de 2,3-epoxibutano.

Um método analítico para detecção de 3-amino-2-butanol foidesenvolvido baseado no método de derivatização de o- ftalodialdeído paradeterminação de aminoácidos relatado por Roth [Anal. Chem. 43:880 (1971)].Uma alíquota de 200 pL de 3-amino-2-butanol 1 mM (mistura de isômeros) foimisturada com 200 μL de uma solução de borato 50 mM (pH 9,5), ao qual foiadicionado 10 pL de 2-mercaptoetanol 5 μL /mL em etanol e 10 μL de o -ftalodialdeído 10 mg / mL em etanol. A solução foi incubada em temperaturaambiente por 10 min, no momento em que o derivativo foi extraído em 200 pLde hexano. O hexano foi separado da solução aquosa por decantação, e 10 pLforam injetados em uma coluna HPLC Chiracel OD (Daicel Chemical Industries;Fort Lee, NJ). A coluna foi isocraticamente executada com uma fase móvel dehexano 90:10: isopropanol a uma taxa de 1 mL/min. Os isômeros derivatizadosde 3-amino-2-butanol foram detectados por absorbância a 340 nm com temposde retenção de cerca de 15,7 e 16,8 min [ (2S, 3S) e (2R, 3R) ], e 18,4 e21,9 min [ (2R, 3S) e (2S, 3R) ]. e 18,4 e 21,9 min [(2R,3S) e (2S,3R)]. Paradiferenciar os enantiômeros na primeira mistura, o isômero puro (2R, 3R)(Bridge Organics; Vicksburg, Ml) também foi executado sob as mesmascondições, encontrando-se o pico em 16,8 min. Para diferenciar osenantiômeros 3091 na segunda mistura, a mistura foi primeiro cineticamenteresolvida usando a alanina: acetoína aminotransferase 0,28 mg de enzimapurificada foi incubada com piruvato 10mM e 3-amino-2-butanol 10mM[mistura 1:1 de isômeros (2R, 3S) e (2S, 3R) ] em 1 ml de Tris propano-bis100 mM (pH 9,0). Após 24 h à temperatura ambiente, uma alíquota foi retiradae analisada conforme descrito acima. A análise revelou que o pico foi a18,4 min foi 95% esgotado, enquanto que o pico a 21,9 min foi de > 90% retido.Uma alíquota 100 pL do remanescente da mistura de reação foi misturada com50 pL, de NADH20 mM e 10 pL do extrato da cepa TOP10/pTrc99a-BudCdescrita no exemplo 9. A enzima BudC é conhecida por reduzir (R) - acetoínapara meso- 2,3-butanodiol e (S) -acetoína para (S, S) - 2,3-butanodiol [Ui et al.(2004) Letters in Applied Microbiology 39:533-537]. Após 3 h, as amostrasforam tomadas a partir da reação e analisadas conforme descrito acima paraacetoína e butanodiol. A análise indicou que o principal produto da redução foimeso -2,3-butanodiol, indicando que o produto da reação de aminotransferasefoi (R) -acetoína e, por conseguinte, o isômero de 3-amino-2-butanolconsumido foi o isômero (2R, 3S). Assim, o tempo de retenção de 18,4 minpode ser atribuído a este isômero e de 21,9 para o isômero (2S, 3R).

Para confirmar que o produto da reação catalisada por APT dealanina:acetoína aminotransferase foi 3-amino-2-butanol, 0,28 mg de enzimapurificada foi incubada com acetoína 10 mM, l -alanina 10 mM, 50 Udesidrogenase láctica e NADH 200 μΜ em 1 ml de bis-tris propano 100 mM(pH9,0). A mistura de reação foi incubada à temperatura ambiente por 20 h, após oqual uma alíquota de 200 μΐ_ foi retirada e derivatizada como descrito acima.Os tempos de retenção dos produtos derivatizados foram 15,8 min (produtoprincipal) e 18,5 min (produto secundário), que correspondem aos dos padrõesde (2S, 3S) - e (2R, 3S) - 3-amino-2-butanol.

Exemplo 14

Identificação ε Clonagem de Erwinia Carotovora Subespécie AtrosepticaAminoálcool Quinase ε Aminoálcool O-Fosfatoliase

O objetivo deste exemplo é descrever a identificação e clonagemde seqüências que codificam uma aminoálcool quinase e aminoálcool O-fosfatoliase da bactéria Erwinia carotovora. Essas duas enzimas são parte davia 1 para a conversão de 3-amino-2-butanol a 2-butanona através dointermediário 3-amino-2-butanol fosfato, conforme mostrado na figura 1.Previsão da Erwinia Aminoálcool Quinase ε do Aminoálcool O-FosfatoliaseAs atividades de aminoálcool quinase dependente de ATP e deaminoálcool O-fosfatoliase têm sido detectadas em várias espécies dePseudomonas e Erwinia, incluindo Pseudomonas sp. P6 (NCIB10431),Pseudomonas putida NCIB 10558 (Jones et al. (1973) Biochem. J. 134:167-182),Erwinia carotovora, Erwinia amanas, Erwina miiletiae, e Erwinia atroseptica(Jones et al. (1973) Biochem. J. 134:959-968). Nestes estudos, os extratos dasespécies supracitadas foram mostrados por terem atividade para a conversãoenzimática de aminopropanol através de aminopropanol O -fosfato apropionaldeído, e para a conversão de etanolamina através de etanolamina O-fosfato a acetaldeído.

A seqüência do genoma da cepa Erwinia atroseptica em queestas atividades foram reportadas a existir (agora designada como Erwiniacarotovora subespécie atroseptica cepa SCR11043 (ATCC BAA-672)) tem sidodeterminada no Sanger Institute (Bell et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101(30):11105-11110). Análise das quinases putativas na Erwinia carotovorasubespécie atroseptica o genoma revelou uma seqüência operon (SEQ ID n°164) que codifica uma proteína putativa (ECA2059; N0 SEQ ID: 124) que é 39%idêntica a um Rhizobium Ioti homoserina quinase e uma aminotransferase(ECA2060; N0 SEQ ID: 126) dependente de piridoxal-fosfato (PLP-pyridoxalphosphate) classe Ill putativo que é 58% idêntica a uma aminotransferaseputativa a partir de Rhizobium meliloti. Com base no exposto acima esperava-se que ECA2059 fosse um aminoálcool quinase e ECA2060 fosse umaminoálcool O -fosfatoliase, que usa PLP como cofator.

Clonagem do Aminoálcool Quinase Putativa ε Aminoálcool O-Fosfaseliase Putativa a partir de Erwinia Carotovora SubespécieAtroseptica

O DNA genômico de Erwinia carotovora subespécie atroseptica(ATCC #: BAA-672D) foi obtido a partir da American Type Culture Collection(ATCC). O operon que codifica a aminoálcool quinase (KA) putativa eaminoálcool O-fosfatoliase (AT), foi nomeado KA-TA (SEQ ID n° 164. Esteoperon foi amplificado a partir do DNA genômico de Erwinia por Phusion DNApolimerase (Finnzymes; via New England Biolabs; Ipswich, MA) usandoiniciadores OT872 (SEQ. ID. N0 127) e OT873 (SEQ. ID. N0 128). Umfragmento de DNA de 2,4 kb foi obtido pela reação de PCR1 o que correspondeao tamanho do operon KA-AT. O produto de PCR foi digerido com as enzimasde restrição EcoRI e Pstl, e clonado no vetor pKK223-3 (AmershamBiosciences, Piscataway1 NJ) que foi digerido com as mesmas enzimas derestrição. Este produziu plasmídeo pKK223.KA-AT, que contém a putativaErwinia aminoálcool quinase e operon Iiase sob controle do promotor tac.Semelhantemente, plasmídeos pKK223.KA e pKK223.AT foram feitos, quecolocaram as regiões de codificação da putativa Erwinia quinase e da putativaErwinia Iiase em vetores separados, cada sob o controle do promotor tac. Paraa clonagem de PCR da região de codificação KA (SEQ ID n° 123), iniciadoresOT872 (SEQ. ID. N0 127) e OT879 (SEQ. ID. N0 129) foram usadas; e para aclonagem de PCR da região codificante AT (SEQ ID n° 125), iniciadoresOT873 (SEQ.ID. N0 128) e OT88O (SEQ. ID. N0 130) foram usados nasamplificações da PCR, que geraram produtos PCR de 1,1 kb e 1,3 kb,respectivamente. Os produtos de PCR foram cada um digeridos com EcoRI ePstl1 e ligados no vetor pKK223-3 para gerar pKK223.KA e pKK223.AT.

A ATIVIDADE IN VIVO DO AMINOÁLCOOL QUINASE PUTATIVA E AMINOÁLCOOL O-FOSFATOLIASE PUTATIVA A PARTIR DE ERWINIA CAROTOVORA SUBESPÉCIE ATROSEPTICAOs plasmídeos pKK223.KA-AT, pKK223.KA, pKK223.AT epKK223-3 foram transformados na cepa E. coii MG1655. Os transformantesforam reaplicados por esfregaço em uma placa com meio mínimo ("minimaimedia") MOPS contendo 1% de glicose, 0,5% de aminopropanol como umaúnica fonte de nitrogênio, IPTG 1 mM e 100 pg / ml_ de ampicilina. A expressãode genes KA-AT, KA e AT foram induzidos pelo IPTG. Uma placa de controlenão tinha IPTG incluído. As placas foram incubadas a 37°C por 7 dias. Naplaca com IPTG, somente a cepa MG 1655/pKK223.KA-AT cresceu, enquantotodas as outras três cepas não cresceram. Na placa sem IPTG adicionado, acepa MG1655/pKK223.KA-AT cresceu, mas as colônias foramsignificativamente menores que aquelas na placa contendo IPTG1 quecorresponde aos níveis de expressão mais baixos de KA evAT nas células nãoinduzidas. Nenhuma das outras três cepas cresceu sobre este prato. Issoindica que a co-expressão dos genes putativos KA e AT de Erwinia forneceusuficiente atividade enzimática que permitiu a cepa E. coliMG 1655/pKK223.KA-AT usar aminopropanol como uma única fonte denitrogênio. Expressão da de cada enzima individual, quer KA ou AT não foisuficiente para fornecer essa atividade enzimática in vivo.

Exemplo 15

Atividade in Vitro da Erwinia Putativa Aminoálcool Quinase ε AminoálcoolO-Fosfatoliase

Subclonagem do Operon Erwinia KA-AT no Vetor pBAD.HisB ε na Induçãoda Expressão Protéica

Os níveis de expressão de proteína de enzimas Erwinia putativasKA e AT expressas em células MG1655 do vetor pKK223.KA-AT foramanalisadas por análise SDS-Page. O nível de expressão da enzima Erwinia ATfoi relativamente baixo, com uma nova fita de proteína detectada no corretopeso molecular de 46 kD na fração solúvel de um extrato da célula, enquantonão era detectada nova fita de proteína no tamanho previsto para a enzima KA.

Em um esforço para melhorar a expressão dos genes putativos deErwinia KA e AT, o operon KA-AT foi subclonado nos locais EcoRI e Hindlll dovetor pBAD.HisB-EcoRI. A pBAD.HisB-EcoRI foi derivada do vetor pBAD.HisB(Invitrogen), pela substituição do sítio Ncol no pBAD.HisB por um sítio EcoRIvia QuickChange mutagênese de sítiodirigido (Stratagene, La JoIla1 CA)usando os iniciadores OT909 (SEQ ID. n° 131) & OT910 (SEQ ID. n° 132). Noplasmídeo construído pBAD.KA-AT, o operon KA-AT foi colocado diretamentesob controle do promotor araB (sem sua identificação).

O plasmídeo AT-pBAD.KA foi transformado na cepa E. coliTOPIO. 50 mL da cultura da cepa TOPIO/pBAD.KA-AT foi cultivada parameados da fase Iog (DO 6oo = 0,6) em LB, meio de ampicilina 100 pg/mL, a37°C com agitação a 250 rpm. A cultura foi induzida através da adição de L-arabinose para uma concentração final de 0,1% (peso por volume), e foi aindaincubada a 37°C durante 5 h antes da colheita por centrifugação. O pélete dacélula foi ressuspenso em Tris-HCI 50 mM congelado, pH 8,0, e atingidos porsonicação sobre o gelo com um Fischer Sonic Model 300 Dismembrator(Fischer, Pittsburgh, PA) a 50% de potência, repetindo quatro ciclos desonicação por 30 segundos com 60 segundos de repouso entre cada ciclo.Cada amostra após a sonicação foi centrifugada (15000 χ g, 4 min., 4°C). Osextratos clarificados livres da célula foram analisados por nível de expressão deproteína e atividade de aminoálcool O- fosfatoliase.

Síntese química de aminobutanol O-fosfato ε aminopropanol O-fosfatoO substrato de (R, R)-3-amino-2-butanol O -fosfato foi sintetizadopor um método baseado no que foi reportado por Ferrari e Ferrari (patente US2730542 [1956]) para fosfoetanolamina: 10 mmol de H 3 PO 4 em uma soluçãoaquosa 50% (peso por volume) foi misturado com uma solução 50% (peso porvolume) de 3-amino-2-butanol (~ 20:1 (R, R): (S,S) isomers; Bridge Organics;Vicksburg, Ml) enquanto agitando no gelo. Depois de misturada, a solução foilentamente aquecida à temperatura ambiente e, em seguida, agitada sob vácuoe aquecida a 70°C. Depois de 1 h a 70°C, a temperatura foi lentamenteaumentada para 185°C e mantida ali por mais 2 h. Então, a reação foi resfriadaà temperatura ambiente e liberada do vácuo. O restante do material foidissolvido em água, e a análise por RMN indicou que 80% do material inicial foiconvertido em produto com 20% permanecendo não-reagido. Produtosadicionais não foram observados.

Os substratos adicionais de (2R, 3S) -3-amino-2-butanol O -fosfato e (2S, 3R) -- 3-amino-2-butanol O -fosfato foram sintetizados pelomesmo procedimento utilizando uma mistura 1:1 de (2R, 3S) -3-amino-2 -butanol e (2S, 3R) -3-amino-2-butanol (sintetizada como descrito em exemplo13) como o material de partida. DL -1-amino-2-propanol O -fosfato, (S) - 2-amino-1-propanol O- fosfato, e (R) -2-amino-1-propanol O- fosfato foramsintetizados pelo mesmo procedimento utilizando DL -1-amino-2-propanol, (R) -2-amino-1-propanol ou (S) - 2-amino-1-propanol como o material de partida.

Análise da Atividade de Aminopropanol O-Fosfato Liase Codificada Pelo

Operon Putativo Erwinia KA-AT

O teste aminopropanol O-fosfatoliase foi realizado conformedescrito por Jones et al. (1973, Biochem. J. 134:167-182) e Gori G. et al. (1995,Chromatographia 40:336). A formação de aminopropanol a partir depropionaldeído O -fosfato foi testada colorimetricamente com MBTH, quepermite a detecção de formação de aldeído. A reação foi realizada da seguinteforma. Em um 1 mL da reação, 100 mg de extrato livre de células de E. coliTOPIO / pBAD.KA-AT foi adicionado para DL -1-amino-2-propanol O -fosfato10 mM em Tris-HCI 100 mM, pH 7,8, com mM PLP 0,1. A reação foi incubada a37°C por 10 min e 30 min, com uma alíquota de 100 pL de mistura da reaçãoremovida em cada ponto de tempo e misturada com IOOpL de MBTH-HCI6 mg / mL em glicina 375 mM, pH 2,7. Essa mistura foi incubada a 100°C por3 min, resfriada em gelo durante 15 a 30 s, e 1 mL de FeCh.6 H 2 O 3,3 mg/ mL (em HCI 10 mM) foi adicionado, seguido de incubação por 30 minutos emtemperatura ambiente. A absorbância da mistura de reação que contém oaldeído-MBTH aduto, foi medida a 670 nm. Os resultados do teste sãoindicados na tabela 9. Na presença do substrato de fosfato aminopropanol PLPe extrato livre de células, formação de aldeído foi detectada, conforme indicadopor um Abs67o que era mais elevado do que o controle do fundo de até 0,3. Naausência de um deles, do substrato ou do extrato livre de célula, a formação dealdeído não foi detectada. Na ausência do PLP adicionado, uma quantidade umpouco menor do aldeído foi detectada, provavelmente devido à presença dePLP no extrato livre de célula. O extrato livre de célula da culturaTOPIO/pBAD.KA-AT não-induzida não produziu qualquer aldeído detectável nareação. Estes resultados indicaram que a Erwinia aminoálcool O- fosfato Iiaseputativa catalisa a conversão de aminopropanol O -fosfato para propionaldeído.

Tabela 9.

Teste de aminopropanol O-fosfatoliase. A amostra 1 foi a célula sem oextrato do controle não induzido de e. COLI TOP1Q/PBAD.KA-AT. ASamostra 2 a 5 continham a célula livre de extrato da cultura induzida E.

Cou Top10/Pbad.KA-AT.

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Análise da atividade de Erwinia aminoálcool O-fosfato liase com respeitoao substrato de aminobutanol 0-fosfato

A atividade da aminoálcool O- fosfato liase rumo à aminobutanolO -fosfato de substratos foi estudada em condições idênticas às descritasacima. A reação foi conduzida a 37°C de um dia para o outro em 1 mL dareação que continha 100 microgramas de extrato livre da célula de E. coliTOP10/pBAD.KA-AT1 aminobutanol O -fosfato 10 mM (quer seja a mistura de(R, R) + (S, S) ou a mistura de isômeros (R, SJ + (S, I) descritas no exemplo15), em Tris -HCI 100 mM, pH 7,8, com PLP 0,1 mM. As alíquotas de 100 pL damistura de reação foram retiradas e o produto 2-butanona foi detectado usandoo método de derivatização MBTH descrito em métodos gerais. Os dois picosrepresentando os isômeros derivatizado de 2-butanona foram observados.Portanto, a Erwinia aminoálcool O-fosfatoliase é um aminobutanol fosfatofosfoliase além de uma aminopropanol fosfato fosfoliase.

a análise da atividade da erwinia aminoálcool o -fosfatoliase em

Estereoisômeros de Aminopropanol O-Fosfato ε Aminobutanol O-Fosfato.

A atividade da Erwinia aminoálcool O-fosfatoliase para váriosestereoisômeros de aminopropanol O -fosfato e aminobutanol O -fosfato foiestudada em condições idênticas às descritas acima. Na presença da Erwiniaaminoálcool O-fosfato liase, ambos (R) e (SJ-2-amino-l-propanol O-fosfatoforam convertidos para propanona pela enzima, mas o produto produzido eramuito mais alto com o isômero (S). A enzima também produziu butanona apartir de ambas as misturas de isômeros de 3-amino) - 2-butanol O -fosfato,com um produto produzido mais elevado encontrado na reação contendo osisômeros dos substratos (R, S) e (S, I). Ambos os produtos butanona epropanona foram derivatizados por MBTH, e detectados por HPLC comodescrito em métodos gerais.

Otimização do Nível de Expressão Gênica para Erwinia Aminoálcool

Quinase ε Aminoálcool O-Fosfatoliase

A fim de melhorar a expressão de níveis para a Erwiniaaminoálcool quinase e aminoálcool O-fosfatoliase em E. coli, as regiões decodificação códon otimizadas para ambas as enzimas (chamado EKA:SEQ ID n°155 e EAT: SEQ ID n° 156 respectivamente) foram sintetizadas por DNA2.0(Redwood City, CA). Cada região de codificação foi sintetizada com caudas de 5'e 3' incluindo sítios de restrição para clonagem: EKA tem sítios 5' Bbsl e 3'EcoRI, Hindlll; EAT tem sítios 5' EcoRI e 3', Hindlll; As regiões de codificaçãoEKA e EAT foram fornecidas a partir de DNA2.0 como plasmídeos pEKA epEAT, que estavam no vetor pJ51 de DNA2.0.A região de codificação da EKAotimizada foi subclonada pela ligação de um fragmento digerido Bbsl e Hindlll depEKA no vetor pBAD.HisB entre os sítios Ncol e Hindlll1 para gerar plasmídeopBAD.EKA. No plasmídeo resultante a região codificante é 5 'para a suaidentificação, então uma região de codificação para uma amino-terminal His 6identificação ligada à Erwinia aminoálcool quinase foi construída através daexecução de uma QuickChange reação mutagênese dirigida utilizando a um sítiousando iniciadores N0 SEQ ID: 157 e N0 SEQ ID: 158 para gerar o vetorpBAD.His-EKA.

pBAD.His-EKA foi transformada em cepa E. coli BL21-AI (F' ompT hsdSB (RB' MB') gal DCM ara B: T7RNAP-TETA; Invitrogen para produzircepa BL21-AI/pBAD.HisA-EKA. 50 mL de uma cultura BL21-AI/pBAD.HisA-EKAfoi cultivada para o meio da fase Iog (ϋΟβοο = 0,6), induzida com arabinose0,1%, e incubada adicionalmente a 30°C de um dia para o outro. Os extratoslivres de célula foram preparadas por sonicação. A His 6 -identificada proteínade fusão de Erwinia aminoálcool quinase foi purificada usando o Probond™Sistema de Purificação (Invitrogen)1 sob condições de purificação não-desnaturante seguindo as instruções do fabricante.

Resultado ProfiláticoA atividade da quinase da aminoálcool quinase da Erwinia comHiS6-identificada é analisada pelo teste ADP Quest (DiscoveRx1 Fremont, CA),seguindo as instruções do fabricante. Este é um teste bioquímico que mede oacúmulo de ADP, um produto da reação aminoálcool quinase usando queraminopropanol ou aminobutanol como substrato. O substrato 10 mM é misturadocom o His 6 -identicada Erwinia aminoálcool quinase, em Tris-HCI 100 mM, pH7,8, MgCI IOmM2, KCI 2 mM, ATP 0,1 mM, e incubado a 37°C por 1 h em0,2 mL da reação. O reagente ADP A (100 μΙ_) e reagente ADP B (200 μΙ_) sãoadicionados e a mistura é incubada em temperatura ambiente por 30 min. Umsinal fluorescente indicando atividade é medido com comprimento de onda deexcitação de 530 nm e comprimento de onda de emissão de 590 nm.Exemplo 16

Expressão da Inteira Via 3

Construção do Vetor pCL1925-KoDD-ddr:

O vetor pTrc99a: BudABC (descrito no exemplo 9) é digerido comEcoRI, e o DNA é tratado com polimerase Klenow DNA para embotar asextremidades. O vetor embotado é, subseqüentemente, digerido com Spel paraproduzir um fragmento 2,5 kb contendo os genes budA e budB. O vetorpCL1925-ter-T5chnA (descrito no exemplo 9) é digerido com Hindlll1 e o DNA foitratado com Klenow DNA polimerase para embotar as extremidades. O vetorembotado é, subseqüentemente, digerido com Xbal para produzir um fragmento4,6 kb que é então ligado para o fragmento budAB de pTrc99a: BudABC. Oplasmídeo resultante, chamado pCLBudAB-ter-T5chnA, é usado paratransformar células de E. coli TopIO1 e colônias únicas são então testadas paraestrutura de plasmídeo própria por PCR usando iniciadores pCL1925vecF (SEQID n° 62) e N84seqR3 (SEQ ID n° 159). O plasmídeo é preparada a partir deuma única colônia que produz um produto PCR do tamanho esperado de 1,4 kb.

Construção do Vetor PKK223.KA-AT-APT

O gene APT é amplificado a partir do vetor pBAD.APT (descrito noexemplo 12) por PCR usando iniciadores APTfor (SEQ ID n° 162; 5' incluindoRBS e sítio Smal) e APTrev (SEQ ID n° 163; 3' adicional sítio Smal). O produtodo tamanho esperado de 1 ,t kbp é purificado por gel e digerido com Smal paraproduzir extremidades embotadas. O vetor pKK223.KA-AT (descrito no exemplo14) é digerido com Pstl, e o DNA foi tratado com Klenow DNA polimerase paraembotar as extremidades. O fragmento de DNA resultante é ligado com oproduto PCR digerido por Smal1 e o produto de ligação é usado para transformarcélulas de E. coli Top10. As colônias Individuais resistentes à ampicilina sãotestadas para PCR usando iniciadores OT872 (SEQ ID n° 127) e APTrev (SEQID n° 163). A presença de um produto PCR do tamanho esperado de 4,1 kbpindica que o gene codificando APT está presente e orientado na mesma direçãodos genes que codificam KA e AT. A seqüência dos elementos de inserção éverificada usando os iniciadores APTseqRev (SEQ ID n° 160) e APTseqFor(SEQ ID n° 161). Este plasmídeo é chamado pKK223.KA-AT-APT. A expressãoprópria de todos os três genes é verificada pelo crescimento de 5 ml_ de umacultura de Top 10/pKK223.KA-AT-APT em LB + 100 pg/mL de ampicilina a 37°C,com agitação. Quando a ϋΟεοο atinge ~0,8, a expressão dos genes noplasmídeo é induzida pela adição de IPTG a 0,4 mM. A expressão é avaliadapela SDS-PAGE e testes de atividade conforme descrito acima.Construção de cepas de produção de 2-butanol ε produção de 2-butanona2-butanol

A cepa de_E. coli MG1655 é transformada com ambosρKK223.KA-AT-APT e pCLBudAB-ter-T5chnA, e transformantes selecionadospela resistência a ampicilina e espectinomicina, indicativos da presença dosplasmídeos. As células são inoculadas nos frascos de agitação(aproximadamente 175 ml_ de volume total) contendo 50 ou 150 ml_ deTM3a/meio de glicose (com antibióticos adequados) para representar o meio econdições com pouco oxigênio, respectivamente. 0,4 mM de IPTG é adicionadopara induzir expressão de genes a partir de pKK223.KA-AT-APT. Como umcontrole negativo, células de MG1655 são cultivadas no mesmo meio, mas semantibióticos. Os frascos são inoculados a uma ϋΟβοο inicial de < 0,01 eincubados a 34°C com agitação a 300 rpm por 24 h. Os frascos contendo50 mL do meio são tampados com tampas com respiro; Os frascos contendo150 mL do meio são tampados com tampas sem respiro para minimizar a trocade ar. A cepa 1655/ pKK223.KA-AT-APT/pCLBudAB-ter-T5chnA quecompreende uma biossintética de 2-butanol produz ambos 2-butanona e 2-butanol sobre condições de oxigênio em baixas e médias concentraçõesenquanto a cepa de controle negativo não produz níveis detectáveis nem de 2-butanona nem de 2-butanol.

Exemplo 17

Caracterização de Atividade de Glicerol Desidratase Bütano Diol

Desidratase

A glicerol desidratase (E.C. 4.2.1.30) e a diol desidratase (E.C.4.2.1.28), enquanto relacionadas estruturalmente, são freqüentementedistinguidas na técnica à base de várias diferenças, que incluem especificidadede substrato. Este exemplo demonstra que glicerol desidratase converte meso-2,3-butanodiol para 2-butanona. A cepa recombinante E. coli KLP23/pSYCO12,que compreende genes de Klebsiella pneumoniae codifica as múltiplassubunidades de glicerol desidratase (alfa: SEQ ID n° 145 (região de codificação)e 146 (proteína); beta: SEQ ID n° 147 (região de codificação) e 148 (proteína); egama: SEQ ID n° 149 (região de codificação) e 150 (proteína)) e genes deKlebsiella pneumoniae codificando as múltiplas subunidades de gliceroldesidratase reativase (subunidade grande, SEQ ID n° 151 (região decodificação) e 152 (proteína); e pequena subunidade, SEQ ID n° 153 (região decodificação) e 154 (proteína)), é descrito em Emptage et al. US 6.514.733 e noWO 2003089621, os quais estão aqui incorporados, a título de referência. Umacélula bruta, sem extrato de KLP23/pSYCO12 foi preparada pelos métodosconhecido pelo versado na técnica. O teste de enzima foi realizado na ausênciade luz em tampão 80 mM HEPES1 pH 8,2 a 37°C com 12 μΜ coenzima Bi2 e10 mM de meso-2,3-butanodiol. A formação de 2-butanona foi monitorada peloHPLC (coluna Shodex SH-1011 e coluna de proteção SH-G com detecção deíndice de refração; H2SO4 0,01 M como a fase móvel a um fluxo de 0,5 mL/min euma temperatura da coluna de 50°C; tempo de retenção de 2-butanona =40,2 min). A taxa de formação de 2-butanona pela preparação de gliceroldesidratase foi determinada para ser 0,4 nmol/min/mg de proteína bruta.Listagem de Seqüências

<110> E.I. du Pont de Nemours and Co.

