MX2008013881A - Produccion de alcoholes de cuatro carbonos por fermentacion. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos para la producción por fermentación de alcoholes de cuatro carbonos. Específicamente el butanol, preferentemente el 2-butanol es producido por el crecimiento por fermentación de una bacteria recombinante que expresa una ruta biosintética de 2-butanol. Los microorganismos y métodos recombinantes de la invención también pueden estar adaptados para producir 2-butanona, un compuesto intermedio en las rutas biosintéticas de 2-butanol descritas aquí.

Description

PRODUCCION DE ALCOHOLES DE CUATRO CARBONOS POR FERMENTACION CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo de la microbiología industrial y a la producción de alcoholes. Más específicamente, el 2-butanol es producido por medio de fermentación industrial de un microorganismo recombinante . Los microorganismos recombinantes y los métodos de la invención también pueden ser adaptados para producir 2-butanona, un compuesto intermedio en las rutas biosintét icas del 2-butanol descritas aquí. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El butanol es una substancia química industrial importante, útil como un aditivo de combustible, como una substancia química de alimentación en la industria de los plásticos, como un agente de extracción de grado alimenticio en la industria de los alimentos y de los sabores. Cada año, 4,540 a 5,448 millones de kilogramos (10,000 a 12,000 millones de libras) de butanol son producidas por medios petroquímicos y la necesidad de que esta substancia química básica probablemente se incrementará. La 2-butanona, también referida como la metil etil cetona (MEK, por sus siglas en inglés) , es un solvente utilizado ampliamente y es la cetona producida comercialmente más importante, después de la acetona. La misma es utilizada como un solvente para pinturas, resinas y adhesivos, así como un agente de Ref .196273 extracción selectivo y un activador de las reacciones de oxidación . Los métodos para la síntesis química de la 2-butanona ya son conocidos, tales como por la deshidrogenación del 2-butanol o en un proceso en donde el butano líquido es oxidado de manera catalítica proporcionando la 2-butanona y ácido acético {Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, sexta edición, 2003, Wiley-VHCVerlag GmbH and Co. Weinheim, Alemania, Vol. 5, pp. 727-732) . La 2-butanona también puede ser convertida químicamente al 2-butanol por hidrogenación (Breen et al., J. , o Catalysis 236: 270-281 (2005) ) . Los métodos para la síntesis química de 2-butanol ya son conocidos, tales como la hidratación del n-buteno {Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, sexta edición, 2003, Wiley-VHCVerlag GmbH y Co. Weinheim, Alemania, Vol. 5, pp. 716-719) . Estos procesos utilizan las materias primas derivadas de substancias petroquímicas y generalmente son costosos, y no son favorables para el medio ambiente. La producción de 2-butanona y 2-butanol a partir de las materias primas derivadas de las plantas podrían minimizar las emisiones del gas de invernadero y podría representar un avance en el arte. Los métodos para producir 2-butanol por la biotransformación de otras substancias químicas orgánicas también son conocidos. Por ejemplo, Stampfer et al (WO. 03/078615) describe la producción de alcoholes secundarios, tales como 2-butanol, por la reducción de las cetonas que es catalizada por una enzima de la alcohol deshidrogenase obtenida de Rhodococcus ruber. De manera semejante, Kojima et al. (EP 0645453) describe un método para la preparación de alcoholes secundarios, tales como 2-butanol, por la reducción de las cetonas que es catalizada por una enzima de alcohol deshidrogenasa secundaria obtenida de Candida parapsilosis . Adicionalmente, Kuehnle et al. (EP 1149918) describe un proceso que produce tanto el 1-butanol y el 2-butanol por la oxidación de los hidrocarburos por ¦ varias cepas de Rhodococcus ruber. El proceso favoreció la producción de 1-butanol con una selectividad de 93.8 %. La producción de 2-butanol por ciertas cepas de Lactobacilli también es conocida (Speranza et . al, J. Agrie. Food. Chem. (1997) 45:3 76-3480) . El 2-butanol es producido por la transformación de meso-2 , 3-butandiol . La producción de 2-butanol a partir de acetolactato y acetoina por estas cepas de Lactobacilli también fue demostrada. Sin embargo, no han existido reportes de un microorganismo recombinante diseñado para producir el 2-butanol. Por lo tanto, existe una necesidad de un proceso efectivo en cuanto al costo, responsable con el medio ambiente, para la producción de 2-butanol y 2-butanona. La presente invención resuelve esta necesidad por medio del descubrimiento de elementos hospederos para la producción de microbios recombinantes que expresan rutas biosintéticas para el 2-butanol y la 2-butanona. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta biosintética diseñada para el 2-butanol. También se proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta biosintética diseñada para la 2-butanona, que es la misma que la ruta biosintética para el 2-butanol con la omisión de la última etapa. Los microorganismos diseñados pueden ser utilizados para la producción comercial de 2-butanol o 2-butanona. En consecuencia, la invención proporciona una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir una conversión, seleccionado del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato ; ii) alfa-acetolactato a la acetoína; iü) acetoina al 3-amino-2-butanol ; iv) 3-amino-2-butanol al fosfato de 3-amino-2-butanol ; v) fosfato de 3-amino-2-butanol a la 2-butanona; y vi) 2-butanona al 2-butanol; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana y en donde la célula hospedera microbiana produce 2-butanol. De manera semejante, la invención proporciona una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir la conversión, seleccionado del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato ; ii) alfa-acetolactato a acetoina; iü) acetoina al 3-amino-2-butanol ; iv) 3-amino-2-butanol al fosfato de 3-amino-2-butanol; y v) fosfato de 3-amino-2-butanol a la 2-butanona; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana y en donde la célula hospedera microbiana produce 2-butanona. En otra modalidad, la invención proporciona un método para la producción de 2-butanol, que comprende: 1) proporcionar una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir la conversión seleccionada del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iii) acetoína al 3-amino-2-butanol ; iv) 3-amino-2-butanol al fosfato de 3-amino-2-butanol ; v) fosfato de 3-amino-2-butanol a la 2-butanona; y vi) 2-butanona al 2-butanol; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana; y 2) poner en contacto la célula hospedera de (1) con un substrato de carbón fermentable en un medio de fermentación bajo condiciones por las cuales el 2-butanol es producido . De manera semejante, la invención proporciona un método para la producción de 2-butanona que comprende: 1) proporcionar una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir la conversión seleccionada del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a la acetoína; iii) acetoína al 3-amino-2-butanol ; iv) 3-amino-2-butanol al fosfato de 3-amino-2-butanol; y v) fosfato de 3-amino-2-butanol a 2-butanona; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana; y 2 ) poner en contacto la célula hospedera de ( 1 ) con un substrato de carbón fermentable en un medio de fermentación bajo condiciones por las cuales se produzca la 2-butanona. En otra modalidad la invención proporciona un 2 -butanol o la 2-butanona que contiene el medio del producto de fermentación producido por los métodos de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA La invención puede ser entendida de manera más completa a partir de la siguiente descripción detallada, la figura 1 , y las descripciones de las secuencias que se anexan, que forman una parte de esta solicitud. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La figura 1 muestra cuatro diferentes rutas para la biosíntesis de 2-butanona y 2-butanol. Las siguientes secuencias están de acuerdo con 37 C.F.R. 1 . 821 - 1 . 825 ("Requerimientos para las Solicitudes de Patente que Contienen Secuencias de Nucleótidos y/o Descripciones de Secuencias de Aminoácidos - las Reglas de la Secuencia") y son consistentes con el estándar ST. 25 de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (OMPI) y los requerimientos del listado de las secuencias de la EPO y del PCT (Reglas 5 . 2 y 49 . 5 (a-bis) , y la Sección 208 y el Anexo C de las Instrucciones Administrativas) . Los símbolos y el formato utilizado para la secuencia de nucleótidos y aminoácidos cumplen con las reglas descritas en 37 C.F.R. § 1.822. Tabla 1 Breve descripción de los números de SEC ID de los ácidos nucleicos y proteínas Descripción SEC ID del ácido SEC ID de la nucleico proteína budA, acetolactato descarboxilasa de Klebsiella 1 2 pneumoniae ATCC 25955 alsD, acetolactato descarboxilasa de Bacillus subtilis 80 81 BudA, acetolactato descarboxilasa de Klebsiella terrigena 82 83 budB, acetolactato sintasa de Klebsiella pneumoniae 3 4 ATCC 25955 alsS, acetolactato sintasa de Bacillus subtilis 76 77 budB, acetolactato sintasa de Klebsiella terrigena 78 79 BudC, butandiol deshidrogenasa de Klebsiella 5 6 pneumoniae LAMI 063 • butandiol deshidrogenasa de Bacillus cereus 84 85 butandiol deshidrogenasa de bacillus cereus 86 87 butB, butandiol deshidrogenasa de Lactococcus lactis 88 89 pddA, butandiol deshidratasa, subunidad alfa de 7 8 Klebsiella oxytoca ATCC 8724 pddB, unidad beta de la butandiol deshidratasa de 9 10 Klebsiella oxytoca ATCC 8724 pddC, subunidad gamma de la butandiol deshidratasa de 1 1 12 Klebsiella oxytoca ATCC 8724 Descripción SEC ID del ácido SEC ID de la nucleico proteína pd C, subunidad grande de la diol deshidratasa 92 93 dependiente de B 12 de Salmonella typhimurium pduD, subunidad intermedia de la diol deshidratasa 94 95 dependiente de B 12 de Salmonella typhimurium pduE, subunidad pequeña de la diol deshidratasa 96 97 dependiente de B 12 de la Salmonella typhimurium pduC, subunidad grande de la diol deshidratasa 98 99 dependiente de B 12 de Lactobaccillus collinoides pduD, subunidad intermedia de la diol deshidratasa 100 101 dependiente de B 12 del Lactobaccillus collinoides pduE, subunidad pequeña de la diol deshidratasa 102 103 dependiente de B 12 de Lactobaccillus collinoides pddC, subunidad alfa de la diol deshidratasa dependiente 104 105 de adenosilcobalamina de Kliebsiella pneumoniae pddD, subunidad beta de la diol deshidratasa dependiente 106 107 de adenosilcobalamina de Klebsiella pneumoniae pddD, subunidad gamma de la diol deshidratasa 108 109 dependiente de adenosilcobalamina de Kliebsiella pneumoniae ddrA, subunidad grande del factor de reactivación de la 1 10 1 1 1 diol deshidratasa de Kliebsiella oxytoca ddrB, subunidad pequeña del factor de reactivación de la 1 12 1 13 diol deshidratasa de Kliebsiella oxytoca pduG, subunidad grande del factor de reactivación de la 1 14 1 15 diol deshidratasa de Salmonella typhimurium pduH, subunidad pequeña del factor de reactivación de la 1 16 1 17 diol deshidratasa de Salmonella typhimurium Descripción SEC ID del ácido SEC ID de la nucleico proteína pduG, subunidad grande del factor de reactivación de la 1 18 1 19 diol deshidratasa de Lactobaccillus collinoides pduH, subunidad pequeña del factor de reactivación de la 120 121 diol deshidratasa de Lactobaccillus collinoides sadH, butanol deshidrogenasa de Rhodococcus ruber 219 13 14 adhA, butanol deshidrogenasa de Pyrococcus furiosus 90 91 chnA, ciclohexanol deshidrogenasa de Acinteobacter sp. 71 72 yqhD, butanol deshidrogenasa de Escherichia coli 74 75 amina: piruvato transaminasa de Vibrio fluvialis (una 144 codon opc. 122 acetoína aminasa) aminobutanol cinasa de Erwinia carotovora subesp. 123 124 atroseptica Amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora 125 126 subesp. atroseptica budC, acetoína reductasa (butandiol deshidrogenasa) de 133 134 Klebsiella terrigena (ahora Raoultella terrigená) Subunidad alfa de la glicerol deshidratasa de Klebsiella 145 146 pneumoniae Subunidad beta de la glicerol deshidratasa de Klebsiella 147 148 pneumoniae Subunidad gamma de la glicerol deshidratasa de 149 150 Klebsiella pneumoniae Subunidad grande de la glicerol deshidratasa reactivasa 151 152 de Klebsiella pneumoniae Subunidad pequeña de la glicerol deshidratasa reactivasa 153 154 de Klebsiella pneumoniae SEC ID NOs: 15-65 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores de clonación, selección, y secuenciación, de la PCR del oligonucleótido , utilizados en los ejemplos. SEC ID NO: 66 es la secuencia de nucleótidos de la región delecionada del gel yqhD en la cepa G1655 AyqhCD de E. coli, descrito en el ejemplo 11. La SEC ID NO: 67 es la secuencia de nucleótidos de una variante del promotor de glucosa isomerasa i.6GI. SEC ID NO: 68 es la secuencia de nucleótidos del promotor 1.5GI . La SEC ID NO: 69 es la secuencia de nucleótidos del operón de la diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca . La SEC ID NO: 70 es la secuencia de nucleótidos del operón del factor de reactivación de la diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca. La SEC ID NO: 73 es la secuencia de nucleótidos de pDCQ2, que es descrita en el ejemplo 9. Las SEC ID NOs: 127-132 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores de clonación y de PCR de oligonucleótidos , adicionales, utilizados en los ejemplos. La SEC ID NO: 155 es una región de codificación optimizada para la amino alcohol cinasa de Erwinia carotovora subesp. atroseptica. La SEC ID NO: 156 es una región de codificación optimizada por el codón para la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora subesp. atroseptica. Las SEC ID NOs: 157-163 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores de clonación y de PCR de oligonucleótidos , adicionales, utilizados en los ejemplos. La SEC ID NO: 164 es la secuencia de nucleótidos de un operón de Erwinia carotovora subesp. atroseptica. Tabla 2 Subunidades grande, media y pequeña de la glicerol y diol deshidratasa, adicionales aDescripción bsubunidad SEC ID de la proteína Subunidades correspondientes del mismo organismo" Subunidad alfa de la glicerol deshidratasa de Clostridium L 135 pasteurianum Subunidad beta de la glicerol deshidratasa de Clostridium M 136 pasteurianum Subunidad de gamma de la glicerol deshidratasa de S 137 Clostridium pasteurianum Subunidad alfa de glicerol deshidratasa de Escherichia L 138 blattae Subunidad beta de glicerol deshidratasa de Escherichia M 139 blattae Subunidad gamma de glicerol deshidratasa de S 140 Escherichia blattae Subunidad alfa de glicerol deshidratasa de Citrobacter L 141 freundii Subunidad beta de glicerol deshidratasa de Citrobacter M 142 freundii Subunidad gamma de glicerol deshidratasa de S 143 Citrobacter freundii aDescripción : de la anotación del Genbank de la secuencia y no puede ser corregida incluyendo la designación del glicerol o del diol, o no puede incluir la información de la subunidad. bSubunidad: identificada por la homología de la secuencia con respecto a la subunidad grande, media o pequeña de la enzima Kliebsiella oxytoca. cLas subunidades son listadas conjuntamente que son del mismo organismo y tienen anotaciones como la misma enzima, o tienen los números de Genbank cercanos estrechamente indicando la proximidad en el genoma . La presente invención se refiere a los métodos para la producción de 2-butanol utilizando microorganismos recombinantes . La presente invención satisface un número de necesidades comerciales e industriales. El butanol es una substancia química básica industrial importante, con una variedad de aplicaciones, en donde su potencial como un combustible o como un aditivo para combustible es particularmente significativo. Aunque es solamente un alcohol de cuatro carbonos, el butanol tiene un contenido de energía semejante a aquel de la gasolina y puede ser mezclado con cualquier combustible fósil. El butanol es favorecido como un combustible o aditivo para combustible que solamente produce C02 y poco o nada de SOx o NOx cuando es quemado en un motor de combustión interna estándar. Adicionalmente , el butanol es menos corrosivo que el etanol, el aditivo para combustible más preferido hasta la fecha. Además de su utilidad como un biocombustible o un aditivo para combustible, el butanol tiene el potencial de tener un impacto sobre los problemas de distribución de hidrógeno en la industria de las celdas de combustible que está en crecimiento. Las celdas de combustible todavía están afectadas por asuntos de seguridad asociados con el transporte y distribución de hidrógeno. El butanol puede ser reformado fácilmente por su contenido de hidrógeno y puede ser distribuido a través de las estaciones de gas existentes con la pureza requerida para ya sea las celdas de combustible o los motores de combustión en los vehículos. Finalmente, la presente invención produce 2-butanol a partir de fuentes de carbono derivadas de las plantas, evitando el impacto negativo sobre el medio ambiente asociado con los procesos petroquímicos estándares para la producción de butanol . La presente invención también proporciona microorganismos recombinantes y métodos para la producción de 2-butanona, un compuesto intermedio en las rutas biosintét icas de 2-butanol descritas aquí. La 2-butanona, también conocida como metil etil cetona (MEK) , es útil como un solvente en las pinturas y otros recubrimientos. La misma también es utilizada en la industria del caucho sintético y en la producción de cera de parafina. Las siguientes definiciones y abreviaturas son para que sean utilizadas para la interpretación de las reivindicaciones y especificación. El término "invención" o "presente invención" como se utilizan aquí, es un término no limitante y no está propuesto para referirse a ninguna modalidad única de la invención particular sino que abarca todas las modalidades posibles como se describen en la especificación y las reivindicaciones . El término "ruta biosintética para el 2-butanol" se refiere a las rutas de la enzima para producir el 2-butanol a partir del piruvato. El término "ruta biosintética para la 2-butanona" se refiere a las rutas de la enzima para producir la 2-butanona a partir del piruvato. El término "acetolactato sintasa", también conocido como "acetohidroxi ácido sintasa", se refiere a un polipéptido (o polipépt idos ) que tiene una actividad de la enzima que cataliza la conversión de dos moléculas de ácido pirúvico hasta una molécula de alfa-acetolactato . La acetatolactato sintasa, conocida como EC 2.2.1.6 [anteriormente 4.1.3.18] [Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego) puede ser dependiente del cofactor de pirofosfato de tiamina para su actividad. Las enzimas de acetolactato sintasa adecuadas están disponibles de un número de fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis [GenBank Nos: AAA22222 NCBI (National Center for Biotechnology Information) secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 77), la secuencia de nucleótidos de L04470 NCBI (SEC ID NO: 76)], Klebsiella terrigena [GenBank Nos: AAA25055 (SEC ID NO: 79), L04507 (SEC ID NO: 78)], y Klebsiella pneumoniae GenBank Nos: AAA25079 (SEC ID NO: 4), M73842 (SEC ID NO: 3)] . El término "acetolactato descarboxilasa" se refiere a un polipéptido (o polipépt idos ) que tienen actividad de la enzima, que catalizan la conversión de alfa-acetolactato a la acetoina. Las acetolactatos descarboxilasas son conocidas como EC 4.1.1.5 y están disponibles, por ejemplo de Bacillus subtilis [GenBank Nos: AAA22223 (SEC ID NO: 81), L04470 (SEC ID NO: 80) ], Kliebsiella terrigena (GenBank Nos: AAA25054 (SEC ID NO: 83), L04507 (SEC ID NO: 82)] y Klebsiella pneumoniae [GenBank Nos: AAU43774 (SEC ID NO: 2), AY722056 (SEC ID NO: 1) ] . El término "acetoina aminasa" o "acetoina transaminasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tienen una actividad de la enzima que cataliza la conversión de acetoina a 3-amino-2-butanol . La acetoina aminasa puede utilizar el cofactor de 5' -fosfato de piridoxal o NADH (dinucleótido de nicotinamida adenina reducida) o NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducida) . El producto resultante puede tener la estereoquímica (R) o (S) en la posición 3. La enzima dependiente del fosfato de piridoxal puede utilizar un aminoácido tal como la alanina o glutamato como el donador de amino. Las enzimas dependientes de NADH y de NADPH pueden utilizar el amoníaco como un segundo substrato. Un ejemplo adecuado de una acetoína aminasa dependiente de NADH, también conocida como la amino alcohol deshidrogenasa, se describe por Ito et al. (patente U.S. No. 6,432,688). Un ejemplo de una acetoína aminasa dependiente del piridoxal es la amina : piruvato aminotransferasa (también llamada amina : piruvato transaminasa ) descrita por Shin y Kim (J. Org. Chem. 67: 2848-2853 (2002) ) . El término "butanol deshidrogenasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tiene una actividad de la enzima que cataliza la interconversión de 2-butanona y 2-butanol. Las butanol deshidrogenasas son un subconjunto de una familia amplia de alcohol deshidrogenasas. La butanol deshidrogenasa puede ser dependiente de NAD o NADP. Las enzimas dependientes de NAD son conocidas como EC 1.1.1.1 y están disponibles por ejemplo, de Rhodococcus ruber [GenBank Nos: CAD36475 (SEC ID NO: 14), AJA91307 (SEC ID NO: 13)]. Las enzimas dependientes de NADP son conocidas como EC 1.1.1.2 y están disponibles, por ejemplo, de Pyrococcus furiosus [GenBank Nos: AAC25556 (SEC ID NO: 91), AF013169 (SEC ID NO: 90)]. Adicionalraente , una butanol deshidrogenasa está disponible de Escherichia coli [GenBank Nos: NP_417484 (SEC ID NO: 75), NC_000913 (SEC ID NO:74)] y una ciclohexanol deshidrogenasa está disponible de Acinetobacter sp. [GenBank Nos: AAG10026 (SEC ID NO: 72), AF282240 (SEC ID NO: 71)]. El término "acetoína cinasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tienen una actividad de la enzima que cataliza la conversión de acetoina a fosfoacetoina . La acetoina cinasa puede utilizar la ATP (trifosfato de adenosina) o el fosfoenolpiruvato como el donador de fosfato en la reacción. Aunque no existen reportes de enzimas que catalicen esta reacción sobre la acetoina, existen enzimas que catalizan la reacción análoga sobre el substrato de hidroxiacetona semejante, por ejemplo, las enzimas conocidas como EC 2.7.1.29 (Garcia-Alles et al. (2004) Biochemistry 43:13037-13046). El término "acetoina fosfato aminasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tienen una actividad de enzima que cataliza la conversión de fosfoacetoina hasta el O-fosfato de 3-amino-2-butanol . La acetoina fosfato aminasa puede utilizar el cofactor de 5' -fosfato de piridoxal, NADH o NADPH. El producto resultante puede tener la estereoquímica (R) o (S) en la posición 3. La enzima dependiente del fosfato de piridoxal puede utilizar un aminoácido tal como la alanina o glutamato. Las enzimas dependientes de NADH y de NADPH pueden utilizar el amoniaco como un segundo substrato. Aunque no existen reportes de enzimas que catalizan esta reacción sobre la fosfoacetoina , existe una enzima dependiente del fosfato de piridoxal que está propuesta para llevar a cabo una reacción análoga sobre el substrato de fosfato de serinol semejante (Yasuta et al. (2001) Appl . Environ. Microbiol. 67: 4999-5009) . El término "aminobutanol fosfato fosfo-liasa" también llamada "amino alcohol 0-fosfato liasa", se refiere a un polipéptido (o polipépt idos ) que tienen una actividad en la enzima que cataliza la conversión del O-fosfato de 3-amino-2-butanol a 2-butanona. La aminobutanol fosfato fosfo-liasa puede utilizar el cofactor de 5' -fosfato de piridoxal. No existen reportes previos de enzimas que catalicen esta reacción sobre el fosfato de aminobutanol, aunque existen reportes de enzimas que catalizan la reacción de manera análoga sobre el substrato de fosfato de l-amino-2-propanol semejante (Jones et al. (1973) Biochem J. 134:167-182) . La presente invención describe una aminobutanol fosfato fosfo-liasa identificada recientemente (SEC ID NO: 126) del organismo de Erwinia carotovora, con la actividad demostrada en el ejemplo 15 de la presente. El término "aminobutanol cinasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tiene una actividad de la enzima que cataliza la conversión del 3-amino-2-butanol al 0-fosfato de 3-amino-2-butanol . La aminobutanol cinasa puede utilizar el ATP como el donador de fosfato. Aunque no existen reportes de enzimas que catalicen esta reacción sobre el 3-amino-2-butanol , existen reportes de enzimas que catalizan la reacción análoga sobre los substratos semejantes de etanolamina y l-amino-2-propanol (Jones et al., supra) . La presente invención describe, en el ejemplo 14, un amino alcohol cinasa de Erwinia carotovora subespecie atroseptica (SEC ID NO: 124) . El término "butandiol deshidrogenasa" también conocida como "acetoina reductasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tienen una actividad de enzima que cataliza la conversión de acetoina a 2,3-butandiol . Las butandiol deshidrogenasas son un subconjunto de la amplia familia de las alcohol deshidrogenasas. Las enzimas de butandiol deshidrogenasa pueden tener una especificidad para la producción de la estereoquímica (R) o (S) en el producto de alcohol. Las butandiol deshidrogenasas específicas para (S) son conocidas como EC 1.1.1.76 y están disponibles, por ejemplo, de Klebsiella pneu oniae (GenBank Nos: BBA13085 (SEC ID NO: 6, D86412 (SEC ID NO: 5)) . Las butandiol deshidrogenasas específicas para (R) son conocidas como EC 1.1.1.4 y están disponibles, por ejemplo, de Bacillus cereus [GenBank Nos: NP_830481 (SEC ID NO: 85), NC_004722 (SEC ID NO: 84); AAP07682 (SEC ID NO: 87), AE017000 (SEC ID NO: 86)], y Lactococcus lactis [GenBank Nos. AAK04995 (SEC ID NO: 89), AE006323 (SEC ID NO: 88) ] . El término "butandiol deshidrogenasa", también conocido como "diol deshidrogenasa" o "propandiol deshidratase" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tienen una actividad de enzima que cataliza la conversión de 2 , 3-butandiol a la 2-butanona. La butandiol deshidratasa puede utilizar el cofactor de adenosil cobalamina (vitamina B12) . Las enzimas dependientes de la adenosil cobalamina son conocidas como EC 4.2.1.28 y están disponibles, por ejemplo, de Klebsiella oxytoca [GenBank Nos: BAA08099 (subunidad alfa) (SEC ID NO: 8), D45071 (SEC ID NO: 7), BAA08100 (Subunidad beta) (SEC ID NO: 10), D45071 (SEC ID NO: 9) ; y BBA08101 (subunidad gamma) (SEC ID NO: 12) , D045071 (SEC ID NO: 11) (nótese que la totalidad de las tres subunidades son requeridas para la actividad) ] , y Klebsiella pneumoniae [GenBank Nos: AAC98384 (subunidad alfa) (SEC ID NO: 105), AF102064 (SEC ID NO: 104) ; GenBank Nos: AAC98385 (subunidad beta (SEC ID NO: 107), AF102064 (SEC ID NO: 106), GenBank Nos: AAC98386 (subunidad gamma) (SEC ID NO: 109) , AF102064 (SEC ID NO: 108)] . Otras diol deshidratasas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, las diol deshidratasas dependientes de B12 disponibles de Salmonella typhimurium [GenBank Nos: AAB84102 (subunidad grande) (SEC ID NO: 93), AF026270 (SEC ID NO: 92); GenBank Nos: AAB84103 (subunidad media) (SEC ID NO: 95), AF026270 (SEC ID NO: 94); GenBank Nos: AAB84104 (subunidad pequeña) (SEC ID NO: 97), AF026270 (SEC ID NO: 96)]; y Lactobacillus collinoides [GenBank Nos: CAC82541 (subunidad grande) (SEC ID NO: 99), AJ297723 (SEC ID NO: 98); GenBank Nos: CAC82542 (subunidad media) (SEC ID NO: 101) ; AJ297723 (SEC ID NO: 100); GenBank Nos: CAD01091 (subunidad pequeña) (SEC ID NO: 103) , AJ297723 (SEC ID NO: 102) ]; y las enzimas de Lactobacillis brevis (particularmente las cepas CNRZ 734 y CNRZ 735, Speranza et al., supra) , y las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas correspondientes. Los métodos de aislamiento del gen de la diol deshidratasa son bien conocidos