<120> Produção fermentativa de álcoois de quatro carbonos <130> CL3775 PCT <160> 164 <170> PatentIn versão 3.4 <210> 1<211> 780<212> DNA<213> Klebsiella pneumoniae <400> 1 atgaatcatt ctgctgaatg cacctgcgaa gagagtctat gcgaaaccct gcgggcgttt 60tccgcgcagc atcccgagag cgtgctctat cagacatcgc tcatgagcgc cctgctgagc 120ggggtttacg aaggcagcac caccatcgcg gacctgctga aacacggcga tttcggcctc 180ggcaccttta atgagctgga cggggagctg atcgccttca gcagtcaggt ctatcagctg 240cgcgccgacg gcagcgcgcg caaagcccag ccggagcaga aaacgccgtt cgcggtgatg 300acctggttcc agccgcagta ccggaaaacc tttgaccatc cggtgagccg ccagcagctg 360cacgaggtga tcgaccagca aatcccctct gacaacctgt tctgcgccct gcgcatcgac 420ggccatttcc gccatgccca tacccgcacc gtgccgcgcc agacgccgcc gtaccgggcg 480atgaccgacg tcctcgacga tcagccggtg ttccgcttta accagcgcga aggggtgctg 540gtcggcttcc ggaccccgca gcatatgcag gggatcaacg tcgccgggta tcacgagcac 600tttattaccg atgaccgcaa aggcggcggt cacctgctgg attaccagct cgaccatggg 660gtgctgacct tcggcgaaat tcacaagctg atgatcgacc tgcccgccga cagcgcgttc 720ctgcaggcta atctgcatcc cgataatctc gatgccgcca tccgttccgt agaaagttaa 780

<210> 2<211> 259<212> PRT

<213> KTebsielTa pneumoniae<400> 2

Met Asn His Ser Ala Clu Cys Thr Cys Glu Glu Ser Leu Cys Glu Thr1 5 10 15Leu Arg Ala Phe Ser Ala Gln His Pro Glu Ser Val Leu Tyr Gln Thr20 25 30

Ser Leu Met Ser Ala Leu Leu Ser Gly Val Tyr Glu Gly Ser Thr Thr35 40 45

Ile Ala Asp Leu Leu Lys His Gly Asp Phe Gly Leu Gly Thr Phe Asn50 55 60

Glu Leu Asp Gly Glu Leu Ile Ala Phe Ser Ser Gln Val Tyr Gln Leu65 70 75 80

Arg Ala Asp Gly Ser Ala Arg Lys Ala Gln Pro Glu Gln Lys Thr Pro85 90 95

Phe Ala Val Met Thr Trp Phe Gln Pro Gln Tyr Arg Lys Thr Phe Asp100 105 110

His Pro Val Ser Arg Gln Gln Leu His Glu Val Ile Asp Gln Gln Ile115 120 125

Pro Ser Asp Asn Leu Phe Cys Ala Leu Arg Ile Asp Gly His Phe Arg130 135 140

His Ala His Thr Arg Thr Val Pro Arg Gln Thr Pro Pro Tyr Arg Ala145 150 155 160

Met Thr Asp Val Leu Asp Asp Gln Pro Val Phe Arg Phe Asn Gln Arg165 170 175

Glu Gly Val Leu Val Gly Phe Arg Thr Pro Gln His Met Gln Gly Ile180 185 190

Asn Val Ala Gly Tyr His Glu His Phe Ile Thr Asp Asp Arg Lys Gly195 200 205

Gly Gly His Leu Leu Asp Tyr Gln Leu Asp His Gly Val Leu Thr Phe210 215 220

Gly Glu Ile His Lys Leu Met Ile Asp Leu Pro Ala Asp Ser Ala Phe225 230 235 240

Leu Gln Ala Asn Leu His Pro Asp Asn Leu Asp Ala Ala Ile Arg Ser245 250 255

Val Glu Ser<210> 3

<211> 1680

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 3

atggacaaac agtatccggt acgccagtgg gcgcacggcg ccgatctcgt cgtcagtcag 60ctggaagctc agggagtacg ccaggtgttc ggcatccccg gcgccaaaat tgacaaggtc 120ttcgactcac tgctggattc ctcgattcgc attattccgg tacgccacga agccaacgcc 180gcgtttatgg ccgccgccgt cggacgcatt accggcaaag cgggcgtggc gctggtcacc 240tccggtccgg gctgttccaa cctgatcacc ggcatggcca ccgcgaacag cgaaggcgac 300ccggtggtgg ccctgggcgg cgcggtaaaa cgcgccgata aagcgaagca ggtccaccag 360agtatggata cggtggcgat gttcagcccg gtcaccaaat acgccgtcga ggtgacggcg 420ccggatgcgc tggcggaagt ggtctccaac gccttccgcg ccgccgagca gggccggccg 480ggcagcgcgt tcgttagcct gccgcaggat gtggtcgatg gcccggtcag cggcaaagtg 540ctgccggcca gcggggcccc gcagatgggc gccgcgccgg atgatgccat cgaccaggtg 600gcgaagctta tcgcccaggc gaagaacccg atcttcctgc tcggcctgat ggccagccag 660ccggaaaaca gcaaggcgct gcgccgtttg ctggagacca gccatattcc agtcaccagc 720acctatcagg ccgccggagc ggtgaatcag gataacttct ctcgcttcgc cggccgggtt 780gggctgttta acaaccaggc cggggaccgt ctgctgcagc tcgccgacct ggtgatctgc 840atcggctaca gcccggtgga atacgaaccg gcgatgtgga acagcggcaa cgcgacgctg 900gtgcacatcg acgtgctgcc cgcctatgaa gagcgcaact acaccccgga tgtcgagctg 960gtgggcgata tcgccggcac tctcaacaag ctggcgcaaa atatcgatca tcggctggtg 1020ctctccccgc aggcggcgga gatcctccgc gaccgccagc accagcgcga gctgctggac 1080cgccgcggcg cgcagctgaa ccagtttgcc ctgcatccgc tgcgcatcgt tcgcgccatg 1140caggacatcg tcaacagcga cgtcacgttg accgtggaca tgggcagctt ccatatctgg 1200attgcccgct acctgtacag cttccgcgcc cgtcaggtga tgatctccaa cggccagcag 1260accatgggcg tcgccctgcc ctgggctatc ggcgcctggc tggtcaatcc tgagcgaaaa 1320gtggtctccg tctccggcga cggcggcttc ctgcagtcga gcatggagct ggagaccgcc 1380gtccgcctga aagccaacgt actgcacctg atctgggtcg ataacggcta caacatggtg 1440gccattcagg tttaaagcct aagagaaaaa atgccgaatc ataccagcgc cttcggcgcg ctgtccggcg aaagggtttg tcgagttcgg ccgtggaaag gccgatggat cgccgaggcg 1500 1560ctggagccga ccctgcacgc ggcgatggac gtcgacggcc cggcggtggt ggccattccg 1620gtggattatc gcgataaccc gctgctgatg ggccagctgc atctgagtca gattctgtaa 1680210> 4<211> 559<212> PRT

<213> Klebsiella pneumoniae<400> 4

Met Asp Lys Gln Tyr Pro Val Arg Cln Trp Ala His Gly Ala Asp Leu1 5 10 15

Val Val Ser Gln Leu Glu Ala Gln Gly Val Arg Gln Val Phe Gly Ile20 25 30

Pro Gly Ala Lys Ile Asp Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asp Ser Ser35 40 45

Ile Arg Ile Ile Pro Val Arg His Glu Ala Asn Ala Ala Phe Met Ala50 55 60

Ala Ala Val Gly Arg Ile Thr Gly Lys Ala Gly Val Ala Leu Val Thr65 70 75 80

Ser Gly Pro Gly Cys Ser Asn Leu Ile Thr Gly Met Ala Thr Ala Asn85 90 95

Ser Clu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Gly Gly Ala Val Lys Arg Ala100 105 110

Asp Lys Ala Lys Gln Val His Gln Ser Met Asp Thr Val Ala Met Phe115 120 125

Ser Pro Val Thr Lys Tyr Ala Val Glu Val Thr Ala Pro Asp Ala Leu130 135 140

Ala Glu Val Val Ser Asn Ala Phe Arg Ala Ala Glu Gln Gly Arg Pro145 150 155 160

Cly Ser Ala Phe Val Ser Leu Pro Gln Asp Val Val Asp Gly Pro Val165 170 175

Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Gly Ala Pro Gln Met Gly Ala Ala180 185 190

Pro Asp Asp Ala Ile Asp Gln Val Ala Lys Leu Ile Ala Gln Ala Lys195 200 205Asn Pro Ile Phe Leu Leu Cly Leu Met Ala Ser Gln Pro Glu Asn Ser210 215 220

Lys Ala Leu Arg Arg Leu Leu Glu Thr Ser His Ile Pro Val Thr Ser225 230 235 240

Thr Tyr Gln Ala Ala Gly Ala Val Asn Gln Asp Asn Phe Ser Arg Phe245 250 255

Ala Gly Arg Val Gly Leu Phe Asn Asn Gln Ala Gly Asp Arg Leu Leu260 265 270

Gln Leu Ala Asp Leu Val Ile Cys Ile Gly Tyr Ser Pro Val Glu Tyr275 280 285

Clu Pro Ala Met Trp Asn Ser Gly Asn Ala Thr Leu Val His Ile Asp290 295 300

Val Leu Pro Ala Tyr Glu Glu Arg Asn Tyr Thr Pro Asp Val Glu Leu305 310 315 320

Val Gly Asp Ile Ala Gly Thr Leu Asn Lys Leu Ala Gln Asn Ile Asp325 330 335

His Arg Leu Val Leu Ser Pro Cln Ala Ala Glu Ile Leu Arg Asp Arg340 345 350

Gln His Gln Arg Glu Leu Leu Asp Arg Arg Gly Ala Gln Leu Asn Gln355 360 365

Phe Ala Leu His Pro Leu Arg Ile Val Arg Ala Met Gln Asp Ile Val370 375 380

Asn Ser Asp Val Thr Leu Thr Val Asp Met Gly Ser Phe His Ile Trp385 390 395 400

Ile Ala Arg Tyr Leu Tyr Ser Phe Arg Ala Arg Cln Val Met Ile Ser405 410 415

Asn Gly Gln Gln Thr Met Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala Ile Gly Ala 420 425 430 Trp Leu Val Asn Pro Glu Arg Lys Val Val Ser Val Ser Gly Asp Gly435 440 445Gly Phe Leu Cln Ser Ser Met Glu Leu Glu Thr Ala Val Arg Leu Lys

Ala Asn Val Leu His Leu Ile Trp Val Asp Asn Gly Tyr Asn Met Val

Ala Ile Gln Glu Glu Lys Lys Tyr Gln Arg Leu Ser Gly Val Glu Phe

Gly Pro Met Asp Phe Lys Ala Tyr Ala Glu Ser Phe Gly Ala Lys Gly

Phe Ala Val Glu Ser Ala Glu Ala Leu Glu Pro Thr Leu His Ala Ala

Met Asp Val Asp Gly Pro Ala Val Val Ala Ile Pro Val Asp Tyr Arg

Asp Asn Pro Leu Leu Met Gly Gln Leu His Leu Ser Gln Ile Leu

<210> 5

<211> 771

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 5

atgaaaaaag tcgcacttgt taccggcgcc ggccagggga ttggtaaagc tatcgccctt 60

cgtctggtga aggatggatt tgccgtggcc attgccgatt ataacgacgc caccgccaaa 120

gcggtcgcct cggaaatcaa ccaggccggc ggacacgccg tggcggtgaa agtggatgtc 180

tccgaccgcg atcaggtatt tgccgccgtt gaacaggcgc gcaaaacgct gggcggcttc 240

gacgtcatcg tcaataacgc cggtgtggca ccgtctacgc cgatcgagtc cattaccccg 300

gagattgtcg acaaagtcta caacatcaac gtcaaagggg tgatctgggg tattcaggcg 360

gcggtcgagg cctttaagaa agaggggcac ggcgggaaaa tcatcaacgc ctgttcccag 420

gccggccacg tcggcaaccc ggagctggcg gtgtatagct ccagtaaatt cgcggtacgc 480

ggcttaaccc agaccgccgc tcgcgacctc gcgccgctgg gcatcacggt caacggctac 540

tgcccgggga ttgtcaaaac gccaatgtgg gccgaaattg accgccaggt gtccgaagcc 600

gccggtaaac cgctgggcta cggtaccgcc gagttcgcca aacgcatcac tctcggtcgt 660

ctgtccgagc cggaagatgt cgccgcctgc gtctcctatc ttgccagccc ggattctgat 720

tacatgaccg gtcagtcgtt gctgatcgac ggcgggatgg tatttaacta a 771<210> 6<211> 256<212> PRT

<213> KlebsielTa pneumoniae<400> 6

Met Lys Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Cly Gln Gly Ile Gly Lys1 5 10 15

Ala Ile Ala Leu Arg Leu Val Lys Asp Gly Phe Ala Val Ala Ile Ala20 25 30

Asp Tyr Asn Asp Ala Thr Ala Lys Ala Val Ala Ser Glu Ile Asn Gln35 40 45

Ala Gly Gly His Ala Val Ala Val Lys Val Asp Val Ser Asp Arg Asp50 55 60

Gln65

Val Phe Ala Ala

Val Glu Gln Ala Arg Lys Thr70 75

Leu Gly Gly Phe80

Asp Val Ile Val Asn Asn Ala Gly Val Ala Pro Ser Thr Pro Ile Glu85 90 95

Ser Ile Thr Pro Glu Ile Val Asp Lys Val Tyr Asn Ile Asn Val Lys100 105 110

Gly Val Ile Trp Gly Ile Gln Ala Ala Val Glu Ala Phe Lys Lys Glu115 120 125

Gly His Gly Gly Lys Ile Ile Asn Ala Cys Ser Gln Ala Gly His Val130 135 140

Cly Asn Pro Glu Leu Ala Val Tyr Ser Ser Ser Lys Phe Ala Val Arg145 150 155 160

Gly Leu Thr Gln Thr Ala Ala Arg Asp Leu Ala Pro Leu Gly Ile Thr165 170 175

Val Asn Cly Tyr Cys Pro Cly Ile Val Lys Thr Pro Met Trp Ala Glu180 185 190

Ile Asp Arg Gln Val Ser Glu Ala Ala Gly Lys Pro Leu Gly Tyr Gly

195 200 205

Thr Ala Glu Phe Ala Lys Arg Ile Thr Leu Gly Arg Leu Ser Glu Pro210 215 220Glu Asp Val Ala Ala Cys Val Ser Tyr Leu Ala Ser Pro Asp Ser Asp225 230 235 240

Tyr Met Thr Gly Gln Ser Leu Leu Ile Asp Gly Gly Met Val Phe Asn245 250 255

<210> 7<211> 1665<212> DNA

<213> Klebsiella oxytoca<400> 7

atgagatcga aaagatttga agcactggcg aaacgccctg tgaatcagga cggcttcgtt 60aaggagtgga tcgaagaagg ctttatcgcg atggaaagcc cgaacgaccc aaaaccgtcg 120attaaaatcg ttaacggcgc ggtgaccgag ctggacggga aaccggtaag cgattttgac 180ctgatcgacc actttatcgc ccgctacggt atcaacctga accgcgccga agaagtgatg 240gcgatggatt cggtcaagct ggccaacatg ctgtgcgatc cgaacgttaa acgcagcgaa 300atcgtcccgc tgaccaccgc gatgacgccg gcgaaaattg tcgaagtggt ttcgcatatg 360aacgtcgtcg agatgatgat ggcgatgcag aaaatgcgcg cccgccgcac cccgtcccag 420caggcgcacg tcaccaacgt caaagataac ccggtacaga ttgccgccga cgccgccgaa 480ggggcatggc gcggatttga cgaacaggaa accaccgttg cggtagcgcg ctatgcgccg 540ttcaacgcca tcgcgctgct ggtgggctcg caggtaggcc gtccgggcgt gctgacgcag 600tgctcgctgg aagaagccac cgagctgaag ctcggcatgc tgggccacac ctgctacgcc 660gaaaccatct ccgtctacgg caccgagccg gtctttaccg acggcgacga cacgccgtgg 720tcgaagggct tcctcgcctc gtcctacgcc tctcgcgggc tgaaaatgcg ctttacctcc 780ggctccggct cggaagtgca gatgggctac gccgaaggca aatccatgct ttatctggaa 840gcgcgctgca tctacatcac caaagccgcg ggcgtacagg gtctgcaaaa cggttccgta 900agctgcatcg gcgtgccgtc tgcggtgcct tccggcattc gcgcggtgct ggcggaaaac 960ctgatctgtt cgtcgctgga tctggagtgc gcctccagca acgaccagac cttcacccac 1020tccgatatgc gtcgtaccgc gcgcctgctg atgcagttcc tgccgggcac cgactttatc 1080tcctccggtt attccgcggt gccgaactac gacaacatgt tcgccggctc caacgaagat 1140gccgaagact ttgacgacta caacgtcatc cagcgcgacc tgaaggtgga cggcggtttg 1200cgtccggttc gcgaagagga cgtcatcgcc atccgtaaca aagccgcccg cgcgctgcag 1260gccgtgtttg ccggaatggg gctgccgccg attaccgatg aagaagttga agccgcgacc 1320tacgcccacg gttcgaaaga tatgccggag cgcaacatcg tcgaagacat caagttcgcc 1380caggaaatca tcaataaaaa ccgcaacggt ctggaagtgg tgaaagcgct ggcgcagggc 1440ggattcaccg acgtggccca ggacatgctc aacatccaga aagctaagct gaccggggac 1500tacctgcata cctccgcgat tatcgtcggc gacgggcagg tgctgtcagc cgtcaacgac 1560gtcaacgact atgccggtcc ggcaacgggc tatcgcctgc agggcgaacg ctgggaagag 1620attaaaaaca tccctggcgc tcttgatccc aacgagattg attaa 1665

<210> 8<211> 554<212> PRT

<21B> KTebsieTla oxytoca<400> 8

Met Arg Ser Lys Arg Phe Glu Ala Leu Ala Lys Arg Pro Val Asn Gln1 5 10 15

Asp Gly Phe Val Lys Glu Trp Ile Glu Glu Gly Phe Ile Ala Met Glu20 25 30

Ser Pro Asn Asp Pro Lys Pro Ser Ile Lys Ile Val Asn Gly Ala Val35 40 45

Thr Glu Leu Asp Gly Lys Pro Val Ser Asp Phe Asp Leu Ile Asp His50 55 60

Phe Ile Ala Arg Tyr Gly Ile Asn Leu Asn Arg Ala Glu Glu Val Met65 70 75 80

Ala Met Asp Ser Val Lys Leu Ala Asn Met Leu Cys Asp Pro Asn Val85 90 95

Lys Arg Ser Glu Ile Val Pro Leu Thr Thr Ala Met Thr Pro Ala Lys100 105 110

Ile Val Glu Val Val Ser His Met Asn Val Val Glu Met Met Met Ala

115 120 125

Met Gln Lys Met Arg Ala Arg Arg Thr Pro Ser Gln Gln Ala His Val130 135 140

Thr Asn Val Lys Asp Asn Pro Val Gln Ile Ala Ala Asp Ala Ala Glu145 150 155 160

Gly Ala Trp Arg Gly Phe Asp Glu Gln Glu Thr Thr Val Ala Val Ala165 170 175Arg Tyr Ala Pro Phe Asn Ala Ile Ala Leu Leu Val Gly Ser Gln Val180 185 190

Gly Arg Pro Gly Val Leu Thr Gln Cys Ser Leu Glu Glu Ala Thr Glu195 200 205

Leu Lys Leu Gly Met Leu Gly His Thr Cys Tyr Ala Glu Thr Ile Ser210 215 220

Val Tyr Gly Thr Glu Pro Val Phe Thr Asp Gly Asp Asp Thr Pro Trp225 230 235 240

Ser Lys Gly Phe Leu Ala Ser Ser Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys Met245 250 255

Arg Phe Thr Ser Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln Met Gly Tyr Ala Glu260 265 270

Gly Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ala Arg Cys Ile Tyr Ile Thr Lys275 280 285

Ala Ala Gly Val Gln Gly Leu Gln Asn Gly Ser Val Ser Cys Ile Gly290 295 300

Val Pro Ser Ala Val Pro Ser Gly Ile Arg Ala Val Leu Ala Glu Asn305 310 315 320

Leu Ile Cys Ser Ser Leu Asp Leu Glu Cys Ala Ser Ser Asn Asp Gln325 330 335

Thr Phe Thr His Ser Asp Met Arg Arg Thr Ala Arg Leu Leu Met Gln340 345 350

Phe Leu Pro Gly Thr Asp Phe Ile Ser Ser Gly Tyr Ser Ala Val Pro

355 360 365

Asn Tyr Asp Asn Met Phe Ala Gly Ser Asn Glu Asp Ala Glu Asp Phe

370 375 380

Asp Asp Tyr Asn Val Ile Gln Arg Asp Leu Lys Val Asp Gly Gly Leu385 390 395 400

Arg Pro Val Arg Glu Glu Asp Val Ile Ala Ile Arg Asn Lys Ala Ala405 410 415

Arg Ala Leu Gln Ala Val Phe Ala Gly Met Gly Leu Pro Pro Ile Thr420 425 430Asp Glu Clu Val Glu Ala Ala Thr Tyr Ala His Gly Ser Lys Asp Met

Pro Glu Arg Asn Ile Val Glu Asp Ile Lys Phe Ala Gln Glu Ile Ile

Asn Lys Asn Arg Asn Gly Leu Glu Val Val Lys Ala Leu Ala Gln Gly

Gly Phe Thr Asp Val Ala Gln Asp Met Leu Asn Ile Gln Lys Ala Lys

Leu Thr Gly Asp Tyr Leu His Thr Ser Ala Ile Ile Val Gly Asp Gly

Gln Val Leu Ser Ala Val Asn Asp Val Asn Asp Tyr Ala Gly Pro Ala

Thr Gly Tyr Arg Leu Gln Gly Glu Arg Trp Glu Glu Ile Lys Asn Ile

Pro Gly Ala Leu Asp Pro Asn Glu Ile Asp545 550

<210> 9<211> 675<212> DNA

<213> Klebsiella oxytoca<400> 9

atggaaatta atgaaaaatt gctgcgccag ataattgaag acgtgctcag cgagatgaag 60

ggcagcgata aaccggtctc gtttaatgcg ccggcggcct ccgcggcgcc ccaggccacg 120

ccgcccgccg gcgacggctt cctgacggaa gtgggcgaag cgcgtcaggg aacccagcag 180

gacgaagtga ttatcgccgt cggcccggct ttcggcctgg cgcagaccgt caatatcgtc 240

ggcatcccgc ataagagcat tttgcgcgaa gtcattgccg gtattgaaga agaaggcatt 300

aaggcgcgcg tgattcgctg ctttaaatcc tccgacgtgg ccttcgtcgc cgttgaaggt 360

aatcgcctga gcggctccgg catctctatc ggcatccagt cgaaaggcac cacggtgatc 420

caccagcagg ggctgccgcc gctctctaac ctggagctgt tcccgcaggc gccgctgctg 480

accctggaaa cctatcgcca gatcggcaaa aacgccgccc gctatgcgaa acgcgaatcg 540

ccgcagccgg tcccgacgct gaatgaccag atggcgcggc cgaagtacca ggcgaaatcg 600

gccattttgc acattaaaga gaccaagtac gtggtgacgg gcaaaaaccc gcaggaactg 660

cgcgtggcgc tttga 675<210> 10<211> 224<212> PRT

<213> Klebsiella oxytoca<400> 10

Met Glu Ile Asn Clu Lys Leu Leu Arg Gln Ile Ile Glu Asp Val Leu15 10 15

Ser Glu Met Lys Gly Ser Asp Lys Pro Val Ser Phe Asn Ala Pro Ala20 25 30

Ala Ser Ala Ala Pro Gln Ala Thr Pro Pro Ala Gly Asp Gly Phe Leu35 40 45

Thr Glu Val Gly Glu Ala Arg Gln Gly Thr Gln Gln Asp Glu Val Ile50 55 60

Ile Ala Val Gly Pro Ala Phe Gly Leu Ala Gln Thr Val Asn Ile Val65 70 75 80

Gly Ile Pro His Lys Ser Ile Leu Arg Glu Val Ile Ala Gly Ile Glu85 90 95

Glu Glu Gly Ile Lys Ala Arg Val Ile Arg Cys Phe Lys Ser Ser Asp100 105 110

Val Ala Phe Val Ala Val Clu Gly Asn Arg Leu Ser Gly Ser Gly Ile115 120 125

Ser Ile Gly Ile Gln Ser Lys Gly Thr Thr Val Ile His Gln Gln Gly130 135 140

Leu Pro Pro Leu Ser Asn Leu Glu Leu Phe Pro Gln Ala Pro Leu Leu145 150 155 160

Thr Leu Glu Thr Tyr Arg Gln Ile Gly Lys Asn Ala Ala Arg Tyr Ala165 170 175

Lys Arg Glu Ser Pro Gln Pro Val Pro Thr Leu Asn Asp Gln Met Ala180 185 190

Arg Pro Lys Tyr Gln Ala Lys Ser Ala Ile Leu His Ile Lys Clu Thr

195 200 205

Lys Tyr Val Val Thr Gly Lys Asn Pro Gln Glu Leu Arg Val Ala Leu210 215 220<210> 11

<211> 522

<212> DNA

<213> Klebsiella oxytoca

<400> 11

atgaataccg acgcaattga atcgatggta cgcgacgtat tgagccgcat gaacagcctg 60cagggcgagg cgcctgcggc ggctccggcg gctggcggcg cgtcccgtag cgccagggtc 120agcgactacc cgctggcgaa caagcacccg gaatgggtga aaaccgccac caataaaacg 180ctggacgact ttacgctgga aaacgtgctg agcaataaag tcaccgccca ggatatgcgt 240attaccccgg aaaccctgcg cttacaggct tctattgcca aagacgcggg ccgcgaccgg 300ctggcgatga acttcgagcg cgccgccgag ctgaccgcgg taccggacga tcgcattctt 360gaaatctaca acgccctccg cccctatcgc tcgacgaaag aggagctgct ggcgatcgcc 420gacgatctcg aaagccgcta tcaggcgaag atttgcgccg ctttcgttcg cgaagcggcc 480acgctgtacg tcgagcgtaa aaaactcaaa ggcgacgatt aa 522

<210> 12<211> 173<212> PRT

<213> Klebsiella oxytoca<400> 12

Met Asn Thr Asp Ala Ile Clu Ser Met Val Arg Asp Val Leu Ser Arg1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Gln Cly Glu Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly20 25 30

Gly Ala Ser Arg Ser Ala Arg Val Ser Asp Tyr Pro Leu Ala Asn Lys35 40 45

His Pro Glu Trp Val Lys Thr Ala Thr Asn Lys Thr Leu Asp Asp Phe50 55 60

Thr Leu Glu Asn Val Leu Ser Asn Lys Val Thr Ala Gln Asp Met Arg65 70 75 80

Ile Thr Pro Glu Thr Leu Arg Leu Gln Ala Ser Ile Ala Lys Asp Ala85 90 95

Gly Arg Asp Arg Leu Ala Met Asn Phe Glu Arg Ala Ala Glu Leu Thr100 105 110Ala Val Pro Asp Asp Arg Ile Leu Glu Ile Tyr Asn Ala Leu Arg Pro

115

120

125

Tyr Arg Ser Thr Lys Clu Glu Leu Leu Ala Ile Ala Asp Asp Leu Glu

130

135

140

Ser Arg Tyr Gln Ala Lys Ile Cys Ala Ala Phe Val Arg Gl

u Ala Ala160

145

150

155

Thr Leu Tyr Val Glu Arg Lys Lys Leu Lys Gly Asp Asp

165

170

<210> 13<211> 1041<212> DNA

<213> Rhodococcus ruber<400> 13

atgaaagccc tccagtacac cgagatcggc tccgagccgg tcgtcgtcga cgtccccacc 60

ccggcgcccg ggccgggtga gatcctgctg aaggtcaccg cggccggctt gtgccactcg 120

gacatcttcg tgatggacat gccggcagag cagtacatct acggtcttcc cctcaccctc 180

ggccacgagg gcgtcggcac cgtcgccgaa ctcggcgccg gcgtcaccgg attcgagacg 240

ggggacgccg tcgccgtgta cgggccgtgg gggtgcggtg cgtgccacgc gtgcgcgcgc 300

ggccgggaga actactgcac ccgcgccgcc gagctgggca tcaccccgcc cggtctcggc 360

tcgcccgggt cgatggccga gtacatgatc gtcgactcgg cgcgccacct cgtcccgatc 420

ggggacctcg accccgtcgc ggcggttccg ctcaccgacg cgggcctgac gccgtaccac 480

gcgatctcgc gggtcctgcc cctgctggga cccggctcga ccgcggtcgt catcggggtc 540

ggcggactcg ggcacgtcgg catccagatc ctgcgcgccg tcagcgcggc ccgcgtgatc 600

gccgtcgatc tcgacgacga ccgactcgcg ctcgcccgcg aggtcggcgc cgacgcggcg 660

gtgaagtcgg gcgccggggc ggcggacgcg atccgggagc tgaccggcgg tgagggcgcg 720

acggcggtgt tcgacttcgt cggcgcccag tcgacgatcg acacggcgca gcaggtggtc 780

gcgatcgacg ggcacatctc ggtggtcggc atccatgccg gcgcccacgc caaggtcggc 840

ttcttcatga tcccgttcgg cgcgtccgtc gtgacgccgt actggggcac gcggtccgag 900

ctgatggacg tcgtggacct ggcccgtgcc ggccggctcg acatccacac cgagacgttc 960

accctcgacg agggacccac ggcctaccgg cggctacgcg agggcagcat ccgcggccgc 1020

ggggtggtcg tcccgggctg a 1041

<210> 14<211> 346<212> PRT

<213> KTebsielTa oxytoca<400> 14

Met Lys Ala Leu Gln Tyr Thr Glu Ile Gly Ser Glu Pro Val Val Val15 10 15

Asp Val Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Gly Glu Ile Leu Leu Lys Val20 25 30

Thr Ala Ala Gly Leu Cys His Ser Asp Ile Phe Val Met Asp Met Pro35 40 45

Ala Glu Gln Tyr Ile Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly50 55 60

Val Gly Thr Val Ala Glu Leu Gly Ala Gly Val Thr Gly Phe Glu Thr65 70 75 80

Gly Asp Ala Val Ala Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Ala Cys His85 90 95

Ala Cys Ala Arg Gly Arg Glu Asn Tyr Cys Thr Arg Ala Ala Glu Leu100 105 110

Gly Ile Thr Pro Pro Gly Leu Gly Ser Pro Gly Ser Met Ala Glu Tyr

115 120 125

Met Ile Val Asp Ser Ala Arg His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp130 135 140

Pro Val Ala Ala Val Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His145 150 155 160

Ala Ile Ser Arg Val Leu Pro Leu Leu Gly Pro Gly Ser Thr Ala Val165 170 175

Val Ile Gly Val Gly Gly Leu Gly His Val Gly Ile Gln Ile Leu Arg180 185 190

Ala Val Ser Ala Ala Arg Val Ile Ala Val Asp Leu Asp Asp Asp Arg195 200 205

Leu Ala Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala Asp Ala Ala Val Lys Ser Gly210 215 220Ala Gly Ala Ala Asp Ala Ile Arg Glu Leu Thr Gly Gly Glu Gly Ala225 230 235 240

Thr Ala Val Phe Asp Phe Val Gly Ala Gln Ser Thr Ile Asp Thr Ala245 250 255

Gln Gln Val Val Ala Ile Asp Gly His Ile Ser Val Val Gly Ile His260 265 270

Ala Gly Ala His Ala Lys Val Gly Phe Phe Met Ile Pro Phe Gly Ala275 280 285

Ser Val Val Thr Pro Tyr Trp Gly Thr Arg Ser Glu Leu Met Asp Val290 295 300

Val Asp Leu Ala Arg Ala Gly Arg Leu Asp Ile His Thr Glu Thr Phe305 310 315 320

Thr Leu Asp Glu Gly Pro Thr Ala Tyr Arg Arg Leu Arg Glu Gly Ser325 330 335

Ile Arg Gly Arg Gly Val Val Val Pro Gly340 345

<210> 15<211> 29<212> DNA<213> Seqüência<220> <223> Iniciador<400> 15

caccatggac aaacagtatc cggtacgcc

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 16

cgaagggcga tagctttacc aatcc

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 17

caccatgaat cattctgctg aatgcacctg cg

32

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 18

gatactgttt gtccatgtga cc 22

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 20

ttagttaaat accat 15

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 19

caccatgaaa aaagtcgcac ttgttacc

28

<400> 21

caccatgaga tcgaaaagat ttg

23

<210> 22<211> 22<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador<400> 22

cttagagaag ttaatcgtcg cc

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 23

caccatgaaa gccctccagt acacc

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 24

cgtcgtgtca tgcccggg

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 25

gatcgaattc gtttaaactt agttttctac cgcacg

<210> 26<211> 34<212> DNA<213> Seqüência<220> <223> Iniciador<400> 26

gatcgcatgc aagctttcat atagtcggaa ttcc

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 27

gatcgaattc gtttaaacaa aggaggtctg attcatgaga tcg

43

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 28

gatcggattc ttaatcgtcg cc 22

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 30

gatctctaga aagctttcag cccgggacga cc 32

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 29

gatcggatcc aaaggaggtc gggcgcatga aagccc

36

<400> 31

actttctttc gcctgtttca c

21

<210> 32<211> 79<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 32

catgaagctt gtttaaactc ggtgaccttg aaaataatga aaacttatat tgttttgaaa 60

ataatgaaaa cttatattg

79

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador BABC F

<400> 33

gagctcgaat tcaaaggagg aagtgtatat gaatcattc 39

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador BAB R

<210> 35

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador M13 Forward

<400> 35

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 36

<211> 16

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador M13 Reverse

<400> 34

ggatcctcta gaattagtta aataccatcc cgccg

35

<400> 36aacagctatg accatg

16

<210> 37<211> 20<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador N83 SeqF2<400> 37

gctggattac cagctcgacc

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador N83SeqF3

<400> 38

cggacgcatt accggcaaag

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador N84 SeqR4

<400> 39

cgaagcgaga gaagttatcc

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador BC Spe F

<400> 40

actagtaaag gaggaaagag tatgaagaag gtcgcact

<210> 41<211> 26<212> DNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Iniciador BC Xba R<400> 41

tctagaaagc aggggcaagc catgtc

<210> 42<211> 20<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Trc F<400> 42

ttgacaatta atcatccggc

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Trc R

<400> 43

cttctctcat ccgccaaaac

<210> 44

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador DDo For

<400> 44

aagcttaaag gaggctgatt catgagatcg aaaagatt

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador DDo Rev

<400> 45

tctagattat tcatcctgct gttctcc

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador DDko seq F2

<400> 46

gcatggcgcg gatttgacga ac

<210> 47<211> 22<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador DDko seq F5<400> 47

cattaaagag accaagtacg tg

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador DDko seq F7

<400> 48

atatcctggt ggtgtcgtcg gcgt

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador DDko seq F9

<400> 49

tctttgtcac caacgccctg cg

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador DDko seq Rl

<400> 50

gcccaccgcg ctcgccgccg cg

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador DDko seq R3

<400> 51

cccccaggat ggcggcttcg gc

<210> 52<211> 22<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador DDko seq R7<400> 52

gggccgacgg cgataatcac tt 22

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador DDko seq RlO

<400> 53

ttcttcgatc cactccttaa cg 22

<210> 54<211> 56<212> DNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Iniciador ChnA F<400> 54

catcaattga ctacgtagtc gtacgtgtaa ggaggtttga aatggaaaaa attatg 56

<210> 55<211> 40<212> DNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Iniciador ChnA R<400> 55

catgctagcc ccgggtatct tctactcatt ttttatttcg 40

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Squence<220>

<223> Iniciador chnSeq Fl

<400> 56

ctcaacaggg tgtaagtgta gt 22

<210> 57<211> 22<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador chnSeq Rl<400> 57

cgttttgata tagccaggat gt 22

<210> 58<211> 35<212> DNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Iniciador Top ter Fl<400> 58

ctagaagtca aaagcctccg accggaggct tttga 35

<210> 59<211> 60<212> DNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Iniciador Top ter F2<400> 59

ctgctcgagt tgctagcaag tttaaacaaa aaaaagcccg ctcattaggc gggctgagct 60

<210> 60

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Bot ter Rl

<400> 60

cagcccgcct aatgagcggg cttttttttg tttaaac 37

<210> 61

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Bot ter R2

<400> 61

ttgctagcaa ctcgagcagt caaaagcctc cggtcggagg cttttgactt 50

<210> 62<211> 22<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador pCL1925 vec F<400> 62

cggtatcatc aacaggctta cc 22

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador pCL1925 vec Rl

<400> 63

agggttttcc cagtcacgac gt 22

<210> 64

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador pCL1925 vec R2

<400> 64

cgcaatagtt ggcgaagtaa tc 22

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador N84 Seq R2

<400> 65

gcatcgagat tatcgggatg 20

<210> 66<211> 208<212> DNA

<213> Escherichia coli<400> 66

atcgcccgca ttcttgccgc atcttccccc ggcgtcacac cgaagtaacg tttaaactca 60cggctgtgta ggctggagct gcttcgaagt tcctatactt tctagagaat aggaacttcg 120gaataggaac taaggaggat attcatatga ttacgttgga tgtcagccgc cgtatatacg 180aagccgcccg ctaagctttt tacgcctc 208<210> 67<211> 42<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Promotor 1.6GI Variante

<400> 67gcccttgaca atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca ct 42

<210> 68<211> 42<212> DNA<213> Seqüência artificial <220> <223> Promotor 1.5 GI <400> 68gcccttgact atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca ct 42

<210> 69<211> 3240<212> DNA<213> Klebsiella oxytoca <400> 69ggcgcggtcc gccaggcggt cacctccgcg cgcgaaatcg gcaaaaccgt ccttgcgacc 60

ctcggtgctg aaccgaaaaa cgatcgcccg tcctacatct gatacccacg aggctgattc 120atgagatcga aaagatttg acggcttcgtt agcactggcg aaacgccctg tgaatcagga 180aaggagtgga tcgaagaagg ctttatcgcg atggaaagcc cgaacgaccc aaaaccgtcg 240attaaaatcg ttaacggcgc ggtgaccgag ctggacggga aaccggtaag cgattttgac 300ctgatcgacc actttatcgc ccgctacggt atcaacctga accgcgccga agaagtgatg 360gcgatggatt cggtcaagct ggccaacatg ctgtgcgatc cgaacgttaa acgcagcgaa 420atcgtcccgc tgaccaccgc gatgacgccg gcgaaaattg tcgaagtggt ttcgcatatg 480aacgtcgtcg agatgatgat ggcgatgcag aaaatgcgcg cccgccgcac cccgtcccag 540caggcgcacg tcaccaacgt caaagataac ccggtacaga ttgccgccga cgccgccgaa 600ggggcatggc gcggatttga cgaacaggaa accaccgttg cggtagcgcg ctatgcgccg 660ttcaacgcca tcgcgctgct ggtgggctcg caggtaggcc gtccgggcgt gctgacgcag 720tgctcgctgg aagaagccac cgagctgaag ctcggcatgc tgggccacac ctgctacgcc 780gaaaccatct ccgtctacgg caccgagccg gtctttaccg acggcgacga cacgccgtgg 840tcgaagggct tcctcgcctc gtcctacgcc tctcgcgggc tgaaaatgcg ctttacctcc 900ggctccggct cggaagtgca gatgggctac gccgaaggca aatccatgct ttatctggaa 960gcgcgctgca tctacatcac caaagccgcg ggcgtacagg gtctgcaaaa cggttccgta 1020agctgcatcg gcgtgccgtc tgcggtgcct tccggcattc gcgcggtgct ggcggaaaac 1080ctgatctgtt cgtcgctgga tctggagtgc gcctccagca acgaccagac cttcacccac 1140tccgatatgc gtcgtaccgc gcgcctgctg atgcagttcc tgccgggcac cgactttatc 1200tcctccggtt attccgcggt gccgaactac gacaacatgt tcgccggctc caacgaagat 1260gccgaagact ttgacgacta caacgtcatc cagcgcgacc tgaaggtgga cggcggtttg 1320cgtccggttc gcgaagagga cgtcatcgcc atccgtaaca aagccgcccg cgcgctgcag 1380gccgtgtttg ccggaatggg gctgccgccg attaccgatg aagaagttga agccgcgacc 1440tacgcccacg gttcgaaaga tatgccggag cgcaacatcg tcgaagacat caagttcgcc 1500caggaaatca tcaataaaaa ccgcaacggt ctggaagtgg tgaaagcgct ggcgcagggc 1560ggattcaccg acgtggccca ggacatgctc aacatccaga aagctaagct gaccggggac 1620tacctgcata cctccgcgat tatcgtcggc gacgggcagg tgctgtcagc cgtcaacgac 1680gtcaacgact atgccggtcc ggcaacgggc tatcgcctgc agggcgaacg ctgggaagag 1740attaaaaaca tccctggcgc tcttgatccc aacgagattg attaaggggt gagaaatgga 1800aattaatgaa aaattgctgc gccagataat tgaagacgtg ctcagcgaga tgaagggcag 1860cgataaaccg cgccggcgac gtctcgttta ggcttcctga atgcgccggc cggaagtggg 1920 ggcctccgcg cgaagcgcgt gcgccccagg cagggaaccc ccacgccgcc agcaggacga 1980agtgattatc gccgtcggcc cggctttcgg cctggcgcag accgtcâata tcgtcggcat 2040cccgcataag agcattttgc gcgaagtcat tgccggtatt gaagaagaag gcattaaggc 2100gcgcgtgatt cgctgcttta aatcctccga cgtggccttc gtcgccgttg aaggtaatcg 2160cctgagcggc tccggcatct ctatcggcat ccagtcgaaa ggcaccacgg tgatccacca 2220gcaggggctg ccgccgctct ctaacctgga gctgttcccg caggcgccgc tgctgaccct 2280ggaaacctat cgccagatcg gcaaaaacgc cgcccgctat gcgaaacgcg aatcgccgca 2340gccggtcccg acgctgaatg accagatggc gcggccgaag taccaggcga aatcggccat 2400tttgcacatt aaagagacca agtacgtggt gacgggcaaa aacccgcagg aactgcgcgt 2460ggcgctttga taaaggataa ctccatgaat accgacgcaa ttgaatcgat ggtacgcgac 2520gtattgagcc gcatgaacag cctgcagggc gaggcgcctg cggcggctcc ggcggctggc 2580ggcgcgtccc gtagcgccag ggtcagcgac tacccgctgg cgaacaagca cccggaatgg 2640gtgaaaaccg ccaccaataa aacgctggac gactttacgc tggaaaacgt gctgagcaat 2700aaagtcaccg cccaggatat gcgtattacc ccggaaaccc tgcgcttaca ggcttctatt 2760gccaaagacg cgggccgcga ccggctggcg atgaacttcg agcgcgccgc cgagctgacc 2820gcggtaccgg acgatcgcat tcttgaaatc tacaacgccc tccgccccta tcgctcgacg 2880aaagaggagc tgctggcgat cgccgacgat ctcgaaagcc gctatcaggc gaagatttgc 2940gccgctttcg ttcgcgaagc ggccacgctg tacgtcgagc gtaaaaaact caaaggcgac 3000gattaacttc tctaagtaat tcgagatgca ttgaggcggc aagtgagtga caaattcgtc 3060tggaacgaat ttgaacagcc ataggctggc tttagtgagg gacagggatg tccctcataa 3120ccccgatgag cttactgtag taagtgattc gggtgaaaga acgcagccaa caaaaaggca 3180gtttgaagta cgacgagaaa aggggcatgt gatgcgatat atagctggca ttgatatcgg 3240

<210> 70

<211> 2640

<212> DNA

<213> KTebsiella oxytoca

<400> 70

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<210> 71<211> 756<212> DNA

<213> Acinetobacter sp.<400> 71

atggaaaaaa ttatgtcaaa taaattcaac aataaagtcgtcaggtattg gtaaaagcac cgcactgctt ttggctcaactcagatatta acctggaagc agcacagaaa gttgtggacg

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<210> 72<211> 251<212> PRT

<213> Acinetobacter sp.<400> 72

Met Glu Lys Ile Met Ser Asn Lys Phe Asn Asn Lys Val Ala Leu Ile1 5 10 15

Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ile Gly Lys Ser Thr Ala Leu Leu Leu Ala20 25 30

Gln Gln Gly Val Ser Val Val Val Ser Asp Ile Asn Leu Glu Ala Ala35 40 45

Gln Lys Val Val Asp Glu Ile Val Ala Leu Gly Gly Lys Ala Ala Ala50 55 60

Asn Lys Ala Asn Thr Ala Glu Pro Glu Asp Met Lys Ala Ala Val Glu65 70 75 80

Phe Ala Val Ser Thr Phe Gly Ala Leu His Leu Ala Phe Asn Asn Ala85 90 95

Gly Ile Leu Gly Glu Val Asn Ser Thr Glu Glu Leu Ser Ile Glu Gly100 105 110

Trp Arg Arg Val Ile Asp Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Ser Met115 120 125

His Tyr Glu Val Pro Ala Ile Leu Ala Ala Gly Gly Gly Ala Ile Val

130 135 140Asn Thr Ala Ser Ile Ala Gly Leu Ile Gly Ile Gln Asn Ile Ser Gly145 150 155 160

Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Thr Gly Leu Thr Lys Ala Ala Ala165 170 175

Leu Glu Tyr Ala Asp Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ser Val His Pro Gly180 185 190

Tyr Ile Lys Thr Pro Leu Ile Ala Glu Phe Glu Glu Ala Glu Met Val195 200 205

Lys Leu His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Gln Pro Glu Glu Val Ala Gln210 215 220

Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Asp Asp Ala Ser Phe Val Thr Gly Ser225 230 235 240

Gln Tyr Val Val Asp Gly Ala Tyr Thr Ser Lys245 250

<210> 73<211> 17417<212> DNA

<213> Acinetobacter sp.<400> 73

ctagcattta cgcgtgaggt aggtgggtag gtctgtaatg tgaagatcta cgaggaaatc 60ggcgtcatga cgtgaggtcc agcgaaccgt cttgcgtaat ccgtcattca tggtgagtaa 120cattgcccgt atttcgcgtt cagtatatag cagaccagca tgattaacga gatcctgggt 180attttagtcc ggacacccaa agtcccatgc ggtcgccaga tccagtaagt cgactacgac 240ttgctcatct gtagccaacc ccgcaatcac ttccacaatt ttcatcagtg gaaccggatt 300gaagaaatgg aaacctgcga tacggccctg atgctgacac gcagatgcaa ttgaggtcac 360agatagtgag gatgtatttg aaaccagaat agtttcttca gccacaatcc tttcaagctg 420tttaaacaaa gtttgcttga tttccagatt ttcaataatt gcttctacga ccagatcaac 480gccagcaacc tcttcaatgc tttccaagat aatcaatcgg gctaaggtat ccacaagctg 540ctgttcggtt aactttcctt tagcagctag tttgtgcaag gttactttta atttttccaa 600gccttgctca gcagcgccgg gtttagcatc aaataaacgg acctcaacac ccgcctgtgc 660tgcaatttgc gcaataccca ttcccattac gcctgtgcca atcaaggcca ttttttgaat 720cgtcatgact tattttcctt gatattgagg gcttcgcttt tcgaaaaagg cattgacgcc 780ttctttttga tcttgtgtat caaataaaat ttggaaggct ttacgctcta atgccaaagc 840accatcgagt ggcatattgg cacctagtgt 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2580cgcaaacagt ttggtcaagc gattgcgaac ttccagttga ttcaaggtat gttagccgat 2640tctaaagctg aaatttacgc agcaaaatgt atggtattag atgctgcccg acttcgtgat 2700gctggacaga atgtcagcac ggaagcatct tgtgccaaga tgtttgccac tgaaatgtgt 2760ggccgtgtcg cagatcgtgg cgtacagatc catggtggtg cgggttatat cagtgaatat 2820gctattgagc gtttttaccg tgatgtacgt ttattccgtt tgtatgaagg tacaacgcaa 2880atccaacagg tcattattgc ccgcaatatg atccgtgaag cgactcaata attgtataac 2940aggtattgag tgtatctaaa aggacgggat tagtgattta agctataact tgaatactaa 3000tcctgacttt ttgatggcaa ggctataaaa cctcctagct cattttatct ctaagctaat 3060cacagctgaa agatattttc agtcttcatc cttaccagac agttcacaat acaaaattgg 3120attttatgaa tatgcaagaa caagaaatcg aacgcgaatc aatggagttt gacgtcgtga 3180ttgtcggcgc aggaccggcc ggtctttctg cagcgatcaa gatccgtcaa cttgcaattg 3240aaaacaacct acatcttgtc gaacgatctg cggtgcggta tcggtttgtg ctggaaccac tggtggaaaa gtgccatgaa aggctctgaa tgagctgttc gtcggtgcgc ccgaactgga 3300 3360aggaagaagg tgcaccttta aatgttccag tgaccgaaga caagacctat ttcctgctct 3420cggatgaaaa 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attgatactt atagcaaagt ggttcactgc aagctgtaca caaccaagac accaatcaca 10080

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16800attaaaaaaa agccgtggca tatttcgcaa gccagttcaa gtcaggtatg tctttattca 16860gtacctcagt taaactttag attttcataa cgatggttat tctgcatggc taaatacgct 16920aatcagcaaa aaactctcca aaagataggc acagaaacac atatcaacca taaaaaccat 16980ctcagacagt atatttacaa gcctctaatt caccgcactc acacttctct gcaagccttt 17040ttaaataccc tgtacaaagt tctcagcctg atgaagcttc accttggact tagctttcag 17100ttcagcctgt acttggtcag tttctgaatt ttcatttgca taaaactcct ccaccacatc 17160cataccctcc tcaatgtcag tttcaaaatg tgcattgtca tagccttgcc gtgccatttg 17220aatggcttat tgaagattaa tggcatcacg taaagttaaa tccacgtaat acacaggtgt 17280tcgatagctt tgcgtcgtag actttctcga agagtcaatt gcagcggtag gcatgacagc 17340aagccattca atgccgcatg gtaataactc agccgtgcgg ccaacgttcg tatgctgtta 17400aaacccggtt attctaa 17417

<210> 74<211> 1164<212> DNA

<213> Escherichia coli<400> 74

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<210> 75<211> 387<212> PRT

<213> Escherichia coli<400> 75

Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Cly Lys15 10 15

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Gln Val Leu Asp Ala Leu Lys Gly Met Asp Val Leu Glu Phe Gly Gly50 55 60

Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Asn Ala Val Lys Leu65 70 75 80

Val Arg Glu Gln Lys Val Thr Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser85 90 95

Val Leu Asp Gly Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ala Ala Asn Tyr Pro Glu100 105 110

Asn Ile Asp Pro Trp His Ile Leu Gln Thr Gly Gly Lys Glu Ile Lys115 120 125

Ser Ala Ile Pro Met Gly Cys Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser130 135 140

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Asp Ala Lys Ile Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Ile Leu Leu Thr Leu210 215 220

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Gly Ala Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Leu Gly His Glu260 265 270Leu Thr Ala Met His Cly Leu Asp His Ala Gln Thr Leu Ala Ile Val275 280 285

Leu Pro Ala Leu Trp Asn Clu Lys Arg Asp Thr Lys Arg Ala Lys Leu290 295 300

Leu Gln Tyr Ala Clu Arg Val Trp Asn Ile Thr Clu Gly Ser Asp Asp305 310 315 320

Clu Arg Ile Asp Ala Ala Ile Ala Ala Thr Arg Asn Phe Phe Glu Gln325 330 335

Leu Cly Val Pro Thr His Leu Ser Asp Tyr Cly Leu Asp Gly Ser Ser340 345 350

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Gly Glu Asn His Asp Ile Thr Leu Asp Val Ser Arg Arg Ile Tyr Glu370 375 380

Ala Ala Arg385

<210> 76 <211> 1623 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 76 atgtatttgg cattccaggt gcaaaaattg atgcggtatt tgacgcttta caagataaag 60gacctgaaat tatcgttgcc cggcacgaac aaaacgcagc aattcatggc ccaagcagtc 120ggccgtttaa ctggaaaacc gggagtcgtg ttagtcacat caggaccggg tgcctctaac 180ttggcaacag gcctgctgac agcgaacact gaaggagacc ctgtcgttgc gcttgctgga 240aacgtgatcc gtgcatatcg tttaaaacgg acacatcaat ctttggataa tgcggcgcta 300ttccagccga ttacaaaata cagtgtagaa gttcaagatg taaaaaatat accggaagct 360gttacaaatg catttaggat agcgtcagca gggcaggctg gggccgcttt tgtgagcttt 420ccgcaagatg ttgtgaatga agtcacaaat acgaaaaacg tgcgtgctgt tgcagcgcca 480aaactcggtc ctgcagcaga tgatgcaatc agtgcggcca tagcaaaaat ccaaacagca 540aaacttcctg tcgttttggt cggcatgaaa ggcggaagac cggaagcaat taaagcggtt 600cgcaagcttt tgaaaaaggt tcagcttcca tttgttgaaa catatcaagc tgccggtacc 660ctttctagag atttagagga tcaatatttt ggccgtatcg gtttgttccg caaccagcct 720ggcgatttac tgctagagca ggcagatgtt gttctgacga tcggctatga cccgattgaa 780tatgatccga aattctggaa tatcaatgga gaccggacaa ttatccattt agacgagatt 840atcgctgaca ttgatcatgc ttaccagcct gatcttgaat tgatcggtga cattccgtcc 900acgatcaatc atatcgaaca cgatgctgtg aaagtggaat ttgcagagcg tgagcagaaa 960atcctttctg atttaaaaca atatatgcat gaaggtgagc aggtgcctgc agattggaaa 1020tcagacagag cgcaccctct tgaaatcgtt aaagagttgc gtaatgcagt cgatgatcat 1080gttacagtaa cttgcgatat cggttcgcac tccatttgga tgtcacgtta tttccgcagc 1140tacgagccgt taacattaat gatcagtaac ggtatgcaaa cactcggcgt tgcgcttcct 1200tgggcaatcg gcgcttcatt ggtgaaaccg ggagaaaaag tggtttctgt ctctggtgac 1260ggcggtttct tattctcagc aatggaatta gagacagcag ttcgactaaa agcaccaatt 1320gtacacattg tatggaacga cagcacatat gacatggtgc atttccagca attgaaaaaa 1380tataaccgta catctgcggt cgatttcgga aatatcgata tcgtgaaata tgcggaaagc 1440ttcggagcaa ctgcgttgcg cgtagaatca ccagaccagc tggcagatgt tctgcgtcaa 1500ggcatgaacg ctgaaggtcc tgtcatcatc gatgtcccgg ttgactacag tgataacatt 1560aatttagcaa gtgacaagct tccgaaagaa ttcggggaac tcatgaaaac gaaagctctc 1620tag 1623

<210> 77<211> 540<212> PRT

<213> BaciΠus subtilis<400> 77

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Tyr Lys Ile Lys Asp Leu Lys Leu Ser Leu Pro Gly Thr Asn Lys Thr20 25 30

Gln Gln Phe Met Ala Gln Ala Val Gly Arg Leu Thr Gly Lys Pro Gly35 40 45

Val Val Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly50 55 60

Leu Leu Thr Ala Asn Thr Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Ala Gly65 70 75 80Asn Val Ile Arg Ala Tyr Arg Leu Lys Arg Thr His Gln Ser Leu Asp85 90 95

Asn Ala Ala Leu Phe Gln Pro Ile Thr Lys Tyr Ser Val Glu Val Gln100 105 110

Asp Val Lys Asn Ile Pro Glu Ala Val Thr Asn Ala Phe Arg Ile Ala115 120 125

Ser Ala Gly Gln Ala Gly Ala Ala Phe Val Ser Phe Pro Gln Asp Val130 135 140

Val Asn Glu Val Thr Asn Thr Lys Asn Val Arg Ala Val Ala Ala Pro145 150 155 160

Lys Leu Gly Pro Ala Ala Asp Asp Ala Ile Ser Ala Ala Ile Ala Lys165 170 175

Ile Gln Thr Ala Lys Leu Pro Val Val Leu Val Gly Met Lys Gly Gly180 185 190

Arg Pro Glu Ala Ile Lys Ala Val Arg Lys Leu Leu Lys Lys Val Gln195 200 205

Leu Pro Phe Val Glu Thr Tyr Gln Ala Ala Gly Thr Leu Ser Arg Asp210 215 220

Leu Glu Asp Gln Tyr Phe Gly Arg Ile Gly Leu Phe Arg Asn Gln Pro225 230 235 240

Gly Asp Leu Leu Leu Glu Gln Ala Asp Val Val Leu Thr Ile Gly Tyr245 250 255

Asp Pro Ile Glu Tyr Asp Pro Lys Phe Trp Asn Ile Asn Gly Asp Arg260 265 270

Thr Ile Ile His Leu Asp Glu Ile Ile Ala Asp Ile Asp His Ala Tyr275 280 285

Gln Pro Asp Leu Glu Leu Ile Gly Asp Ile Pro Ser Thr Ile Asn His290 295 300

Ile Glu His Asp Ala Val Lys Val Glu Phe Ala Glu Arg Glu Gln Lys305 310 315 320Ile Leu Ser Asp Leu Lys Gln Tyr Met His Clu Gly Glu Gln Val Pro325 330 335

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Leu Arg Asn Ala Val Asp Asp His Val Thr Val Thr Cys Asp Ile Gly355 360 365

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Trp Ala Ile Gly Ala Ser Leu Val Lys Pro Gly Glu Lys Val Val Ser405 410 415

Val Ser Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser Ala Met Glu Leu Glu Thr420 425 430

Ala Val Arg Leu Lys Ala Pro Ile Val His Ile Val Trp Asn Asp Ser435 440 445

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Ser Ala Val Asp Phe Gly Asn Ile Asp Ile Val Lys Tyr Ala Glu Ser465 470 475 480

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Val Leu Arg Gln Gly Met Asn Ala Glu Gly Pro Val Ile Ile Asp Val500 505 510

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<210> 78

<211> 1680

<212> DNA

<213> KlebsieTla terrigena<400> 78

atggacaaac cgcgtcacga acgtcaatgg gcccacggtg ccgacttaat cgtcagccag 60cttgaggccc agggcgtacg ccaggtcttc ggcatccccg gtgccaaaat cgacaaggtg 120tttgattccc tcctcgactc ctcaatccgc attattccgg tgcgccacga ggctaacgcc 180gcctttatgg ccgcggcggt cgggcggatt accggtaaag cgggcgtcgc gctggtgacc 240tccggtcccg gctgctcaaa cctgattacc ggcatggcca ccgccaatag cgaaggcgac 300ccggtggtgg cgctgggcgg cgcggtgaag cgcgcggata aggccaagct ggttcaccaa 360agcatggaca ccgtggcgat gttcagcccg gtcaccaaat acgccgtcga ggtgaccgcc 420tccgacgcgc tggccgaggt ggtctccaac gcctttcgcg ccgccgaaca ggggcgtccg 480gggagcgcgt ttgtcagcct gccgcaggat atcgttgacg gccccgccag cggcagcacg 540ctgcccgcca gcagagcgcc gcagatgggc gccgcgccgg atggcgccgt tgacagcgtg 600gcgcaggcga tcgccgcggc gaagaaccct atcttcctgc tcgggctgat ggccagccag 660ccggaaaaca gccgcgccct gcaccgccat gctggaaaaa agccatattc cggtcaccag 720cacctatcag gcgccggggc ggtaaatcag gataacttcg cccgcttcgc cggccgggta 780ggcctgttta ataaccaggc gggcgatcgc ctgctgcgtc aggcggacct gatcatctgc 840atcggctata gcccggttga gtacgaaccg gcgatgtgga acagcggcac ggcaaccctg 900gtgcatatcg acgtgctgcc ggcctatgaa gagcggaact acgtcccgga tatcgagctg 960gtgggcgaca tcgccgccac cctcgagaag ctggcccagc gcattgaaca tcggctggtg 1020ttaactccgc aggcggcgga catcctcgcc gaccgccagc gccagcggga gctgcttgac 1080cgccgcgggg cgcagctgaa tcagtttgcg ctccacccgc tgcgcatcgt gcgggcgatg 1140caggatatcg tcaatagcga cgtcaccttg accgtcgata tgggcagttt ccatatctgg 1200attgcccgct acctctacag cttccgcgcc cgccaggtga tgatctccaa cggtcagcaa 1260acgatgggcg tcgcgctgcc gtgggcaatc ggcgcgtggc tggtcaatcc gcagcgcaag 1320gtggtctcgg tatccggcga tggcggcttc ctgcagtcga gcatggagct ggagaccgcc 1380gtgcgcctgc acgccaatat tctgcacatc atctgggtcg ataacggcta caacatggtg 1440gcgattcagg aacagaagaa atatcagcgc ctctccggcg tggagttcgg cccggtcgat 1500ttcaaagtct acgccgaagc gttcggggcc tgcgggtttg cggtagagag cgccgaggcc 1560ctggagccga ccctgcgcgc ggcgatggat gtcgacggcc cggcggtggt cgccattccg 1620gtcgattacc gcgataaccc tctgctgatg ggccagctcc atctcagcca aatactgtga 1680

<210> 79<211> 559<212> PRT

<213> Klebsiella terrigena<400> 79

Met Asp Lys Pro Arg His Clu Arg Cln Trp Ala His Gly Ala Asp Leu15 10 15

Ile Val Ser Gln Leu Glu Ala Gln Gly Val Arg Gln Val Phe Gly Ile20 25 30

Pro Gly Ala Lys Ile Asp Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asp Ser Ser35 40 45

Ile Arg Ile Ile Pro Val Arg His Glu Ala Asn Ala Ala Phe Met Ala50 55 60

Ala Ala Val Gly Arg Ile Thr Gly Lys Ala Gly Val Ala Leu Val Thr65 70 75 80

Ser Gly Pro Gly Cys Ser Asn Leu Ile Thr Gly Met Ala Thr Ala Asn85 90 95

Ser Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Gly Gly Ala Val Lys Arg Ala100 105 110

Asp Lys Ala Lys Leu Val His Gln Ser Met Asp Thr Val Ala Met Phe115 120 125

Ser Pro Val Thr Lys Tyr Ala Val Glu Val Thr Ala Ser Asp Ala Leu130 135 140

Ala Clu Val Val Ser Asn Ala Phe Arg Ala Ala Glu Gln Gly Arg Pro145 150 155 160

Gly Ser Ala Phe Val Ser Leu Pro Gln Asp Ile Val Asp Gly Pro Ala165 170 175

Ser Gly Ser Thr Leu Pro Ala Ser Arg Ala Pro Gln Met Cly Ala Ala180 185 190

Pro Asp Gly Ala Val Asp Ser Val Ala Gln Ala Ile Ala Ala Ala Lys195 200 205

Asn Pro Ile Phe Leu Leu Gly Leu Met Ala Ser Gln Pro Glu Asn Ser210 215 220Arg Ala Leu His Arg His Ala Gly Lys Lys Pro Tyr Ser Cly His Gln225 230 235 240

His Leu Ser Gly Ala Gly Ala Val Asn Gln Asp Asn Phe Ala Arg Phe245 250 255

Ala Gly Arg Val Gly Leu Phe Asn Asn Gln Ala Gly Asp Arg Leu Leu260 265 270

Arg Gln Ala Asp Leu Ile Ile Cys Ile Gly Tyr Ser Pro Val Clu Tyr275 280 285

Glu Pro Ala Met Trp Asn Ser Gly Thr Ala Thr Leu Val His Ile Asp290 295 300

Val Leu Pro Ala Tyr Clu Glu Arg Asn Tyr Val Pro Asp Ile Glu Leu305 310 315 320

Val Gly Asp Ile Ala Ala Thr Leu Glu Lys Leu Ala Gln Arg Ile Glu325 330 335

His Arg Leu Val Leu Thr Pro Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ala Asp Arg340 345 350

Gln Arg Gln Arg Glu Leu Leu Asp Arg Arg Gly Ala Gln Leu Asn Cln355 360 365

Phe Ala Leu His Pro Leu Arg Ile Val Arg Ala Met Cln Asp Ile Val370 375 380

Asn Ser Asp Val Thr Leu Thr Val Asp Met Gly Ser Phe His Ile Trp385 390 395 400

Ile Ala Arg Tyr Leu Tyr Ser Phe Arg Ala Arg Gln Val Met Ile Ser405 410 415

Asn Gly Gln Gln Thr Met Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala Ile Gly Ala420 425 430

Trp Leu Val Asn Pro Gln Arg Lys Val Val Ser Val Ser Gly Asp Gly435 440 445

Gly Phe Leu Cln Ser Ser Met Glu Leu Clu Thr Ala Val Arg Leu His450 455 460Ala Asn Ile Leu His Ile Ile Trp Val Asp Asn Cly Tyr Asn Met Val465 470 475 480