en el arte (por ejemplo, patente U.S. No. 5,686,276) . El término "glicerol deshidratasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tienen una actividad de la enzima que cataliza la conversión de glicerol al 3-hidroxipropionaldehido . Las glicerol deshidratases dependientes de la adenosil cobalamina son conocidas como EC 4.2.1.30. Las glicerol deshidratasas de EC 4.2.1.30 son semejantes a las diol desihidratasas en la secuencia y en que tienen tres subunidades. Las glicerol deshidratasas también pueden ser utilizadas para convertir la 2 , 3-butandiol a la 2-butanona. Algunos ejemplos de glicerol deshidratasas de EC 4.2.1.30 incluyen aquellos de Klebsiella pneumoniae (subunidad alfa, SEC ID NO: 145, región de codificación y SEC ID NO: 146, proteína; subunidad beta, SEC ID NO: 147, región de codificación y SEC ID NO: 148, proteína, y la subunidad gamma SEC ID NO: 149, región de codificación y SEC ID NO: 150, proteína); de Clostridium pasteurianum [GenBank Nos: 3360389 (subunidad alfa, SEC ID NO: 135), 3360390 (subunidad beta, SEC ID NO: 136), y 3360391 (subunidad gamma, SEC ID NO: 137)]; de Escherichia blattae [GenBank Nos: 60099613 (subunidad alfa, SEC ID NO: 138), 57340191 (subunidad beta, SEC ID NO: 139), y 57340192 (subunidad gamma, SEC ID NO: 140)]; y de Citrobacter freundii [GenBank Nos: 1169287 (subunidad alfa, SEC ID NO: 141), 1229154 (subunidad beta, SEC ID NO: 142), y 1229155 (subunidad gamma, SEC ID NO: 143) ] . Nótese que la totalidad de las tres subunidades son requeridas para la actividad. Las glicerol deshidratasas adicionales son listadas en la tabla 2. Las diol y glicerol deshidratasas pueden padecer la inactivación suicida durante la catálisis. Una proteína del factor de reactivación, también referida aquí como "reactivasa", puede ser utilizada para reactivar las enzimas inactivas (Mori et al., J. Biol. Chem. 272:32034 (1997)) . Preferentemente, el factor de reactivación es obtenido de la misma fuente que la diol o glicerol deshidratasa utilizada. Por ejemplo, los factores de la reactivación de la diol deshidratasa adecuados están disponibles de Klebsiella oxytoca [GenBank Nos: AAC15871 (subunidad grande) (SEC ID NO: 111) , AF017781 (SEC ID NO: 110); GenBank Nos: AAC15872 (subunidad pequeña) (SEC ID NO: 113), AF017781 (SEC ID NO: 112) ]; Salmonella typhímurium [GenBank Nos: AAB84105 (subunidad grande) (SEC ID NO: 115) , AF026270 (SEC ID NO: 114), GenBank Nos: AAD39008 (subunidad pequeña) (SEC ID NO: 117); AF026270 (SEC ID NO: 116)]; y Lactobacillus collinoides [GenBank Nos: CAD01092 (subunidad grande) (SEC ID NO: 119), AJ297723 (SEC ID NO: 118); GenBank Nos: CAD01093 (subunidad pequeña) (SEC ID NO: 121), AJ297723 (SEC ID NO: 120)] . Las subunidades tanto pequeñas como grandes son requeridas para la actividad. Por ejemplo, los factores de reactivación de la glicerol deshidratasa adecuados están disponibles de Klebsiella pneumoniae (subunidad grande, SEC ID NO: 151, región de codificación y SEC ID NO: 152, proteína; y la subunidad pequeña, SEC ID NO: 153, región de codificación y SEC ID NO: 154, proteína) . El término "un anaerobio facultativo" se refiere a un microorganismo que puede crecer en los medio ambientes tanto aeróbico como anaeróbico. El término "substrato de carbón" o "substrato de carbón fermentable" se refiere a una fuente de carbón capaz de ser metabolizada por los organismos hospederos de la presente invención y particularmente las fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste de monosacáridos , oligosacáridos , polisacáridos , y substratos de un carbón o mezclas de los mismos. El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de ser expresado como una proteina especifica, incluyendo opcionalmente las secuencias reguladoras precedentes (las secuencias no codificantes 5') y siguientes (secuencias no codificantes 3') de la secuencia de codificación. El "gen natural" se refiere a un gen como es encontrado en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. El "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen natural, que comprende las secuencias reguladoras y de codificación que no son encontradas conjuntamente en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender las secuencias reguladoras y las secuencias de codificación que son derivadas de diferentes fuentes, o las secuencias reguladoras y las secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero arregladas de manera diferente que la encontrada en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen natural en su localización natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" o "heterólogo" se refiere a un gen no encontrado normalmente en el organismo hospedero, pero que es introducido en el organismo hospedero por transferencia genética. Los genes extraños pueden comprender genes naturales insertados en un organismo no natural, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido en el genoma por un procedimiento de transformación. Cuando se utilice aquí, un "fragmento de ácido nucleico aislado" o "molécula de ácido nucleico aislado" o "construcción genética" serán utilizados intercambiablemente, y significarán un polímero de ARN o de ADN que es de una sola hebra o de doble hebra, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento del ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético. Un fragmento de ácido nucleico es "hibridi zable" a otro fragmento de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, ADN genómico o de ARN, cuando una forma de una sola hebra del fragmento de ácido nucleico puede ser recocida a otro fragmento de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y concentración iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y ejemplificadas en Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente el capítulo 11 de la tabla 11.1 en el mismo (incorporado completamente aquí para referencia) . Las condiciones de temperatura y de concentración iónica determinan las "características estrictas" de la hibridación. Las condiciones estrictas pueden ser ajustadas para seleccionar los fragmentos moderadamente semejantes (tales como las secuencias homologas de los organismos relacionados distantemente), hasta los fragmentos altamente semejantes (tales como los genes que duplican las enzimas funcionales de los organismos estrechamente relacionados) . Los lavados posthibridación determinan las condiciones estrictas. Un conjunto de condiciones preferidas utilizan una serie de lavados empezando con 6X SSC, 0.5 % de SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se repite con 2X SSC, 0.5 % de SDS a 45 °C durante 30 minutos, y luego se repite dos veces con 0.2 X SSC, 0.5 % de SDS a 50 °C durante 30 minutos. Un conjunto más preferido de condiciones estrictas utiliza las temperaturas más elevadas en las cuales los lavados son idénticos a aquellos mencionados anteriormente excepto que la temperatura de los dos lavados de 30 minutos finales en 0.2X SSC, 0.5 % de SDS se incrementó a 60 °C. Otro conjunto preferido de condiciones altamente estrictas utiliza dos lavados finales en 0.1 X SCS, 0.1 % de SDS a 65 °C. Un conjunto adicional de condiciones estrictas incluyen la hibridación a 0. IX SSC, 0.1 % de SDS, 65 °C y lavados con 2X SSC, 0.1 % SDS seguido por 0.1 X SSC, 0.1 % de SDS, por ej emplo . La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de las características estrictas de la hibridación, son posibles desigualdades entre las bases. Las características estrictas apropiadas para la hibridación de los ácidos nucleicos dependen de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complemento, variables que son bien conocidas en el arte. Mientras mayor es el grado de semejanza u homología entre dos secuencias de nucleótidos, más grande será el valor de Tm para los híbridos de los ácidos nucleicos que tienen estas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a una T/n más elevada) de las hibridaciones del ácido nucleico se reduce en el siguiente orden: ARN : ARN, AD : RN , ADN : AD . Para los híbridos mayores que 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular Tm (véase Sambrook et al., supra, 9.50-9.51) . Para las hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos , la posición de las desigualdades llega a ser más importante, y la longitud de los oligonucleótidos determina la especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8) . En una modalidad, la longitud por un ácido nucleico hibridizable es de al menos aproximadamente 10 nucleótidos. Preferentemente una longitud mínima para un ácido nucleico hibridizable es de al menos aproximadamente 15 nucleótidos; más preferentemente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos; y todavía más preferentemente la longitud es de al menos aproximadamente 30 nucleótidos. Además, la persona experta reconocerá que la temperatura y la concentración de la sal de la solución de lavado pueden ser ajustadas cuando sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda. Una "porción substancial" de una secuencia de aminoácidos o nucleótidos es aquella porción que comprende una cantidad suficiente en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar supuestamente tal polipéptido o gen, ya sea por evaluación manual de la secuencia por un experto en el arte, o por una comparación de una secuencia automatizada por computadora y la identificación utilizando algoritmos tales como BLAST (Altschul, S. F. , et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)) . En general, una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos, es necesario para identificar supuestamente un polipéptido o secuencia de ácidos nucleicos como homólogos con respecto a una proteina o gen conocido. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, las sondas de nucleótidos especificas para el gen que comprenden 20-30 nucleótidos contiguos pueden ser utilizadas en los métodos dependientes de la secuencia de la identificación del gen (por ejemplo, la hibridación de Southern) y el aislamiento (por ejemplo, la hibridación in situ de las colonias bacterianas o placas de bacteriófagos) . Además, los polinucleótidos cortos de 12-15 bases pueden ser utilizados como cebadores de la amplificación de la PCR para obtener un fragmento de aminoácidos particulares que comprende los cebadores. En consecuencia, una "porción substancial" de una secuencia de nucleótidos comprende una cantidad suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La presente especificación enseña la secuencia de aminoácidos y nucleótidos completa que codifica las proteínas fungosas particulares. La persona experta, que tiene el beneficio de las secuencias como se reportaron aquí, puede utilizar ahora la totalidad o una porción substancial de las secuencias descritas para los propósitos conocidos para aquellos expertos en el arte. En consecuencia, la presente invención comprende las secuencias completas como se reportaron en el listado de secuencias que se anexa, así como las porciones substanciales de estas secuencias como se definieron anteriormente . El término "complementario" se utiliza para describir la relación entre las bases de nucleótidos que son capaces de hibridizarse con respecto a las otras. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria con respecto a la timina y la citosina es complementaria con respecto a la guanina. Los términos "homología" y "homólogo" son utilizados intercambiablemente aquí. Los mismos se refieren a los fragmentos de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases de nucleótidos no afectan la capacidad del fragmento de ácido nucleico para que tenga un papel de mediación en la expresión del gen o para producir un cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a las modificaciones de los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención tales como la deleción o inserción de uno o más nucleótidos que no alteran substancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con relación al fragmento no modificado, inicial. Por lo tanto, se entiende como lo apreciarán aquellos expertos en el arte, que la invención abarca más de las secuencias ejemplares especificas. Además, la persona experta reconoce que las secuencias de ácidos nucleicos homologas abarcadas por esta invención también están definidas por su capacidad para hibridizar, bajo condiciones moderadamente estrictas (por ejemplo, 0.5 X SSC, 0.1 % de SDS, 60 °C) con las secuencias ejemplificadas aquí, o con respecto a cualquier porción de las secuencias de nucleótidos descritas aquí y que son equivalentes funcionalmente con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas aquí. La "degeneración del codón" se refiere a la naturaleza en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. La persona experta está bien conciente de la "desviación del codón" exhibida por una célula hospedera especifica en el uso de los codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un gen para la expresión mejorada en una célula hospedera, es deseable diseñar el gen de tal modo que su frecuencia de uso del codón se aproxime a la frecuencia del uso del codón preferida de la célula hospedera . El término "identidad porcentual" como se conoce en el arte, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleót idos , como se determina por la comparación de las secuencias. En el arte, "identidad" también significa el grado de capacidad de relación de las secuencias entre las secuencias de polinucleót idos o polipéptidos, dependiendo del caso de que trate, como se determina por la correspondencia entre las cadenas de tales secuencias. La "identidad" y "semejanza" pueden ser calculadas fácilmente por los métodos conocidos, incluyendo pero sin estar limitado a aquellos descritos en: 1.) Computacional Molecular Biology (Lesk, A. M. Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomput ing : Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993) ; 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds . ) Humania: NJ (1994) ; 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); y 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J. , Eds . ) Stockton: NY (1991) . Los métodos preferidos para determinar la identidad son diseñados para dar la mejor correspondencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y semejanza son codificados en los programas de computadora disponibles públicamente. Las alineaciones de las secuencias y los cálculos de la identidad porcentual pueden ser efectuados utilizando el programa MegAlign™ del sitio de cálculos bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) . La alineación múltiple de las secuencias es efectuada utilizando el "Método de alineación de Clustal" que abarca varias variedades del algoritmo incluyendo el "Método de Alineación Clustal V" que corresponde al método de alineación etiquetado como Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D. G. et al., Comput Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)); y encontrados en el programa MegAlign™ del sitio de cálculos bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc.) . Para alineaciones múltiples, los valores de falla corresponden a PENALIDAD POR HUECO = 10 y PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 10. Los parámetros de falla para las alineaciones por pareja y el cálculo de la identidad porcentual de las secuencias de proteínas que utilizan el método Clustal son KTUPLE = 1, PENALIDAD POR HUECO = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5. Para los ácidos nucleicos estos parámetros son KTUPLE = 2, PENALIDAD POR HUECO = 5, VENTANA = 4 y DIAGONALES GUARDADAS = 4. Después de la alineación de las secuencias utilizando el programa Clustal V, es posible obtener una "identidad porcentual" por la observación de la tabla de "distancias de las secuencias" del mismo programa. Adicionalmente, el "método de alineación Clustal W" está disponible y corresponde al método de alineación etiquetado Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Higgins, D. G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191 (1992) ) y encontrados en el programa MegAlign™ ?ß.? del sitio de cálculos bioinformát icos LASERGENE (DNASTAR Inc.) . Los parámetros de falla para la alineación múltiple (PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LA LONGITUD DEL HUECO = 0.2, Secuencias Divergentes de Retardo (%) = 30, Peso de la Transición de ADN = 0.5, Matriz de Peso de la Proteina = Serie Gonnet, Matriz de Peso de ADN = IUB) . Después de la alineación de las secuencias utilizando el programa Clustal W es posible obtener una "identidad porcentual" observando la tabla de "distancias de la secuencia" del mismo programa. Se entiende bien por un experto en el arte que muchos niveles de identidad de la secuencia son útiles en la identificación de los polipéptidos , a partir de otras especies, en donde tales polipéptidos tienen la misma función o actividad o una semejante. Los ejemplos útiles de las identidades porcentuales incluyen, pero no están limitadas a: 24 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, ó 95 %, o cualquier porcentaje de número entero desde 24 % hasta 100 % puede ser útil en la descripción de la presente invención, tal como 25 %, 26 %, 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 ° r 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 . Los fragmentos de ácidos nucleicos adecuados tienen las homologías anteriores sino que típicamente codifican un polipéptido que tiene al menos 50 aminoácidos, preferentemente al menos 100 aminoácidos, más preferentemente al menos 150 aminoácidos, todavía más preferentemente al menos 200 aminoácidos, y aún más preferentemente al menos 250 aminoácidos. El término "software de análisis de la secuencia" se refiere a cualquier algoritmo de computadora o programa de software que es útil para el análisis de las secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El "software de análisis de la frecuencia" puede estar disponible comercialmente o puede ser desarrollado independientemente. El software de análisis de la secuencia típico incluirá, pero no está limitado a: 1.) el sitio de GCG de programas (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, WI); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol . 215:403-410 (1190) ) ; 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison WI); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) ; y 5.) el programa FASTA que incorpora el algoritmo de Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Fecha de Reunión 1992, 111-20. Editor (es) : Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY) . Dentro del contexto de esta solicitud se entenderá que el software del análisis de la secuencia es utilizado para el análisis, porque los resultados del análisis estarán basados en los "valores de falla" del programa referido, a menos que se especifique de otra manera. Cuando se utilice aquí "valores de falla" significará cualquier conjunto de valores o parámetros que originalmente serán cargados con el software cuando es iniciado primero. Cuando se utilice aquí el término "secuencia de codificación" o "CDS" se refiere a una secuencia de ADN que codifica alguna secuencia de aminoácidos específica. "Secuencias reguladoras adecuadas" se refiere a las secuencias de nucleótidos localizadas corriente arriba (secuencias no codificantes 5' ) , dentro, o corriente abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia de codificación, y que influyen en la transcripción, procesamiento de "ARN o estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir los promotores, secuencias delanteras de la traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de la poliadenilación, sitio de procesamiento del ARN, sitio de aglutinación del efector y estructura de espiga-anillo. El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o un ARN funcional. En general, una secuencia de codificación está localizada 3' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden ser derivados en su totalidad de un gen natural, o está compuesto de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o que comprenden aún segmentos del ADN sintético. Se entiende por aquellos expertos en el arte que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones fisiológicas o del medio ambiente. Los promotores que provocan que un gen sea expresado en la mayoría de los tipos de las células la mayoría de las veces, son referidos comúnmente como "promotores constitutivos". Se reconoce además que puesto que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no han sido definidos completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad idéntica del promotor. El término "enlazado operativamente" se refiere a la asociación de las secuencias de ácidos nucleicos sobre un fragmento de ácido nucleico único de modo que la función de uno es afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está enlazado operativamente con una secuencia de codificación cuando la misma es capaz de afectar la expresión de modo que la secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias de codificación pueden estar enlazadas operativamente con las secuencias reguladoras en una orientación de sentido o antisentido. El término "expresión" como se utiliza aquí, se refiere a la trascripción y la acumulación estable del ARN de sentido (ARNm) o del ARN antisentido derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión también se puede referir a la traducción del ARNm en un polipéptido. Cuando se utilice aquí, el término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en un organismo hospedero, conduciendo a una herencia estable genéticamente. Los organismos hospederos que contienen los elementos de ácidos nucleicos transformados son referidos como organismos "transgénicos" o "recombinantes" o "transformados" . Los términos "plásmido" y "vector" se refieren a un elemento extracromosómico que lleva frecuentemente los genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y usualmente en la forma de los fragmentos de ADN de doble hebra, circulares. Tales elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias de integración del genoma, secuencias del fago o del nucleótido, lineales o circulares, de un ADN o de ARN de una sola hebra o de doble hebra, derivada de cualquier fuente, en el cual un número de secuencias de nucleótidos han sido unidas o recombinadas en una construcción única que es capaz de introducirse en un fragmento del promotor y la secuencia de ADN para un producto genético seleccionado en compañía de la secuencia no traducida 3' apropiada en una célula. "Vector de transformación" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos además del gen extraño que facilitan la transformación de una célula hospedera particular. Cuando se utilice aquí, el término "degeneración del codón" se refiere a la naturaleza en el código genético que permite la variación de una secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. La persona experta está bien advertido de la "desviación del codón" exhibida por una célula hospedera específica en el uso de los codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetice un gen para la expresión mejorada en una célula hospedera, es deseable diseñar el gen de tal modo que su frecuencia de uso del codón se aproxime a la frecuencia del uso del codón preferida de la célula hospedera. El término "codón optimizado" cuando el mismo se refiere a los genes o las regiones de codificación de las moléculas de ácido nucleico para la transformación de varios elementos hospederos, se refiere a la alteración de los codones en el gen o las regiones de codificación de las moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso del codón típico del organismo hospedero sin alterar al polipéptido codificado por el ADN . El término "medio del producto de fermentación" se refiere a un medio en el cual la fermentación ha ocurrido de tal modo que el producto está presente en el medio. El ADN recombinante estándar y las técnicas de clonación molecular utilizadas aquí son bien conocidas en el arte y se describen por Sambrook, J. Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Lahoratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (aquí posteriormente) ("Maniatis"); y por Silhavy, T. J. , Bennan, M. L. y Enquist, L. W. Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicada por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987). Las rutas biosintéticas de 2-butanol y 2-butanona Los microorganismos que utilizan carbohidratos emplean la ruta de Embden-Meyerhof-Pamas (EMP, por sus siglas en inglés), la ruta de Entner-Doudoroff y el ciclo del fosfato de pentosa como la ruta metabólicas centrales para proporcionar la energía y los precursores celulares para el crecimiento y mantenimiento. Estas rutas tienen en común el 3-fosfato de gliceraldehído intermedio y, por último, el piruvato es formado directamente o en combinación con la ruta de EMP. Las reacciones combinadas de la conversión de azúcar a piruvato produce energía (por ejemplo el 5' -trifosfato de adenosina ATP) y los equivalentes de reducción (por ejemplo el dinucleótido de nicotinamida adenina reducido, NADH, y el fosfato del dinucleótido de adenina nicotinamida reducido, NADPH) . NADH y NADPH deben ser reciclados a sus formas oxidadas (NAD+ y NADP+, respectivamente) . En la presencia de los aceptores de electrones inorgánicos (por ejemplo 02, N03~ y S042~) , los equivalentes de la reducción pueden ser utilizados para aumentar el conjunto de la energía; alternativamente, un producto por carbón reducido puede ser formado . La invención hace posible la producción de 2- butanona o 2-butanol a partir de las fuentes de carbohidratos con microorganismos recombinantes por la provisión de una ruta biosintética completa desde el piruvato hasta la 2-butanona o 2-butanol. Tres rutas adicionales ya han sido descritas. Aunque el 2-butanol no se sabe que sea el producto principal de cualquier fermentación bacteriana, existen un número de posibles rutas para la producción del 2-butanol por medio de los tipos de reacción bioquímica conocidos. Estas rutas son mostradas en la figura 1. Las letras y los números romanos citados anteriormente corresponden a las letras y números romanos en la figura 1, que son utilizados para mostrar las etapas y productos de conversión, respectivamente. Como se describe posteriormente, la 2-butanona es un compuesto intermedio en la totalidad de estas rutas biosintét icas del 2-butanol. La totalidad de las rutas empiezan con la reacción inicial de dos moléculas de piruvato para dar el alfa-acetolactato (I), mostradas como la conversión del substrato con respecto al producto (a) en la figura 1. A partir del alfa-acetolactato, existen 4 rutas posibles para la 2-butanona (V) , referidas aquí como las rutas biosintéticas de la 2-butanona: Ruta 1) I ? II ? III ? IV ? V (conversiones del substrato al producto b, c, d, e) ; Esta es la ruta de la presente invención. 2) I ? II - VII ? IV ? V (conversiones del substrato al producto b, g, h, e) 3) I ? II ? VIII ? V (conversiones del substrato al producto b, i , j ) : 4) I ? IX ? X -? V (conversiones del substrato al producto k, 1 , m) . Las rutas biosintéticas del 2-butanol concluyen con la conversión de la 2-butanona (V) al 2-butanol (VI). Una descripción detallada de las conversiones del substrato con respecto al producto en cada ruta se proporciona en seguida. Ruta 1: (a) piruvato a la alfa-acetolactato : La etapa inicial de la ruta 1 es la conversión de las dos moléculas de piruvato a una molécula de alfa-acetolactato (compuesto 1 en la figura 1) y una molécula de dióxido de carbono catalizada por una enzima dependiente del pirofosfato de tiamina. Las enzimas que catalizan esta conversión del substrato con respecto al producto (llamada generalmente ya sea la acetolactato sintasa o el acetohidroxi ácido sintasa; EC 2.2.1.6 [cambiado a partir de 4.1.3.18 en el 2002]) son bien conocidas, y las mismas participan en la ruta biosintética para los aminoácidos proteinogénicos de leucina y valina, asi como en la ruta para la producción por fermentación del 2 , 3-butandiol y acetoina de un número de organismos.