Ala Ile Cln Clu Gln Lys Lys Tyr Gln Arg Leu Ser Gly Val Glu Phe485 490 495

Gly Pro Val Asp Phe Lys Val Tyr Ala Glu Ala Phe Cly Ala Cys Gly500 505 510

Phe Ala Val Glu Ser Ala Glu Ala Leu Glu Pro Thr Leu Arg Ala Ala515 520 525

Met Asp Val Asp Gly Pro Ala Val Val Ala Ile Pro Val Asp Tyr Arg530 535 540

Asp Asn Pro Leu Leu Met Cly Gln Leu His Leu Ser Gln Ile Leu545 550 555

<210> 80 <211> 768 <212> DNA <213> Bacillus subti lis <400> 80 atgaaacgag aaagcaacat tcaagtgctc agccgtggtc aaaaagatca gcctgtgagc 60cagatttatc aagtatcaac aatgacttct ctattagacg gagtatatga cggagatttt 120gaactgtcag agattccgaa atatggagac ttcggtatcg gaacctttaa caagcttgac 180ggagagctga ttgggtttga cggcgaattt taccgtcttc gctcagacgg aaccgcgaca 240ccggtccaaa atggagaccg ttcaccgttc tgttcattta cgttctttac accggacatg 300acgcacaaaa ttgatgcgaa aatgacacgc gaagactttg aaaaagagat caacagcatg 360ctgccaagca gaaacttatt ttatgcaatt cgcattgacg gattgtttaa aaaggtgcag 420acaagaacag tagaacttca agaaaaacct tacgtgccaa tggttgaagc ggtcaaaaca 480cagccgattt tcaacttcga caacgtgaga ggaacgattg taggtttctt gacaccagct 540tatgcaaacg gaatcgccgt ttctggctat cacctgcact tcattgacga aggacgcaat 600tcaggcggac acgtttttga ctatgtgctt gaggattgca cggttacgat ttctcaaaaa 660atgaacatga atctcagact tccgaacaca gcggatttct ttaatgcgaa tctggataac 720cctgattttg cgaaagatat cgaaacaact gaaggaagcc ctgaataa 768

<210> 81<211> 255<212> PRT<213> BaciΠus subtilis<400> 81

Met Lys Arg Glu Ser Asn Ile Gln Val Leu Ser Arg Gly Gln Lys Asp1 5 10 15

Gln Pro Val Ser Gln Ile Tyr Gln Val Ser Thr Met Thr Ser Leu Leu20 25 30

Asp Gly Val Tyr Asp Gly Asp Phe Glu Leu Ser Glu Ile Pro Lys Tyr35 40 45

Gly Asp Phe Gly Ile Gly Thr Phe Asn Lys Leu Asp Gly Glu Leu Ile50 55 60

Gly Phe Asp Gly Glu Phe Tyr Arg Leu Arg Ser Asp Gly Thr Ala Thr65 70 75 80

Pro Val Gln Asn Gly Asp Arg Ser Pro Phe Cys Ser Phe Thr Phe Phe85 90 95

Thr Pro Asp Met Thr His Lys Ile Asp Ala Lys Met Thr Arg Glu Asp100 105 110

Phe Glu Lys Glu Ile Asn Ser Met Leu Pro Ser Arg Asn Leu Phe Tyr115 120 125

Ala Ile Arg Ile Asp Gly Leu Phe Lys Lys Val Gln Thr Arg Thr Val130 135 140

Glu Leu Gln Glu Lys Pro Tyr Val Pro Met Val Glu Ala Val Lys Thr145 150 155 160

Gln Pro Ile Phe Asn Phe Asp Asn Val Arg Gly Thr Ile Val Gly Phe165 170 175

Leu Thr Pro Ala Tyr Ala Asn Gly Ile Ala Val Ser Gly Tyr His Leu180 185 190

His Phe Ile Asp Glu Gly Arg Asn Ser Gly Gly His Val Phe Asp Tyr195 200 205

Val Leu Glu Asp Cys Thr Val Thr Ile Ser Gln Lys Met Asn Met Asn210 215 220Leu Arg Leu Pro Asn Thr Ala Asp Phe Phe Asn Ala Asn Leu Asp Asn225 230 235 240

Pro Asp Phe Ala Lys Asp Ile Glu Thr Thr Clu Gly Ser Pro Glu245 250 255

<210> 82

<211> 780

<212> DNA

<213> KlebsielTa terrigena

<400> 82

gtgaatcatt atcctgaatg cacctgccag gagagcctgt gcgaaaccgt acgcggcttc 60tccgcccacc accctgatag cgttatctat cagacctctc tgatgagcgc gctgctgagc 120ggggtctatg agggtagcac caccatcgcc gacctgctga cccacggcga cttcggtctc 180ggcaccttta acgaactcga tggcgaactg attgccttta gcagcgaggt ctaccagctg 240cgcgctgacg gcagcgcgcg taaagcccgg gcggatcaaa aaacgccctt cgcggtgatg 300acctggttca gaccgcagta ccgtaaaacc tttgaccacc cggtcagccg ccagcagctg 360cacgacgtta tcgaccagca aatcccctcc gataacctgt tctgcgccct gcatattgat 420ggtcactttc gccacgccca cacccgcacc gtgccgcggc agacgccgcc ctatcgggcg 480atgaccgacg tgctcgatga ccagccggtt ttccgcttca accagcgcaa ggggacgctg 540gtcggctttc gcaccccgca gcatatgcag ggccttaacg ttgccggcta ccacgagcac 600tttattaccg acgatcgcca gggcggcggc catctgctgg actaccagct cgatagcggc 660gtgctgacct tcggcgagat ccacaagctg atgattgacc tcccggccga cagcgctttc 720ctgcaggccg acctgcatcc tgacaatctc gatgccgcta ttcgtgcggt agaaaactaa 780

<210> 83<211> 259<212> PRT

<213> Klebsiella terrigena<400> 83

Met Asn His Tyr Pro Glu Cys Thr Cys Gln Glu Ser Leu Cys Glu Thr15 10 15

Val Arg Gly Phe Ser Ala His His Pro Asp Ser Val Ile Tyr Gln Thr20 25 30

Ser Leu Met Ser Ala Leu Leu Ser Gly Val Tyr Glu Gly Ser Thr Thr35 40 45Ile Ala Asp Leu Leu Thr His Gly Asp Phe Gly Leu Gly Thr Phe Asn50 55 60

Glu Leu Asp Gly Glu Leu Ile Ala Phe Ser Ser Glu Val Tyr Gln Leu65 70 75 80

Arg Ala Asp Gly Ser Ala Arg Lys Ala Arg Ala Asp Gln Lys Thr Pro85 90 95

Phe Ala Val Met Thr Trp Phe Arg Pro Gln Tyr Arg Lys Thr Phe Asp100 105 110

His Pro Val Ser Arg Gln Gln Leu His Asp Val Ile Asp Gln Gln Ile115 120 125

Pro Ser Asp Asn Leu Phe Cys Ala Leu His Ile Asp Gly His Phe Arg130 135 140

His Ala His Thr Arg Thr Val Pro Arg Gln Thr Pro Pro Tyr Arg Ala145 150 155 160

Met Thr Asp Val Leu Asp Asp Gln Pro Val Phe Arg Phe Asn Gln Arg165 170 175

Lys Gly Thr Leu Val Gly Phe Arg Thr Pro Gln His Met Gln Gly Leu180 185 190

Asn Val Ala Gly Tyr His Glu His Phe Ile Thr Asp Asp Arg Gln Gly195 200 205

Gly Gly His Leu Leu Asp Tyr Gln Leu Asp Ser Gly Val Leu Thr Phe210 215 220

Gly Glu Ile His Lys Leu Met Ile Asp Leu Pro Ala Asp Ser Ala Phe225 230 235 240

Leu Gln Ala Asp Leu His Pro Asp Asn Leu Asp Ala Ala Ile Arg Ala245 250 255

Val Glu Asn

<210> 84

<211> 1053

<212> DNA

<213> Bacillus cereus<400> 84

atgaaagcac tactttggca taatcaacgt gatgtacgag tagaagaagt accagaacca 60acagtaaaac caggaacagt gaaaatcaaa gttaaatggt gtggtatttg tgggacagac 120ttgcatgaat atttagcagg gcctattttt attccaacag aagaacatcc attaacacat 180gtgaaagcac ctgttatttt aggtcatgag tttagtggtg aggtaataga gattggtgaa 240ggagttacat ctcataaagt gggagaccgc gttgttgtag agccaattta ttcttgtggt 300aaatgtgaag cttgtaaaca tggacattac aatgtttgtg aacaacttgt tttccacggt 360cttggcggag aaggcggcgg tttctctgaa tatacagtag taccagaaga tatggttcat 420cacattccag atgaaatgac gtatgaacaa ggtgcgcttg tagaaccagc agcagtagca 480gttcatgcag tacgtcaaag taaattaaaa gaaggggaag ctgtagcggt atttggttgc 540ggtccaattg gacttcttgt tatccaagca gctaaagcag caggagcaac tcctgttatt 600gcagttgaac tttctaaaga acgtcaagag ttagcgaaat tagcaggtgc ggattatgta 660ttaaatccag caactcaaga tgtgttagct gaaattcgta acttaacaaa tggtttaggt 720gtaaatgtta gctttgaagt aacaggtgtt gaagttgtac tacgccaagc gattgaaagt 780acaagcttcg aaggacaaac tgtaattgtt agtgtatggg aaaaagacgc aacaattact 840ccaaataact tagtattaaa agaaaaagaa gttattggta ttttaggata ccgtcacatc 900ttcccagctg ttattaaatt gattagctcc ggtcaaattc aagcagagaa attaattacg 960aaaaaaatta cagtggatca agttgttgaa gaaggatttg aagcacttgt aaaagataaa 1020acacaagtga aaattcttgt ttcacctaaa taa 1053

<210> 85<211> 350<212> PRT

<213> Bacillus cereus<400> 85

Met Lys Ala Leu Leu Trp His Asn Cln Arg Asp Val Arg Val Glu Glu15 10 15

Val Pro Glu Pro Thr Val Lys Pro Gly Thr Val Lys Ile Lys Val Lys20 25 30

Trp Cys Gly Ile Cys Gly Thr Asp Leu His Glu Tyr Leu Ala Gly Pro35 40 45

Ile Phe Ile Pro Thr Clu Glu His Pro Leu Thr His Val Lys Ala Pro50 55 60Val Ile Leu Cly His Glu Phe Ser Cly Glu Val Ile Glu Ile Gly Glu65 70 75 80

Gly Val Thr Ser His Lys Val Gly Asp Arg Val Val Val Glu Pro Ile85 90 95

Tyr Ser Cys Gly Lys Cys Glu Ala Cys Lys His Gly His Tyr Asn Val100 105 110

Cys Glu Gln Leu Val Phe His Gly Leu Gly Gly Glu Gly Gly Gly Phe115 120 125

Ser Glu Tyr Thr Val Val Pro Glu Asp Met Val His His Ile Pro AspIBO 135 140

Glu Met Thr Tyr Glu Gln Gly Ala Leu Val Glu Pro Ala Ala Val Ala145 150 155 160

Val His Ala Val Arg Gln Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Ala Val Ala165 170 175

Val Phe Gly Cys Gly Pro Ile Gly Leu Leu Val Ile Gln Ala Ala Lys180 185 190

Ala Ala Gly Ala Thr Pro Val Ile Ala Val Glu Leu Ser Lys Glu Arg195 200 205

Gln Glu Leu Ala Lys Leu Ala Gly Ala Asp Tyr Val Leu Asn Pro Ala210 215 220

Thr Gln Asp Val Leu Ala Glu Ile Arg Asn Leu Thr Asn Gly Leu Gly225 230 235 240

Val Asn Val Ser Phe Glu Val Thr Gly Val Glu Val Val Leu Arg Gln245 250 255

Ala Ile Glu Ser Thr Ser Phe Glu Gly Gln Thr Val Ile Val Ser Val260 265 270

Trp Glu Lys Asp Ala Thr Ile Thr Pro Asn Asn Leu Val Leu Lys Glu

275 280 285

Lys Glu Val Ile Gly Ile Leu Gly Tyr Arg His Ile Phe Pro Ala Val

290 295 300

Ile Lys Leu Ile Ser Ser Gly Gln Ile Gln Ala Glu Lys Leu Ile Thr

305 310 315 320Lys Lys Ile Thr Val Asp Cln Val Val Clu Glu Cly Phe Glu Ala Leu325 330 335

Val Lys Asp Lys Thr Gln Val Lys Ile Leu Val Ser Pro Lys340 345 350

<210> 86<211> 1053<212> DNA

<213> Bacillus cereus<400> 86

atgaaagcac tactttggca taatcaacgt gatgtacgag tagaagaagt accagaacca 60acagtaaaac caggaacagt gaaaatcaaa gttaaatggt gtggtatttg; tgggacagac 120ttgcatgaat atttagcagg gcctattttt attccaacag aagaacatcc attaacacat 180gtgaaagcac ctgttatttt aggtcatgag tttagtggtg aggtaataga gattggtgaa 240ggagttacat ctcataaagt gggagaccgc gttgttgtag agccaattta ttcttgtggt 300aaatgtgaag cttgtaaaca tggacattac aatgtttgtg aacaacttgt tttccacggt 360cttggcggag aaggcggcgg tttctctgaa tatacagtag taccagaaga tatggttcat 420cacattccag atgaaatgac gtatgaacaa ggtgcgcttg tagaaccagc agcagtagca 480gttcatgcag tacgtcaaag taaattaaaa gaaggggaag ctgtagcggt atttggttgc 540ggtccaattg gacttcttgt tatccaagca gctaaagcag caggagcaac tcctgttatt 600gcagttgaac tttctaaaga acgtcaagag ttagcgaaat tagcaggtgc ggattatgta 660ttaaatccag caactcaaga tgtgttagct gaaattcgta acttaacaaa tggtttaggt 720gtaaatgtta gctttgaagt aacaggtgtt gaagttgtac tacgccaagc gattgaaagt 780acaagcttcg aaggacaaac tgtaattgtt agtgtatggg aaaaagacgc aacaattact 840ccaaataact tagtattaaa agaaaaagaa gttattggta ttttaggata ccgtcacatc 900ttcccagctg ttattaaatt gattagctcc ggtcaaattc aagcagagaa attaattacg 960aaaaaaatta cagtggatca agttgttgaa gaaggatttg aagcacttgt aaaagataaa 1020acacaagtga aaattcttgt ttcacctaaa taa 1053

<210> 87

<211> 350

<212> PRT

<213> BaciIlus cereus

<400> 87

Met Lys Ala Leu Leu Trp His Asn Gln Arg Asp Val Arg Val Clu Clu15 10 15Val Pro Glu Pro Thr Val Lys Pro Gly Thr Val Lys Ile Lys Val Lys20 25 30

Trp Cys Gly Ile Cys Gly Thr Asp Leu His Glu Tyr Leu Ala Gly Pro35 40 45

Ile Phe Ile Pro Thr Glu Glu His Pro Leu Thr His Val Lys Ala Pro50 55 60

Val Ile Leu Gly His Glu Phe Ser Gly Glu Val Ile Glu Ile Gly Glu65 70 75 80

Gly Val Thr Ser His Lys Val Gly Asp Arg Val Val Val Glu Pro Ile85 90 95

Tyr Ser Cys Gly Lys Cys Glu Ala Cys Lys His Gly His Tyr Asn Val100 105 110

Cys Glu Gln Leu Val Phe His Gly Leu Gly Gly Glu Gly Gly Gly Phe115 120 125

Ser Glu Tyr Thr Val Val Pro Glu Asp Met Val His His Ile Pro Asp130 135 140

Glu Met Thr Tyr Glu Gln Gly Ala Leu Val Glu Pro Ala Ala Val Ala145 150 155 160

Val His Ala Val Arg Gln Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Ala Val Ala165 170 175

Val Phe Gly Cys Gly Pro Ile Gly Leu Leu Val Ile Gln Ala Ala Lys180 185 190

Ala Ala Gly Ala Thr Pro Val Ile Ala Val Glu Leu Ser Lys Glu Arg195 200 205

Gln Glu Leu Ala Lys Leu Ala Gly Ala Asp Tyr Val Leu Asn Pro Ala210 215 220

Thr Gln Asp Val Leu Ala Glu Ilè Arg Asn Leu Thr Asn Gly Leu Gly225 230 235 240

Val Asn Val Ser Phe Glu Val Thr Gly Val Glu Val Val Leu Arg Gln245 250 255Ala Ile Glu Ser Thr Ser Phe Clu Gly Gln Thr Val Ile Val Ser Val

Lys Glu Val Ile Gly Ile Leu Gly Tyr Arg His Ile Phe Pro Ala Val

Ile Lys Leu Ile Ser Ser Gly Gln Ile Gln Ala Glu Lys Leu Ile Thr

Lys Lys Ile Thr Val Asp Gln Val Val Glu Glu Gly Phe Glu Ala Leu

Val Lys Asp Lys Thr Gln Val Lys Ile Leu Val Ser Pro Lys

<210> 88<211> 1113<212> DNA

<213> Lactococcus Taetis<400> 88

ttgcctgaaa cgacaaccat cctatataga ggaggcgttt ttatgcgcgc agcacgtttt 60

tacgaccgcg gggatatccg cattgatgaa attaatgaac caatagtaaa agctggccaa 120

gttggcattg atgtggcttg gtgtggaatt tgtggaacag atctccatga atttttagat 180

ggcccaattt tttgtccgtc agcagaacat cctaatccaa ttactggaga agtaccacca 240

gtcactcttg gacatgaaat gtctggggtt gtaaatttta taggtgaagg agtaagcgga 300

cttaaagtag gtgaccatgt cgttgtcgaa ccttatatcg ttcccgaagg gactgataca 360

agtgaaactg gacattataa cctctcagaa ggctcaaact ttattggttt gggcggaaat 420

ggtggaggtt tggctgaaaa aatttctgtt gatgaacgtt gggttcacaa aattcctgat 480

aacttaccat tggatgaagc tgctctaatt gagccactat cagtcggcta tcacgctgtt 540

gaacgagcaa atttaagtga aaagagtacg gtattagttg ttggtgctgg accaattgga 600

ctattaactg ctgccgttgc aaaagcgcaa ggacatactg ttatcatcag tgaacctagt 660

ggacttcgtc gtaaaaaagc acaagaagca caagttgctg attatttctt caatccaatt 720

gaagatgaca ttcaagctaa agttcatgaa attaatgaaa aaggagtgga cgcagccttt 780

gaatgtacct ctgtccaacc gggatttgac gcttgtctag atgcgattcg tatgggtgga 840

acagttgtca ttgtcgcaat ttggggcaag cctgctagtg ttgatatggc aaaattagta 900atcaaagaag ctaacctttt aggaacgatt gcttataata acactcatcc aaaaacaatt 960

gatttagtat caacaggtaa aataaaattg gaccaattca tcacagctaa aatcggtttg 1020

gatgatttga ttgataaagg attcgatacg ctgattcatc ataatgaaac agctgttaaa 1080

attttagttt caccaactgg taaaggtcta taa 1113

<210> 89<211> 370<212> PRT

<213> Lactococcus Iaetis<400> 89

Met Pro Clu Thr Thr Thr Ile Leu Tyr Arg Gly Gly Val Phe Met Arg1 5 10 15

Ala Ala Arg Phe Tyr Asp Arg Gly Asp Ile Arg Ile Asp Glu Ile Asn20 25 30

Glu Pro Ile Val Lys Ala Gly Gln Val Gly Ile Asp Val Ala Trp Cys35 40 45

Cly Ile Cys Gly Thr Asp Leu His Glu Phe Leu Asp Gly Pro Ile Phe50 55 60

Cys Pro Ser Ala Glu His Pro Asn Pro Ile Thr Gly Glu Val Pro Pro65 70 75 80

Val Thr Leu Gly His Glu Met Ser Gly Val Val Asn Phe Ile Gly Glu85 90 95

Gly Val Ser Gly Leu Lys Val Gly Asp His Val Val Val Glu Pro Tyr100 105 110

Ile Val Pro Glu Gly Thr Asp Thr Ser Glu Thr Cly His Tyr Asn Leu115 120 125

Ser Glu Gly Ser Asn Phe Ile Gly Leu Gly Gly Asn Gly Gly Gly Leu130 135 140

Ala Glu Lys Ile Ser Val Asp Glu Arg Trp Val His Lys Ile Pro Asp145 150 155 160

Asn Leu Pro Leu Asp Glu Ala Ala Leu Ile Glu Pro Leu Ser Val Gly165 170 175Tyr His Ala Val Glu Arg Ala Asn Leu Ser Clu Lys Ser Thr Val Leu180 185 190

Val Val Gly Ala Gly Pro Ile Gly Leu Leu Thr Ala Ala Val Ala Lys195 200 205

Ala Gln Gly His Thr Val Ile Ile Ser Glu Pro Ser Gly Leu Arg Arg210 215 220

Lys Lys Ala Gln Glu Ala Gln Val Ala Asp Tyr Phe Phe Asn Pro Ile225 230 235 240

Glu Asp Asp Ile Gln Ala Lys Val His Glu Ile Asn Glu Lys Gly Val245 250 255

Asp Ala Ala Phe Glu Cys Thr Ser Val Gln Pro Gly Phe Asp Ala Cys260 265 270

Leu Asp Ala Ile Arg Met Gly Gly Thr Val Val Ile Val Ala Ile Trp275 280 285

Gly Lys Pro Ala Ser Val Asp Met Ala Lys Leu Val Ile Lys Glu Ala290 295 300

Asn Leu Leu Gly Thr Ile Ala Tyr Asn Asn Thr His Pro Lys Thr Ile305 310 315 320

Asp Leu Val Ser Thr Gly Lys Ile Lys Leu Asp Gln Phe Ile Thr Ala325 330 335

Lys Ile Gly Leu Asp Asp Leu Ile Asp Lys Gly Phe Asp Thr Leu Ile340 345 350

His His Asn Glu Thr Ala Val Lys Ile Leu Val Ser Pro Thr Gly Lys355 360 365

Gly Leu370

<210> 90

<211> 705

<212> DNA

<213> Pyrococcus furiosus

<400> 90

atgaaggttg ccgtaattac tggggcatcc cgtggaatcg gggaagctat agcaaaggcccttgctgaag atggatattc ccttgcctta ggggctagaa gtgttgatag gttagagaag 120attgccaagg aactcagcga aaaacatggg gtggaggtat tttacgacta cctcgatgta 180tcaaaaccag aaagcgttga agagtttgca aggaaaacgc tagctcactt tggagatgtg 240gacgttgttg tggccaatgc ggggcttggt tactttggta ggcttgaaga gcttacagaa 300gagcagttcc acgaaatgat tgaagtaaac cttttgggag tttggagaac aataaaagct 360ttcttaaact ccttaaagcg gactggagga gtggctattg ttgttacttc agatgtttct 420gcaaggctac ttccatacgg tggaggttat gtggcaacta aatgggctgc aagagcattg 480gtaaggacct tccagattga gaatccagat gtgaggttct tcgagctaag acctggagca 540gtagatacat attttggagg gagcaaagct gggaagccaa aggagcaagg gtatttaaaa 600cctgaggaag ttgctgaggc agtaaaatac ctcctaagac ttccaaagga tgttagggtt 660gaggaattaa tgttgcgctc aatttatcaa aaacctgagt attga 705

<210> 91<211> 234<212> PRT

<213> Pyrococcus furiosus<400> 91

Met Lys Val Ala Val Ile Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Glu Ala1 5 10 15

Ile Ala Lys Ala Leu Ala Glu Asp Gly Tyr Ser Leu Ala Leu Gly Ala20 25 30

Arg Ser Val Asp Arg Leu Glu Lys Ile Ala Lys Glu Leu Ser Glu Lys35 40 45

His Gly Val Glu Val Phe Tyr Asp Tyr Leu Asp Val Ser Lys Pro Glu50 55 60

Ser Val Glu Glu Phe Ala Arg Lys Thr Leu Ala His Phe Gly Asp Val65 70 75 80

Asp Val Val Val Ala Asn Ala Gly Leu Gly Tyr Phe Gly Arg Leu Glu

85 90 95

Glu Leu Thr Glu Glu Gln Phe His Glu Met Ile Glu Val Asn Leu Leu100 105 110

Gly Val Trp Arg Thr Ile Lys Ala Phe Leu Asn Ser Leu Lys Arg Thr115 120 125Cly Gly Val Ala Ile Val Val Thr Ser Asp Val Ser Ala Arg Leu Leu

Pro Tyr Gly Gly Gly Tyr Val Ala Thr Lys Trp Ala Ala Arg Ala Leu

Val Arg Thr Phe Gln Ile Glu Asn Pro Asp Val Arg Phe Phe Glu Leu

Arg Pro Gly Ala Val Asp Thr Tyr Phe Gly Gly Ser Lys Ala Gly Lys

Pro Lys Glu Gln Gly Tyr Leu Lys Pro Glu Glu Val Ala Glu Ala Val

Lys Tyr Leu Leu Arg Leu Pro Lys Asp Val Arg Val Glu Glu Leu Met

Leu Arg Ser Ile Tyr Gln Lys Pro Glu Tyr

<210> 92<211> 1665<212> DNA

<213> Salmonella typhimurium<400> 92

atgagatcga aaagatttga agcactggcg aaacgccctg tgaatcagga cggctttgtt 60

aaggagtgga tcgaagaagg ctttatcgcg atggaaagcc cgaacgaccc aaaaccgtcg 120

ataaaaatcg ttaacggcgc ggtaaccgag ctggacggaa aaccggttag cgaattcgac 180

ctgatcgacc actttatcgc ccgctacggc atcaacctga accgcgccga agaagtgatg 240

gcgatggatt cggtcaagct ggctaacatg ctgtgcgatc cgaacgtcaa gcgcagcgaa 300

atcgttccgc taaccaccgc gatgacccca gcgaaaattg tcgaagtggt ttcgcatatg 360

aacgtggttg agatgatgat ggcgatgcag aaaatgcgcg cccgccgtac tccatctcaa 420

caggcgcacg tcaccaacgt taaagacaac ccggtgcaaa ttgccgccga tgccgccgaa 480

ggcgcatggc gcgggtttga cgaacaagag acgacggttg cggtagcgcg ctatgcgccg 540

ttcaacgcca tcgcgctgct ggttggttct caggtaggtc gtccgggggt actgactcaa 600

tgctcgctgg aagaagccac cgagctgaag ctcggcatgc tgggccacac ctgctacgcc 660

gaaaccatct ccgtttacgg caccgagccg gtcttcaccg acggtgacga taccccatgg 720

tcgaagggct tcttagcctc ttcctacgcc tctcgcggcc tgaaaatgcg cttcacctcc 780ggctccggct ccgaagtgca gatgggctac gccgaaggca aatccatgct gtatctggaa 840gcgcgctgca tctatatcac caaagccgcg ggcgttcagg ggctgcaaaa cggctccgta 900agcagcatcg gcgtaccgtc tgccgtgccg tcaggcattc gtgccgtgct ggcggaaaac 960ctgatctgct cttcgctgga tctggaatgc gcctccagta acgaccagac cttcacccac 1020tccgatatgc gtcgtaccgc tcgcctgctg atgcagttcc tgccgggtac cgactttatc 1080tcctccggtt attccgcggt gccgaactac gacaacatgt tcgccggttc caacgaagat 1140gcggaagact ttgacgacta caacgttatc cagcgtgacc tgaaagtgga cggcggtctg 1200cgcccggttc gcgaagagga cgttatcgcc atccgtaaca aagccgcccg cgcgctgcag 1260gccgtgtttg ccggaatggg actgccgccg attaccgatg aagaagttga agccgcgacc 1320tatgcccacg gttcgaaaga tatgccggag cgcaacatcg tcgaagacat caagttcgcc 1380caggaaatca tcaataaaaa ccgcaacggt ctggaagttg tgaaagcgct ggctcagggc 1440gggtttaccg acgtggccca ggacatgctc aacatccaga aagccaagct aaccggcgac 1500tatttgcaca cctccgccat tatcgtcggc gacggacaag tgctctctgc ggttaatgac 1560gtcaatgact atgccggtcc ggcaacaggt tatcgcctgc agggagaacg ctgggaagag 1620attaaaaaca tccctggcgc tcttgatccc aacgagattg attaa 1665

<210> 93<211> 554<212> PRT

<213> SaTmonella typhimurium<400> 93

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Asp Gly Phe Val Lys Glu Trp Ile Glu Glu Gly Phe Ile Ala Met Glu20 25 30

Ser Pro Asn Asp Pro Lys Pro Ser Ile Lys Ile Val Asn Gly Ala Val35 40 45

Thr Glu Leu Asp Gly Lys Pro Val Ser Glu Phe Asp Leu Ile Asp His50 55 60

Phe Ile Ala Arg Tyr Gly Ile Asn Leu Asn Arg Ala Glu Glu Val Met65 70 75 80

Ala Met Asp Ser Val Lys Leu Ala Asn Met Leu Cys Asp Pro Asn Val85 90 95Lys Arg Ser Glu Ile Val Pro Leu Thr Thr Ala Met Thr Pro Ala Lys100 105 110

Ile Val Glu Val Val Ser His Met Asn Val Val Glu Met Met Met Ala115 120 125

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Asn Lys Asn Arg Asn Gly Leu Gl u Val Val Lys Ala Leu Ala Gln Gly465 470 475 480

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Leu Thr Cly Asp Tyr Leu His Thr Ser Ala Ile Ile Val Gly Asp Gly500 505 510

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<210> 94

<211> 675

<212> DNA

<213> Salmonella typhimurium<400> 94

atggaaatta atgaaaaatt gctgcgccag ataattgaag acgtactccg cgatatgaag 60ggcagcgata aacccgtctc gtttaatgcg cctgcggcat ccacagcacc acagaccgct 120gcgcctgcgg gcgacggctt tctgaccgaa gtgggcgaag cgcgccaggg cactcagcag 180gacgaagtca ttatcgccgt cggcccggca tttggcctgg cgcaaaccgt caatatcgtc 240ggcttaccgc ataagagcat tctgcgcgaa gtcattgccg gtattgaaga agaaggcatc 3 00aaggcgcgcg tgattcgctg ctttaaatct tccgacgtgg cgttcgtcgc cgttgaaggt 360aaccgcctga gcggatccgg catctccatc ggcatccagt cgaaaggtac tacggttatc 420caccagcagg ggctaccgcc gctctccaac ctggagctgt tcccgcaggc accgctgctg 480acgctggaaa cctaccgtca gattggtaaa aacgccgccc gctatgcgaa acgagaatca 540ccgcagccgg tccctacgct caatgaccag atggcacgcc cgaagtacca ggcaaagtcg 600gccattttgc atattaaaga gaccaagtac gtcgtgacgg gcaaaaaccc gcaggaactg 660cgcgtggcgc tttga 675

<210> 95<211> 224<212> PRT

<213> Salmonella typhimurium<400> 95

Met Glu Ile Asn Glu Lys Leu Leu Arg Gln Ile Ile Glu Asp Val Leu1 5 10 15

Arg Asp Met Lys Gly Ser Asp Lys Pro Val Ser Phe Asn Ala Pro Ala20 25 30

Ala Ser Thr Ala Pro Gln Thr Ala Ala Pro Ala Gly Asp Gly Phe Leu35 40 45

Thr Glu Val Gly Glu Ala Arg Gln Gly Thr Gln Gln Asp Glu Val Ile

50 55 60

Ile Ala Val Gly Pro Ala Phe Gly Leu Ala Gln Thr Val Asn Ile Val

65 70 75 80

Gly Leu Pro His Lys Ser Ile Leu Arg Glu Val Ile Ala Gly Ile Glu85 90 95

Glu Glu Gly Ile Lys Ala Arg Val Ile Arg Cys Phe Lys Ser Ser Asp100 105 110Val Ala Phe Val Ala Val Glu Gly Asn Arg Leu Ser Gly Ser Gly Ile115 120 125

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Leu Pro Pro Leu Ser Asn Leu Glu Leu Phe Pro Gln Ala Pro Leu Leu145 150 155 160

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Lys Tyr Val Val Thr Gly Lys Asn Pro Gln Glu Leu Arg Val Ala Leu210 215 220

<210> 96

<211> 522

<212> DNA

<213> SalmoneTla typhimurium

<400> 96

atgaataccg acgcaattga atcgatggtc cgggacgtat tgagccgcat gaacagcctg 60cagggcgatg cgccagcagc ggctcctgcg gcaggcggca cgtcccgcag cgcaaaggtc 120agcgactacc cgctggcgaa caaacacccg gaatgggtga aaaccgccac caataaaacg 180ctggacgact ttacgctgga aaacgtgctg agcaataaag tcaccgctca ggatatgcgt 240attaccccgg aaaccctgcg cttacaggcc tctatcgcca aagatgcggg tcgcgaccgg 300ctggcgatga acttcgaacg cgccgccgaa ctgaccgcgg taccggacga tcgcattctt 360gaaatctaca acgcccttcg tccgtatcgt tcaacgaaag aagagctgct cgctatcgcc 420gacgatctcg aaaaccgtta tcaggcaaag atttgcgcag ctttcgttcg tgaagcggca 480gggctgtacg ttgagcgtaa aaaactcaaa ggcgacgatt aa 522

<210> 97

<211> 173

<212> PRT

<213> Salmonella typhimurium

<400> 97Met Asn Thr Asp Ala Ile Glu Ser Met Val Arg Asp Val Leu Ser Arg1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Gln Gly Asp Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly20 25 30

Gly Thr Ser Arg Ser Ala Lys Val Ser Asp Tyr Pro Leu Ala Asn Lys35 40 45

His Pro Glu Trp Val Lys Thr Ala Thr Asn Lys Thr Leu Asp Asp Phe50 55 60

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Ile Thr Pro Glu Thr Leu Arg Leu Gln Ala Ser Ile Ala Lys Asp Ala85 90 95

Gly Arg Asp Arg Leu Ala Met Asn Phe Glu Arg Ala Ala Glu Leu Thr100 105 110

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Asn Arg Tyr Gln Ala Lys Ile Cys Ala Ala Phe Val Arg Glu Ala Ala145 150 155 160

Gly Leu Tyr Val Glu Arg Lys Lys Leu Lys Gly Asp Asp165 170

<210> 98

<211> 1677

<212> DNA

<213> LactobaciIlus collinoides

<400> 98

ttggaacgtc aaaaaagatt tgaaaaatta gagaaacgtc cagtgcattt agatgggttc 60

gttaagaact gggacgacga aggtttagtt gcccttaacg gtaagaacga tccaaagcca 120

agcattacga tcgaaaacgg tgttgttact gaaatggatg gtaagaagaa ggcagacttc 180

gaccttatcg acaagtacat cgctgaatac gggatcaact tggacaatgc tgaaaagact 240

ttaaacacag attcagttaa gatcgccaac atgatgtgtg atcctaacgt ctcccgtgct 300gaaattattg aatatacaac tgctatgaca ccagccaagg ctgctgaagt tatcagccag 360ttaaacttcg ctgaaatgat catggcaact caaaagatgc ggccacgtcg gacccctatg 420actcaagtcc acgctaccaa cactttggat aacccagttg aaatcgctgc tgatgctgcc 480gaagctgcat tacgtggggt tcctgaagaa gaaaccacca ctgccattgc tcggtatgcg 540ccaatgaacg ctatttcaat catggttggg gcccaagcag gccgtcctgg tgttatcacc 600caatgttcag ttgaagaagc tgacgaattg agtttgggga tgcgtgggtt tactgcctat 660gctgaaacca tttcagttta tgggactgac cgggtcttca ctgatggtga tgatacccct 720tggtcaaaag gtttcttagc ttcttgctac gcttcacgtg gtttgaagat gcggtttact 780tcaggtgccg gttcagaagc tatgatgggc tacactgaag gtaaatcaat gctttacctt 840gaagctcgtt gtatctacat taccaaggcg tcaggtgttc aaggtctgca aaacggtggt 900gttagttgta tcgggatgcc aggtgccgtc gttggtggta tccgtgaagt cttaggtgaa 960aacttactat gtatgtcact tgatgttgaa tgtgcttctg gttgtgacca agccttctct 1020cactctgaca ttcgtcggac tggccggatg attggccaat tcatcgctgg tactgattac 1080ctgtcatcag gttacgctgc cgaagaaaac atggataaca ccttcgctgg ttcaaacatg 1140gatgttctgg actacgatga ttacatcact ttggaacgtg atatggctat taacggtggt 1200atcatgccaa ttaccgaaga ggaatctatt aagattcgtc acaaggctgc ggttgctatc 1260caagctgtct ttgatggctt aggcctacca cagatcactg atgaagaagt tgaagccgca 1320acttatggca gcaattcaaa cgacatgcca aaacgtgaca tggttcaaga tatgaaagct 1380gctcaaggtc tgatgactcg tggcattact gttgttgacg ttatcaaggc cttatatgac 1440catgatatta aagacgtcgc tgaggctgtg cttaagttag cgcaacaaaa ggtttgtggt 1500gattacctgc aaacatctgc tgtcttcttg gatggttgga agtgtacttc agctattaac 1560aacgctaacg attacaaagg cccaggtact ggttaccgtc tatgggaaga caaagacaaa 1620tgggatcgtc tagaaaacgt tccgtgggct ttggatcctc agaagttgga attctaa 1677

<210> 99<211> 558<212> PRT

<213> Lactobacillus collinoides<400> 99

Met Glu Arg Gln Lys Arg Phe Glu Lys Leu Glu Lys Arg Pro Val His1 5 10 15

Leu Asp Gly Phe Val Lys Asn Trp Asp Asp Glu Gly Leu Val Ala Leu20 25 30Asn Gly Lys Asn Asp Pro Lys Pro Ser Ile Thr Ile Glu Asn Gly Val35 40 45

Val Thr Glu Met Asp Gly Lys Lys Lys Ala Asp Phe Asp Leu Ile Asp50 55 60

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Leu Asn Thr Asp Ser Val Lys Ile Ala Asn Met Met Cys Asp Pro Asn85 90 95

Val Ser Arg Ala Glu Ile Ile Glu Tyr Thr Thr Ala Met Thr Pro Ala100 105 110

Lys Ala Ala Glu Val Ile Ser Gln Leu Asn Phe Ala Glu Met Ile Met115 120 125

Ala Thr Gln Lys Met Arg Pro Arg Arg Thr Pro Met Thr Gln Val His130 135 140

Ala Thr Asn Thr Leu Asp Asn Pro Val Glu Ile Ala Ala Asp Ala Ala145 150 155 160

Glu Ala Ala Leu Arg Gly Val Pro Glu Glu Glu Thr Thr Thr Ala Ile165 170 175

Ala Arg Tyr Ala Pro Met Asn Ala Ile Ser Ile Met Val Gly Ala Gln180 185 190

Ala Gly Arg Pro Gly Val Ile Thr Gln Cys Ser Val Glu Glu Ala Asp195 200 205

Glu Leu Ser Leu Gly Met Arg Gly Phe Thr Ala Tyr Ala Glu Thr Ile210 215 220

Ser Val Tyr Gly Thr Asp Arg Val Phe Thr Asp Gly Asp Asp Thr Pro225 230 235 240

Trp Ser Lys Gly Phe Leu Ala Ser Cys Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys245 250 255

Met Arg Phe Thr Ser Gly Ala Gly Ser Glu Ala Met Met Gly Tyr Thr260 265 270Clu Cly Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ala Arg Cys Ile Tyr Ile Thr275 280 285

Lys Ala Ser Gly Val Gln Gly Leu Gln Asn Gly Gly Val Ser Cys Ile290 295 300

Gly Met Pro Cly Ala Val Val Gly Gly Ile Arg Glu Val Leu Gly Glu305 310 315 320

Asn Leu Leu Cys Met Ser Leu Asp Val Glu Cys Ala Ser Gly Cys Asp325 330 335

Gln Ala Phe Ser His Ser Asp Ile Arg Arg Thr Gly Arg Met Ile Gly340 345 350

Gln Phe Ile Ala Gly Thr Asp Tyr Leu Ser Ser Gly Tyr Ala Ala Glu355 360 365

Glu Asn Met Asp Asn Thr Phe Ala Gly Ser Asn Met Asp Val Leu Asp370 375 380

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Ile Met Pro Ile Thr Clu Glu Glu Ser Ile Lys Ile Arg His Lys Ala405 410 415

Ala Val Ala Ile Gln Ala Val Phe Asp Gly Leu Gly Leu Pro Gln Ile420 425 430

Thr Asp Glu Glu Val Glu Ala Ala Thr Tyr Gly Ser Asn Ser Asn Asp435 440 445

Met Pro Lys Arg Asp Met Val Gln Asp Met Lys Ala Ala Gln Cly Leu450 455 460

Met Thr Arg Gly Ile Thr Val Val Asp Val Ile Lys Ala Leu Tyr Asp465 470 475 480

His Asp Ile Lys Asp Val Ala Glu Ala Val Leu Lys Leu Ala Cln Gln485 490 495

Lys Val Cys Cly Asp Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Val Phe Leu Asp Gly500 505 510Trp Lys Cys Thr Ser Ala Ile Asn Asn Ala Asn Asp Tyr Lys Gly Pro515 520 525

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<210> 100

<211> 693

<212> DNA

<213> Lactobaci7 7us collinoides

<400> 100

gtgagttcag aaatcgatga aacattgctt agaaatatca ttaaaggcgt tttaaatgaa 60gttcaaaact ctgatacgcc aatttccttt ggtggccaag atgcagcccc agttgccggt 120gccaaggaag gtgccgcacc agaaaagaag ttggattggt tccaacacgt tggaatcgcc 180aaaccaggtt tgtcaaagga tgaagttgta attggtgttg ccccagcatt tgctgaagtg 240ttgacgcaaa ctatgacgaa gatccaacac aaagacatcc tgcgtcaaat cattgccgga 300gttgaagaag aaggtctcaa ggcccgtgtc gttaaggttt atcggacttc agacgtttcc 360ttcgtttccg ctgatgttga caagttgtca ggttcaggaa tttcagttgc cgttcaatca 420aaggggacaa cgattattca ccaaaaggat caagcaccgt tgtcaaacct tgaattgttc 480ccacaggctc cagttttgac attggacgct taccgtcaaa tcggtaagaa cgctgcccag 540tatgctaagg gtatgtcacc aaccccagtg ccaacaatta acgaccagat ggcacgtgtg 600caatatcaag cactttctgc tttgatgcac atcaaggaaa caaaacaggt tgttgttggg 660aagcctgctg aagaaattaa ggtaaccttt tag 693

<210> 101<211> 230<212> PRT

<213> Lactobaci1Ius collinoides<400> 101

Met Ser Ser Glu Ile Asp Glu Thr Leu Leu Arg Asn Ile Ile Lys Gly15 10 15

Val Leu Asn Glu Val Gln Asn Ser Asp Thr Pro Ile Ser Phe Gly Gly20 25 30

Gln Asp Ala Ala Pro Val Ala Gly Ala Lys Glu Gly Ala Ala Pro Glu35 40 45Lys Lys Leu Asp Trp Phe Gln His Val Cly Ile Ala Lys Pro Cly Leu50 55 60

Ser Lys Asp Clu Val Val Ile Gly Val Ala Pro Ala Phe Ala Clu Val65 70 75 80

Leu Thr Gln Thr Met Thr Lys Ile Gln His Lys Asp Ile Leu Arg Cln85 90 95

Ile Ile Ala Gly Val Glu Glu Glu Gly Leu Lys Ala Arg Val Val Lys100 105 110

Val Tyr Arg Thr Ser Asp Val Ser Phe Val Ser Ala Asp Val Asp Lys115 120 125

Leu Ser Cly Ser Gly Ile Ser Val Ala Val Gln Ser Lys Gly Thr Thr130 135 140

Ile Ile His Gln Lys Asp Gln Ala Pro Leu Ser Asn Leu Clu Leu Phe145 150 155 160

Pro Gln Ala Pro Val Leu Thr Leu Asp Ala Tyr Arg Cln Ile Gly Lys165 170 175

Asn Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Gly Met Ser Pro Thr Pro Val Pro Thr180 185 190

Ile Asn Asp Gln Met Ala Arg Val Gln Tyr Gln Ala Leu Ser Ala Leu195 200 205

Met His Ile Lys Glu Thr Lys Gln Val Val Val Gly Lys Pro Ala Clu

210 215 220

Clu Ile Lys Val Thr Phe225 230

<210> 102<211> 522<212> DNA

<213> Lactobaci7 7us collinoides<400> 102

atgagtgaag tagatgactt agtagctaga attgctgctc agctacaaca aagtggaaac 60gcttctagtg cctcaactag tgccggtact tctgctggtt ccgagaaaga attaggcgca 120gcagattacc cactatttga aaagcaccca gatcaaatca agacgccatc aggtaaaaat 180gttgaagaaa tcaccttgga aaatgttatt aacggcaagg tagacgcaaa ggatatgcgg 240attacgcccg caaccctgaa gttacaaggt gaaattgctg ccaacgcagg tcggccagca 300atccaacgga acttccagcg ggcttctgaa ttaacttcag ttcccgatga tgttgttttg 360gacttatata attcattacg gccattccgt tcaaccaagc aagaattatt ggataccgcc 420aaggagcttc gtgacaagta tcacgcacct atctgtgccg gctggttcga agaagcagcc 480gaaaactacg aagtcaacaa gaagttgaag ggcgataact ag 522

<210> 103<211> 173<212> PRT

<213> Lactobaci Πus colIinoides<400> 103

Met Ser Glu Val Asp Asp Leu Val Ala Arg Ile Ala Ala Cln Leu Cln1 5 10 15

Gln Ser Gly Asn Ala Ser Ser Ala Ser Thr Ser Ala Cly Thr Ser Ala20 25 30

Cly Ser Glu.Lys Glu Leu Cly Ala Ala Asp Tyr Pro Leu Phe Glu Lys35 40 45

His Pro Asp Gln Ile Lys Thr Pro Ser Gly Lys Asn Val Glu Glu Ile50 55 60

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Ile Thr Pro Ala Thr Leu Lys Leu Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Ala85 90 95

Gly Arg Pro Ala Ile Gln Arg Asn Phe Gln Arg Ala Ser Glu Leu Thr100 105 110

Ser Val Pro Asp Asp Val Val Leu Asp Leu Tyr Asn Ser Leu Arg Pro115 120 125

Phe Arg Ser Thr Lys Gln Glu Leu Leu Asp Thr Ala Lys Glu Leu Arg130 135 140

Asp Lys Tyr His Ala Pro Ile Cys Ala Gly Trp Phe Glu Glu Ala Ala145 150 155 160

Glu Asn Tyr Glu Val Asn Lys Lys Leu Lys Gly Asp Asn165 170<210> 104

<211> 1665

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 104

atgagatcga aaagatttga agcactggcg aaacgccctg tgaatcagga tggtttcgtt 60aaggagtgga ttgaagaggg ctttatcgcg atggaaagtc ctaacgatcc caaaccttct 120atccgcatcg tcaacggcgc ggtgaccgaa ctcgacggta aaccggttga cgagttcgac 180ctgattgacc actttatcgc gcgctacggc attaatctcg cccgggccga agaagtgatg 240gccatggatt cggttaagct cgccaacatg ctctgcgacc cgaacgttaa acgcagcgac 300atcgtgccgc tcactaccgc gatgaccccg gcgaaaatcg tggaagtggt gtcgcatatg 360aacgtggtcg agatgatgat ggcgatgcaa aaaatgcgcg cccgccgcac gccgtcccag 420caggcgcatg tcactaatat caaagataat ccggtacaga ttgccgccga cgccgctgaa 480ggcgcatggc gcggctttga cgaacaggag accaccgtcg ccgtggcgcg ctacgcgcgg 540ttcaacgcca tcgccctgct ggtgggttca caggttggcc gccccggcgt cctcacccag 600tgttcgctgg aagaagccac cgagctgaaa ctgggcatgc tgggccacac ctgctatgcc 660gaaaccattt cggtatacgg tacggaaccg gtgtttaccg atggcgatga cactccatgg 720tcgaaaggct tcctcgcctc ctcctacgcc tcgcgcggcc tgaaaatgcg ctttacctcc 780ggttccggtt ctgaagtaca gatgggctat gccgaaggca aatcgatgct ttatctcgaa 840gcgcgctgca tctacatcac caaagccgcc ggggtgcaag gcctgcagaa tggctccgtc 900agctgtatcg gcgtaccgtc cgccgtgccg tccgggatcc gcgccgtact ggcggaaaac 960ctgatctgct cagcgctgga tctggagtgc gcctccagca acgatcaaac ctttacccac 1020tcggatatgc ggcgtaccgc gcgtctgctg atgcagttcc tgccaggcac cgacttcatc 1080tcctccggtt actcggcggt gcccaactac gacaacatgt tcgccggttc caacgaagat 1140gccgaagact tcgatgacta caacgtgatc cagcgcgacc tgaaggtcga tgggggtctg 1200cggccggtgc gtgaagagga cgtgatcgcc attcgcaaca aagccgcccg cgcgctgcag 1260gcggtatttg ccggcatggg tttgccgcct attacggatg aagaggtaga agccgccacc 1320tacgcccacg gttcaaaaga tatgcctgag cgcaatatcg tcgaggacat caagtttgct 1380caggagatca tcaacaagaa ccgcaacggc ctggaggtgg tgaaagccct ggcgaaaggc 1440ggcttccccg atgtcgccca ggacatgctc aatattcaga aagccaagct caccggcgac 1500tacctgcata cctccgccat cattgttggc gagggccagg tgctctcggc cgtgaatgac 1560gtgaacgatt atgccggtcc ggcaacaggc taccgcctgc aaggcgagcg ctgggaagag 1620attaaaaata tcccgggcgc gctcgatccc aatgaacttg gctaa

<210> 105<211> 554<212> PRT

<213> Klebsiella pneumoniae<400> 105

Met Arg Ser Lys Arg Phe Clu Ala Leu Ala Lys Arg Pro Val Asn Gln15 10 15

Asp Gly Phe Val Lys Glu Trp Ile Glu Glu Gly Phe Ile Ala Met Glu20 25 30

Ser Pro Asn Asp Pro Lys Pro Ser Ile Arg Ile Val Asn Gly Ala Val35 40 45

Thr Glu Leu Asp Gly Lys Pro Val Asp Glu Phe Asp Leu Ile Asp His50 55 60

Phe Ile Ala Arg Tyr Gly Ile Asn Leu Ala Arg Ala Glu Glu Val Met65 70 75 80

Ala Met Asp Ser Val Lys Leu Ala Asn Met Leu Cys Asp Pro Asn Val85 90 95

Lys Arg Ser Asp Ile Val Pro Leu Thr Thr Ala Met Thr Pro Ala Lys100 105 110

Ile Val Glu Val Val Ser His Met Asn Val Val Glu Met Met Met Ala115 120 125

Met Gln Lys Met Arg Ala Arg Arg Thr Pro Ser Gln Gln Ala His Val130 135 140

Thr Asn Ile Lys Asp Asn Pro Val Gln Ile Ala Ala Asp Ala Ala Clu145 150 155 160

Gly Ala Trp Arg Gly Phe Asp Glu Gln Glu Thr Thr Val Ala Val Ala165 170 175

Arg Tyr Ala Arg Phe Asn Ala Ile Ala Leu Leu Val Gly Ser Gln Val180 185 190

Cly Arg Pro Gly Val Leu Thr Gln Cys Ser Leu Glu Glu Ala Thr Glu195 200 205Leu Lys Leu Gly Met Leu Gly His Thr Cys Tyr Ala Glu Thr Ile Ser210 215 220

Val Tyr Gly Thr Glu Pro Val Phe Thr Asp Gly Asp Asp Thr Pro Trp225 230 235 240

Ser Lys Gly Phe Leu Ala Ser Ser Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys Met245 250 255

Arg Phe Thr Ser Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln Met Gly Tyr Ala Glu260 265 270

Gly Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ala Arg Cys Ile Tyr Ile Thr Lys275 280 285

Ala Ala Gly Val Gln Gly Leu Gln Asn Gly Ser Val Ser Cys Ile Gly290 295 300

Val Pro Ser Ala Val Pro Ser Gly Ile Arg Ala Val Leu Ala Glu Asn305 310 315 320

Leu Ile Cys Ser Ala Leu Asp Leu Glu Cys Ala Ser Ser Asn Asp Gln325 330 335

Thr Phe Thr His Ser Asp Met Arg Arg Thr Ala Arg Leu Leu Met Gln340 345 350

Phe Leu Pro Gly Thr Asp Phe Ile Ser Ser Gly Tyr Ser Ala Val Pro355 360 365

Asn Tyr Asp Asn Met Phe Ala Gly Ser Asn Glu Asp Ala Glu Asp Phe370 375 380

Asp Asp Tyr Asn Val Ile Gln Arg Asp Leu Lys Val Asp Gly Gly Leu385 390 395 400

Arg Pro Val Arg Glu Glu Asp Val Ile Ala Ile Arg Asn Lys Ala Ala405 410 415

Arg Ala Leu Gln Ala Val Phe Ala Gly Met Gly Leu Pro Pro Ile Thr420 425 430

Asp Glu Glu Val Glu Ala Ala Thr Tyr Ala His Gly Ser Lys Asp Met435 440 445Pro Glu Arg Asn Ile Val Glu Asp Ile Lys Phe Ala Gln Glu Ile Ile

Asn Lys Asn Arg Asn Gly Leu Glu Val Val Lys Ala Leu Ala Lys Gly

Gly Phe Pro Asp Val Ala Gln Asp Met Leu Asn Ile Gln Lys Ala Lys

Leu Thr Gly Asp Tyr Leu His Thr Ser Ala Ile Ile Val Gly Glu Gly

Gln Val Leu Ser Ala Val Asn Asp Val Asn Asp Tyr Ala Gly Pro Ala

Thr Gly Tyr Arg Leu Gln Gly Glu Arg Trp Glu Glu Ile Lys Asn Ile

Pro Gly Ala Leu Asp Pro Asn Glu Leu Gly

<210> 106<211> 687<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae<400> 106

atggaaatta acgaaacgct gctgcgccag attatcgaag aggtgctgtc ggagatgaaa 60

tcaggcgcag ataagccggt ctcctttagc gcgccggcgt ctgtcgcctc tgccgcgccg 120

gtcgccgttg cgcctgtgtc cggcgacagc ttcctgacgg aaatcggcga agccaaaccc 180

ggcacgcagc aggatgaagt cattattgcc gtcgggccag cgtttggtct ggcgcaaacc 240

gccaatatcg tcggcattcc gcataaaaat attctgcgcg aagtgatcgc cggcattgag 300

gaagaaggca tcaaagcccg ggtgatccgc tgctttaagt catctgacgt cgccttcgtg 360

gcagtggaag gcaaccgcct gagcggctcc ggcatctcga tcggtattca gtcgaaaggc 420

accaccgtca tccaccagcg cggcctgccg ccgctttcca atctggaact cttcccgcag 480

gcgccgctgt taacgctgga aacctaccgt cagattggca aaaacgccgc gcgctacgcc 540

aaacgcgagt cgccgcagcc ggtgccgacg cttaacgatc agatggctcg tcccaaatac 600

caggcgaagt cggccatttt gcacattaaa gagaccaaat acgtggtgac gggcaaaaac 660

ccgcaggaac tgcgcgtggc gctttaa 687

<210> 107<211> 228<212> PRT

<213> Klebsiella pneumoniae<400> 107

Met Glu Ile Asn Glu Thr Leu Leu Arg Gln Ile Ile Glu Glu Val Leu15 10 15

Ser Glu Met Lys Ser Gly Ala Asp Lys Pro Val Ser Phe Ser Ala Pro20 25 30

Ala Ser Val Ala Ser Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Pro Val Ser Gly35 40 45

Asp Ser Phe Leu Thr Glu Ile Gly Glu Ala Lys Pro Gly Thr Gln Gln50 55 60

Asp Glu Val Ile Ile Ala Val Gly Pro Ala Phe Gly Leu Ala Gln Thr65 70 75 80

Ala Asn Ile Val Gly Ile Pro His Lys Asn Ile Leu Arg Glu Val Ile85 90 95

Ala Gly Ile Glu Glu Glu Gly Ile Lys Ala Arg Val Ile Arg Cys Phe100 105 110

Lys Ser Ser Asp Val Ala Phe Val Ala Val Glu Gly Asn Arg Leu Ser

115 120 125

Gly Ser Gly Ile Ser Ile Gly Ile Gln Ser Lys Gly Thr Thr Val Ile130 135 140

His Gln Arg Gly Leu Pro Pro Leu Ser Asn Leu Glu Leu Phe Pro Gln145 150 155 160

Ala Pro Leu Leu Thr Leu Glu Thr Tyr Arg Gln Ile Gly Lys Asn Ala165 170 175

Ala Arg Tyr Ala Lys Arg Glu Ser Pro Gln Pro Val Pro Thr Leu Asn180 185 190

Asp Gln Met Ala Arg Pro Lys Tyr Gln Ala Lys Ser Ala Ile Leu His195 200 205

Ile Lys Glu Thr Lys Tyr Val Val Thr Gly Lys Asn Pro Gln Glu Leu210 215 220Arg Val Ala Leu225

<210> 108

<211> 525

<212> DNA

<21B> KlebsieTTa pneumoniae

<400> 108 atgaataccg acgcaattga atccatggta cgcgacgtgc tgagccggat gaacagccta 60caggacgggg taacgcccgc gccagccgcg ccgacaaacg acaccgttcg ccagccaaaa 120gttagcgact acccgttagc gacctgccat ccggagtggg tcaaaaccgc taccaataaa 180acgctcgatg acctgacgct ggagaacgta ttaagcgatc gcgttacggc gcaggacatg 240cgcatcactc cggaaacgct gcgtatgcag gcggcgatcg cccaggatgc cggacgcgat 300cggctggcga tgaactttga gcgggccgca gagctcaccg cggttcccga cgaccgaatc 360cttgagatct acaacgccct gcgcccatac cgttccaccc aggcggagct actggcgatc 420gctgatgacc tcgagcatcg ctaccaggca cgactctgtg ccgcctttgt tcgggaagcg 480gccgggctgt acatcgagcg taagaagctg aaaggcgacg attaa 525

<210> 109<211> 174<212> PRT

<213> KTebsieTTa pneumoniae<400> 109

Met Asn Thr Asp Ala Ile Clu Ser Met Val Arg Asp Val Leu Ser Arg15 10 15

Met Asn Ser Leu Gln Asp Cly Val Thr Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr20 25 30

Asn Asp Thr Val Arg Gln Pro Lys Val Ser Asp Tyr Pro Leu Ala Thr35 40 45

Cys His Pro Glu Trp Val Lys Thr Ala Thr Asn Lys Thr Leu Asp Asp50 55 60

Leu Thr Leu Glu Asn Val Leu Ser Asp Arg Val Thr Ala Gln Asp Met65 70 75 80

Arg Ile Thr Pro Glu Thr Leu Arg Met Gln Ala Ala Ile Ala Gln Asp85 90 95Ala Gly Arg Asp Arg100

Leu Ala Met Asn Phe Clu105

Arg Ala Ala Glu Leu110

Thr Ala Val Pro Asp115

Asp Arg Ile Leu Glu Ile120

Tyr Asn Ala Leu Arg125

Pro Tyr Arg Ser Thr130

Gln Ala Glu Leu Leu Ala135

Ile Ala Asp Asp Leu140

Glu His Arg Tyr Gln145

Ala150

Arg Leu Cys Ala Ala155

Phe Val Arg Clu Ala160

Ala Gly Leu Tyr Ile Glu165

Arg Lys Lys Leu Lys Gly Asp Asp170

<210> 110<211> 1833<212> DNA

<213> KTebsielTa oxytoca<400> 110

atgcgatata tagctggcat tgatatcggc aactcatcga cggaagtcgc cctggcgacc 60

ctggatgagg ctggcgcgct gacgatcacc cacagcgcgc tggcggaaac caccggaatc 120

aaaggcacgt tgcgtaacgt gttcgggatt caggaggcgc tcgccctcgt cgccagaggc 180

gccgggatcg ccgtcagcga tatttcgctc atccgcatca acgaagcgac gccggtgatt 240

ggcgatgtgg cgatggaaac cattaccgaa accatcatca ccgaatcgac catgatcggc 300

cataacccga aaacgcccgg cggcgcgggg cttggcacag gcatcaccat tacgccgcag 360

gagctgctaa cccgcccggc ggacgcgccc tatatcctgg tggtgtcgtc ggcgttcgat 420

tttgccgata tcgccagcgt gattaacgct tccctgcgcg ccgggtatca gattaccggc 480

gtcattttac agcgcgacga tggcgtgctg gtcagcaacc ggctggaaaa accgctgccg 540

atcgttgacg aagtgctgta catcgaccgc attccgctgg ggatgctggc ggcgattgag 600

gtcgccgttc cggggaaggt catcgaaacc ctctctaacc cttacggcat cgccaccgtc 660

tttaacctca gccccgagga gacgaagaac atcgtcccga tggcccgggc gctgattggc 720

aaccgttccg ccgtggtggt caaaacgcca tccggcgacg tcaaagcgcg cgcgataccc 780

gccggtaatc ttgagctgct ggcccagggc cgtagcgtgc gcgtggatgt ggccgccggc 840

gccgaagcca tcatgaaagc ggtcgacggc tgcggcaggc tcgataacgt caccggcgaa 900

tccggcacca atatcggcgg catgctggaa cacgtgcgcc agaccatggc cgagctgacc 960

aacaagccga gcagcgaaat atttattcag gacctgctgg ccgttgatac ctcggtaccg 1020gtgagcgtta ccggcggtct ggccggggag ttctcgctgg agcaggccgt gggcatcgcc 1080tcgatggtga aatcggatcg cctgcagatg gcaatgatcg cccgcgaaat cgagcagaag 1140ctcaatatcg acgtgcagat cggcggcgca gaggccgaag ccgccatcct gggggcgctg 1200accacgccgg gcaccacccg accgctggcg atcctcgacc tcggcgcggg ctccaccgat 1260gcctccatca tcaaccccaa aggcgacatc atcgccaccc atctcgccgg cgcaggcgac 1320atggtgacga tgattattgc ccgcgagctg gggctggaag accgctatct ggcggaagag 1380atcaagaagt acccgctggc taaggtggaa agcctgttcc atttacgcca cgaggacggc 1440agcgtgcagt tcttctccac gccgctgccg cccgccgtgt tcgcccgcgt ctgcgtggtg 1500aaagcggacg aactggtgcc gctgcccggc gatttagcgc tggaaaaagt gcgcgccatt 1560cgccgcagcg ccaaagagcg ggtctttgtc accaacgccc tgcgcgcgct gcgtcaggtc 1620agccccaccg gcaacattcg cgatattccg ttcgtggtgc tggtcggcgg ttcgtcgctg 1680gatttcgaag tcccgcagct ggtcaccgat gcgctggcgc actaccgcct ggttgccgga 1740cggggaaata ttcgcggcag cgagggcccc cgaaacgcgg tggccaccgg cctgattctc 1800tcctggcata aggagtttgc gcatgaacgg taa 1833

<210> 111<211> 610<212> PRT

<213> KlebsieTla oxytoca<400> 111

Met Arg Tyr Ile Ala Gly Ile Asp Ile Gly Asn Ser Ser Thr Glu Val15 10 15

Ala Leu Ala Thr Leu Asp Glu Ala Gly Ala Leu Thr Ile Thr His Ser20 25 30

Ala Leu Ala Glu Thr Thr Gly Ile Lys Gly Thr Leu Arg Asn Val Phe35 40 45

Gly Ile Gln Glu Ala Leu Ala Leu Val Ala Arg Gly Ala Gly Ile Ala50 55 60

Val Ser Asp Ile Ser Leu Ile Arg Ile Asn Glu Ala Thr Pro Val Ile65 70 75 80

Gly Asp Val Ala Met Glu Thr Ile Thr Glu Thr Ile Ile Thr Glu Ser85 90 95Thr Met Ile Gly His Asn Pro Lys Thr Pro Gly Gly Ala Gly Leu Gly100 105 110