La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen la actividad de acetolactato sintasa aislados de una variedad de fuertes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Algún ejemplo de las enzimas de acetolactato sintasa adecuadas están disponibles de un número de fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis [GenBank Nos: AAA22222 NCBI (National Center for Biotechnology Information) secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 77), L04470 NCBI secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 76)], Klebsíella terrigena [GenBank Nos: AAA25055 (SEC ID NO: 79), L04507 (SEC ID NO: 78)], y Klebsíella pneumoniae [GenBank Nos: AAA25079 (SEC ID NO: 4), 73842 (SEC ID NO: 3)] . Las enzimas de acetolactato sintasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80 % - 85 % de identidad para la SEC ID NOs 4, 77, y 79, en donde al menos 85 % - 90 % de identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de identidad basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz de peso de la proteína, es más preferido . (b) alfa-acetolactato a acetoína El alfa-acetatolactato (I) es convertido a la acetoína (II) por la acción de una enzima tal como la acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5). De manera semejante a la acetatolactato sintasa, la enzima es dependiente del pirofosfato de tiamina y también está involucrada en la producción de 2 , 3-butandiol y acetoina por un número de organismos. Las enzimas de diferentes fuentes pueden variar muy ampliamente en tamaño (25-50 kilodaltons) , la oligomerización (dimero-hexámero) , la localización ( intracelular o extracelular) , y la regulación alostérica (por ejemplo, la activación por los aminoácidos de cadena ramificada) . Para el propósito de la presente invención, una localización intracelular es más preferible que una extracelular, pero otras variaciones son aceptables generalmente . La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen la actividad de acetatolactato descarboxilasa aislada de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Algún ejemplo de las enzimas de acetatolactato descarboxilasa adecuadas están disponibles de un número de fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis [GenBank Nos: AAA22223 (SEC ID NO: 81), L04470 (SEC ID NO: 80) ], Klebsiella terrigena [GenBank Nos: AAA25054 (SEC ID NO: 83), L04507 (SEC ID NO: 82)] y Klebsiella pneumoniae [GenBank Nos: AAU43774 (SEC ID NO: 2), AY722056 (SEC ID NO: 1)] . Las enzimas de acetatolactato descarboxilasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80 % - 85 % de identidad hacia las SEC ID NOs 2, 81 y 83, en donde al menos 85 % - 90 % de identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de identidad basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz por peso de la proteina, es más preferida . (c) acetoina a 3-amino-2-butanol : Existen dos tipos conocidos de reacciones bioquímicas que podrían efectuar la conversión del substrato al producto de acetoina (II) al 3-amino-2-butanol (III), específicamente, la transaminación dependiente del fosfato de piridoxal utilizando un donador de amino accesorio y la aminación reductora directa con amoníaco. En este último caso, los equivalentes de reducción son suministrados en la forma de un cofactor de nicotinamida reducida (ya sea NADH o NADPH) . Un ejemplo de una enzima dependiente de NADPH que cataliza esta reacción con acetoina como un substrato es reportada por Ito et al. (patente U.S. No. 6,432,688) . Cualquier esteroespecificidad de esta enzima no ha sido ensayada. Un ejemplo de una transaminasa dependiente del foafato de piridoxal que cataliza la conversión de acetoina a 3-amino-2-butanol ha sido reportado por Shin y Kim (supra) . Esta enzima fue mostrada en el ejemplo 13 de la presente que se convierte tanto al isómero (R) de la acetoina al isómero (2R,3S) del 3-amino-2-butanol como el isómero (S) de la acetoina al isómero (2S,3S) del 3-amino-2-butanol . Cualquier tipo de enzima (es decir, transaminasa o aminasa reductora) se considera que va a ser una acetoina aminasa y puede ser utilizada en la producción de 2-butanol. Otras enzimas en este grupo pueden tener diferentes estereoespecifidades . La persona experta apreciará que los polipéptidos que tiene una actividad de acetoina aminasa aislado de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Un ejemplo de esta actividad es descrita aquí y es identificada como la SEC ID NO: 122. En consecuencia, las enzimas de acetoina aminasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80 % - 85 % de identidad con respecto a la secuencia SEC ID NO: 122, en donde al menos 85 % - 90 % de identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de la identidad basada en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteína, es más preferida. (d) 3-amino-2-butanol a O-fosfato de 3-amino-2-butanol No existen enzimas conocidas en el arte que catalicen la conversión del substrato al producto del 3-amino-2-butanol (III) al fosfato de 3-amino-2-butanol (IV) .