Thr Gly Ile Thr Ile Thr Pro Gln Glu Leu Leu Thr Arg Pro Ala Asp115 120 125

Ala Pro Tyr Ile Leu Val Val Ser Ser Ala Phe Asp Phe Ala Asp Ile130 135 140

Ala Ser Val Ile Asn Ala Ser Leu Arg Ala Gly Tyr Gln Ile Thr Gly145 150 155 160

Val Ile Leu Gln Arg Asp Asp Gly Val Leu Val Ser Asn Arg Leu Glu165 170 175

Lys Pro Leu Pro Ile Val Asp Glu Val Leu Tyr Ile Asp Arg Ile Pro180 185 190

Leu Gly Met Leu Ala Ala Ile Glu Val Ala Val Pro Gly Lys Val Ile195 200 205

Glu Thr Leu Ser Asn Pro Tyr Gly Ile Ala Thr Val Phe Asn Leu Ser210 215 220

Pro Glu Glu Thr Lys Asn Ile Val Pro Met Ala Arg Ala Leu Ile Gly225 230 235 240

Asn Arg Ser Ala Val Val Val Lys Thr Pro Ser Gly Asp Val Lys Ala245 250 255

Arg Ala Ile Pro Ala Gly Asn Leu Glu Leu Leu Ala Gln Gly Arg Ser260 265 270

Val Arg Val Asp Val Ala Ala Gly Ala Glu Ala Ile Met Lys Ala Val275 280 285

Asp Gly Cys Gly Arg Leu Asp Asn Val Thr Gly Glu Ser Gly Thr Asn290 295 300

Ile Gly Gly Met Leu Glu His Val Arg Gln Thr Met Ala Glu Leu Thr305 310 315 320

Asn Lys Pro Ser Ser Glu Ile Phe Ile Gln Asp Leu Leu Ala Val Asp325 330 335

Thr Ser Val Pro Val Ser Val Thr Gly Gly Leu Ala Gly Glu Phe Ser340 345 350Leu Glu Gln Ala Val Gly Ile Ala Ser Met Val Lys Ser Asp Arg Leu355 360 365

Gln Met Ala Met Ile Ala Arg Glu Ile Glu Gln Lys Leu Asn Ile Asp370 375 380

Val Gln Ile Gly Gly Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ile Leu Gly Ala Leu385 390 395 400

Thr Thr Pro Gly Thr Thr Arg Pro Leu Ala Ile Leu Asp Leu Gly Ala405 410 415

Gly Ser Thr Asp Ala Ser Ile Ile Asn Pro Lys Gly Asp Ile Ile Ala420 425 430

Thr His Leu Ala Gly Ala Gly Asp Met Val Thr Met Ile Ile Ala Arg435 440 445

Glu Leu Gly Leu Glu Asp Arg Tyr Leu Ala Glu Glu Ile Lys Lys Tyr450 455 460

Pro Leu Ala Lys Val Glu Ser Leu Phe His Leu Arg His Glu Asp Gly465 470 475 480

Ser Val Gln Phe Phe Ser Thr Pro Leu Pro Pro Ala Val Phe Ala Arg485 490 495

Val Cys Val Val Lys Ala Asp Glu Leu Val Pro Leu Pro Gly Asp Leu500 505 510

Ala Leu Glu Lys Val Arg Ala Ile Arg Arg Ser Ala Lys Glu Arg Val515 520 525

Phe Val Thr Asn Ala Leu Arg Ala Leu Arg Gln Val Ser Pro Thr Gly530 535 540

Asn Ile Arg Asp Ile Pro Phe Val Val Leu Val Gly Gly Ser Ser Leu545 550 555 560

Asp Phe Glu Val Pro Gln Leu Val Thr Asp Ala Leu Ala His Tyr Arg565 570 575

Leu Val Ala Gly Arg Gly Asn Ile Arg Gly Ser Glu Gly Pro Arg Asn580 585 590

Ala Val Ala Thr Gly Leu Ile Leu Ser Trp His Lys Glu Phe Ala His595 600 605Glu Arg610

<210> 112<211> 378<212> DNA<213> Klebsiella oxytoca

<400> 112

atgaacggta atcacagcgc cccggccatc gcgatcgccg tcatcgacgg ctgcgacggc 60ctgtggcgcg aagtgctgct gggtatcgaa gaggaaggta tccctttccg gctccagcat 120cacccggccg gagaggtcgt ggacagcgcc tggcaggcgg cgcgcagctc gccgctgctg 180gtgggcatcg cctgcgaccg ccatatgctg gtcgtgcact acaagaattt acccgcatcg 240gcgccgcttt ttacgctgat gcatcatcag gacagtcagg cccatcgcaa caccggtaat 300aacgcggcac ggctggtcaa ggggatccct ttccgggatc tgaatagcga agcaacagga 360gaacagcagg atgaataa 378

<210> 113<211> 125<212> PRT<213> Klebsiella oxytoca

<400> 113

Met Asn Cly Asn His Ser Ala Pro Ala Ile Ala Ile Ala Val Ile Asp1 5 10 15

Cly Cys Asp Gly Leu Trp Arg Clu Val Leu Leu Gly Ile Glu Glu Clu20 25 30

Gly Ile Pro Phe Arg Leu Gln His His Pro Ala Gly Glu Val Val Asp35 40 45

Ser Ala Trp Gln Ala Ala Arg Ser Ser Pro Leu Leu Val Gly Ile Ala50 55 60

Cys Asp Arg His Met Leu Val Val His Tyr Lys Asn Leu Pro Ala Ser65 70 75 80

Ala Pro Leu Phe Thr Leu Met His His Gln Asp Ser Gln Ala His Arg85 90 95

Asn Thr Gly Asn Asn Ala Ala Arg Leu Val Lys Gly Ile Pro Phe Arg100 105 110Asp Leu Asn Ser Glu Ala Thr Gly Glu Gln Gln Asp Glu115 120 125

<210> 114

<211> 18B3

<212> DNA

<213> SalmoneTla typhimurium

<400> 114

atgcgatata tagctggcat tgacatcggt aactcatcaa cggaagtcgc actggcgcgg 60caagatgaga ctggcgcact gacgattaca cacagcgcgc tggcggaaac caccgggatc 120aaaggcacgt tgcgtaacgt gttcggcatt caggaagcgc tcgccctcgt cgcaaagcgc 180gcggggatca atgtcagaga tatttcgctc atccgcatta acgaagccac gccggtgatt 240ggcgatgtgg cgatggaaac cattaccgaa accatcatca ccgaatcgac aatgatcggc 300cataacccaa aaacgccggg cggagcaggc cttggtgtgg gtatcacgat tacgccggag 360gagctgttaa cccgcccggc ggactcgtcc tatattctgg tggtatcgtc agcctttgat 420tttgctgàta tcgccaatgt tatcaacgcc tcaatgcgcg ccggatacca gattaccggc 480gtcattttgc agcgcgacga tggcgtactg gtcagcaacc ggctggaaaa atcgctaccg 540attgtcgatg aagttctgta catcgaccgc attccgctgg ggatgctggc ggcgattgaa 600gtcgccgtgc cgggaaaggt tatcgaaacc ctctctaacc cttacggcat cgccaccgta 660tttaatctca acgccgatga gacaaaaaac atcgtcccga tggcgcgcgc gctgattggc 720aaccgttccg ccgtggtggt taaaacgcca tccggcgacg tcaaagcgcg cgcaataccc 780gccggtaacc tggagctgca ggctcagggt cgtaccgtgc gcgtggatgt tgccgccggt 840gccgaagcca tcatgaaagc ggtggacggt tgcggcaagc tcgacaacgt caccggcgag 900gccgggacca atatcggcgg catgctggag cacgtgcgcc agaccatggc cgaactgacc 960aacaagccga gcagtgagat tttcattcag gatctactgg ccgttgacac ctcggttccg 1020gtgagcgtca ccggcggtct ggccggggag ttctcgctgg agcaggccgt cggcatcgcc 1080tcgatggtga aatcagaccg tctgcagatg gcgatgattg cccgtgaaat tgagcagaag 1140cttaatatcg acgtgcagat cggcggcgct gaggctgaag ccgccattct gggcgcgctg 1200accacgccgg gtaccacccg accgctggcg atcctcgacc tcggcgcggg ctccaccgat 1260gcctccatca tcaaccctaa aggcgaaatc atcgccaccc atctcgccgg ggcaggcgac 1320atggtcacga tgattattgc ccgcgaactg gggctggaag accgctatct ggcggaagag 1380atcaaaaaat acccgctggc taaggtcgaa agcctgttcc acttacgcca cgaggacggc 1440agcgtccagt tcttcccgac gccgctgcct cccgccgtgt tcgcccgcgt ctgcgtggtg 150088

aaaccggacg aactggtgcc gcttcccggc gacttagcgc tggaaaaagt gcgcgccatt 1560cgccgcagcg ctaaagaacg cgtctttgtc accaacgccc tgcgcgcgct gcgccaggtc 1620agtccaaccg gcaacattcg cgatattccg ttcgtggtgc tggtcggcgg ctcgtcgctg 1680gatttcgaag ttccgcagct ggtcaccgat gcgctggcgc actaccgcct ggtcgccggg 1740cgaggaaata ttcgcggcag cgaaggccca agaaacgcgg tggccaccgg cctgattctc 1800tcctggcata aggagtttgc gcatggacag taa 1833

<210> 115<211> 610<212> PRT

<213> Salmonella typhimurium

<400> 115

Met Arg Tyr Ile Ala Gly Ile Asp Ile Gly Asn Ser Ser Thr Glu Val15 10 15

Ala Leu Ala Arg Gln Asp Glu Thr Gly Ala Leu Thr Ile Thr His Ser

20 25 30

Ala Leu Ala Glu Thr Thr Gly Ile Lys Gly Thr Leu Arg Asn Val Phe35 40 45

Gly Ile Gln Glu Ala Leu Ala Leu Val Ala Lys Arg Ala Gly Ile Asn50 55 60

Val Arg Asp Ile Ser Leu Ile Arg Ile Asn Glu Ala Thr Pro Val Ile65 70 75 80

Gly Asp Val Ala Met Glu Thr Ile Thr Glu Thr Ile Ile Thr Glu Ser85 90 95

Thr Met Ile Gly His Asn Pro Lys Thr Pro Gly Gly Ala Gly Leu Gly100 105 110

Val Gly Ile Thr Ile Thr Pro Glu Glu Leu Leu Thr Arg Pro Ala Asp115 120 125

Ser Ser Tyr Ile Leu Val Val Ser Ser Ala Phe Asp Phe Ala Asp Ile130 135 140

Ala Asn Val Ile Asn Ala Ser Met Arg Ala Gly Tyr Gln Ile Thr Gly145 150 155 160

Val Ile Leu Gln Arg Asp Asp Gly Val Leu Val Ser Asn Arg Leu Glu165 170 175Lys Ser Leu Pro Ile Val Asp Glu Val Leu Tyr Ile Asp Arg Ile Pro180 185 190

Leu Gly Met Leu Ala Ala Ile Glu Val Ala Val Pro Gly Lys Val Ile195 200 205

Glu Thr Leu Ser Asn Pro Tyr Gly Ile Ala Thr Val Phe Asn Leu Asn210 215 220

Ala Asp Glu Thr Lys Asn Ile Val Pro Met Ala Arg Ala Leu Ile Gly225 230 235 240

Asn Arg Ser Ala Val Val Val Lys Thr Pro Ser Gly Asp Val Lys Ala245 250 255

Arg Ala Ile Pro Ala Gly Asn Leu Glu Leu Gln Ala Gln Gly Arg Thr

260 265 270

Val Arg Val Asp Val Ala Ala Gly Ala Glu Ala Ile Met Lys Ala Val275 280 285

Asp Gly Cys Gly Lys Leu Asp Asn Val Thr Gly Glu Ala Gly Thr Asn290 295 300

Ile Gly Gly Met Leu Glu His Val Arg Gln Thr Met Ala Glu Leu Thr305 310 315 320

Asn Lys Pro Ser Ser Glu Ile Phe Ile Gln Asp Leu Leu Ala Val Asp325 330 335

Thr Ser Val Pro Val Ser Val Thr Gly Gly Leu Ala Gly Glu Phe Ser340 345 350

Leu Glu Gln Ala Val Gly Ile Ala Ser Met Val Lys Ser Asp Arg Leu355 360 365

Gln Met Ala Met Ile Ala Arg Glu Ile Glu Gln Lys Leu Asn Ile Asp370 375 380

Val Gln Ile Gly Gly Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ile Leu Gly Ala Leu385 390 395 400

Thr Thr Pro Gly Thr Thr Arg Pro Leu Ala Ile Leu Asp Leu Gly Ala405 410 415

Gly Ser Thr Asp Ala Ser Ile Ile Asn Pro Lys Gly Glu Ile Ile Ala420 425 430Thr His Leu Ala Cly Ala Gly Asp Met Val Thr Met Ile Ile Ala Arg435 440 445

Clu Leu Cly Leu Clu Asp Arg Tyr Leu Ala Clu Glu Ile Lys Lys Tyr450 455 460

Pro Leu Ala Lys Val Glu Ser Leu Phe His Leu Arg His Clu Asp Cly465 470 475 480

Ser Val Gln Phe Phe Pro Thr Pro Leu Pro Pro Ala Val Phe Ala Arg485 490 495

Val Cys Val Val Lys Pro Asp Glu Leu Val Pro Leu Pro Gly Asp Leu

500 505 510

Ala Leu Glu Lys Val Arg Ala Ile Arg Arg Ser Ala Lys Glu Arg Val

515 520 525

Phe Val Thr Asn Ala Leu Arg Ala Leu Arg Gln Val Ser Pro Thr Gly530 535 540

Asn Ile Arg Asp Ile Pro Phe Val Val Leu Val Gly Gly Ser Ser Leu545 550 555 560

Asp Phe Glu Val Pro Cln Leu Val Thr Asp Ala Leu Ala His Tyr Arg565 570 575

Leu Val Ala Gly Arg Gly Asn Ile Arg Gly Ser Glu Gly Pro Arg Asn580 585 590

Ala Val Ala Thr Gly Leu Ile Leu Ser Trp His Lys Glu Phe Ala His595 600 605

Gly Gln610

<210> 116<211> 372<212> DNA

<213> Salmonella typhimurium<400> 116

atggacagta atcacagcgc cccggctatc gtcattaccg ttatcaacga ctgcgccagc 60ctctggcacg aagtgctgct gggcattgaa gaggaaggca tccctttcct gcttcagcat 120cacccggctg gagatatcgt tgacagcgcc tggcaggcgg cgcgcagctc gccgctgctg 180gtcggcattg cctgcgatcg acactcgctg gtcgtgcatt acaagaattt acccgcatcg 240gcgccgcttt ttacgctgat gcatcatcag gacagtcagg cccaacgcaa caccggtaat 300aacgcggcac ggctggtcaa agggatccct ttcgggatct ccatgcttaa tcacaggaga 360acggcagtat ga 372

<210> 117<211> 123<212> PRT

<213> SalmonelTa typhimurium<400> 117

Met Asp Ser Asn His Ser Ala Pro Ala Ile Val Ile Thr Val Ile Asn15 10 15

Asp Cys Ala Ser Leu Trp His Glu Val Leu Leu Gly Ile Glu Glu Glu20 25 30

Gly Ile Pro Phe Leu Leu Gln His His Pro Ala Gly Asp Ile Val Asp35 40 45

Ser Ala Trp Gln Ala Ala Arg Ser Ser Pro Leu Leu Val Gly Ile Ala50 55 60

Cys Asp Arg His Ser Leu Val Val His Tyr Lys Asn Leu Pro Ala Ser65 70 75 80

Ala Pro Leu Phe Thr Leu Met His His Gln Asp Ser Gln Ala Gln Arg85 90 95

Asn Thr Gly Asn Asn Ala Ala Arg Leu Val Lys Gly Ile Pro Phe Gly100 105 110

Ile Ser Met Leu Asn His Arg Arg Thr Ala Val115 120

<210> 118

<211> 1833

<212> DNA

<213> Lactobacillus collinoides

<400> 118

atgacacgtg taattggtgt tgatatcggg aattcctcta cagaagttgc gcttgctgat 60gtgtctgaca gtggtgaagt aaatttcatt aattctggaa tttccgatac aactggcatt 120aaaggtacta aacaaaattt gatcggggtg cgtaaatcca tccagatcgt tttgaaaaag 180tcgaatatgc aaatttccga tgttgacctg attcggatca acgaagcaac gcccgttatc 240ggtgatgttg ccatggagac catcaccgaa acggtgatta ctgaatcgac gatgatcggc 300cacaacccag ggactcctgg gggtgtcggt actggttctg gttacacggt gaatttgctt 360gatttgttga gccaaacgga taaggatcgt ccttatatcg ttatcatctc gaaagaaatc 420gattttgctg acgcagctaa gctgatcaac gcttatgtgg cttctggtta taatattacc 480gctgccattc tgcaaagtga tgatggggtg ctgatcaata atcggttgac ccataagatt 540cccatcgtgg atgaagtctc acagatcgac aaggtaccgt tgaacatgct tgccgcagtg 600gaagttgcac cgcctggcaa agtaattgct caactttcca acccgtatgg cattgccaca 660ctgttcgaac tttcctctga agaaaccaag aacattgtgc cagttgcccg agccttaatc 720ggaaaccggt cagcggttgt tattaaaacc cctgccggtg atgttaaagc tcgtgttatc 780ccagccggga aaatcttgat caatggccaa ccgaatggtc atggtgaagt taacgttgcg 840gctggtgccg atgccatcat gaaaaaggtg aacgagttcg atagtgtcga tgacattacc 900ggtgaatcgg gcactaacgt tggtgggatg cttgaaaaag ttcgtcaaac aatggctgag 960ttgaccgaca agcaaaatag cgacattgcc attcaagatt tattagctgt caatacgtcc 1020gttccagtaa cggtgcgtgg tggtctggct ggtgaattct caatggaaca agccgttggg 1080attgctgcta tggtcaaatc tgatcacttg caaatgcaag cgattgcaga cctgatgaaa 1140gatgaatttc acgttcaagt cgaaatcggc ggtgctgaag ctgaatcagc catcctcggt 1200gcgctaacaa cgccagggac gacaaaacca attgccatcc ttgatttggg ggctggttca 1260acggatgcat caattatcaa ccaaaaggac gaaaaggtcg ctattcactt ggctggtgcc 1320ggtgatatgg ttaccatgat catcaattct gaacttgggt tggaagaccc atatttagct 1380gaggatatta agaaatatcc gctggctaaa gttgataatc tattccagct acggcatgaa 1440gatggtgccg ttcaattctt tgaagatcca ttacctgctg atttatttgc cagagttgtg 1500gctgttaaac cagatggtta cgaaccactt cctggtaatt tgagtatcga gaaagttaaa 1560atcgtccgtc aaactgctaa gaagcgggtg ttcgtaacga acgcaattcg tgccttacac 1620cacgttagcc caacaggtaa tatccgagat atcccatttg tggtcattgt cggcggctca 1680gccctcgatt ttgaaattcc acaattggtc accgatgaat tatcacactt taacttagtt 1740 gcaggtcgtg gtaatattcg gggaattgaa ggtccacgga acgccgtggc aactggtttg 1800 attctttcat acgcgagtga gaagagggga tag 1833

<210> 119<211> 610<212> PRT<21Β> Lactobacillus collinoides

<400> 119Met Thr Arg Val Ile Gly Val Asp Ile Gly Asn Ser Ser Thr Glu Val1 5 10 15

Ala Leu Ala Asp Val Ser Asp Ser Gly Glu Val Asn Phe Ile Asn Ser20 25 30

Gly Ile Ser Asp Thr Thr Gly Ile Lys Gly Thr Lys Gln Asn Leu Ile35 40 45

Gly Val Arg Lys Ser Ile Gln Ile Val Leu Lys Lys Ser Asn Met Gln

50 55 60

Ile Ser Asp Val Asp Leu Ile Arg Ile Asn Glu Ala Thr Pro Val Ile65 70 75 80

Gly Asp Val Ala Met Glu Thr Ile Thr Glu Thr Val Ile Thr Glu Ser85 90 95

Thr Met Ile Gly His Asn Pro Gly Thr Pro Gly Gly Val Gly Thr Gly100 105 110

Ser Gly Tyr Thr Val Asn Leu Leu Asp Leu Leu Ser Gln Thr Asp Lys115 120 125

Asp Arg Pro Tyr Ile Val Ile Ile Ser Lys Glu Ile Asp Phe Ala Asp130 135 140

Ala Ala Lys Leu Ile Asn Ala Tyr Val Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Thr145 150 155 160

Ala Ala Ile Leu Gln Ser Asp Asp Gly Val Leu Ile Asn Asn Arg Leu165 170 175

Thr His Lys Ile Pro Ile Val Asp Glu Val Ser Gln Ile Asp Lys Val180 185 190

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Ser Ser Glu Glu Thr Lys Asn Ile Val Pro Val Ala Arg Ala Leu Ile225 230 235 240

Gly Asn Arg Ser Ala Val Val Ile Lys Thr Pro Ala Gly Asp Val Lys245 250 255Ala Arg Val Ile Pro Ala Gly Lys Ile Leu Ile Asn Gly Gln Pro Asn260 265 270

Gly His Gly Glu Val Asn Val Ala Ala Gly Ala Asp Ala Ile Met Lys275 280 285

Lys Val Asn Glu Phe Asp Ser Val Asp Asp Ile Thr Gly Glu Ser Gly

290 295 BOO

Thr Asn Val Gly Gly Met Leu Glu Lys Val Arg Gln Thr Met Ala Glu

305 310 315 320

Leu Thr Asp Lys Gln Asn Ser Asp Ile Ala Ile Gln Asp Leu Leu Ala325 330 335

Val Asn Thr Ser Val Pro Val Thr Val Arg Gly Gly Leu Ala Gly Glu340 345 350

Phe Ser Met Glu Gln Ala Val Gly Ile Ala Ala Met Val Lys Ser Asp355 360 365

His Leu Gln Met Gln Ala Ile Ala Asp Leu Met Lys Asp Glu Phe His370 375 380

Val Gln Val Glu Ile Gly Gly Ala Glu Ala Glu Ser Ala Ile Leu Gly385 390 395 400

Ala Leu Thr Thr Pro Gly Thr Thr Lys Pro Ile Ala Ile Leu Asp Leu405 410 415

Gly Ala Gly Ser Thr Asp Ala Ser Ile Ile Asn Gln Lys Asp Glu Lys420 425 430

Val Ala Ile His Leu Ala Gly Ala Gly Asp Met Val Thr Met Ile Ile435 440 445

Asn Ser Glu Leu Gly Leu Glu Asp Pro Tyr Leu Ala Glu Asp Ile Lys450 455 460

Lys Tyr Pro Leu Ala Lys Val Asp Asn Leu Phe Gln Leu Arg His Glu465 470 475 480

Asp Gly Ala Val Gln Phe Phe Glu Asp Pro Leu Pro Ala Asp Leu Phe485 490 495

Ala Arg Val Val Ala Val Lys Pro Asp Gly Tyr Glu Pro Leu Pro Gly500 505 510Asn Leu Ser Ile Glu Lys Val Lys Ile Val Arg Gln Thr Ala Lys Lys515 520 525

Arg Val Phe Val Thr Asn Ala Ile Arg Ala Leu His His Val Ser Pro

530 535 540

Thr Gly Asn Ile Arg Asp Ile Pro Phe Val Val Ile Val Gly Gly Ser

545 550 555 560

Ala Leu Asp Phe Glu Ile Pro Gln Leu Val Thr Asp Glu Leu Ser His565 570 575

Phe Asn Leu Val Ala Gly Arg Gly Asn Ile Arg Gly Ile Glu Gly Pro580 585 590

Arg Asn Ala Val Ala Thr Gly Leu Ile Leu Ser Tyr Ala Ser Glu Lys595 600 605

Arg Gly

<210> 120

<211> 351

<212> DNA

<213> LactobaciITus collinoides

<400> 120

atggcatttg attctgaacg tccgtcaatt ctattggcga caccaacggg ttctaatggc 60caacttccag aagttctaaa accaatgctc aatggtattg aagaagaaca gattcctttt 120cagattctcg atatggaagg cggttcagca gttgagcggg cttataacgc gtcagttgct 180tcacgattat cagtgggcgt tgggtttgat gatgcacata tcattgtgca ttataaaaac 240ttgaaaccag aaaaaccgct gtttgatgtt gccatcactg atgcagcatc cattcgtaaa 300gttggcgcaa acgccgctcg acttgtaaag ggagttccat tcaagaagta a 351

<210> 121<211> 116<212> PRT

<213> LactobaciIlus collinoides<400> 121

Met Ala Phe Asp Ser Glu Arg Pro Ser Ile Leu Leu Ala Thr Pro Thr1 5 10 15

Gly Ser Asn Gly Gln Leu Pro Glu Val Leu Lys Pro Met Leu Asn Gly20 25 30Ile Clu Glu Clu Gln Ile Pro Phe Gln Ile Leu Asp Met Glu Gly Gly35 40 45

Ser Ala Val Glu Arg Ala Tyr Asn Ala Ser Val Ala Ser Arg Leu Ser50 55 60

Val Gly Val Gly Phe Asp Asp Ala His Ile Ile Val His Tyr Lys Asn65 70 75 80

Leu Lys Pro Glu Lys Pro Leu Phe Asp Val Ala Ile Thr Asp Ala Ala85 90 95

Ser Ile Arg Lys Val Gly Ala Asn Ala Ala Arg Leu Val Lys Gly Val100 105 110

Pro Phe Lys Lys115

<210> 122<211> 453<212> PRT

<213> Vibrio fluvialis<400> 122

Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu1 5 10 15

Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Leu His Gln Arg Gly Thr Val Val20 25 30

Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Arg35 40 45

Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp50 55 60

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Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu85 90 95

Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Ser Gly Arg Val Phe100 105 110

Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu115 120 125Trp Phe Leu His Ala Ala Clu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu130 135 140

Thr Arg Trp Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met145 150 155 160

Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe165 170 175

Val His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu180 185 190

Thr Glu Glu Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Glu Thr195 200 205

Ile Gln Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro210 215 220

Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Lys Gly Tyr Phe Gln225 230 235 240

Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Val Ile Ser Asp245 250 255

Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Val260 265 270

Thr Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ser Lys Asn Leu Thr275 280 285

Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu Leu Ser290 295 300

Lys Arg Leu Glu Thr Ala Ile Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Gly305 310 315 320

Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala325 330 335

Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu340 345 350

Ala Pro Arg Phe Glu Glu Arg Leu Lys His Ile Ala Glu Arg Pro Asn355 360 365Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Ala Val370 375 380

Lys Asp Lys Ala Ser Lys Thr Pro Phe Asp Gly Asn Leu Ser Val Ser385 390 395 400

Glu Arg Ile Ala Asn Thr Cys Thr Asp Leu Gly Leu Ile Cys Arg Pro405 410 415

Leu Gly Gln Ser Val Val Leu Cys Pro Pro Phe Ile Leu Thr Glu Ala420 425 430

Gln Met Asp Glu Met Phe Asp Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val435 440 445

Phe Ala Glu Val Ala450

<210> 123

<211> 1122

<212> DNA

<213> Erwinia caratovora subsp. atroseptica

<400> 123

atgtctgacg gacgactcac cgcacttttt cctgcattcc cacacccggc gtccaatcag 60cccgtatttg ccgaggcttc accgcacgac gacgagttaa tgacgcaggc cgtaccgcag 120gtttcctgtc agcaggcgtt ggcgattgcg cagcaagaat atggcttgtc tgggcagatg 180tcgctgcttc agggcgagcg tgatgtgaat ttctgtctga cggtgacgcc agatgaacgc 240tacatgctga aagtcatcaa tgcggcagaa cctgccgacg tcagcaattt ccaaaccgcg 300ctgctgctgc atcttgcccg tcaggcacct gaactgcccg taccgcgtat caggtcgaca 360aaagcgggtc agtcggaaac aggcgttgag atcgatggtg tactgctgcg tgtgcggctt 420gtgagctatc tggcaggaat gccgcagtat ctggcctcac cgtcaacggc gctgatgccg 480cagttggggg gaacgctggc gcagttggat aacgcgcttc acagctttac gcatccggcg 540gcaaaccgtg cgctgctgtg ggatatcagc cgggcagagc aggtgcgtcc ttacctcgat 600ttcgtttctg aaccgcagca gtatcagcat cttcagcgta tttttgaccg ttatgacagt 660aacgttgctc ctctgttgac gacgctacgt cgtcaggtca ttcataacga tctgaatccg 720cataacgtgc tggtggatgg atcgtcgccg acgcgggtta ctggcattat cgattttggc 780gatgccgtat ttgccccgtt aatttgcgaa gtcgcgacgg cactggcgta tcagatcggc 840gatggaaccg atttgttgga gcatgttgtg ccgtttgttg cggcctatca ccaacgcatt 900ccgttagcac cggaggagat tgcgctgtta cccgatctga tagcgacccg tatggcgctg 960

accctgacca ttgcgcagtg gcgagcatcg cgttatcccg acaatcggga gtatctgctg 1020

cgtaacgtgc cgcgctgttg gcacagtttg cagcgcattg cgacctattc ccatgcgcaa 1080

tttttgactc gcctacagca ggtttgcccg gagaatgcgc ga 1122

<210> 124<211> 374<212> PRT

<213> Erwinia caratovora subsp. atroseptica<400> 124

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Ala Ser Asn Gln Pro Val Phe Ala Glu Ala Ser Pro His Asp Asp Glu20 25 30

Leu Met Thr Gln Ala Val Pro Gln Val Ser Cys Gln Gln Ala Leu Ala35 40 45

Ile Ala Gln Gln Glu Tyr Gly Leu Ser Gly Gln Met Ser Leu Leu Gln50 55 60

Gly Glu Arg Asp Val Asn Phe Cys Leu Thr Val Thr Pro Asp Glu Arg65 70 75 80

Tyr Met Leu Lys Val Ile Asn Ala Ala Glu Pro Ala Asp Val Ser Asn85 90 95

Phe Gln Thr Ala Leu Leu Leu His Leu Ala Arg Gln Ala Pro Glu Leu100 105 110

Pro Val Pro Arg Ile Arg Ser Thr Lys Ala Gly Gln Ser Glu Thr Gly115 120 125

Val Glu Ile Asp Gly Val Leu Leu Arg Val Arg Leu Val Ser Tyr Leu130 135 140

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Gln Leu Gly Gly Thr Leu Ala Gln Leu Asp Asn Ala Leu His Ser Phe165 170 175Thr His Pro Ala Ala Asn Arg Ala Leu Leu Trp Asp Ile Ser Arg Ala180 185 190

Glu Gln Val Arg Pro Tyr Leu Asp Phe Val Ser Glu Pro Gln Gln Tyr195 200 205

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Leu Leu Thr Thr Leu Arg Arg Gln Val Ile His Asn Asp Leu Asn Pro225 230 235 240

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Ile Asp Phe Gly Asp Ala Val Phe Ala Pro Leu Ile Cys Glu Val Ala260 265 270

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Val Val Pro Phe Val Ala Ala Tyr His Gln Arg Ile Pro Leu Ala Pro290 295 300

Glu Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asp Leu Ile Ala Thr Arg Met Ala Leu305 310 315 320

Thr Leu Thr Ile Ala Gln Trp Arg Ala Ser Arg Tyr Pro Asp Asn Arg325 330 335

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<210> 125

<211> 1272

<212> DNA

<213> Erwinia caratovora subsp. atroseptica

<400> 125

atgacagcga cagaagcttt gctggcgcgc cgtcagcgag tgttgggcgg cggttatcgcctgttttatg aagagccgct gcatgtcgcg cgcggcgagg gcgtgtggct gttcgatcac 120caagggaaac gttatctgga tgtctacaat aatgtggctt cggtcggaca ttgccacccc 180gcggtggttg aagccgtggc gcgacagagc gcacaactca atacccacac gcgctatttg 240caccacgcga ttgtcgattt tgcggaagat ttgctgagcg aatttcccgc cgaattgaac 300aatgtaatgc tgacctgtac cggcagtgag gctaacgatc tggcgctgcg tatcgcccga 360catgtcacgg gcgggacggg gatgttggtg acgcgctggg cgtatcacgg cgtgaccagc 420gcgctggcgg aactgtctcc gtcgctgggg gatggcgttg tgcgcggtag ccatgtgaag 480ctgatcgacg cgccagacac ttatcgtcag cccggtgcat ttcttaccag cattcgtgaa 540gcgctggcgc agatgcaacg ggaaggtatt cgtcctgcgg cgctgctggt agataccatt 600ttttccagcg atggcgtgtt ctgtgcgccg gaaggcgaaa tggcacaggc ggcggcgttg 660atccgtcagg cgggcgggct gtttattgcg gatgaagtgc agccgggctt cgggcgcacc 720ggggaatcac tgtggggctt tgcgcgccac aatgtcgtcc ctgatttggt gagtctaggg 780aaaccgatgg gcaacggaca tcccatcgct ggattggtgg ggcgttccgc tctgttcgac 840gcatttgggc gcgatgtgcg ctatttcaat acctttggcg gcaatccggt ttcctgtcag 900gcggcgcacg cggtgctgcg ggtgattcgg gaagagcagt tgcagcagaa tgcccagcgg 960gtcggtgatt atctgcggca agggttgcag caactggcgc agcatttccc gctgattggt 1020gatattcggg cttacggcct gtttattggt gcggagctgg tcagcgatcg cgaaagtaaa 1080acgccggcaa gtgaatccgc gttgcaggtg gtgaatgcga tgcgccaacg tggtgtgctc 1140atcagcgcga cggggccagc ggcgaacata ctgaaaattc gcccgccgct ggtgtttctg 1200gaagaacacg ccgatgtgtt cttaaccacg ctgagtgacg ttttagcgct catcggcact 1260cgtgcacaga ga 1272

<210> 126<211> 424<212> PRT

<213> Erwinia caratovora subsp. atroseptica<400> 126

Met Thr Ala Thr Glu Ala Leu Leu Ala Arg Arg Gln Arg Val Leu Gly15 10 15

Gly Gly Tyr Arg Leu Phe Tyr Glu Glu Pro Leu His Val Ala Arg Gly20 25 30

Glu Gly Val Trp Leu Phe Asp His Gln Gly Lys Arg Tyr Leu Asp Val35 40 45Tyr Asn Asn Val Ala Ser Val Cly His Cys His Pro Ala Val Val Glu50 55 60

Ala Val Ala Arg Gln Ser Ala Gln Leu Asn Thr His Thr Arg Tyr Leu65 70 75 80

His His Ala Ile Val Asp Phe Ala Glu Asp Leu Leu Ser Glu Phe Pro85 90 95

Ala Glu Leu Asn Asn Val Met Leu Thr Cys Thr Gly Ser Glu Ala Asn100 105 110

Asp Leu Ala Leu Arg Ile Ala Arg His Val Thr Gly Gly Thr Gly Met115 120 125

Leu Val Thr Arg Trp Ala Tyr His Gly Val Thr Ser Ala Leu Ala Glu130 135 140

Leu Ser Pro Ser Leu Gly Asp Gly Val Val Arg Gly Ser His Val Lys145 150 155 160

Leu Ile Asp Ala Pro Asp Thr Tyr Arg Gln Pro Gly Ala Phe Leu Thr165 170 175

Ser Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gln Met Gln Arg Glu Gly Ile Arg Pro180 185 190

Ala Ala Leu Leu Val Asp Thr Ile Phe Ser Ser Asp Gly Val Phe Cys195 200 205

Ala Pro Glu Gly Glu Met Ala Gln Ala Ala Ala Leu Ile Arg Gln Ala210 215 220

Gly Gly Leu Phe Ile Ala Asp Glu Val Gln Pro Gly Phe Gly Arg Thr225 230 235 240

Gly Glu Ser Leu Trp Gly Phe Ala Arg His Asn Val Val Pro Asp Leu245 250 255

Val Ser Leu Gly Lys Pro Met Gly Asn Gly His Pro Ile Ala Gly Leu260 265 270

Val Gly Arg Ser Ala Leu Phe Asp Ala Phe Gly Arg Asp Val Arg Tyr275 280 285

Phe Asn Thr Phe Cly Gly Asn Pro Val Ser Cys Gln Ala Ala His Ala290 295 300Val Leu Arg Val Ile Arg Clu Glu Cln Leu Gln Gln Asn Ala Cln Arg305 310 315 320

Val Gly Asp Tyr Leu Arg Gln Gly Leu Gln Gln Leu Ala Gln His Phe325 330 335

Pro Leu Ile Gly Asp Ile Arg Ala Tyr Gly Leu Phe Ile Gly Ala Glu340 345 350

Leu Val Ser Asp Arg Glu Ser Lys Thr Pro Ala Ser Glu Ser Ala Leu355 360 365

Gln Val Val Asn Ala Met Arg Gln Arg Gly Val Leu Ile Ser Ala Thr370 375 380

Gly Pro Ala Ala Asn Ile Leu Lys Ile Arg Pro Pro Leu Val Phe Leu385 390 395 400

Glu Glu His Ala Asp Val Phe Leu Thr Thr Leu Ser Asp Val Leu Ala405 410 415

Leu Ile Gly Thr Arg Ala Gln Arg420

<210> 127<211> 35<212> DNA<213> Seqüência<220> <223> Iniciador<400> 127

ctccggaatt catgtctgac ggacgactca ccgca 35

<210> 128

<211> 46

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 128

ttccaatgca ttggctgcag ttatctctgt gcacgagtgc cgatga 46

<210> 129

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> Iniciador<400> 129

aacagccaag cttggctgca gtcatcgcgc attctccggg 40

<210> 130

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 130

tctccggaat tcatgacgtc tgaaatgaca gcgacagaag 40

<210> 131

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 131

gctaacagga ggaagaattc atggggggtt ctc 33

<210> 132

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 132

gagaaccccc catgaattct tcctcctgtt age 33

<210> 133<211> 723<212> DNA

<213> Klebsiella terrigena<400> 133

atgcaaaaag tcgcacttgt caccggcgcc ggtcagggca tcggtaaagc tatcgccctg 60cgtctggtga aggatggatt tgccgtggca ategeegatt acaacgacgc tacggccaca 120gcggtagccg ctgaaatcaa ccaggccggc ggccgcgcgg tggccattaa ggtcgacgtc 180tcgcgccggg accaggtttt cgccgccgtt gagcaggcgc gtaaagccct gggcggattc 240aacgttatcg tcaacaacgc cggcatcgcg ccgtcaacgc cgatcgagtc catcaccgag 300gagatcgtcg accgggtcta taacatcaac gttaagggcg tcatctgggg gatgcaggcg 360gcggtggagg ccttcaaaaa agaggggcac ggcgggaaga tcgtcaacgc ctgctcccag 420gccggccacg tcggcaaccc ggagctggcg gtctacagtt cgagtaaatt cgccgtgcgc 480ggcctgacgc aaaccgccgc ccgcgatctg gcgccgctgg gcatcaccgt taacggcttc 540tgcccaggga tcgttaagac gccaatgtgg gcggagattg accgtcagtg tcggaagcgg 600cgggcaaacc gctgggctac ggcacggctg aatttgccaa acgcatcacc cttggccgcc 660tgtcggagcc tgaagacgtc gccgcctgcg tgtcgttcct cgccagcccg gattccgact 720ata 723

<210> 134<211> 241<212> PRT

<213> Klebsiella terrigena<400> 134

Met Cln Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly Gln Gly Ile Gly Lys1 5 10 15

Ala Ile Ala Leu Arg Leu Val Lys Asp Gly Phe Ala Val Ala Ile Ala20 25 30

Asp Tyr Asn Asp Ala Thr Ala Thr Ala Val Ala Ala Glu Ile Asn Gln35 40 45

Ala Gly Gly Arg Ala Val Ala Ile Lys Val Asp Val Ser Arg Arg Asp50 55 60

Gln Val Phe Ala Ala Val Glu Gln Ala Arg Lys Ala Leu Gly Gly Phe65 70 75 80

Asn Val Ile Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Pro Ser Thr Pro Ile Glu85 90 95

Ser Ile Thr Glu Glu Ile Val Asp Arg Val Tyr Asn Ile Asn Val Lys100 105 110

Gly Val Ile Trp Gly Met Gln Ala Ala Val Glu Ala Phe Lys Lys Glu

115 120 125

Gly His Gly Gly Lys Ile Val Asn Ala Cys Ser Gln Ala Gly His Val130 135 140

Cly Asn Pro Glu Leu Ala Val Tyr Ser Ser Ser Lys Phe Ala Val Arg145 150 155 160Cly Leu Thr Gln Thr Ala Ala Arg Asp Leu Ala Pro Leu Cly Ile Thr165 170 175

Val Asn Cly Phe Cys Pro Gly Ile Val Lys Thr Pro Met Trp Ala Glu180 185 190

Ile Asp Arg Gl n Cys Arg Lys Arg Arg Ala Asn Arg Trp Ala Thr Ala195 200 205

Arg Leu Asn Leu Pro Asn Ala Ser Pro Leu Ala Ala Cys Arg Ser Leu210 215 220

Lys Thr Ser Pro Pro Ala Cys Arg Ser Ser Pro Ala Arg Ile Pro Thr225 230 235 240

Ile

<210> 135<211> 554<212> PRT

<213> Clostridium pasteurianum<400> 135

Met Lys Ser Lys Arg Phe Gln Val Leu Ser Glu Arg Pro Val Asn Lys1 5 10 15

Asp Gly Phe Ile Cly Glu Trp Pro Glu Glu Gly Leu Ile Ala Met Ser20 25 30

Ser Pro Asn Asp Pro Lys Pro Ser Ile Lys Ile Lys Glu Gly Lys Val35 40 45

Ile Glu Leu Asp Gly Lys Asn Arg Glu Asp Phe Asp Met Ile Asp Arg50 55 60

Phe Ile Ala Asn Tyr Gly Ile Asn Leu Asn Arg Ala Glu Asp Val Ile65 70 75 80

Lys Met Asp Ser Val Lys Leu Ala Lys Met Leu Val Asp Ile Asn Val85 90 95

Asp Arg Lys Thr Ile Val Glu Leu Thr Thr Ala Met Thr Pro Ala Lys100 105 110

Ile Val Glu Val Val Gly Asn Met Asn Val Val Glu Met Met Met Ala115 120 125Leu Cln Lys Met Arg Ala Arg Lys Thr Pro Ser Asn Gln Cys His Val130 135 140

Thr Asn Leu Lys Asp Asn Pro Val Gln Ile Ala Ala Asp Ala Ala Clu145 150 155 160

Ala Ala Ile Arg Gly Phe Asp Glu Gln Glu Thr Thr Val Gly Ile Val165 170 175

Arg Tyr Ala Pro Phe Asn Ala Leu Ala Leu Leu Val Gly Ala Gln Val180 185 190

Gly Arg Gly Gly Val Leu Thr Gln Cys Ala Ile Glu Glu Ala Thr Glu195 200 205

Leu Glu Leu Gly Met Arg Gly Leu Thr Ser Tyr Ala Glu Thr Val Ser210 215 220

Val Tyr Cly Thr Glu Asn Val Phe Thr Asp Gly Asp Asp Thr Pro Trp225 230 235 240

Ser Lys Ala Phe Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys Met245 250 255

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305 310 315 320

Leu Ile Thr Thr Met Leu Asp Ile Glu Val Ala Ser Ala Asn Asp Gln

325 330 335

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Met Leu Pro Gly Thr Asp Phe Ile Phe Ser Gly Tyr Ser Ser Val Pro

355 360 365

Asn Tyr Asp Asn Met Phe Ala Gly Ser Asn Phe Asp Ala Glu Asp Phe

370 375 380Asp Asp Tyr Asn Val Ile Gln Arg Asp Leu Met Val Asp Cly Cly Leu385 390 395 400

Arg Pro Val Ser Clu Glu Glu Val Ile Thr Ile Arg Asn Lys Ala Ala405 410 415

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Asn Arg Gly Ile Thr Gly Ile Asp Val Val Lys Ala Leu Ser Lys His465 470 475 480

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Ile Ser Gly Asp Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Ile Ile Asp Lys Asn Phe500 505 510

Asn Val Val Ser Ala Val Asn Asp Cys Asn Asp Tyr Met Gly Pro Cly515 520 525

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<210> 136<211> 179<212> PRT

<213> Clostridium pasteurianum<400> 136

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Ile Ile Ser

<210> 137<211> 146<212> PRT

<213> Clostridium pasteurianum<400> 137

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Val Ala Glu Gly Ser Gly Arg Cys Ala Ile Ala Arg Asn Phe Arg Arg65 70 75 80110Ala Ala Clu Leu Ile Ser Ile Ser Asp Clu Arg Ile Leu Clu Ile Tyr85 90 95

Asn Ala Leu Arg Pro Tyr Arg Ser Thr Lys Asn Glu Leu Leu Ala Ile100 105 110

Ala Asp Glu Leu Glu Glu Lys Tyr Asp Ala Lys Val Asn Ala Asp Phe115 120 125

Ile Arg Glu Ala Ala Glu Val Tyr Ser Lys Arg Asn Lys Val Arg Ile130 135 140

Glu Asp145

<210> 138<211> 555<212> PRT

<213> Escherichia blattae<400> 138

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Gly Ser Pro Trp Asp Pro Pro Ser Ser Val Lys Val Glu Gln Gly Arg

35 40 45

Ile Val Glu Leu Asp Gly Lys Ala Arg Ala Asp Phe Asp Met Ile Asp50 55 60

Arg Phe Ile Ala Asp Tyr Ala Ile Asn Ile Glu Glu Thr Glu His Ala65 70 75 80

Met Gly Leu Asp Ala Leu Thr Ile Ala Arg Met Leu Val Asp Ile Asn85 90 95

Val Ser Arg Ala Glu Ile Ile Lys Val Thr Thr Ala Ile Thr Pro Ala100 105 110

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Glu Ser Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ser Arg Cys Ile Phe Ile Thr

275 280 285

Lys Gly Ala Cly Val Gln Gly Leu Gln Asn Gly Ala Val Ser Cys Ile

290 295 300

Gly Met Thr Gly Ala Val Pro Ser Gly Ile Arg Ala Val Leu Ala Glu305 310 315 320

Asn Leu Ile Ala Ser Met Leu Asp Leu Glu Val Ala Ser Ala Asn Asp325 330 335

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Arg Val Thr Gly Asp Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Ile Leu Asp Arg Glu500 505 510

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515 520 525

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<210> 139<211> 196<212> PRT

<213> Escherichia blattae<400> 139

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<210> 140<211> 141<212> PRT

<213> Escherichia blattae<400> 140

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His Arg His Ala Ile Ala Arg Asn Leu Arg Arg Ala Gly Glu Leu Ile65 70 75 80Ala Ile Pro Asp Ala Arg Ile Leu Glu Ile Tyr Asn Ala Leu Arg Pro85 90 95

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Thr Arg Tyr Gln Ala Thr Val Asn Ala Ala Phe Ile Arg Glu Ala Ala115 120 125

Glu Val Tyr Arg Gln Arg Asp Lys Leu Arg Lys Glu Ala130 135 140

<210> 141

<211> 555

<212> PRT

<213> Citrobacter freundii

<400> 141

Met Arg Arg Ser Lys Arg Phe Glu Val Leu Ala Gln Arg Pro Val Asn15 10 15

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Ile Val Glu Leu Asp Gly Lys Ser Arg Ala Glu Phe Asp Met Ile Asp50 55 60

Arg Phe Ile Ala Asp Tyr Ala Ile Asn Val Pro Glu Ala Glu Arg Ala65 70 75 80

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Ala Leu Gln Lys Met Arg Ala Arg Arg Thr Pro Ser Asn Gln Cys His130 135 140Val Thr Asn Leu Lys Asp Asn Pro Val Gln Ile Ala Ala Asp Ala Ala145 150 155 160

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Ala Arg Tyr Ala Pro Phe Asn Ala Leu Ala Leu Leu Val Gly Ser Gln180 185 190

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Glu Leu Glu Leu Gly Met Arg Gly Leu Thr Ser Tyr Ala Glu Thr Val210 215 220

Ser Val Tyr Gly Thr Glu Ser Val Phe Thr Asp Gly Asp Asp Thr Pro225 230 235 240

Trp Ser Lys Ala Phe Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys245 250 255

Met Arg Tyr Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Ala Leu Met Gly Tyr Ser260 265 270

Glu Ser Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ser Arg Cys Ile Phe Ile Thr275 280 285

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Gly Met Thr Gly Ala Val Pro Ser Gly Ile Arg Ala Val Leu Ala Glu305 310 315 320

Asn Leu Ile Ala Ser Met Leu Asp Leu Glu Val Ala Ser Ala Asn Asp325 330 335

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Pro Asn Tyr Asp Asn Met Phe Ala Gly Ser Asn Phe Asp Ala Glu Asp370 375 380Phe Asp Asp Tyr Asn Ile Leu Cln Arg Asp Leu Met Val Asp Cly Cly385 390 395 400

Leu Arg Pro Val Thr Glu Glu Glu Thr Ile Ala Ile Arg Asn Lys Ala405 410 415

Ala Arg Ala Ile Gln Ala Val Phe Arg Glu Leu Gly Leu Pro Leu Ile420 425 430

Ser Asp Glu Gl u Val Asp Ala Ala Thr Tyr Ala His Gly Ser Lys Asp435 440 445

Met Pro Ala Arg Asn Val Val Glu Asp Leu Ala Ala Val Glu Glu Met450 455 460

Met Lys Arg Asn Ile Thr Gly Leu Asp Ile Val Gly Ala Leu Ser Ser465 470 475 480

Ser Gly Phe Glu Asp Ile Ala Ser Asn Ile Leu Asn Met Leu Arg Gln485 490 495

Arg Val Thr Gly Asp Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Ile Leu Asp Arg Gln500 505 510

Phe Asp Val Val Ser Ala Val Asn Asp Ile Asn Asp Tyr Gln Gly Pro515 520 525

Gly Thr Gly Tyr Arg Ile Ser Ala Glu Arg Trp Ala Glu Ile Lys Asn530 535 540

Ile Ala Gly Val Val Gln Pro Gly Ser Ile Glu545 550 555

<210> 142<211> 194<212> PRT

<213> Citrobacter freundii<400> 142

Met Glu Cys Thr Thr Glu Arg Lys Pro Val Phe Thr Leu Gln Val Ser15 10 15

Glu Gly Glu Ala Ala Lys Ala Asp Glu Arg Val Asp Glu Val Val Ile20 25 30

Gly Val Gly Pro Ala Phe Asp Lys Tyr Gln His Lys Thr Leu Ile Asp35 40 45Met Pro His Lys Ala Ile Leu Lys Glu Leu Val Ala Gly Ile Glu Glu50 55 60

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Pro Lys Phe Met Ala Lys Ala Ala Leu Phe His Ile Lys Glu Thr Lys165 170 175

His Val Val Gln Asp Arg Ala Pro Val Thr Leu His Ile Ala Leu Val180 185 190

Arg Glu

<210> 143

<211> 142

<212> PRT

<213> Citrobacter freundii

<400> 143

Met Asn Asp Asn Ile Met Thr Ala Gln Asp Tyr Pro Leu Ala Thr Arg1 5 10 15

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Phe Arg Ser Ser Phe Ala Glu Leu Gln Ala Ile Ala Asp Glu Leu Glu100 105 110

His Thr Trp His Ala Thr Val Asn Ala Gly Phe Val Arg Glu Ser Ala115 120 125

Glu Val Tyr Leu Gln Arg Asn Lys Leu Arg Lys Gly Ser Gln130 135 140

<210> 144

<211> 1359

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Amino: piruvato transaminase códon otimizada de <400> 144 atgaacaaac cacagtcttg ggaagctcgt gcagaaacct attctctgta Vibrio fluvialis cggcttcact 60 gacatgccgt ccctgcacca gcgtggtact gttgttgtca cgcacggcga aggtccgtac 120attgttgacg tcaatggtcg ccgttatctg gacgctaatt ctggcctgtg gaatatggtt 180gcaggttttg accataaggg tctgatcgac gcagctaagg ctcagtacga gcgttttccg 240ggctaccatg cgttcttcgg tcgtatgagc gatcagacgg tgatgctgtc cgaaaaactg 300gtagaagtct ctccgttcga cagcggccgt gtgttctata cgaacagcgg tagcgaagca 360aacgacacta tggttaagat gctgtggttc ctgcatgcgg cggaaggtaa gccacaaaag 420cgcaaaattc tgacccgttg gaacgcgtat cacggcgtta ctgcagttag cgcctccatg 480accggtaaac cgtacaacag cgttttcggt ctgccgctgc caggtttcgt tcacctgact 540tgccctcact actggcgtta cggtgaagaa ggcgagacgg aagaacaatt cgttgcacgc 600ctggcacgcg aactggaaga gactatccag cgtgagggtg ctgacactat cgctggcttc 660tttgctgagc cggttatggg tgcaggtggt gttattccgc ctgctaaagg ttattttcag 720gctattctgc caatcctgcg taaatatgac atcccggtta tctctgacga agttatctgt 780ggttttggtc gcactggcaa cacctggggt tgcgtaactt atgattttac tccggatgct 840atcatctcta gcaaaaacct gaccgccggt ttcttcccga tgggcgcagt gatcctgggt 900ccagaactga gcaagcgcct ggaaaccgca attgaagcaa tcgaggaatt tccgcacggc 960tttaccgcgt ccggccatcc ggtaggctgt gcaatcgcgc tgaaagcgat cgatgttgtt 1020atgaacgaag gcctggcgga aaacgttcgc cgtctggcac cgcgcttcga agaacgtctg 1080aaacatatcg cggaacgtcc gaacattggt gaatatcgtg gtatcggttt tatgtgggct 1140ctggaggcag tcaaagacaa agcgtctaaa actccgttcg atggcaatct gagcgtgagc 1200gaacgtatcg ccaacacttg caccgacctg ggtctgatct gccgtccact gggccaaagc 1260gtagtgctgt gtccgccgtt tatcctgacc gaagcgcaaa tggacgaaat gttcgacaaa 1320ctggagaaag cactggataa agtgttcgca gaggtggca 1359

<210> 145

<211> 1668

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 145

atgaaaagat caaaacgatt tgcagtactg gcccagcgcc ccgtcaatca ggacgggctg 60attggcgagt ggcctgaaga ggggctgatc gccatggaca gcccctttga cccggtctct 120tcagtaaaag tggacaacgg tctgatcgtc gaactggacg gcaaacgccg ggaccagttt 180gacatgatcg accgatttat cgccgattac gcgatcaacg ttgagcgcac agagcaggca 240atgcgcctgg aggcggtgga aatagcccgt atgctggtgg atattcacgt cagccgggag 300gagatcattg ccatcactac cgccatcacg ccggccaaag cggtcgaggt gatggcgcag 360atgaacgtgg tggagatgat gatggcgctg cagaagatgc gtgcccgccg gaccccctcc 420aaccagtgcc acgtcaccaa tctcaaagat aatccggtgc agattgccgc tgacgccgcc 480gaggccggga tccgcggctt ctcagaacag gagaccacgg tcggtatcgc gcgctacgcg 540ccgtttaacg ccctggcgct gttggtcggt tcgcagtgcg gccgccccgg cgtgttgacg 600cagtgctcgg tggaagaggc caccgagctg gagctgggca tgcgtggctt aaccagctac 660gccgagacgg tgtcggtcta cggcaccgaa gcggtattta ccgacggcga tgatacgccg 720tggtcaaagg cgttcctcgc ctcggcctac gcctcccgcg ggttgaaaat gcgctacacc 780tccggcaccg gatccgaagc gctgatgggc tattcggaga gcaagtcgat gctctacctc 840gaatcgcgct gcatcttcat tactaaaggc gccggggttc agggactgca aaacggcgcg 900gtgagctgta tcggcatgac cggcgctgtg ccgtcgggca ttcgggcggt gctggcggaa 960aacctgatcg cctctatgct cgacctcgaa gtggcgtccg ccaacgacca gactttctcc 1020cactcggata ttcgccgcac cgcgcgcacc ctgatgcaga tgctgccggg caccgacttt 1080attttctccg gctacagcgc ggtgccgaac tacgacaaca tgttcgccgg ctcgaacttc 1140gatgcggaag attttgatga ttacaacatc ctgcagcgtg acctgatggt tgacggcggc 1200ctgcgtccgg tgaccgaggc ggaaaccatt gccattcgcc agaaagcggc gcgggcgatc 1260caggcggttt tccgcgagct ggggctgccg ccaatcgccg acgaggaggt ggaggccgcc 1320acctacgcgc acggcagcaa cgagatgccg ccgcgtaacg tggtggagga tctgagtgcg 1380gtggaagaga tgatgaagcg caacatcacc ggcctcgata ttgtcggcgc gctgagccgc 1440agcggctttg aggatatcgc cagcaatatt ctcaatatgc tgcgccagcg ggtcaccggc 1500gattacctgc agacctcggc cattctcgat cggcagttcg aggtggtgag tgcggtcaac 1560gacatcaatg actatcagg gccgggcacc ggctatcgca tctctgccga acgctgggcg 1620gagatcaaaa actatcaggg cgtggttcag cccgacacca ttgaataa 1668 <210> 146<211> 555<212> PRT<213> KlebsieNa pneumoniae<400> 146

Met Lys Arg Ser Lys Arg Phe Ala VaT Leu Ala Gln Arg Pro Val Asn1 5 10 15

Gln Asp Gly Leu Ile Gly Glu Trp Pro Glu Glu Gly Leu Ile Ala Met20 25 30

Asp Ser Pro Phe Asp Pro Val Ser Ser Val Lys Val Asp Asn Gly Leu35 40 45

Ile Val Glu Leu Asp Gly Lys Arg Arg Asp Gln Phe Asp Met Ile Asp50 55 60

Arg Phe Ile Ala Asp Tyr Ala Ile Asn Val Glu Arg Thr Glu Gln Ala65 70 75 80

Met Arg Leu Glu Ala Val Glu Ile Ala Arg Met Leu Val Asp Ile His85 90 95

Val Ser Arg Glu Glu Ile Ile Ala Ile Thr Thr Ala Ile Thr Pro Ala100 105 110

Lys Ala Val Glu Val Met Ala Gln Met Asn Val Val Glu Met Met Met115 120 125

Glu Ala Gly Ile Arg Gly Phe Ser Glu Gln Glu Thr Thr Val Gly Ile165 170 175

Ala Arg Tyr Ala Pro Phe Asn Ala Leu Ala Leu Leu Val Gly Ser Gln180 185 190

Cys Gly Arg Pro Gly Val Leu Thr Gln Cys Ser Val Glu Glu Ala Thr195 200 205

Glu Leu Glu Leu Gly Met Arg Gly Leu Thr Ser Tyr Ala Glu Thr Val210 215 220

Ser Val Tyr Gly Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Gly Asp Asp Thr Pro225 230 235 240

Trp Ser Lys Ala Phe Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys245 250 255

Met Arg Tyr Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Ala Leu Met Gly Tyr Ser260 265 270

Glu Ser Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ser Arg Cys Ile Phe Ile Thr275 280 285

Lys Gly Ala Gly Val Gln Gly Leu Gln Asn Gly Ala Val Ser Cys Ile290 295 300

Gly Met Thr Gly Ala Val Pro Ser Gly Ile Arg Ala Val Leu Ala Glu305 310 315 320

Asn Leu Ile Ala Ser Met Leu Asp Leu Glu Val Ala Ser Ala Asn Asp325 330 335

Gln Thr Phe Ser His Ser Asp Ile Arg Arg Thr Ala Arg Thr Leu Met340 345 350

Gln Met Leu Pro Gly Thr Asp Phe Ile Phe Ser Gly Tyr Ser Ala Val355 360 365

Pro Asn Tyr Asp Asn Met Phe Ala Gly Ser Asn Phe Asp Ala Glu Asp370 375 380Phe Asp Asp Tyr Asn Ile Leu Cln Arg Asp Leu Met Val Asp Cly Gly385 390 395 400

Leu Arg Pro Val Thr Glu Ala Glu Thr Ile Ala Ile Arg Gln Lys Ala405 410 415

Ala Arg Ala Ile Gln Ala Val Phe Arg Glu Leu Gly Leu Pro Pro Ile420 425 430

Ala Asp Glu Glu Val Glu Ala Ala Thr Tyr Ala His Gly Ser Asn Glu435 440 445

Met Pro Pro Arg Asn Val Val Glu Asp Leu Ser Ala Val Glu Glu Met450 455 460

Met Lys Arg Asn Ile Thr Gly Leu Asp Ile Val Gly Ala Leu Ser Arg465 470 475 480

Ser Gly Phe Clu Asp Ile Ala Ser Asn Ile Leu Asn Met Leu Arg Gln485 490 495

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Phe Glu Val Val Ser Ala Val Asn Asp Ile Asn Asp Tyr Gln Gly Pro515 520 525

Gly Thr Gly Tyr Arg Ile Ser Ala Clu Arg Trp Ala Clu Ile Lys Asn530 535 540

Ile Pro Gly Val Val Gln Pro Asp Thr Ile Glu545 550 555

<210> 147

<211> 585

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 147

gtgcaacaga caacccaaat tcagccctct tttaccctga aaacccgcga gggcggggta 60gcttctgccg atgaacgcgc cgatgaagtg gtgatcggcg tcggccctgc cttcgataaa 120caccagcatc acactctgat cgatatgccc catggcgcga tcctcaaaga gctgattgcc 180ggggtggaag aagaggggct tcacgcccgg gtggtgcgca ttctgcgcac gtccgacgtc 240tcctttatgg cctgggatgc ggccaacctg agcggctcgg ggatcggcat cggtatccag 300tcgaagggga ccacggtcat ccatcagcgc gatctgctgc cgctcagcaa cctggagctg 360ttctcccagg cgccgctgct gacgctggag acctaccggc agattggcaa aaacgctgcg 420cgctatgcgc gcaaagagtc accttcgccg gtgccggtgg tgaacgatca gatggtgcgg 480ccgaaattta tggccaaagc cgcgctattt catatcaaag agaccaaaca tgtggtgcag 540gacgccgagc ccgtcaccct gcacatcgac ttagtaaggg agtga 585

<210> 148<211> 194<212> PRT

<21B> KlebsieTTa pneumoniae<400> 148

Met Gln Gln Thr Thr Gln Ile Gln Pro Ser Phe Thr Leu Lys Thr Arg15 10 15

Glu Gly Gly Val Ala Ser Ala Asp Glu Arg Ala Asp Glu Val Val Ile20 25 30

Gly Val Gly Pro Ala Phe Asp Lys His Gln His His Thr Leu Ile Asp35 40 45

Met Pro His Gly Ala Ile Leu Lys Glu Leu Ile Ala Gly Val Glu Glu50 55 60

Glu Gly Leu His Ala Arg Val Val Arg Ile Leu Arg Thr Ser Asp Val65 70 75 80

Ser Phe Met Ala Trp Asp Ala Ala Asn Leu Ser Gly Ser Gly Ile Gly85 90 95

Ile Gly Ile Gln Ser Lys Gly Thr Thr Val Ile His Gln Arg Asp Leu100 105 110

Leu Pro Leu Ser Asn Leu Glu Leu Phe Ser Gln Ala Pro Leu Leu Thr115 120 125

Leu Glu Thr Tyr Arg Gln Ile Gly Lys Asn Ala Ala Arg Tyr Ala Arg130 135 140

Lys Glu Ser Pro Ser Pro Val Pro Val Val Asn Asp Gln Met Val Arg145 150 155 160

Pro Lys Phe Met Ala Lys Ala Ala Leu Phe His Ile Lys Glu Thr Lys165 170 175His Val Val Gln Asp Ala Glu Pro Val Thr Leu His Ile Asp Leu Val180 185 190