Sin embargo, algunas especies de Pseudomonas y Erwinia se ha mostrado que expresan una etanolamina cinasa dependiente de ATP (EC 2.7.1.82) que permite que ellos utilicen la etanolamina o el l-amino-2-propanol como una fuente de nitrógeno (Jones et al. (1973) Biochem. J. 134: 167-182) . Es probable que esta enzima también tenga actividad hacia el 3-amino-2-butanol o podría ser diseñado para hacerlo así, por lo cual se proporciona una aminobutanol cinasa. La presente invención describe en el ejemplo 14, un gen de Erwinia carotovora subespecie atroseptica (SEC ID NO: 123) que codifica una proteína (SEC ID NO: 24) . Esta proteína ha sido identificada como una amino alcohol cinasa. Esta enzima puede ser utilizada para convertir el 3-amino-2-butanol al 0-fosfato de 3-amino-2-butanol . La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen una actividad de aminobutanol cinasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Un ejemplo de esta actividad ha sido descrita aquí y es identificada como la SEC ID NO: 124. En consecuencia, las enzimas de aminobutanol cinasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80 % - 85 % de identidad con respecto a SEC ID NO: 124, en donde al menos 85 % - 90 % de identidad es más preferido y en donde al menos 95 % de identidad basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteína, es más preferida. ( e ) fosfato de 3-amino-2-butanol a 2-butanona: Aunque no existan enzimas reportadas que catalicen la conversión del substrato al producto del fosfato de 3-amino-2-butanol (IV) a la 2-butanona (V) , el substrato es muy semejante a aquellos utilizados por la enzima de fosfotanolamina fosfo-liasa dependiente del fosfato de piridoxal, que ha sido encontrada en un número pequeño de especies de pseudomonas y Erwinia. Estas enzimas tienen actividad hacia la fosfoetanolamina y ambos enantiómeros del 2-fosfo-l-aminopropano (Jones et al. (1973) Biochem J. 134:167-182), y también pueden tener actividad hacia el 0-fosfato de 3-amino-2-butanol . Aquí está identificado un gen de Erwinia carotovora subespecie atroseptica (SEC ID NO: 125) que codifica una proteína (SEC ID NO: 126) con homología con respecto a la aminotransferasa de la clase III. El ejemplo 15 demuestra que esta enzima es activa sobre tanto el fosfato de aminopropanol como los substratos del fosfato de aminobutanol . La enzima caracterizada e identificada recientemente fue capaz de catalizar la conversión de una mezcla de ( R) -3-amino- ( S ) -2-butanol y O-fosfato de (S)-3-amino- (R) -2-butanol , y una mezcla de ( R) -3-amino- ( R) -2-butanol y O-fosfato de (S) -3-amino- (S) -2-butanol a la 2- butanona. La enzima identificada y caracterizada recientemente también fue capaz de catalizar la conversión del fosfato tanto (R) como (S) -2-amino-l-propanol a la propanona, con una preferencia hacia el fosfato de (S)-2-amino-l-propanol . La actividad más elevada fue observada con el substrato natural propuesto de fosfato de DL-l-amino-2-propanol, el cual fue convertido al propionaldehido . La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen una actividad de aminobutanol fosfato fosfo-liasa aislada de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Un ejemplo de la enzima de aminobutanol fosfato fosfo-liasa adecuada es descrita aquí en la SEC ID NO: 126. En consecuencia, las enzimas de aminobutanol fosfato fosfo-liasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80 - 85 % de identidad con respecto a la SEC ID NO: 126, en donde al menos 85 % - 90% de identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de identidad basado en el método de la invención de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteína, es más preferida . ( f ) 2-butanona a 2-butanol La etapa final en todas las rutas para producir 2-butanol a partir de ácido pirúvico es la reducción de la 2- butanona (V) a 2-butanol (VI) . Este substrato para la conversión del producto es catalizado por algunos miembros de la clase amplia de alcohol deshidrogenasas (los tipos que utilizan ya sea NADH o NADPH como una fuente de hidruro, dependiendo de la enzima) que pueden ser llamadas butanol deshidrogenasas. Las enzimas de cada tipo que catalizan la reducción de 2-butanona son bien conocidas, como se describió anteriormente en la definición para la butanol deshidrogenasa. La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen la actividad de la butanol deshidrogenasa aislada de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Algunos ejemplos de las enzimas de butanol deshidrogenasas adecuadas están disponibles de un número de fuentes, por ejemplo, Rodhococcus ruber [GenBank Nos: CAD36475 (SEC ID NO: 14), AJ491307 (SEC ID NO: 13)]. Las enzimas dependientes de NADP son conocidas como EC 1.1.1.2 y están disponibles, por ejemplo, de Pyrococcus furiosus [GenBank Nos: AAC25556 (SEC ID NO: 91), AF013169 (SEC ID NO: 90)]. Adicionalmente, una butanol deshidrogenasa está disponible de Escherichia coli [GenBank Nos: NP_417484 (SEC ID NO: 75), NC_000913 (SEC ID NO: 74)] y una ciclohexanol deshidrogenasa está disponible de Acinetobacter sp . [GenBank Nos: AAG10026 (SEC ID NO: 72), AF282240 (SEC ID NO: 71)]. Las enzimas de butanol deshidrogenase preferidas son aquellas que tienen al menos 80-85 % de identidad con respecto a las SEC ID NOs 14, 91, 75, y 72, en donde al menos 85 %-90 % de la identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de la identidad basada en el método de Clustal W de alineación utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina, es más preferida. Ruta 2: (a) piruvato a alfa-acetolactato : Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. (b) alfa-acetolactato a acetoina: Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. ( g ) acetoina a fosfoacetoina : Aunque las enzimas que catalizan la conversión del substrato al producto de la acetoina (II) a la fosfoacetoina (VII) no han sido descritas, la estructura del substrato de acetoina es muy semejante a aquel de la dihidroxiacetona , y por lo tanto la acetona puede ser un substrato aceptable para la dihidroxiacetona cinasa (EC 2.7.1.29), una enzima que cataliza la fosforilación de dihidroxiacetona. Las técnicas de diseño de proteínas para la alteración de la especificidad del substrato de las enzimas son bien conocidas (Antikainen y Martin (2005) Bioorg. Med. Chem. 13:2701-1716) y pueden ser utilizadas para generar una enzima con la especificidad requerida. En esta conversión, la porción del fosfato puede ser suministrada por cualquier donador del fosfato biológico de alta energía, con el substrato común que es el fosfoenolpiruvato (como en la dihidroxiacetona cinasa de E.coli) y la ATP) (como en la dihidroxiacetona cinasa de Citrobacter freundii) (Garcia-Alles et al. (2004) Biochemistry 43:13037-13045) . (h) fosfoacetoína a O-fosfato de 3-amino-2-butanol : Aunque las enzimas que catalizan el substrato para producir la conversión de fosfoacetoína (VIII) al O-fosfato de 3-amino-2-butanol (IV) no han sido descritas, la estructura del substrato es muy semejante a aquella del fosfato de hidroxiacetona que es un substrato para la serinol fosfato aminotransferasa propuesta codificada por la porción 5' del gen rtxA en algunas especies de Bradyrhizobium (Yasuta et al., supra) . Por consiguiente, una serinol fosfato aminotransferasa puede ser funcional en esta etapa. (e) O-fosfato de 3-amino-2-butanol a 2-butanona: Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. ( f ) 2-butanona a 2-butanol: Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1.

Ruta 3: ( a ) piruvato a alfa-acetolactato : Este substrato para la conversión del producto es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. (b) alfa-acetolactato a acetoina: Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. ' ( i ) acetoina a 2 , 3-butandiol : El substrato para producir la conversión de acetoina (II) a 2 , 3-butandiol (VIII) puede ser catalizado por una butandiol deshidrogenasa que puede utilizar ya sea NADH o NADPH como la fuente de reducción de los equivalentes cuando se llevan a cabo las reducciones. Las enzimas con actividad hacia la acetoina participan en la ruta para la producción de 2 , 3-butandiol en organismos que producen este compuesto. Las enzimas reportadas (por ejemplo, BudC de Klebsiella pneumoniae (Ui et al. (2004) Letters in Applied Microbiology 39:533-537) generalmente utilizan NADH. Cualquier cofactor es aceptable para su uso en la producción de 2-butanol por esta ruta. ( j ) 2 , 3-butandiol a 2-butanona: Este substrato para producir la conversión de 2,3-butandiol (VIII) a la 2-butanona (V) puede ser catalizado por las enzimas de diol deshidratasa (EC 4.2.1.28) y las enzimas de glicerol deshidratasa (EC 4.2.1.30) . La diol deshidratasa mejor caracterizada es la coenzima de Klebsiella oxytoca dependiente de la coenzima de B12, pero enzimas semejantes son encontradas en un número de bacterias entéricas. La enzima de K. oxytoca se ha mostrado que acepta al meso-2,3- butandiol como un substrato (Bachovchin et al. (1977) Biochemistry 16:1082-1092), produciendo el producto de 2- butanona deseado. El ejemplo 17 demuestra que la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae fue capaz de convertir el meso-2 , 3-butandiol a 2-butanona. Las tres subunidades de la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae (alfa: SEC • ID NO: 145 (región de codificación) y 146 (proteína) ; beta: SEC ID NO: 147 (región de codificación) y 148 (proteína); y gamma: SEC ID NO: 149 (región de codificación) y 150 (proteína) ) fueron expresadas en conjunción con las dos subunidades de la glicerol deshidratasa reactivasa de Klebsiella pneumoniae (subunidad grande, SEC ID NO: 151 (región de codificación) y 152 (proteína) ; y la subunidad pequeña, SEC ID NO: 153 (región de codificación y 154 (proteína)) para proporcionar la actividad. También existen reportes en la literatura de una diol deshidratasa independiente de B12 de Clostridium glycolicum (Hartmanis et al. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 245:144-152) . Esta enzima tiene la actividad hacia el 2,3- butandiol aunque esta actividad es menor que 1 % de la actividad hacia el etandiol, pero la enzima puede ser diseñada para mejorar esta actividad. Una deshidratasa independiente de B12 mejor caracterizada es la glicerol deshidratasa de Clostridium butyricum (O'Brien et al. (2004) Biochemistry 43: 635- 6 5), que tiene una actividad elevada hacia el 1 , 2-propandiol asi como el glicerol. Esta enzima utiliza la S-adenosilmetionina como una fuente del radical de adenosilo. No existen reportes de la actividad hacia el 2,3-butandiol, pero tal actividad, si no está ya presente, posiblemente puede ser diseñada. (f) 2-butanona a 2-butanol: Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. Ruta 4: (a) piruvato a alfa-acetolactato : Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. ( k) al fa-acetolactato al ácido 2 , 3-dihidroxi-2-metilbutanoico : El substrato para producir la conversión de acetolactato (I) al ácido 2 , 3-dihidroxi-2-metilbutanoico (IX) no es conocido en el arte. Sin embargo, el producto de esta conversión ha sido reportado como un componente de los caldos de fermentación (Ziadi et al. (1973) Comptes Rendus des Seances de 1'Academia des Sciences, Serie D: Sciences Naturelles 276:965-8), pero el mecanismo de formación es desconocido. El mecanismo probable de formación es la reducción del acetolactato con NADH o NADPH como el donador de electrones. Para utilizar esta ruta para la producción de 2-butanol, una enzima que cataliza esta reacción necesita ser identificada o diseñada. Sin embargo, el precedente para la reducción enzimática de las cetonas y los alcoholes está bien establecido . ( 1 ) ácido 2 , 3-dihidroxi-2-metilbutanoico al ácido 2-hidroxi-2-meti1-3-fosfobutanoico No existen enzimas conocidas que catalicen la conversión del substrato al producto del ácido 2 , 3-dihidroxi-2-metilbutanoico (IX) al ácido 2-hidroxi-2-metil-3-fosfobutanoico (X) . Sin embargo, existe un gran número de cinasas en la naturaleza que poseen una especificidad variable. Por lo tanto es probable que una enzima podría ser aislada o diseñada con esta actividad. (m) ácido 2-hidroxi-2-metil-3-fosfobutanoico a la 2-butanona : No existen enzimas conocidas que catalicen la conversión del substrato al producto del ácido 2-hidroxi-3-metilfosfobutanoico (X) a la 2-butanona (V) . La combinación de esta reacción con uno previa es muy semejante a la reacción de etapas múltiples catalizada por la mevalonato-5-pirofosfato (M5PP) descarboxilasa , que consiste de la fosforilación inicial de M5PP a la 3-fosfomevalonato-5-??, seguido por la eliminación dependiente de la descarboxilacion del fosfato (Alvear et al. (1982) Biochemistry 21 : 4646-4650 ) . (f ) 2-butanona a 2-butanol: Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. Por consiguiente, para proporcionar rutas recombinantes múltiples del piruvato al 2-butanol, existe un número de elecciones para satisfacer las etapas de conversión individuales, y la persona con experiencia en el arte será capaz de utilizar las secuencias disponibles públicamente y las secuencias descritas aquí para construir las rutas relevantes. Un listado del número representativo de genes conocidos en el arte y útiles en la construcción de las rutas biosintét icas de 2-butanol está dado anteriormente en las tablas 1 y 2. Elementos hospederos microbianos para la producción de 2-butanol y 2-butanona Los elementos hospederos microbianos para la producción de 2-butanol o 2-butanona pueden ser seleccionados de las bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levaduras. El animal hospedero microbiano utilizado para la producción de 2-butanol o 2-butanona debe ser tolerante con respecto al producto producido, de modo que el rendimiento no este limitado por la toxicidad del producto con respecto al animal hospedero. La selección de un animal hospedero microbiano para la producción de 2-butanol se describe con detalle posteriormente. Aplica el mismo criterio para la selección de un animal hospedero para la producción de 2-butanona . Los microbios que son metabólicamente activos a niveles de concentración elevada de 2-butanol no son bien conocidos en el arte. Aunque los mutantes tolerantes al butanol han sido aislados de Clostridia solventogénica , está disponible poca información que se refiera a la tolerancia al butanol de otras cepas de bacterias potencialmente útiles. La mayoría de los estudios sobre la comparación de la tolerancia al alcohol en las bacterias sugirieron que el butanol es más tóxico que el etanol (de Cavallo et al., Microsc. Res. Tech. 64:215-22 (2004) y Kabelitz et al., FEMS Microbíol. Lett. 220:223-227 (2003)) . Thomas et al. (J. Bacteriol. 186:2006-2018 (2004) ) reportó que el rendimiento de 1-butanol durante la fermentación en Clostridium acetobutylicum puede ser limitado por la toxicidad del butanol. El efecto primario del 1-butanol sobre Clostridium acetobutylicum es la alteración de las funciones de la membrana (Hermann et al., Appl .