Arg Glu

<210> 149

<211> 426

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 149

atgagcgaga aaaccatgcg cgtgcaggat tatccgttag ccacccgctg cccggagcat 60atcctgacgc ctaccggcaa accattgacc gatattaccc tcgagaaggt gctctctggc 120gaggtgggcc cgcaggatgt gcggatctcc cgccagaccc ttgagtacca ggcgcagatt 180gccgagcaga tgcagcgcca tgcggtggcg cgcaatttcc gccgcgcggc ggagcttatc 240gccattcctg acgagcgcat tctggctatc tataacgcgc tgcgcccgtt ccgctcctcg 300caggcggagc tgctggcgat cgccgacgag ctggagcaca cctggcatgc gacagtgaat 360gccgcctttg tccgggagtc ggcggaagtg tatcagcagc ggcataagct gcgtaaagga 420agctaa 426

<210> 150<211> 141<212> PRT

<213> Klebsiella pneumoniae<400> 150

Met Ser Glu Lys Thr Met Arg Val Gln Asp Tyr Pro Leu Ala Thr Arg1 5 10 15

Cys Pro Glu His Ile Leu Thr Pro Thr Gly Lys Pro Leu Thr Asp Ile20 25 30

Thr Leu Glu Lys Val Leu Ser Gly Glu Val Gly Pro Gln Asp Val Arg35 40 45

Ile Ser Arg Gln Thr Leu Glu Tyr Gln Ala Gln Ile Ala Glu Gln Met50 55 60

Gln Arg His Ala Val Ala Arg Asn Phe Arg Arg Ala Ala Glu Leu Ile65 70 75 80

Ala Ile Pro Asp Glu Arg Ile Leu Ala Ile Tyr Asn Ala Leu Arg Pro85 90 95Phe Arg Ser Ser Gln Ala Glu Leu Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Glu100 105 110

His Thr Trp His Ala Thr Val Asn Ala Ala Phe Val Arg Glu Ser Ala115 120 125

Glu Val Tyr Gln Gln Arg His Lys Leu Arg Lys Gly Ser130 135 140

<210> 151

<211> 1824

<212> DNA

<213> KTebsieTTa pneumoniae

<400> 151

atgccgttaa tagccgggat tgatatcggc aacgccacca ccgaggtggc gctggcgtcc 60gactacccgc aggcgagggc gtttgttgcc agcgggatcg tcgcgacgac gggcatgaaa 120gggacgcggg acaatatcgc cgggaccctc gccgcgctgg agcaggccct ggcgaaaaca 180ccgtggtcga tgagcgatgt ctctcgcatc tatcttaacg aagccgcgcc ggtgattggc 240gatgtggcga tggagaccat caccgagacc attatcaccg aatcgaccat gatcggtcat 300aacccgcaga cgccgggcgg ggtgggcgtt ggcgtgggga cgactatcgc cctcgggcgg 360ctggcgacgc tgccggcggc gcagtatgcc gaggggtgga tcgtactgat tgacgacgcc 420gtcgatttcc ttgacgccgt gtggtggctc aatgaggcgc tcgaccgggg gatcaacgtg 480gtggcggcga tcctcaaaaa ggacgacggc gtgctggtga acaaccgcct gcgtaaaacc 540ctgccggtgg tggatgaagt gacgctgctg gagcaggtcc ccgagggggt aatggcggcg 600gtggaagtgg ccgcgccggg ccaggtggtg cggatcctgt cgaatcccta cgggatcgcc 660accttcttcg ggctaagccc ggaagagacc caggccatcg tccccatcgc ccgcgccctg 720attggcaacc gttccgcggt ggtgctcaag accccgcagg gggatgtgca gtcgcgggtg 780atcccggcgg gcaacctcta cattagcggc gaaaagcgcc gcggagaggc cgatgtcgcc 840gagggcgcgg aagccatcat gcaggcgatg agcgcctgcg ctccggtacg cgacatccgc 900ggcgaaccgg gcacccacgc cggcggcatg cttgagcggg tgcgcaaggt aatggcgtcc 960ctgaccggcc atgagatgag cgcgatatac atccaggatc tgctggcggt ggatacgttt 1020attccgcgca aggtgcaggg cgggatggcc ggcgagtgcg ccatggagaa tgccgtcggg 1080atggcggcga tggtgaaagc ggatcgtctg caaatgcagg ttatcgcccg cgaactgagc 1140gcccgactgc agaccgaggt ggtggtgggc ggcgtggagg ccaacatggc catcgccggg 1200gcgttaacca ctcccggctg tgcggcgccg ctggcgatcc tcgacctcgg cgccggctcg 1260acggatgcgg cgatcgtcaa cgcggagggg cagataacgg cggtccatct cgccggggcg 1320gggaatatgg tcagcctgtt gattaaaacc gagctgggcc tcgaggatct ttcgctggcg 1380gaagcgataa aaaaataccc gctggccaaa gtggaaagcc tgttcagtat tcgtcacgag 1440aatggcgcgg tggagttctt tcgggaagcc ctcagcccgg cggtgttcgc caaagtggtg 1500tacatcaagg agggcgaact ggtgccgatc gataacgcca gcccgctgga aaaaattcgt 1560ctcgtgcgcc ggcaggcgaa agagaaagtg tttgtcacca actgcctgcg cgcgctgcgc 1620caggtctcac ccggcggttc cattcgcgat atcgcctttg tggtgctggt gggcggctca 1680tcgctggact ttgagatccc gcagcttatc acggaagcct tgtcgcacta tggcgtggtc 1740gccgggcagg gcaatattcg gggaacagaa gggccgcgca atgcggtcgc caccgggctg 1800ctactggccg gtcaggcgaa ttaa 1824

<210> 152<211> 607<212> PRT

<213> Klebsiella pneumoniae<400> 152

Met Pro Leu Ile Ala Gly Ile Asp Ile Gly Asn Ala Thr Thr Glu Val1 5 10 15

Ala Leu Ala Ser Asp Tyr Pro Gln Ala Arg Ala Phe Val Ala Ser Gly20 25 30

Ile Val Ala Thr Thr Gly Met Lys Gly Thr Arg Asp Asn Ile Ala Gly35 40 45

Thr Leu Ala Ala Leu Glu Gln Ala Leu Ala Lys Thr Pro Trp Ser Met50 55 60

Ser Asp Val Ser Arg Ile Tyr Leu Asn Glu Ala Ala Pro Val Ile Gly65 70 75 80

Asp Val Ala Met Glu Thr Ile Thr Glu Thr Ile Ile Thr Glu Ser Thr85 90 95

Met Ile Gly His Asn Pro Gln Thr Pro Gly Gly Val Gly Val Gly Val100 105 110

Gly Thr Thr Ile Ala Leu Gly Arg Leu Ala Thr Leu Pro Ala Ala Gln115 120 125Tyr Ala Glu Gly Trp Ile Val Leu Ile Asp Asp Ala Val Asp Phe Leu130 135 140

Asp Ala Val Trp Trp Leu Asn Glu Ala Leu Asp Arg Gly Ile Asn Val145 150 155 160

Val Ala Ala Ile Leu Lys Lys Asp Asp Gly Val Leu Val Asn Asn Arg165 170 175

Leu Arg Lys Thr Leu Pro Val Val Asp Glu Val Thr Leu Leu Glu Gln180 185 190

Val Pro Glu Gly Val Met Ala Ala Val Glu Val Ala Ala Pro Gly Gln195 200 205

Val Val Arg Ile Leu Ser Asn Pro Tyr Gly Ile Ala Thr Phe Phe Gly210 215 220

Leu Ser Pro Glu Glu Thr Gln Ala Ile Val Pro Ile Ala Arg Ala Leu225 230 235 240

Ile Gly Asn Arg Ser Ala Val Val Leu Lys Thr Pro Gln Gly Asp Val245 250 255

Gln Ser Arg Val Ile Pro Ala Gly Asn Leu Tyr Ile Ser Gly Glu Lys260 265 270

Arg Arg Gly Glu Ala Asp Val Ala Glu Gly Ala Glu Ala Ile Met Gln275 280 285

Ala Met Ser Ala Cys Ala Pro Val Arg Asp Ile Arg Gly Glu Pro Gly290 295 300

Thr His Ala Gly Gly Met Leu Glu Arg Val Arg Lys Val Met Ala Ser305 310 315 320

Leu Thr Gly His Glu Met Ser Ala Ile Tyr Ile Gln Asp Leu Leu Ala325 330 335

Val Asp Thr Phe Ile Pro Arg Lys Val Gln Gly Gly Met Ala Gly Glu340 345 350

Cys Ala Met Glu Asn Ala Val Gly Met Ala Ala Met Val Lys Ala Asp355 360 365Arg Leu Gln Met Gln Val Ile Ala Arg Glu Leu Ser Ala Arg Leu Gln370 375 380

Thr Glu Val Val Val Gly Gly Val Glu Ala Asn Met Ala Ile Ala Gly385 390 395 400

Ala Leu Thr Thr Pro Gly Cys Ala Ala Pro Leu Ala Ile Leu Asp Leu405 410 415

Gly Ala Gly Ser Thr Asp Ala Ala Ile Val Asn Ala Glu Gly Gln Ile420 425 430

Thr Ala Val His Leu Ala Gly Ala Gly Asn Met Val Ser Leu Leu Ile435 440 445

Lys Thr Glu Leu Gly Leu Glu Asp Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ile Lys450 455 460

Lys Tyr Pro Leu Ala Lys Val Glu Ser Leu Phe Ser Ile Arg His Glu465 470 475 480

Asn Gly Ala Val Glu Phe Phe Arg Glu Ala Leu Ser Pro Ala Val Phe485 490 495

Ala Lys Val Val Tyr Ile Lys Glu Gly Glu Leu Val Pro Ile Asp Asn500 505 510

Ala Ser Pro Leu Glu Lys Ile Arg Leu Val Arg Arg Gln Ala Lys Glu515 520 525

Lys Val Phe Val Thr Asn Cys Leu Arg Ala Leu Arg Gln Val Ser Pro530 535 540

Gly Gly Ser Ile Arg Asp Ile Ala Phe Val Val Leu Val Gly Gly Ser545 550 555 560

Ser Leu Asp Phe Glu Ile Pro Gln Leu Ile Thr Glu Ala Leu Ser His565 570 575

Tyr Gly Val Val Ala Gly Gln Gly Asn Ile Arg Gly Thr Glu Gly Pro580 585 590

Arg Asn Ala Val Ala Thr Gly Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Asn595 600 605129

<210> 153

<211> 354

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 153

atgtcgcttt caccgccagg cgtacgcctg ttttacgatc cgcgcgggca ccatgccggc 60gccatcaatg agctgtgctg ggggctggag gagcaggggg tcccctgcca gaccataacc 120tatgacggag gcggtgacgc cgctgcgctg ggcgccctgg cggccagaag ctcgcccctg 180cgggtgggta tcgggctcag cgcgtccggc gagatagccc tcactcatgc ccagctgccg 240gcggacgcgc cgctggctac cggacacgtc accgatagcg acgatcaact gcgtacgctc 300ggcgccaacg ccgggcagct ggttaaagtc ctgccgttaa gtgagagaaa ctga 354

<210> 154<211> 117<212> PRT

<213> Klebsiella pneumoniae<400> 154

Met Ser Leu Ser Pro Pro Cly Val Arg Leu Phe Tyr Asp Pro Arg Gly15 10 15

His His Ala Gly Ala Ile Asn Glu Leu Cys Trp Gly Leu Glu Glu Cln20 25 30

Gly Val Pro Cys Gln Thr Ile Thr Tyr Asp Gly Gly Cly Asp Ala Ala35 40 45

Ala Leu Gly Ala Leu Ala Ala Arg Ser Ser Pro Leu Arg Val Gly Ile50 55 60

Gly Leu Ser Ala Ser Gly Glu Ile Ala Leu Thr His Ala Gln Leu Pro65 70 75 80

Ala Asp Ala Pro Leu Ala Thr Gly His Val Thr Asp Ser Asp Asp Gln85 90 95

Leu Arg Thr Leu Gly Ala Asn Ala Gly Gln Leu Val Lys Val Leu Pro100 105 110

Leu Ser Glu Arg Asn115

<210> 155<211> 1125<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Aminoálcool quinase códon otimizada de Erwinia caratovorasubespécie atroseptica

<400> 155atgagcgatg gccgtctgac cgcactgttt cctgcatttc cacatccggc atccaaccag 60ccagtgtttg cggaggcttc cccgcacgac gatgaactga tgacgcaggc ggtgccgcag 120gtttcctgcc agcaagccct ggcaattgcc cagcaggaat atggcctgag cggtcagatg 180agcctgctgc agggcgaacg tgacgttaat ttctgtctga ccgtaacgcc agatgaacgc 240tatatgctga aagtcatcaa cgctgctgaa ccggcagatg tgagcaactt tcagactgcg 300ctgctgctgc acctggcacg tcaggcgcca gaactgccag tccctcgtat ccgctccacg 360aaggctggtc agtctgaaac gggcgtcgaa attgatggtg ttctgctgcg tgtgcgtctg 420gtttcctacc tggctggcat gccgcagtac ctggcgtctc cgagcacggc actgatgcca 480cagctgggcg gtactctggc gcagctggac aacgctctgc actctttcac ccatccggcg 540gctaaccgtg ctctgctgtg ggacatctcc cgcgcagagc aggtccgccc gtacctggac 600ttcgttagcg agccgcagca gtatcagcac ctgcagcgca tctttgatcg ctatgactct 660aacgtggcac cgctgctgac gacgctgcgc cgccaggtta tccacaacga cctgaacccg 720cataacgtcc tggtcgatgg ttccagcccg acgcgcgtca cgggtatcat cgacttcggc 780gatgcagtgt tcgcgccgct gatctgtgag gttgcgaccg ctctggcgta ccaaattggc 840gacggcacgg atctgctgga acatgtggta ccgtttgtcg cagcgtatca ccagcgtatt 900ccgctggcgc cggaggaaat cgccctgctg ccagatctga tcgcgacccg catggcactg 960actctgacca tcgctcagtg gcgtgcgtct cgctacccag ataaccgcga atacctgctg 1020cgcaacgtgc cgcgctgctg gcactccctg cagcgtatcg caacttacag ccacgcacaa 1080tttctgacgc gcctgcagca ggtttgccca gaaaacgctc gttga 1125

<210> 156<211> 1275<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Aminoálcool O-fosfato liase códon otimizada de Erwinia caratovorasubespécie atroseptica

<400> 156

atgactgcaa ctgaagctct gctggcacgt cgtcagcgcg ttctgggcgg tggctaccgt 60

ctgttctacg aagaaccgct gcatgttgca cgcggcgaag gtgtatggct gttcgatcat 120cagggtaaac gttacctgga cgtatataac aacgtagcta gcgtaggtca ctgtcacccg 180gccgttgtag aagcggtcgc gcgtcaatct gcgcaactga acacccatac gcgctacctg 240catcacgcga tcgtagattt tgctgaagat ctgctgtctg agttcccggc agaactgaac 300aacgtcatgc tgacctgtac tggctccgaa gcgaacgacc tggccctgcg cattgcgcgt 360cacgttacgg gtggtaccgg catgctggtg acccgttggg cctaccatgg tgttacgtcc 420gctctggcgg agctgtcccc gtccctgggc gacggcgtag tacgcggttc ccacgtaaag 480ctgatcgatg ctccggatac ctaccgtcag ccgggtgctt tcctgacctc tatccgcgaa 540gcgctggcac agatgcagcg tgaaggtatt cgtccggcgg ctctgctggt tgatactatc 600ttctcctccg acggtgtatt ctgtgcgccg gaaggtgaga tggcccaggc agccgcactg 660atccgtcagg ccggtggcct gttcattgcg gacgaagtgc agccgggctt tggtcgtacc 720ggtgaatccc tgtggggttt cgcacgtcat aacgtggttc cagatctggt ttctctgggc 780aaaccgatgg gtaacggcca tccgattgct ggtctggtag gtcgctccgc actgttcgac 840gcttttggtc gtgatgttcg ctactttaat actttcggcg gtaacccagt atcctgccag 900gcggcacatg ctgttctgcg cgttatccgt gaagaacagc tgcagcagaa cgcgcagcgt 960gttggtgatt atctgcgcca aggtctgcag cagctggcac aacacttccc gctgatcggt 1020gacattcgtg catatggtct gtttatcggt gctgaactgg tttccgaccg tgaatccaaa 1080accccagcga gcgagtctgc actgcaggtt gttaacgcga tgcgtcagcg tggtgtactg 1140atctccgcaa ccggcccggc ggcgaacatt ctgaagatcc gtcctccgct ggtattcctg 1200gaggaacacg cggacgtgtt cctgactacc ctgtccgacg tgctggcgct gatcggtact 1260cgtgcacagc gttaa 1275

<210> 157<211> 77<212> DNA<213> Seqüência artificial <220><223> Iniciador <400> 157caggaggaat taaccatggg gggttctcat catcatcatc atcatggtga cgatgacgat 60

aagatgagcg atggccg 77

<210> 158<211> 77<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador<400> 158

cggccatcgc tcatcttatc gtcatcgtcaatggttaatt cctcctg

<210> 159

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 159

ggacctgctt cgctttatcg

<210> 160

<211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 160gctagagatg atagc

<210> 161

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 161ggaagagact atccagcg

<210> 162

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 162

gcgcgcccgg gaagaaggag ctcttcacca

ccatgatgat gatgatgatg agaacccccc

tgaacaaacc acagtcttgg

<210> 163<211> 28<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 163

gcgcgcccgg gttcatgcca cctctgcg 28

<210> 164

<211> 2432

<212> DNA

<213> Erwinia caratovora subsp. atroseptica

<400> 164

atgtctgacg gacgactcac cgcacttttt cctgcattcc cacacccggc gtccaatcag 60cccgtatttg ccgaggcttc accgcacgac gacgagttaa tgacgcaggc cgtaccgcag 120gtttcctgtc agcaggcgtt ggcgattgcg cagcaagaat atggcttgtc tgggcagatg 180tcgctgcttc agggcgagcg tgatgtgaat ttctgtctga cggtgacgcc agatgaacgc 240tacatgctga aagtcatcaa tgcggcagaa cctgccgacg tcagcaattt ccaaaccgcg 300ctgctgctgc atcttgcccg tcaggcacct gaactgcccg taccgcgtat caggtcgaca 360aaagcgggtc agtcggaaac aggcgttgag atcgatggtg tactgctgcg tgtgcggctt 420gtgagctatc tggcaggaat gccgcagtat ctggcctcac cgtcaacggc gctgatgccg 480cagttggggg gaacgctggc gcagttggat aacgcgcttc acagctttac gcatccggcg 540gcaaaccgtg cgctgctgtg ggatatcagc cgggcagagc aggtgcgtcc ttacctcgat 600ttcgtttctg aaccgcagca gtatcagcat cttcagcgta tttttgaccg ttatgacagt 660aacgttgctc ctctgttgac gacgctacgt cgtcaggtca ttcataacga tctgaatccg 720cataacgtgc tggtggatgg atcgtcgccg acgcgggtta ctggcattat cgattttggc 780gatgccgtat ttgccccgtt aatttgcgaa gtcgcgacgg cactggcgta tcagatcggc 840gatggaaccg atttgttgga gcatgttgtg ccgtttgttg cggcctatca ccaacgcatt 900ccgttagcac cggaggagat tgcgctgtta cccgatctga tagcgacccg tatggcgctg 960accctgacca ttgcgcagtg gcgagcatcg cgttatcccg acaatcggga gtatctgctg 1020cgtaacgtgc cgcgctgttg gcacagtttg cagcgcattg cgacctattc ccatgcgcaa 1080tttttgactc gcctacagca ggtttgcccg gagaatgcgc gatgaaccag aaaggaatga 1140cgtctatgac gtctgaaatg acagcgacag aagctttgct ggcgcgccgt cagcgagtgt 1200tgggcggcgg ttatcgcctg ttttatgaag agccgctgca tgtcgcgcgc ggcgagggcg 1260tgtggctgtt cgatcaccaa gggaaacgtt atctggatgt ctacaataat gtggcttcgg 1320tcggacattg ccaccccgcg gtggttgaag ccgtggcgcg acagagcgca caactcaata 1380s3g

cccacacgcg ctatttgcac cacgcgattg tcgattttgc ggaagatttg ctgagcgaat 1440ttcccgccga attgaacaat gtaatgctga cctgtaccgg cagtgaggct aacgatctgg 1500cgctgcgtat cgcccgacat gtcacgggcg ggacggggat gttggtgacg cgctgggcgt 1560atcacggcgt gaccagcgcg ctggcggaac tgtctccgtc gctgggggat ggcgttgtgc 1620gcggtagcca tgtgaagctg atcgacgcgc cagacactta tcgtcagccc ggtgcatttc 1680ttaccagcat tcgtgaagcg ctggcgcaga tgcaacggga aggtattcgt cctgcggcgc 1740tgctggtaga taccattttt tccagcgatg gcgtgttctg tgcgccggaa ggcgaaatgg 1800cacaggcggc ggcgttgatc cgtcaggcgg gcgggctgtt tattgcggat gaagtgcagc 1860cgggcttcgg gcgcaccggg gaatcactgt ggggctttgc gcgccacaat gtcgtccctg 1920atttggtgag tctagggaaa ccgatgggca acggacatcc catcgctgga ttggtggggc 1980gttccgctct gttcgacgca tttgggcgcg atgtgcgcta tttcaatacc tttggcggca 2040atccggtttc ctgtcaggcg gcgcacgcgg tgctgcgggt gattcgggaa gagcagttgc 2100agcagaatgc ccagcgggtc ggtgattatc tgcggcaagg gttgcagcaa ctggcgcagc 2160atttcccgct gattggtgat attcgggctt acggcctgtt tattggtgcg gagctggtca 2220gcgatcgcga aagtaaaacg ccggcaagtg aatccgcgtt gcaggtggtg aatgcgatgc 2280gccaacgtgg tgtgctcatc agcgcgacgg ggccagcggc gaacatactg aaaattcgcc 2340cgccgctggt gtttctggaa gaacacgccg atgtgttctt aaccacgctg agtgacgttt 2400tagcgctcat cggcactcgt gcacagagat aa 2432

Claims

1. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA RECOMBINANTE,caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de DNAque codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão deproduto selecionada do grupo consistindo em:i) piruvato para alfa-acetolactato;ii) alfa-acetolactato para acetoína;iii) acetoína para 3-amino-2-butanol;iv) 3-amino-2-butanol para fosfato de 3-amino-2-butanol;v) fosfato de 3-amino-2-butanol para 2-butanona; evi) 2-butanona para 2-butanol;sendo que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga à dita célulahospedeira microbiana e sendo que a dita célula hospedeira microbianaproduz 2-butanol.

2. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA RECOMBINANTE,caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de DNAque codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão deproduto selecionada do grupo consistindo em:i) piruvato para alfa-acetolactato;ii) alfa-acetolactato para acetoína;iii) acetoína para 3-amino-2-butanol;iv) 3-amino-2-butanol para fosfato de 3-amino-2-butanol; ev) fosfato de 3-amino-2-butanol para 2-butanona;sendo que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga à dita célulahospedeira microbiana e sendo que a dita célula hospedeira microbiana produz-2-butanona.

3. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com as reivindicações 1ou 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substratopara a conversão de produto de piruvato em alfa-acetolactato é acetolactatosintase.

4. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com as reivindicações-1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa umsubstrato para a conversão de produto de alfa-acetolactato em acetoína éacetolactato descarboxilase.

5. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com as reivindicações 1ou 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substratopara a conversão de produto de acetoína em 3-amino-2-butanol é acetoínaaminase.

6. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com as reivindicações-1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substratopara a conversão de produto de 3-amino-2-butanol em fosfato de 3-amino-2-butanol é aminobutanol quinase.

7. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com as reivindicações-1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substratopara a conversão de produto de fosfato de 3-amino-2-butanol em 2-butanona éaminobutanol fosfato fosfoliase.

8. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para aconversão de produto de 2-butanona em 2-butanol é butanol desidrogenase.

9. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com as reivindicações 1ou 2, caracterizada pelo fato de que a célula é selecionada do grupo consistindoem: uma bactéria, uma cianobactéria, um fungo filamentoso e uma levedura.

10. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a célula é um membro de um gênero selecionadodo grupo consistindo em C Iostridium , Zymomonas, Escherichia, Salmonella,Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus,Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium,Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula e Saccharomyces.

11. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que a acetolactato sintase tem uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com uma seqüência deaminoácidos selecionada do grupo SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 77e SEQ ID n° 79com base no método de alinhamento Clustal W usando os parâmetrospredeterminados de GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,1 e sériesde matriz de peso de proteína Gonnet 250.

12. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a acetolactato descarboxilase tem umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID n° 2,SEQ ID n° 81, e SEQ ID n° 83 com base no método de alinhamento Clustal W usando os parâmetros predeterminados de GAP PENALTY=10, GAP LENGTHPENALTY=O, 1 e séries de matriz de peso de proteína Gonnet 250.

13. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que a acetoína aminase tem uma seqüência deaminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com uma seqüência deaminoácidos como estabelecida na SEQ ID n° 122, com base no método dealinhamento Clustal W usando os parâmetros predeterminados de GAPPENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,1 e séries de matriz de peso deproteína Gonnet 250.

14. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a aminobutanol quinase tem uma seqüência deaminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com uma seqüência deaminoácidos como estabelecida na SEQ ID n° 124, com base no método dealinhamento Clustal W usando os parâmetros predeterminados de GAPPENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,1 e séries de matriz de peso deproteína Gonnet 250.

15. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a aminobutanol fosfato fosfoliase tem umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com umaseqüência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID n° 126, com baseno método de alinhamento Clustal W usando os parâmetros predeterminadosde GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,1 e séries de matriz depeso de proteína Gonnet 250.

16. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a butanol desidrogenase tem uma seqüência deaminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com uma seqüência deaminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID n° 14, SEQ ID n°-72, SEQ ID n° 75 e SEQ ID n° 91, com base no método de alinhamento ClustalW usando os parâmetros predeterminados de GAP PENALTY=10, GAPLENGTH PENALTY=0,1 e séries de matriz de peso de proteína Gonnet 250.

17. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE 2-BUTANOL,caracterizado pelo fato de que compreende:-1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinanteque compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica umpolipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produtoselecionada do grupo consistindo em:i) piruvato para alfa-acetolactato;ii) alfa-acetolactato para acetoína;iii) acetoína para 3-amino-2-butanol;iv) 3-amino-2-butanol para fosfato de 3-amino-2-butanol;v) fosfato de 3-amino-2-butanol para 2-butanona; evi) 2-butanona para 2-butanol;sendo que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga à dita célulahospedeira microbiana; e-2) colocar a célula hospedeira de (1) em contato com umsubstrato de carbono fermentável em um meio de fermentação nas condiçõesem que é produzido 2-butanol.

18. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE 2-BUTANONA,caracterizado pelo fato de que compreende:-1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinanteque compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um10 polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produtoselecionada do grupo consistindo em:i) piruvato para alfa-acetolactato;ii) alfa-acetolactato para acetoína;iii) acetoína para 3-amino-2-butanol;iv) 3-amino-2-butanol para fosfato de 3-amino-2-butanol; ev) fosfato de 3-amino-2-butanol para 2-butanona;sendo que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga à dita célulahospedeira microbiana; e-2) colocar a célula hospedeira de (1) em contato com umsubstrato de carbono fermentável em um meio de fermentação nas condiçõesem que 2-butanona é produzida.

19. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que o substrato de carbono fermentável é selecionadodo grupo que consiste em monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.

20. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para aconversão de produto de piruvato em alfa-acetolactato é acetolactato sintase.

21. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato paraa conversão de produto de alfa-acetolactato em acetoína é acetolactatodescarboxilase.

22. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para aconversão de produto de acetoína em 3-amino-2-butanol é acetoína aminase.

23. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato paraa conversão de produto de 3-amino-2-butanol em fosfato de 3-amino-2-butanol é aminobutanol quinase.

24. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para aconversão de produto de fosfato de 3-amino-2-butanol em 2-butanona éaminobutanol fosfato fosfoliase.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para aconversão de produto de 2-butanona em 2-butanol é butanol desidrogenase.

26. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que a célula é selecionada do grupo que consisteem: uma bactéria, uma cianobactéria, um fungo filamentoso e uma levedura.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que a célula é um membro de um gênero selecionado do grupoconsistindo em Clostridium , Zymomonas, Escherichia, Salmonella,Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus,Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter,Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula eSaccharomyces.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a acetolactato sintase tem uma seqüência deaminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com uma seqüência deaminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 77e SEQ ID n° 79 com base no método de alinhamento Clustal W usando osparâmetros predeterminados de GAP PENALTY=10, GAP LENGTHPENALTY=0,1 e séries de matriz de peso de proteína Gonnet 250.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que a acetolactato descarboxilase tem umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID n° 2,SEQ ID n° 81 e SEQ ID n° 83 com base no método de alinhamento Clustal Wusando os parâmetros predeterminados de GAP PENALTY=10, GAP LENGTHPENALTY=0,1 e séries de matriz de peso de proteína Gonnet 250.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que a acetoína aminase tem uma seqüência de aminoácidos quetem pelo menos 95% de identidade com uma seqüência de aminoácidos comoestabelecida na SEQ ID n° 122, com base no método de alinhamento Clustal Wusando os parâmetros predeterminados de GAP PENALTY=10, GAP LENGTHPENALTY=0,1 e séries de matriz de peso de proteína Gonnet 250.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que a aminobutanol quinase tem uma seqüência de aminoácidosque tem pelo menos 95% de identidade com uma seqüência de aminoácidoscomo estabelecida na SEQ ID n° 124, com base no método de alinhamentoClustal W usando os parâmetros predeterminados de GAP PENALTY=10, GAPLENGTH PENALTy=O, 1 e séries de matriz de peso de proteína Gonnet 250.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que a aminobutanol fosfato fosfoliase tem umaseqüência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade com umaseqüência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID n° 126, com baseno método de alinhamento Clustal W usando os parâmetros predeterminadosde GAP PENALTY= 10, GAP LENGTH PENALTY=0,1 e séries de matriz depeso de proteína Gonnet 250.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que a butanol desidrogenase tem uma seqüência deaminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade com uma seqüência deaminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID n° 14, SEQ ID n°-72, SEQ ID n° 75 e SEQ ID n° 91, com base no método de alinhamento ClustalW usando os parâmetros predeterminados de GAP PENALTY=10, GAPLENGTH PENALTy=O, 1 e séries de matriz de peso de proteína Gonnet 250.

34. 2-BUTANOL, caracterizado pelo fato de que contém ummeio de fermentação de produto, produzido pelo método conforme descrito nareivindicação 17.

35. 2-BUTANONA, caracterizada pelo fato de que contém ummeio de fermentação de produto, produzido pelo método conforme descrito nareivindicação 18.