Environ. Microbiol. 50:1238-1243 (1985) ) . Los animales hospederos microbianos seleccionados para la producción de 2-butanol deben ser tolerantes hacia el 2-butanol y deben ser capaces de convertir los carbohidratos al 2-butanol utilizando la ruta biosintética introducida. Los criterios para la selección de los animales hospederos microbianos adecuados incluyen los siguientes: tolerancia intrínseca al 2-butanol, velocidad elevada de utilización de carbohidratos, disponibilidad de herramientas genéticas para la manipulación genética, y la capacidad para generar alteraciones cromosómicas estables. Las cepas de los animales hospederos adecuados con una tolerancia hacia el 2-butanol pueden ser identificadas por la selección con base en la tolerancia intrínseca de la cepa. La tolerancia intrínseca de los microbios al 2-butanol puede ser medida por la determinación de la concentración del 2-butanol que es responsable de la inhibición del 50 % de la velocidad de crecimiento (IC50) cuando se hacen crecer en un medio mínimo. Los valores de IC50 pueden ser determinados utilizando los métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, los microbios de interés se pueden hacer crecer en la presencia de varias cantidades de 2-butanol y la velocidad de crecimiento verificada por la medición de la densidad óptica a 600 nanómetros. El tiempo de duplicación puede ser calculado a partir de la parte logarítmica de la curva de crecimiento y utilizado como una medida de la velocidad de crecimiento. La concentración del 2-butanol que produce 50 % de inhibición del crecimiento puede ser determinada de una gráfica de la inhibición porcentual del crecimiento contra la concentración del 2-butanol. Preferentemente, la cepa hospedera debe tener una IC50 hacia el 2-butanol mayor que aproximadamente 0.5 %. Es más adecuada una cepa del animal hospedero con una IC50 hacia el 2-butanol que sea mayor que aproximadamente 1.5 %. Es particularmente adecuada una cepa del animal hospedero con una IC50 hacia el 2-butanol que es mayor que aproximadamente 2.5 % . El animal hospedero microbiano para la producción del 2-butanol también debe utilizar la glucosa y/u otros carbohidratos a una velocidad elevada. La mayoría de los microbios son capaces de utilizar carbohidratos. Sin embargo, ciertos microbios del medio ambiente no pueden utilizar eficientemente los carbohidratos, y por lo tanto podrían no ser animales hospederos adecuados. La capacidad para modificar genéticamente el animal hospedero es esencial para la producción de cualquier microorganismo recombinante . Los modos de la tecnología de transferencia genética que pueden ser utilizados incluyen electroporación, conjugación, transducción o transformación natural. Una amplia gamma de plásmidos conjugados hospederos y marcadores de resistencia del fármaco están disponibles. Los vectores de clonación utilizados con un organismo son adaptados con respecto al organismo hospedero basado en la naturaleza de los marcadores de resistencia antibiótica que pueden funcionar en este animal hospedero. El animal hospedero microbiano también puede ser manipulado para inactivar las rutas competentes para el flujo del carbón por la inactivación de varios genes. Esto requiere la disponibilidad de ya sea los transposones o los vectores de integración cromosómica para dirigir la inactivación. Adicionalmente , la producción de animales hospederos que sean capaces de una mutagénesis química pueden padecer mejoras y la tolerancia al 2-butanol intrínseca por medio de la mutagénesis química y la selección de los mutantes. Basado en los criterios descritos anteriormente, los animales hospederos microbianos adecuados para la producción de 2-butanol y 2-butanona incluyen, pero no están limitados a, elementos de los géneros Clostridium , Zymomonas , Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas , Bacillus, Lactobacillus , Enterococcus , Pediococcus , Alcaligenes , Klebsiella, Paenibacillus , Arthrobacter, Corynebacterium , Brevibacterium , Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces . Los animales hospederos preferidos incluyen: Escherichia coli, Alcaligenes euthrophus , Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans , Rhodococcus erythropolis , Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium , Enterococcus faecalis , Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici , Bacillis subtilis y Saccharomyves cerevisiae . Construcción de los animales hospederos para la producción Los organismos recombinantes que contienen los genes necesarios que codifican la ruta enzimática para la conversión de un substrato de carbono fermentable al 2-butanol o 2-butanona pueden ser construidos utilizando las técnicas bien conocidas en el arte. En la presente invención, los genes que codifican las enzimas de la ruta 1 biosintética del 2-butanol: acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa , acetoina aminasa (o amina : piruvato transaminasa ) , aminobutanol cinasa, aminobutanol O-fosfato liasa y butanol deshidrogenasa ; o la ruta 1 biosintética de la 2-butanona omitiendo la butanol deshidrogenasa, pueden ser aislados de varias fuentes, como se describió anteriormente. Los métodos de obtención de los genes deseados a partir de un genoma bacteriano son comunes y son bien conocidos en el arte de la biología molecular. Por ejemplo, si la secuencia del gen es conocida, los cebadores pueden ser diseñados y la secuencia deseada amplificada utilizando los métodos de amplificación dirigidos al cebador, estándares, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (patente U.S. No. 4,683,202) para obtener las cantidades del ADN adecuadas para la clonación en los vectores de expresión. Si un gen que es heterologo para una secuencia conocida va a ser aislado, las bibliotecas genómicas adecuadas pueden ser creadas por la digestión de la endonucleasa de restricción y pueden ser seleccionados con sondas que tienen una secuencia complementaria para la secuencia del gen deseado. Una vez que la secuencia es aislada, el ADN puede ser amplificado utilizando los métodos de amplificación dirigidos al cebador, estándares, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (U.S. No. 4,683,202) pata obtener las cantidades del ADN adecuadas para la clonación en los vectores de expresión, que son transformados entonces en las células hospederas apropiadas . Además, dada la secuencia de aminoácidos de una proteina con la actividad enzimática deseada, la secuencia de codificación puede ser averiguada por la traducción inversa de la secuencia de la proteina. Un fragmento del ADN que contiene la secuencia de codificación puede ser preparado sintéticamente y clonado en un vector de expresión, luego transformado en la célula hospedera deseada. En la preparación de un fragmento de ADN sintético que contiene una secuencia de codificación, esta secuencia puede ser optimizada para la expresión en la célula hospedera objetivo. Las herramientas para la optimización del codón para la expresión en un elemento hospedero heterólogo están disponibles fácilmente. Algunas herramientas para la optimización del codón están disponibles basado en el contenido de GC del organismo hospedero. Los contenidos de GC de algunos animales hospederos microbianos ejemplares están dados en la tabla 3.

Tabla 3 Contenidos de GC de los animales hospederos microbianos Una vez que los genes de la ruta relevante son identificados y aislados, los mismos pueden ser transformados en elementos hospederos de expresión adecuada por los medios bien conocidos en el arte. Los vectores útiles para la transformación de una variedad de células hospederas son comunes y están disponibles comercialmente de compañías tales como EPICENTRE® (Madison, I), Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) , Stratagene (La Jolla, CA) , y New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) . Típicamente, el vector contiene un marcador seleccionado y secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica en el elemento hospedero deseado. Adicionalmente, los vectores adecuados comprenden una región promotora que colecta los controles de iniciación transcripcional y una región de control de terminación transcripcional, entre las cuales puede ser insertado un fragmento del ADN de la región de codificación, para proporcionar la expresión de la región de codificación insertada. Ambas regiones de control pueden ser derivadas de los genes análogos hacia la célula hospedera transformada, aunque se va a entender que tales regiones de control también pueden ser derivadas de los genes que no son naturales con respecto a las especies genéticas elegidas como un elemento hospedero para la producción. Las regiones de control de iniciación o promotores, que son útiles para estimular la expresión de las regiones de codificación de la ruta relevante en la célula hospedera deseada son numerosas y son familiares para aquellos expertos en el arte. Virtualmente cualquier promotor capaz de estimular estos elementos genéticos es adecuado para la presente invención incluyendo, pero sin estar limitado a los promotores derivados de los siguientes genes: CYC1 , HIS3, GAL1, GALIO, ADH1 , PGK, PH05, GAPDH, ADC1 , TRP1 , URA3 , LEU2 , ENO, TPI, CUP1, FBA, GPD, y GPM (útiles para la expresión en Saccharomyces) ; AOX1 (útil para la expresión en Pichia) , asi como los promotores lac, ara, tet, trp, IPL, IPR, T7, tac, y trc (útiles para la expresión en Escherichia coli, Alcaligenes , y Pseudomonas) ; los promotores amy, apr, y npr, y varios promotores del fago útiles para la expresión en Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis y Paenibacillus macerans; nisA (útil para la expresión de las bacterias gram-positivas, Eichenbaum et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (8) :2763-2769 (1998)) ; y el promotor Pll sintético (útil para la expresión en Lactobacillus plantarum, Rud et al., Microbiology 152: 1011-1019 (2006) ) . Las regiones de control de la terminación también pueden ser derivadas de varios genes negativos naturales para los elementos hospederos preferidos. Opcionalmente, un sitio de terminación también puede ser innecesario, sin embargo, es más preferido si es incluido. Ciertos vectores son capaces de replicación en un intervalo amplio de bacterias hospederas y pueden ser transferidos por conjugación. La secuencia completa y anotada de pRK404 y tres vectores relacionados: pRK437, pRK442, y pRK442(H) están disponibles. Estos derivados han probado que van a ser herramientas valiosas para la manipulación genética en las bacterias gram-negativas (Scott et al., Plasmid 50(l) :74-79 (2003) ) . Varios derivados de plásmido del intervalo de huéspedes amplios de Inc P4 plásmido RSF1010 también están disponibles con los promotores que pueden funcionar en un intervalo de bacterias gram negativas. Los plásmidos pAYC36 y pAYC37, tienen promotores activos en compañía de sitios de clonación múltiples para permitir la expresión del gen heterologo en las bacterias gram negativas. Las herramientas de reemplazo de los genes cromosómicos también están ampliamente disponibles. Por ejemplo, una variante termosensible del replicón pWVIOl del intervalo de huéspedes amplios ha sido modificada para construir un plásmido pVE6002 que puede ser utilizado para efectuar el reemplazo del gen en una gama de bacterias gram-positivas (Maguin et al., J. Bacteriol 174 ( 17 ) : 5633-5638 (1992) ) . Adicionalmente, los transposones in vitro están disponibles de las fuentes comerciales tales como EPICENTRE© para crear mutaciones aleatorias en una variedad de genomas. La expresión de una ruta biosintética de 2-butanol en varios elementos microbianos hospederos preferidos es descrita con mayor detalle posteriormente. Para la expresión de una ruta biosintética de la 2-butanona, aplica la misma descripción, pero el substrato final para producir la conversión de 2-butanona a 2-butanol es omitida. Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en E. coli Los vectores útiles para la transformación de E. coli son comunes y están disponibles comercialmente de las compañías listadas anteriormente. Por ejemplo, los genes de una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser aislados de varias fuentes, como se describió anteriormente, clonados sobre un vector de pUC19 modificados y transformados en E. coli NM522, como se describe en los ejemplos 6 y 7.

Alternativamente, los genes que codifican una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser separados en operones múltiples, clonados sobre los vectores de expresión, y transformados en varias cepas de E. coli como se describe en los ejemplos 9, 10 y 11. La ruta biosintética de la 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Rhodococcus erythropolis En una serie de vectores de transferencia de E. coli-Rhodococcus están disponibles para la expresión en R. erythropolis incluyendo, pero sin estar limitado a pRhBR17 y pDA71 (Kostichka et al., Appl . Microbiol. Biotechnol. 62:61-68 (2003) ) . Adicionalmente, una serie de promotores están disponibles para la expresión del gen heterólogo en R. erythropolis (véase por ejemplo Nakashima et al., Appl.

Environ. Microbiol. 70:5557-5568 (2004), y Tao et al., Appl.

Microbiol. Biotechnol. 2005, DOI 10.1007/s00253-005-006 ) . Las alteraciones de los genes objetivo en los genes cromosómicos de R. erythropolis pueden ser creadas utilizando los métodos descritos por Tao et al., supra; y Brans et al. (Appl. Environ. Microbiol. 66: 2029-2063 (2000)) . Los genes heterólogos requeridos para la producción de 2-butanol, como se describieron anteriormente, pueden ser clonados inicialmente en pDA71 o pRhBR71 y transformados en E. coli. Los vectores pueden ser transformados entonces en R. Erythropolis por electroporación, como se describe por Kostichka et al., supra. Los materiales recombinantes se pueden hacer crecer en un medio sintético que contiene glucosa y la producción de 2-butanol puede ser seguida utilizando los métodos de fermentación conocidos en el arte. La ruta de la biosintesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en B. subtilis Los métodos para la expresión del gen y la creación de mutaciones en B. subtilis también son bien conocidas en el arte. Por ejemplo, los genes de una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser aislados de varias fuentes, como se describe anteriormente, clonados en un vector transferencia de E. coli-Bacillus modificado y transformado en Bacillus subtilis BE1010, como se describe en el ejemplo 8. Los genes deseados pueden ser clonados en el vector de expresión de Bacillus y transformados en una cepa para fabricar un elemento hospedero de producción. Alternativamente, los genes pueden ser integrados en el cromosoma de Bacillus utilizando replicones condicionales o vectores suicidas que son conocidos por un experto en el arte. Por ejemplo, el Bacillus Genetic Stock Center lleva numerosos vectores de integración.

La ruta de la biosíntesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en B. licheniformis La mayoría de los plásmidos y vectores de transferencia que se replican en B. subtilis pueden ser utilizados para transformar B. licheniformis por ya sea la transformación o electroporación del protoplasto. Los genes requeridos para la producción de 2-butanol pueden ser clonados en los plásmidos pBE20 o los derivados de pBE60 (Nagarajan et al., Gene 114:121-126 (1992)). Los métodos para transformar B. licheniformis ya son conocidos en el arte (por ejemplo véase Fleming et al. Appl . Environ. Microbiol., 61 ( 11 ): 3775-3780 (1995)). Los plásmidos construidos para la expresión en B. subtilis pueden ser transformados en B. licheniformis para producir un elemento hospedero recombinante microbiano que produce 2-butanol. La ruta de la biosíntesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa. Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Paenibacillus macerans Los plásmidos pueden ser construidos como se describió anteriormente para la expresión en B. subtilis y utilizados para transformar Paenibacillus macerans por la transformación de protoplasto para producir un elemento hospedero microbiano recombinante que produce 2-butanol. La ruta de la biosintesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Alcaligenes (Ralstonia) eutrophus Los métodos para la expresión del gen y la creación de mutaciones en Alcaligenes euthrophus ya son conocidos en el arte (véase por ejemplo Taghavi et al., Appl . Environ. Microbiol., 60 (10) : 3585-3591 (1994) ) . Los genes para la ruta biosintética de 2-butanol pueden ser clonados en cualquiera de la gama amplia de elementos hospederos descritos anteriormente y electroporados en Alcaligenes euthrophus para generar recombinantes que producen 2-butanol. La ruta de poli (hidroxibutirato) en Alcaligenes ha sido descrita con detalle, una variedad de técnicas genéticas para modificar el genoma de Alcaligenes euthrophus ya son conocidas, y estas herramientas pueden ser aplicadas para diseñar una ruta biosintética de 2-butanol. La ruta de la biosintesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa. Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Pseudomonas putida Los métodos para la expresión del gen en Pseudomonas putida ya son conocidos en el arte (véase por ejemplo Ben-Bassat et al., patente U.S. No. 6,586,629, la cual es incorporada aquí para referencia) . Los genes de una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser insertados en pPCU18, y este ADN ligado puede ser electroporado en las células DOT-Tl C5aARl de Pseudomonas putida electrocompetentes para generar recombinantes que producen 2-butanol. La ruta de la biosintesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Lactobacillus plantarum El género de Lactobacillus que pertenece a la familia de Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores utilizados en la transformación de Lactobacillus subtilis y Streptococcus pueden ser utilizados para Lactobacillus . Los ejemplos no limitativos de los vectores adecuados incluyen ???ß? y los derivados de los mismos (Renault et al., Gene 183:175-182 (1996) ; y O' Sullivan et al., Gene 137:227-231 (1193); pMBBl y pHW800, un derivado de pMBBl (Wyckoff et al. Appl. Environ. Microbiol. 62:1481-1486 (1996) ) ; pMGl, un plásmido conjugado (Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184:5800-5804 (2002)); pNZ9520 (Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63: 4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al., et al., Appl. Environ. Microbiol. 67:1262-1267 (2001) ) ; y pAT392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1899-1903 (1994)) . Varios plásmidos de Lactobacillus plantarum también han sido reportados (van Kranenburg et al., Appl. Environ.

Microbiol. 71 ( 3 ) : 1223-1230 (2005) ) . Los diversos genes para una ruta biosintética del 2-butanol pueden ser ensamblados en cualquier vector adecuado, tales como aquellos descritos anteriormente. Los codones pueden ser optimizados para la expresión basada en el índice del codón deducido de las secuencias del genoma de Lactobacillus plantarum o Lactobacillus arizonensis . Los plásmidos pueden ser introducidos en la célula hospedera utilizando los métodos conocidos en el arte, tales como la electroporación (Cruz-Rodz et al., Molecular Genetics and Genomics 224:1252-154 (1990), Bringel, et al., Appl . Microbiol. Biotechnol. 33:664-670 (1990), Alegre et al., FEMS Microbiology Letters 241:73-77 (2004) ), y conjugación (Shrago et al., Appl. Environ. Microbiol. 52:574-576 (1986)) . Los genes de la ruta biosintética de 2-butanol también pueden ser integrados en el cromosoma de Lactobacillus utilizando vectores de integración (Hols et al., Appl. Environ. Microbiol. 60:1401-1403 (1990), Jang et al., Micro. Lett. 24:191-195 (2003)) . La ruta de la biosíntesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium , y Enterococcus faecalis El género Enterococcus pertenece a la familia Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores utilizados en la transformación de Lactobacillus, Bacillus subtilis , y Streptococcus, descritos anteriormente, pueden ser utilizados para Enterococcus . Los vectores de expresión para E. faecalis utilizando el gen de nisA de Lactococcus también pueden ser utilizados (Eichenbaum et al., Appl . Environ. Microbiol. 64:2763-2769 (1998). Adicionalmente , los vectores para el reemplazo del gen en el cromosoma de E. faecium pueden ser utilizados (Nallaapareddy et al., Appl. Environ. Microbiol. 72 : 334-345 (2006) ) . Los diversos genes para una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser ensamblados en cualquier vector adecuado, tales como aquellos descritos anteriormente. Los codones pueden ser optimizados para la expresión basado en el índice del codón deducido de las secuencias del genoma de Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium. Los plásmidos pueden ser introducidos en la célula hospedera utilizando los métodos conocidos en el arte, tales como la electroporación, como se describen por Cruz-Rodz et al. (Molecular Genetics and Genomics 224:1252-154 (1990)) o conjugación, como se describe por Tanimoto et al. (J. Bacteriol. 184:5800-5804 (2002)); y Grohamann et al. (Microbiol. Mol. Biol . Rev. 67:277-3014 (2003)). La ruta de la biosíntesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa .

Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Pediococcus pentosaceus o Pediococcus acidilactici El género Pediococcus pertenece a la familia Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores utilizados en la transformación de Bacillus subtilis y Streptococcus descritos anteriormente, pueden ser utilizados para Pediococcus . Un ejemplo no limitativo de un vector adecuado es pHPS9 (Bukhtiyarova et al., Appl. Environ. Microbiol. 60:3405-3408 (1994) ) . Varios plásmidos de Pediococcus también han sido reportados (Alegre et al., FEMS Microbiology Lett. 250-151-156 (2005) ; Shareck et al., Crit. Rev. Biotechnol. 24 : 155-208 (2004) ) . Los genes para una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser ensamblados en cualquier vector adecuado, tales como aquellos descritos anteriormente. Los codones pueden ser utilizados para la expresión basada en el índice del codón deducido de la secuencia del genoma de Pediococcus pentosaceus. Los plásmidos pueden ser introducidos en la célula hospedera utilizando los métodos conocidos en el arte, tales como electroporación (véase, por ejemplo, Osmanagaoglu et al., J. Basic Microbiol. 40:233-241 (2000); Alegre et al., FEMS Microbiol. Lett. 250:151-156 (2005) ) y conjugación (González y Kunka, Appl. Environ. Microbiol. 46:81-89 (1983)) . Los genes de la ruta biosintética del 2-butanol también pueden ser integrados en el cromosoma de Pedíococcus utilizando vectores de integración (Davidson et al., Antonie van Leeuwenhoek 70:161-183 (1996) ) . La ruta de la biosintesis de la 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Medio de fermentación El medio de fermentación en la presente invención debe contener substratos de carbono adecuados. Los substratos adecuados pueden incluir pero no están limitados a monosacáridos , tales como glucosa o fructosa, oligosacáridos tales como lactosa o sucrosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa o mezclas de los mismos y mezclas no purificadas de materiales en almacenamiento no renovables tales como un material permeado del suero del queso, el licor de una infusión de maíz, las molasas de la remolacha, y la malta de la cebada. Adicionalmente , el substrato del carbón también puede ser de substratos de un carbón tales como dióxido de carbono, o de metanol para el cual la conversión metabólica en los compuestos intermedios bioquímicos clave ha sido demostrada. Además, para los substratos de uno y dos carbonos, los organismos metilotróficos también se sabe que utilizan un número de otros compuestos que contienen carbón tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, las levaduras metilotróficas se sabe que utilizan el carbón de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd. , [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32, Editor (es) : Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher; Intercept, Andover, UK) . De manera semejante, varias especies de Candida metabolizarán la alanina o el ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153:485-489 (1990) ) . Por consiguiente, está contemplado que la fuente de carbón utilizada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de substratos que comprenden carbono y solamente estará limitado por la elección del organismo. Aunque está contemplado que la totalidad de los substratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de los mismos sean adecuadas en la presente invención, los substratos de carbón preferidos son glucosa, fructosa, y sucrosa, asi como las mezclas de cualquiera de estos azúcares. La sucrosa puede ser obtenida de los materiales en almacenamiento tales como la caña de azúcar, remolacha, mandioca y sorgo dulce. La glucosa y la dextrosa pueden ser obtenidas por medio de la sacarificación de los materiales en almacenamiento a base de almidón incluyendo granos como el maíz, trigo, centeno, cebada, y avenas. Además, los azúcares fermentables pueden ser obtenidos de los materiales celulósicos y la biomasa lignocelulósica por medio de los procesos de pretratamiento y sacarificación, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente US del mismo solicitante y copendiente US 20070031918A1 , que es incorporada aquí para referencia. Biomasa se refiere a cualquier material celulósico o lignocelulósico e incluye los materiales que comprenden celulosa, y que comprenden además opcionalmente hemicelulosa , lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos . La biomasa también puede comprender componentes adicionales, tales como proteina y/o lipidos. La biomasa puede ser derivada de una sola fuente, o la biomasa puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente; por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas de maíz y forraje de maíz, o una mezcla de césped y hojas. La biomasa incluye, pero no está limitada a, cultivos bioenergéticos , residuos agrícolas, desechos sólidos municipales, desechos sólidos industriales, las suspensiones de la manufactura del papel, desechos de astilleros, desechos de madera y forestales. Los ejemplos de la biomasa incluyen, pero no están limitados a, gramos de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivos tales como las cáscaras del maíz, forraje de maíz, céspedes, trigo, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, switchgrass (panicum virgatum) , papel desechado, bagazo de la caña de azúcar, sorgo, soya, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, virutas de madera, aserrín, arbustos y matorrales, vegetales, frutas, flores y estiércol de animales . Además de una fuente apropiada de carbón, el medio de fermentación debe contener minerales adecuados, sales, cofactores, amortiguadores y otros componentes, conocidos por aquellos expertos en el arte, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de una ruta enzimática necesaria para la producción de 2-butanol o 2-butanona. Condiciones del cultivo Típicamente, las células se hacen crecer en una temperatura en el intervalo de aproximadamente 25 °C hasta aproximadamente 40 °C en un medio apropiado. El medio de crecimiento adecuado en la presente invención es el medio preparado comercialmente , común, tal como el caldo de Luria Bertani (LB) , el caldo de dextrosa de Sabourad (SD) o el caldo del medio de levadura (YM) . Otro medio de crecimiento sintético o definido también puede ser utilizado, y el medio apropiado para el crecimiento del microorganismo particular será conocido por un experto en el arte de la ciencia de la microbiología o de la fermentación. El uso de agentes que se sabe que modulan la represión del catabolito de manera directa o indirecta; por ejemplo, el 2 ' : 3 ' -monofosfato de adenosina cíclica, también puede ser incorporado en el medio de fermentación. Los intervalos de pH adecuados para la fermentación están entre pH 5.0 hasta pH 9.0, en donde se prefieren pH 6.0 hasta pH 8.0 como la condición inicial. Las fermentaciones pueden ser efectuadas bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas, en donde las condiciones anaeróbicas o microanaeróbicas son preferidas. Fermentaciones continuas y por lotes, industriales El presente proceso emplea un método por lotes de fermentación. Una fermentación clásica por lotes es un sistema cerrado en donde la composición del medio es colocada al inicio de la fermentación y no sometida a las alteraciones artificiales durante la fermentación. Asi, al inicio de la fermentación, el medio es inoculado con el organismo u organismos deseados, y se deja que ocurra la fermentación sin agregar nada al sistema. Sin embargo, típicamente una fermentación "por lotes" es un lote con respecto a la adición de la fuente de carbono y frecuentemente se hacen intentos para controlar factores tales como el pH y la concentración del oxígeno. En los sistemas por lotes las composiciones del metabolito y la biomasa del sistema cambian constantemente hasta el tiempo en el que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos por lotes las células son moderadas por medio de una fase de retardo estática hasta una fase logarítmica de crecimiento elevado y finalmente hasta una fase estacionaria en donde la velocidad de crecimiento es reducida o detenida. Si las células no son tratadas en la fase estacionaria, eventualmente morirán. Las células en la fase logarítmica generalmente son responsables de la expansión de la producción del producto final o del producto intermedio. Una variación del sistema por lotes estándares es el sistema de lotes de alimentación. Los procesos de fermentación por lotes de alimentación también son adecuados en la presente invención y comprenden un sistema por lotes típico con la excepción que el substrato es agregado en incrementos cuando la fermentación progresa. Los sistemas de alimentación por lotes son útiles cuando la represión del catabolito es apta para inhibir el metabolismo de las células y en donde sea deseable para tener cantidades limitadas del substrato en el medio. La medición de la concentración real del substrato en los sistemas de alimentación por lotes es difícil y por lo tanto se estima con base en los cambios de los factores medibles tales como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de los gases de desecho tales como CO2 -Las fermentaciones por lotes y por lotes de alimentación son comunes y son bien conocidas en el arte y se pueden encontrar ejemplos en Thomas D. Brock en Biotechnology : A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. , o Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227, (1992), incorporada aquí para referencia. Aunque la presente invención es efectuada en un modo por lotes, está contemplado que el método podría ser adaptable a métodos continuos de fermentación. La fermentación continua es un sistema abierto en donde un medio de fermentación definido es agregado continuamente a un biorreactor y una cantidad igual del medio acondicionado es removida simultáneamente para el procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene a los cultivos a una densidad elevada constante. La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento de las células o la concentración del producto final. Por ejemplo, un método mantendrá a un nutriente limitante tal como la fuente del carbón o el nivel del nitrógeno a una tasa fija y permitirá que todos los otros parámetros sean moderados. En otros sistemas, un número de factores que afectan el crecimiento pueden ser alterados continuamente mientras que la concentración de las células, medida por la turbidez del medio de cultivo, es mantenida constante. Los sistemas continuos se esfuerzan en mantener las condiciones de un crecimiento en estado permanente y asi la pérdida de las células debido a que el medio es extraído, debe ser balanceado contra la velocidad de crecimiento de las células en la fermentación. Los métodos de modulación de los nutrientes y los factores del crecimiento para los procesos de fermentación continua así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación del producto son bien conocidos en el arte de la microbiología industrial y una variedad de métodos son detallados por Brock, supra. Está contemplado que la presente invención puede ser practicada utilizando procesos ya sea por lotes, por lotes de alimentación o continuos y que cualquier modo conocido de fermentación podría ser adecuado. Adicionalmente, está contemplado que las células pueden ser inmovilizadas sobre un substrato porque los catalizadores de las células totales y sometidos a las condiciones de fermentación para la producción de 2-butanol o 2-butanona. Métodos para el aislamiento de 2-butanol y 2-butanona a partir del medio de fermentación El 2-butanol bioproducido puede ser aislado del medio de fermentación utilizando los métodos conocidos en el arte para las fermentaciones de ABE (véase por ejemplo, Durre Appl. Microbiol. Biotechnol. 46:639-648 (1998), Groot et al., Process Bíochem. 27:61-75 (1992), y las referencias de allí) . Por ejemplo, los sólidos pueden ser removidos del medio de fermentación por centrifugación, filtración, decantación, o semejantes. Luego, el 2-butanol puede ser aislado del medio de fermentación utilizando los métodos tales como la destilación, destilación azeotrópica, extracción líquido-líquido, adsorción, destilación del gas, evaporación a través de una membrana, o pervaporación. Estos mismos métodos pueden ser adaptados para aislar la 2-butanona bioproducida del medio de fermentación.

Ej emplos La presente invención está definida además en los siguientes ejemplos. Se debe entender que estos ejemplos, aunque indican una modalidad preferida de la invención, están dados solamente a manera de ilustración. De la descripción anterior y de estos ejemplos, un experto en el arte puede averiguar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, pueden hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varios usos y condiciones. Métodos generales Las técnicas de clonación molecular y del ADN, recombinantes, estándares, descritas en los ejemplos son bien conocidas en el arte y son descritas por Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, (1989) (Maniatis); y por T. J. Silhavy, M. L. Bennan, y L. . Enquist, Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols ín Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc. y iley-Interscience (1987) . Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y el crecimiento de los cultivos bacterianos ya son bien conocidos en el arte. Las técnicas adecuadas para su uso en los siguientes ejemplos pueden ser encontradas como se describe en Manual of Methods for General Bacteriology (Philipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, illis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillipps, eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)) o por Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989) . Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales descritos para el crecimiento y mantenimiento de las células bacterianas fueron obtenidos de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI) , BD Diagnostic Systems (Sparks, MD) , Life Technologies (Rockville, MD) , o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que se especifique de otra manera. Las cepas bacterianas son obtenidas de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) a menos que se señale de otra manera . Los cebadores de oligonucleótidos descritos en los siguientes ejemplos están dados en la tabla 4. Todos los cebadores de oligonucleótidos fueron sintetizados por Sigma-Genosys (Woodlands, TX) . Tabla 4 Cebadores para la clonación y selección budA B11 GATCGAATTCGTTTAAACT 25 fctdABC TAG I 1 1 1 CTACCGCACG delantero budC B12 GATCGCATGCAAGCTTTC 26 budABC ATATAGTCGGAATTCC inverso pddA B13 GATCGAATTCGTTTAAACA 27 ddABC AAGGAGGTCTGATTCATG delantero AGATCG pddC B14 GATCGGATTCTTAATCGT 28 pddABC CGCC inverso sadh B1S GATCGGATCCAAAGGAGG 29 sadh TCGGGCGCATGAAAGCC delantero C sadh B16 GATCTCTAGAAAGCTTTC 30 sadh AGCCCGGGACGACC inverso — BenF ACTTTCTTTCGCCTGTTTC 31 — AC BenBPR CATGAAGCTTGTTTAAACT 32 CGGTGACCTTGAAAATAA TGAAAACTTATATTG l l l l GAAAATAATGAAAACTTAT ATTG budAB BABC F GAGCTCGAATTCAAAGGA 33 budAB GGAAGTGTATATGAATCA delantero TTC budAB BAB R GGATCCTCTAGAATTAGT 34 budAB TAAATACCATCCCGCCG inverso budC BC Spe F ACTAGTAAAGGAGGAAAG 40 budC AGTATGAAGAAGGTCGCA delantero CT budC BC Xba R TCTAGAAAGCAGGGGCAA 41 budC GCCATGTC inverso pddAB DDo For AAGCTTAAAGGAGGCTGA 44 pddABC-ddrAB C- TTCATGAGATCGAAAAGA delantero ddrAB TT pddAB DDo Rev TCTAGATTATTCATCCTGC 45 pddABC-ddrAB C- TGTTCTCC inverso ddrAB chnA ChnA F CATCAATTGACTACGTAG 54 chnA TCGTACGTGTAAGGAGGT delantero TTGAAATGGAAAAAATTAT G chnA ChnA R CATGCTAGCCCCGGGTAT 55 chnA CTTCTACTCAI 1 1 1 1 IATTT inverso CG — Top ter F1 CTAGAAGTCAAAAGCCTC 58 delantero CGACCGGAGGC 1 1 1 I GA Top ter F2 CTGCTCGAGTTGCTAGC 59 delantero AAGTTTAAACAAAAAAAA GCCCGCTCATTAGGCGG GCTGAGCT Bot ter I CAGCCCGCCTAATGAGC 60 inverso GGGC I 1 1 1 1 1 1 I GTTTAA AC Bot ter R2 TTGCTAGCAACTCGAGCA 61 inverso GTCAAAAGCCTCCGGTC GGAGGC I 1 1 I GACTT KA-AT OT872 CTCCGGAATTCATGTCTG 127 Aniinoalcohol ACGGACGACTCACCGCA cinasa/liasa operen delantero KA-AT OT873 TTCCAATGCATTGGCTGC 128 Amnoalcohol AGTTATCTCTGTG CACG A cinasa/liasa GTGCCGATGA operen inverso KA OT879 AACAGCCAAGCTTGGCT 129 Aminoalo ol GCAGTCATCGCGCATTCT cinasa CCGGG inversa AT OT880 TCTCCGGAATTCATGACG 130 Aminoaloohol TCTGAAATGACAGCGACA liasa GAAG delantera pBAD. OT909 GCTAACAGGAGGAAGAA 131 agregar a siti< HisB TTCATGGGGGGTTCTC EcoRI para reemp.sitio Nccjl pBAD. OT910 GAGAACCCCCCATGAATT 132 agregar a sitio HisB CTTCCTCCTGTTAGC EocRI para rearp.sitio Ebol BudAB N84soqR3 GGACCTGCTTCGCTTTAT 59 inverso CG APT APTfor GCGCGCCCGGGAAGAAG 162 AF GAGCTCTTCACCATGAAC delantero AAACCACAGTCTTGG APT APTrev GCGCGCCCGGGTTCATG 163 AFT CCACCTCTGCG inverso Tabla 5 Cebadores de Secuenciación Gen SEE ID Neniare Secuencia específico NO: M13 delantero GTAAAACGACGGCCAGT — 35 M13 inverso AACAGCTATGACCATG — 36 N83 SeqF2 GCTGGATTACCAGCTCGACC - 37 N83 SeqF3 CGGACGCATTACCGGCAAAG — 38 N84 Seq R2 GCATCGAGATTATCGGGATG — 65 84 SeqR4 CGAAGCGAGAGAAGTTATCC ~ 39 Tre F TTGACAATTAATCATCCGGC todos 42 Trc R CTTCTCTCATCCGCCAAAAC todos 43 pddABC- DDko seq F2 GCATGGCGCGGATTTGACGAAC 46 ddrAB pddABC- DDko seq F5 CATTAAAGAGACCAAGTACGTG 47 ddrAB pddABC- DDko seq F7 ATATCCTGGTGGTGTCGTCGGCGT 48 ddrAB pddABC- DDko seq F9 TCTTTGTCACCAACGCCCTGCG 49 ddrAB pddABC- DDko seq R1 GCCCACCGCGCTCGCCGCCGCG 50 ddrAB pddABC- DDko seq 3 CCCCCAGGATGGCGGCTTCGGC 51 ddrAB pddABC- DDko seq R7 GGGCCGACGGCGATAATCACTT 52 ddrAB pddABC- DDko seq R10 TTCTTCGATCCACTCCTTAACG 53 ddrAB chnSeq F1 CTCAACAGGGTGTAAGTGTAGT chnA 56 chnSeq R1 CGTTTTGATATAGCCAGGATGT chnA 57 pCL1925 vec F CGGTATCATCAACAGGCTTACC todos 62 pCL1925 vec R1 AGGGTTTTCCCAGTCACGACGT todos 63 pCL1925 vec R2 CGCAATAGTTGGCGAAGTAATC todos 64 APTseqRev GCTAGAGATGATAGC APT 160 APTseqFor GGAAGAGACTATCCAGCG APT 161 Métodos para la determinación de la concentración de 2-butanol y 2-butanona en el medio de cultivo La concentración de 2-butanol y 2-butanona en el medio de cultivo puede ser determinada por un número de métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, un método de cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) utiliza una columna Shodex SH-1011 con una columna protectora Shodex SH-G, ambas compradas de Waters Corporation (Milford, MA) , con una detección del índice de refracción (IR). La separación cromatográfica se logró utilizando H2S04 0.01 M como la fase móvil con una velocidad de flujo de 0.5 ml/min y una temperatura de la columna de 50 °C. Bajo las condiciones utilizadas, la 2-butanona y el 2-butanol tuvieron tiempos de retención de 39.5 y 44.3 min, respectivamente. Alternativamente, los métodos de cromatografía en fase gaseosa (GC) están disponibles. Por ejemplo, un método de GC específico utiliza una columna HP-INNOWax (30 m x 0.53 mm id, espesor de la película de 1 µt?, Agilent Technologies, Wilraington, DE) , con un detector de ionización de la flama (FID) . El gas portador fue helio a una velocidad de flujo de 4.5 ml/min, medido a 150 °C con una presión hidrostática constante; la separación del inyector fue de 1:25 a 200 °C; la temperatura del horno fue de 45 °C durante 1 minuto, 45 hasta 220 °C a 10 °C/minuto, y 220 °C durante 5 minutos; y la detección de FID se empleó a 240 °C con 26 ml/min de gas de composición de helio. Los tiempos de retención de la 2-butanona y 2-butanol fueron de 3.61 y 5.03 minutos, respectivamente . La 2-butanona también puede ser detectada por derivación con 3-metil-2-benzotriazolinona hidrazona (MBTH) . Una solución acuosa que contiene 2-butanona es mezclada con un volumen igual de una solución acuosa de 6 mg/ml de MBTH en 375 mM de glicina-HCl (pH 2.7) y se incuba a 100 °C durante 3 minutos. Las muestras derivadas de MBTH resultantes son analizadas sobre una columna Supelosil LC-18-D5 de 5 µt?, de 25 cm x 4.6 mm (id) (Supelco) utilizando una fase móvil de 55 % de acetonitrilo en agua a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El derivado de 2-butanona aparece como dos picos (isómeros cis y trans) con tiempos de retención de aproximadamente 12.3 y 13.3 min y una absorbancia máxima de 230 y 307 nm.

El significado de las abreviaturas es como sigue: "s" significa segundo(s), "min" significa minuto(s), "h" significa hora(s), "psi" significa libras por pulgada cuadrada, "nm" significa nanómetros, "d" significa dia(s), "µ? ' significa microlitro ( s ) , "mi" significa mililitro ( s ) , "1" significa litro (s), "mm" significa milímetro ( s ) , "nm" significa nanómetros, "m " significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol (es ) , "µ????" significa micromol (es ) , "g" significa gramo (s), NVg" significa microgramo ( s ) y "ng" significa nanogramo ( s ) , "PCR" significa reacción en cadena de la polimerasa", "OD" significa densidad óptica, "OD60o" significa la densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm, "kDa" significa kilodaltons, "g" significa la constante gravitacional , "bp" significa par (es) base, "kbp" significa par (es) de kilobase ( es ) , "% p/v" significa por ciento en peso/volumen, "% v/v" significa por ciento en volumen/volumen", "% peso" significa por ciento en peso, "CLAR" significa cromatografía líquida de alta resolución, y "GC" significa cromatografía en fase gaseosa. El término "selectividad molar" es el número de moles del producto producidos por mol del substrato de azúcar consumido y es reportado como un porcentaje. Ejemplo 1 Clonación y expresión de la acetolactato sintasa El propósito de este ejemplo fue la clonación y expresión en E. coli del gen budB que codifica la enzima de acetolactato sintasa. El gen de budB fue amplificado por el ADN genómico de la cepa ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae utilizando PCR. La secuencia de budB que codifica la acetolactato sintasa fue amplificada a partir del ADN genómico de Klebsiella pneumoniae (ATCC 25955) por PCR utilizando el par de cebadores Bl (SEC ID NO: 15) y B2 (SEC ID NO: 16) . Otros reactivos de amplificación por PCR (por ejemplo la ADN polimerasa de Kod HiFi (Novagen Inc., Madison, I; catálogo no. 71805-3) ) fue suministrado en los kits de los fabricantes y utilizados de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN genómico de Klebsiella pneumoniae se prepara utilizando el kit de Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, N; número de catalogo D-5000A) . La amplificación fue llevada a cabo en una máquina termocicladora de ADN GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) y la secuencia predicha de los aminoácidos de la enzima están dados como la SEC ID NO: 3 y la SEC ID NO: 4, respectivamente. Para los estudios de la expresión se utilizó la tecnología de clonación de Gateway (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) . El vector de entrada pENTR/SD/D-TOPO permite la clonación direccional y proporciona una secuencia de Shine-Dalgarno para el gen de interés. El vector de destino pDEST de 14 utilizó un promotor de T7 para la expresión del gen sin etiqueta. El cebador delantero incorporó cuatro bases (CACC) adyacentes inmediatamente al codón de partida traduccional para permitir la clonación direccional del producto de PCR de la región de codificación de la acetolactasa budB en pENTR/SD/D-TOPO ( Invitrogen ) , generando el plásmido pENTRSDD-TOPObudB . La construcción de pENTR fue transformada en las células ToplO de E. coli (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los transformantes se hicieron crecer toda la noche y el ADN del plásmido se prepara utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Valencia, CA; catálogo no. 27106) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para crear un clon de expresión, la región de codificación, de budB de pENTRSDD-TOPObudB se transfiere al vector pDEST 14 por la recombinación in vitro utilizando la mezcla de LR Clonase (Invitrogen, Corp. Carlsbad, CA) . El vector resultante, pDEST14 budB, se transforma en las células BL-21-AI (Invitrogen Corp.). Las células BL-21-A1 llevan una copia cromosómica de la T7 ARN polimerasa bajo el control del promotor araBAD inducido por arabinosa. Los transformantes son inoculados en el medio LB suplementado con 50 µg/ml de ampicilina y se hicieron crecer toda la noche. Una alícuota del cultivo toda la noche es utilizado para inocular 50 mi del medio de LB suplementado con 50 µg/ml de ampicilina. El cultivo es incubado a 37 °C con agitación hasta que la OD60o alcance 0.6-0.8. El cultivo es dividido en dos porciones de 25 mi y se agrega arabinosa a uno de los frascos a una concentración de 0.2 % p/v. El frasco de control negativo no es inducido con arabinosa. Los frascos son incubados durante 4 h a 37 °c con agitación. Las células fueron colectadas por centrifugación y las pelotillas de las células son resuspendidas en MOPS 50 mM, en un amortiguador de pH 7.0. Las células son alteradas ya sea por sonicación o por el paso a través de un aparato French Pressure Cell. Cada lisado celular es centrifugado produciendo el sobrenadante y la pelotilla o la fracción insoluble. Una alícuota de cada fracción (el lisado celular completo, de las células inducidas y de control), es resuspendido en SDS que es el amortiguador de la carga (MES) ( Invitrogen) , se calienta a 85 °C durante 10 minutos y se somete a análisis de SDS-PAGE (NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Gel, catalogo no. NP0322Box, Invitrogen) . Una proteína del peso molecular esperado, como es deducido de la secuencia de los ácidos nucleicos está presente en el cultivo inducido pero no en el control no inducido. La actividad de la acetolactato sintasa en los extractos libres de la célula es medida utilizando el método descrito por Bauerle et al. (Bauerle et al. (1964) Biochem. Biophys. Acta 92:142-149) . La concentración de la proteína es medida ya sea por el método de Bradford o por el kit de Bicinchoninic (Sigma, catálogo no. BCA-1; St. Louis, MO) utilizando la albúmina de suero de bovino (BSA) (Bio-Rad, Hercules, CA) , como el estándar . Ejemplo 2 Clonación y expresión de la acetolactato descarboxilasa El propósito de este ejemplo fue la clonación y expresión en E. coli del gen budB que codifica la enzima de acetolactato descarboxilasa. El gen de budB fue amplificado a partir del ADN genómico de la cepa ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae utilizando PCR. La secuencia budB que codifica la acetolactato descarboxilasa fue clonada de la misma manera que se describió para budB en el ejemplo 1, excepto que los cebadores utilizados para la amplificación de PCR fue de B3 (SEC ID NO: 17) y B4 (SEC ID NO: 18) . La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORE) y la secuencia predicha de los aminoácidos de la enzima están dados como SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, respectivamente. El plásmido resultante fue nombrado pENTRSDD-TOPObudA. La actividad de la acetolactato descarboxilasa en los extractos libres de la célula es medida utilizando el método descrito por Bauerle et al., supra.

Ejemplo 3 (Profético) Clonación y expresión de la butandiol deshidrogenase El propósito de este ejemplo profético es describir como se clona y se expresa en E. coli del gen budC que codifica la enzima de butandiol deshidrogenasa . El gen de budC es amplificado a partir del ADN genómico de la cepa IAM1063 de Klebsiella pneumoniae utilizando PCR. La secuencia de budC que codifica la butandiol deshidrogenasa es clonada y expresada de la misma manera que la descrita para budA en el ejemplo 1, excepto que los cebadores utilizados para la amplificación por PCR son B5 (SEC ID NO: 19) y B6 (SEC ID NO: 20) y el ADN del molde genómico es de IAM1063 de Klebsiella pneumoniae (el cual es obtenido del Institute of Applied Microbiology Culture Collection, Tokio, Japón) . El ADN genómico de IAM1063 de Klebsiella pneumoniae es preparado utilizando el kit de Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, N; número de catalogo D-5000A) . La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierta (ORF) y la secuencia de aminoácidos predicha de la enzima están dados como la SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6, respectivamente. La actividad de la butandiol deshidrogenasa en los extractos de las células libres es medida espectrofotométricamente por el siguiente consumo de NADH a una absorbancia de 340 nm.

Ejemplo 4 (Profético) Clonación y expresión de la butandiol deshidrogenase El propósito de este ejemplo profético es describir como clonar y expresar en E. coli los genes de pddA, pddB y pddC que codifican la butandiol deshidratasa . Los genes de pddA, pddB y pddC son amplificados a partir del ADN genómico del ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca utilizando PCR. Las secuencias de pddA, pddB y pddC que codifican la butandiol deshidratasa son clonados y expresados de la misma manera que se describió para budA en el ejemplo 1, excepto que el ADN del molde genómico es de ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca, y los cebadores PCR son B7 (SEC ID NO: 21) y B8 (SEC ID NO: 22) . El ADN genómico de Klebsiella oxytoca es preparado utilizando el kit de Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catalogo D-5000A) . Un producto de PCR único incluyendo la totalidad de los tres marcos de lectura abierta (ORF) es clonado, de modo que la totalidad de las tres regiones de codificación sean expresadas como un operón desde un promotor único sobre el plásmido de expresión. Las secuencias de nucleótidos de los marcos de lectura abierta para las tres subunidades son provistas como las SEC ID NOs : 7, 9, y 11, respectivamente y las secuencias de aminoácidos predichas de las tres subunidades de la enzima están provistas como las SEC ID NOs: 8, 10 y 12, respectivamente.

La actividad de la butandiol deshidratasa en los extractos libres de células es medida derivando el producto de cetona con 2 , 4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) . Brevemente, 100 µ? de a mezcla de reacción, el extracto celular que contienen aproximadamente 0.0005 unidades de enzima, el amortiguador de fosfato de potasio 40 mM (pH 8.0), 2 µg de adenosilcobalamina , 5 µg de 2 , 3-butandiol , y 1 9 de albúmina del suero de bovino, es apagada por la adición de un volumen igual de 0.05 % en peso de DNPH en HC1 1.0 N. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, el color es desarrollado por la adición de 100 µ? de NaOH 4 N . La cantidad del producto es determinada a partir de la absorbancia de la solución final a 550 nm comparado con la curva estándar preparada con 2-butanona. Todas las reacciones son llevadas a cabo a 37 °C bajo una luz roja difusa. Ejemplo 5 (Profético) Clonación y expresión de la butanol deshidrogenasa El propósito de este ejemplo profético es describir como clonar y expresar en E. coli el gene de sadh que codifica la butanol deshidrogenasa. El gen sadh es amplificado a partir del ADN genómico de la cepa 219 de Rhodococcus ruber utilizando PCR. La secuencia sadh que codifica la butanol deshidrogenasa es clonada y expresada de la misma manera que la descrita para budA en el ejemplo 1, excepto que el ADN del molde genómico es de la cepa 219 de Rhodococcus ruber (Meens, Institut fuer Mikrobiologie, Universitaet Hannover, Hannover, Alemania) y los cebadores son B9 (SEC ID NO: 23) y B10 (SEC ID NO: 24) . El ADN genómico de Rhodococcus ruber es preparado utilizando el kit de aislamiento del ADN microbiano Ultra Clean™ (MO BIO Laboratories Inc., Carlsbad, CA) , de acuerdo con el protocolo del fabricante. La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierta (ORF) y la secuencia de aminoácidos predicha de la enzima están dados como la SEC ID NO: 13 y la SEC ID NO: 14, respectivamente. La actividad de la butanol deshidrogenasa en los extractos de la célula libre es medida siguiendo el incremento en la absorbancia a 340 nm que resulta de la conversión de NAD a NADH cuando la enzima es incubada con NAD y 2-butanol. Ejemplo 6 (profético) Construcción de un vector de transformación para los genes en una ruta biosintética de 2-butanol El propósito de este ejemplo es describir la preparación de un vector de transformación para los genes en una ruta biosintética de 2-butanol (es decir, la ruta 3, como se describió anteriormente) . De manera semejante a la mayoría de los organismos, E. coli convierte la glucosa inicialmente al ácido pirúvico. Las enzimas requeridas para convertir el ácido pirúvico al 2-butanol siguiendo la ruta 3, es decir, la acetolactato sintasa, la acetolactato descarboxilasa , la butandiol deshidrogenasa , la butandiol deshidratasa , y la butanol deshidrogenasa, son codificadas por los genes de budA, budB, budC, pddA, ppdB, pddC y sadh. Para simplificar la construcción de la ruta biosintética de 2-butanol en un organismo recombinante , los genes que codifican las 5 etapas en la ruta son separados en dos operones. La ruta superior comprende las primeras tres etapas catalizadas por la acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, y butandiol deshidrogenasa. La ruta inferior comprende al menos dos etapas catalizadas por la butandiol deshidratasa y la butanol deshidrogenasa. Las secuencias de codificación son amplificadas por PCR con los cebadores que incorporan los sitios de restricción para la clonación posterior, y los cebadores delanteros contienen un ciclo de aglutinación del ribozoma de E. coli optimizado (AAAGGAGG) . Los productos de PCR son clonados en TOPO en el vector de pCR4Blunt-TOPO y transformados en las células ToplO ( Invitrogen) . El ADN del plásmido es preparado a partir de los clones de TOPO, y la secuencia del fragmento de PCR clonado es verificada. Las enzimas de restricción y la ligasa de ADN de T4 (New England, Biolabs, Beverly, MA) son utilizados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para los experimentos de clonación, los fragmentos de la extracción son purificados en un gel utilizando el kit de extracción en un gel de QIAquick (Qiagen) . Después de la confirmación de la secuencia, las regiones de codificación son subclonadas en un vector de pUC19 modificado como una plataforma de clonación. El vector pUC19 es modificado por una digestión de Hindl I I /SapI , seguido por el tratamiento con la ADN polimerasa para el llenado de los extremos. El fragmento del vector de 2.4 kB es purificado con un gel y religado creando pUC19dHS. Alternativamente, el vector pUC19 es modificado por una digestión de Sphl/SapI, seguido por el tratamiento con la ADN polimerasa de Klenow para separar los extremos. El fragmento del vector de 2.4 kB es purificado en un gel y religado creando UC19dSS. Las digestiones remueven el promotor lac adyacente al MCS (sitios de clonación múltiples), previniendo la transcripción de los operones desde el vector. Ruta superior: Las regiones de codificación de budABC son amplificadas a partir del ADN genómico de Klebsiella pneumoniae por PCR utilizando el par de cebadores Bll y B12 (tabla 4), provistos como las SEC ID NOs: 25 y 26, respectivamente. El cebador delantero incorpora un sitio de restricción de EcoRI y un sitio de aglutinación del ribosoma (RBS). El cebador inverso incorpora un sitio de restricción de Sphl. El producto de PCR es clonado en pCR4 Blunt-TOPO creando pCR4 Blunt-TOPO-budABC . Para construir el operón de la ruta superior el pCR4 Blunt-TOPO-budABC es digerido con EcoRI y Sphl liberando un fragmento de budABC de 3.2 kbp. El vector de bucl9dSS también es digerido con EcoRI y Sphl, liberando un fragmento del vector de 2.0 kbp. El fragmento de budABC y el fragmento del vector son ligados conjuntamente utilizando la T4 ADN ligasa (New England Biolabs) para formar pUCl 9dSS-budABC . Ruta inferior: Las regiones de codificación de pddABC son identificadas a partir del ADN genómico del ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca por PCR utilizando los cebadores B13 y B14 (tabla 4), provistos como las SEC ID NOs : 27 y 28, respectivamente, creando un producto de 2.9 kbp. El cebador delantero incorpora los sitios de restricción de EcoRI y Pmel y un RBS. El producto de PCR es clonado en pCRBlunt II-TOPO creando pCRBluntlI-pdd. El gen de sadh es amplificado a partir del ADN genómico de la cepa 219 de Rhodococcus ruber por PCR utilizando los cebadores B15 y B16 (tabla 4), provistos como las SEC ID NOs: 29 y 30, respectivamente, creando un producto de 1.0 kbp. El cebador delantero incorpora un sitio de restricción de BamHI y un RBS. El cebador inverso incorpora un sitio de restricción de Xbal. El producto de PCR es clonado en pCRBlunt II-TOPO creando pCRBluntlI-sadh .

Para construir el operón de la ruta inferior, un fragmento de EcoRI de 2.9 kbp y el fragmento de BamHI de pCRBluntlI-pdd, un fragmento de BamHI y de Xbal de 1.0 kbp de pCRBluntlI-sadh, y el fragmento grande de una digestión de EcoRI y de Xbal de pUC19dHS son ligados conjuntamente. La ligación de tres vías crea pUCl 9dHS-pdd-sadh . El vector de pUCl 9dSS-pudABC es digerido con Pmel y HindIII liberando un fragmento de 3.2 kbp que es clonado en pBenBP, un vector de transferencia de E. coli-B. subtilis . El plásmido pBenBP es creado por la modificación del vector pBE93, el cual es descrito por Nagarajan (WO 93/2463, ejemplo 4) . Para generar pBenBP, la secuencia de la señal del promotor de la proteasa neutral de Bacillus amyloliquefaciens (NPR) y el gen de phOA son removidos de pBE93 o una digestión de NcoI/HindIII . El promotor de NPR es amplificado por PCR a partir de pBE93 por los cebadores BenF y BenBPR, proporcionando las SEC ID NOs : 31 y 32, respectivamente. El cebador BenBPR incorpora los sitios de BstEII, Pmel y HindIII corriente abajo del promotor. El producto de PCR es digerido con Ncol y HindIII, y el fragmento es clonado en los sitios correspondientes en el vector pBE93 para crear pBenBP. El fragmento del operón superior es subclonado en los sitios de Pmel y HindIII en pBenBP creando pBen-budABC. El vector de pUCl 9dHS-pdd-sadh es digerido con Pmel y HindIII liberando un fragmento de 3.9 kbp que es clonado en los sitios Pmel y HindIII de pBenBP, creando pBen-pdd-sadh . Ejemplo 7 (Profético) Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol en una ruta biosintética en E. coli El propósito de este ejemplo profético es describir como expresar una ruta biosintética de 2-butanol en E. coli. Los plásmidos de pBen-budABC y pBen-pdd-sadh, preparados como se describe en el ejemplo 6, son transformados separadamente en NM522 de E. coli (ATCC No. 47000), y la expresión de los genes en cada operón es verificado por el análisis de SDS-PAGE y el ensayo de la enzima. Después de la confirmación de la expresión de todos los genes, pBen-budABC es digerido con EcoRI y HindIII para liberar el fragmento del promotor de NPR-budABC. El fragmento es dividido en los extremos utilizando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa (New England Biolabs, Catalogo No. M0210S) . El plásmido pBen-pdd-sadh es digerido con EcoRI y dividido de manera semejante para crear un fragmento del vector dividido en los extremos, linearizado. Los fragmentos del vector y de NPR-budABC son ligados, creando p2B0H. Este plásmido es transformado en NM522 de E. coli para dar NM522/p2BOH de E. coli, y la expresión de los genes es verificada como se describió previamente. El NM522/p2BOH de E. coli es inoculado en un recipiente de agitación de 250 mi que contiene 50 mi del medio y se agitan a 250 rpm y 35 °C. El medio está compuesto de: dextrosa, 5 g/1; MOPS, 0.05 M, sulfato de amonio, 0.01 M; fosfato de potasio, monobásico, 0.005 M; una mezcla de metales de S10, 1 % (v/v) ; extracto de levadura, 0.1 % (p/v) ; casaminoácidos, 0.1 % (p/v), tiamina, 0.1 mg/1; prolina 0.05 mg/1; y biotina 0.002 mg/1, y es titulada a pH 7.0 con KOH . La mezcla de metales de S10 contiene MgCl2 200 mM, CaCl2, 70 mM; MnCl2, 5 mM; FeCl3, 0.1 mM; ZnCl2, 0.1 mM; clorhidrato de tiamina, 0.2 mM, CuS04, 172 µ?, CoCl2, 253 µ?; y Na2Mo04; 242 µ?. Después de 18 horas, el 2-butanol es detectado por análisis de CLAR o de GC utilizando los métodos que son bien conocidos en el arte, por ejemplo, como se describe en la sección de métodos generales anterior. Ejemplo 8 (Profético) Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol en Bacillus subtilis El propósito de este ejemplo profético es describir como expresar una ruta biosintética de 2-butanol en Bacillus subtilis . Los plásmidos de pBen-budABC y pBen-pdd-sadh preparados como se describe en el ejemplo 6, son transformados separadamente en BE1010 de bacillus subtilis (J. Bacteriol. 173:2278-2282 (1991) ) y la expresión de los genes en cada operón es verificada como se describe en el ejemplo 7. El plásmido pBen-budABC es digerido con EcoRI y HindIII para liberar el fragmento de budABC-promotor NPR. El fragmento es dividido en los extremos utilizando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa (New England Biolabs, Catálogo No. 0210S) . El plásmido pBen-pdd-sadh es digerido con EcoRI y dividido de manera semejante para crear un fragmento del vector dividido en los extremos, linearizado. El vector y los fragmentos de NPR-budABC son ligados, creando p2BOH. Este plásmido es transformado en BE1010 de Bacillus subtilis para dar BE1010/p2BOH de Bacillus subtílis , y la expresión de los genes es verificada como se describió previamente . BE1010/p2BOH de Bacillus subtilis es inoculado en un recipiente de agitación de 250 mi que contiene 50 mi del medio y se agita a 250 rpm y 35 °C durante 18 h. El medio está compuesto de: dextrosa, 5 g/1; MOPS, 0.05 M, sulfato de amonio, 0.01 ; fosfato de potasio, amortiguador monobásico, 0.005 M; una mezcla de metales de S10, 1 % (v/v) (como se describe en el ejemplo 7) ; extracto de levadura, 0.1 % (p/v) ; casaminoácidos, 0.1 % (p/v) ; triptófano, 50 mg/1; metionina 50 mg/1; y lisina 50 mg/1, y es titulada a pH 7.0 con KOH. Después de 18 horas, el 2-butanol es detectado por análisis de CLAR o de GC utilizando los métodos que son bien conocidos en el arte, por ejemplo, como se describe en la sección de métodos generales anterior.

Ejemplo 9 Construcción de un vector de transformación para los genes en una ruta biosintética de 2-butanol El propósito de este ejemplo fue preparar un elemento hospedero de E. coli recombinante que lleva los genes en una ruta biosintética de 2-butanol (es decir, la ruta 3 como se describió anteriormente) . De manera semejante a la mayoría de los organismos, E. coli convierte la glucosa inicialmente al ácido pirúvico. Las enzimas requeridas para convertir el ácido pirúvico a 2-butanona en la ruta 3, es decir, la acetatolactato sintasa, acetatolactato descarboxilasa , butandiol deshidrogenasa , y butandiol deshidratasa son codificados por los genes budA, budB , budC, pddA, ppdB y pddC . En la última etapa de la ruta, una butanol deshidrogrenasa convierte la 2-butanona al 2-butanol. Las deshidrogenasas que llevan a cabo esta última etapa son promiscuas y pueden ser encontradas en muchos organismos. Para construir de manera amplificada la ruta biosintética de 2-butanol en un organismo recombinante, los genes que codifican las 5 etapas en la ruta fueron separados en operones múltiples. El operón de la ruta superior comprendió las primeras tres etapas catalizadas por la acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, y butandiol deshidrogenasa y fueron clonados sobre un vector de expresión. La ruta inferior comprendió las últimas dos etapas catalizadas por la butandiol deshidratasa incluyendo el factor de reactivación (Mori et al., J. Biol . Chem. 272:32034 (1997)) y una butanol deshidrogenasa . La diol deshidratasa puede padecer la inactivación suicida durante la catálisis. La proteina del factor de reactivación codificada por ddrA y ddrB (GenBank AF017781, SEC ID NO: 70) reactiva la enzima inactiva. Los genes de ddrA y ddrB flanquean el operón de la diol deshidratasa. Los operones para la deshidratasa/factor de reactivación y la butanol deshidrogenasa fueron ya sea clonados sobre otro vector de expresión o la deshidratasa/operón del factor de reactivación fue clonado de manera única sobre el otro vector de expresión y la última etapa fue provista por una actividad endógena en el elemento hospedero de demostración. Construcción del vector pTcr99a-budABC Las regiones de codificación de budAB fueron amplificadas a partir del ADN genómico de ATCC 24955 de K. pneumoníae por PCR utilizando el par de cebadores BABC F y BAB R, dadas como las SEC ID NOs: 33 y 34, respectivamente (véase la tabla 4) creando un producto de 2.5 kbp . El cebador delantero incorporó los sitios de restricción de SacI y EcoRI y un sitio de aglutinación del ribosoma (RBS) . El cebador inverso incorporó un sitio de restricción de Spel. El producto de PCR fue clonado en pCR4 Blunt-TOPO creando pCR4 Blunt-TOPO-budAB . El ADN del plásmido fue preparado a partir de los clones de TOPO y la secuencia de los genes fue verificada con los cebadores M13 delantero (SEC ID NO: 35) , M13 inverso (SEC ID NO: 36), N83 SeqF (SEC ID NO: 37), N83 SeqF3 (SEC ID NO: 38), y N84 SeqR4 (SEC ID NO: 39) (véase la tabla 5) . La región de codificación de budC fue amplificada a partir del ADN genómico del ATCC 25955 de K. pneumoniae por PCR utilizando el par de cebadores BC Spe F y BC Xba R provistos como SEC ID NOs : 40 y 41, respectivamente, creando un producto de 0.8 kbp. El cebador delantero incorporó un sitio de restricción de Spel, un RBS y modificó el CDS cambiando el segundo y tercer codones desde AAA hasta AAG. El cebador inverso incorporó un sitio de restricción de XabI . El producto de PCR fue clonado en pCR4 Blunt-TOPO creando pCR4 Blunt-TOPO-budC . El ADN del plásmido fue preparado a partir de los clones de TOPO y las secuencias de los genes fue verificada con los cebadores M13 delantero (SEC ID NO: 35) y M13 inverso (SEC ID NO: 36) . Para construir el operón de budABC, pCR4 Blunt-TOPO-budC se digiere con SnaBI y XabI liberando un fragmento de budC de 1.0 kbp. El vector pTrc99a (Amann et al., Gene 69 (2) : 301-315 (1992) ) fue digerido con Smal y Xbal creando un fragmento del vector linearizado de 4.2 kbp. El vector y el fragmento de budC fueron ligados para crear pTrc99a-budC y se transformó en las células ToplO de E. coli (Invitrogen) . Los transformantes fueron analizados por amplificación por PCR con los cebadores Trc F (SEC ID NO: 42) y Trc R (SEC ID NO: 43) para un producto de 1.2 kbp para confirmar la presencia del inserto de budC. Los genes de budAB fueron subclonados a partir de pCR4 Blunt-TOPO-budAB como un fragmento de EcoRI/Spel de 2.5 kbp. El vector pTrc99a-budC se digiere con EcoRI y Spel y el fragmento del vector de 5.0 kbp fue purificado con un gel. El vector purificado y el inserto de budAB fueron ligados y transformados en las células ToplO de E. colí. Los transformantes fueron seleccionados por amplificación por PCR con los cebadores Seq R2 (SEC ID NO: 42) y N84 Seq R2 (SEC ID NO: 65) para confirmar la creación de pTrc99a-budABC . En este plásmido, las regiones de codificación de bud A, B, y C están adyacentes entre si, en este orden, y entre el promotor de Trc y la secuencia de terminación de rrnB. Resultados : Tres aislados independientes de ToplO/pTrc99a-budABC de E. coli fueron examinados para la producción de butandiol, utilizando ToplO/pCL 1925-Kodd-ddr de E. coli (descrito posteriormente) como un control negativo. Las cepas se hicieron crecer en el medio LB que contiene 100 µg/ml de carbenicilina . Las células resultantes fueron utilizadas para inocular los recipientes de agitación (aproximadamente 175 mi del volumen total) que contiene 125 mi del medio de TM3a/glucosa con 100 µ?/??? de carbenicilina. Además, los recipientes inoculados con las cepas que llevan pTrc99a-budABC contuvo 0.4 mM de isopropil ß-D-l-t iogalactopiranósido (IPTG) . El medio de TM3a/glucosa contiene (por litro) : 10 g de glucosa, 13.6 g de KH2P04, 2.0 g del monohidrato de ácido cítrico, 3.0 g de (NH4)2S04, 2.0 g de MgS04-7H20, 0.2 g de CaCl2-2H20, 0.33 g del citrato de amonio férrico, 1.0 mg de tiamina · HC1, 0.50 de extracto de levadura, y 10 mi de la solución de los elementos de traza, ajustado a pH 6.8 con NH4OH. La solución de los elementos de traza contuvo: ácido cítrico-H20 (4.0 g/1), MnS04-H20 (3.0 g/1) , NaCl (1.0 g/1), FeS04-7H20 (0.10 g/1), CoCl2-6H20 (0.10 g/1), ZnS04-7H20 (0.10 g/1), CuS04-5H20 (0.010 g/1), H3B03 (0.010 g/1), y Na2Mo04-2H20 (0.010 g/1) . Los recipientes, tapados con tapas ventiladas, fueron inoculados a una OD60o de partida de aproximadamente 0.03 unidades y se incubaron a 34 °C con agitación a 300 rpm. Aproximadamente 23 horas después de la inducción, una alícuota del caldo fue analizada por CLAR (columna Shodex Sugar SH1011) y GC (HP-INNOWax) , utilizando los mismos métodos descritos en la sección de los Métodos Generales para 2-butanol y 2-butanona. Los resultados del análisis son provistos en la tabla 6. Los tres clones de E. coli convirtieron la glucosa a acetoína y meso-2 , 3-butandiol , el compuesto intermedio deseado de la ruta, con una selectividad molar del 14 %. Esta selectividad fue de aproximadamente 35 veces más elevada que aquella observada con la cepa de control de E. coli que carece de budABC . Tabla 6 Producción de acetoína y meso-2 , 3-butandiol por ToplO/pTrc99a-budABC de E. Coli aLa selectividad molar es (acetoína + meso-2, 3-butandiol )/ (glucosa consumida). Construcción del vector de pCL1925-KoDD-drr : Los operones de la diol deshidratasa (GenBank D45071, SEC ID NO: 69) y el factor de reactivación (GenBank AF017781, SEC ID NO: 70) fueron amplificados por PCR a partir de ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca como una sola unidad con los cebadores DDo For (SEC ID NO: 44) y DDo Rev (SEC ID NO: 45) . El cebador delantero incorporó un RBS de E. coli optimizado y un sitio de restricción de HindIII. El cebador inverso incluye un sitio de restricción de Xbal. El producto de PCR de 5318 pb se clonó en pCR4Blunt-TOPO y los clones de pCR4Blunt-T0P0-Kodd-ddr resultante fueron secuenciados con los cebadores M13 delantero (SEC ID NO: 35), M13 inverso (SEC ID NO: 36), DDko seq F2 (SEC ID NO: 46), DDko seq F5 (SEC ID NO: 47), DDko seq F7 (SEC ID NO: 48), DDko seq F9 (SEC ID NO: 49), DDko seq Rl (SEC ID NO: 50), DDko seq R3 (SEC ID NO: 51), DDko seq R7 (SEC ID NO: 52), y DDKo seq RIO (SEC ID NO: 53) . Un clon que tiene el inserto con la secuencia esperada fue identificado. Para la expresión, los genes del factor de react ivación/diol deshidratasa fueron subclonados en pCL 1925(patente U.S. No. 7,074,608), un plásmido de copiado bajo que lleva el promotor de la glucosa isomerasa de Streptomyces . pCR4Blunt-TOPO-Kodd-ddr fueron digeridos con HindIII y Xbal y el fragmento de Kood-ddr de 5.3 kbp resultante fue purificado con un gel. El vector pCL 1925 fue digerido con HindIII y Xbal y el fragmento del vector de 4539 pb resultante fue purificado con un gel. El vector y el fragmento de Kodd-ddr fueron ligados y transformados en ToplO de E. coli. Los transformantes fueron seleccionados por PCR como los cebadores DDko seq F7 (SEC ID NO: 48) y DDko seq R7 (SEC ID NO: 52) . La amplificación del plásmido (pCL 1925-Kodd-ddr) que lleva al inserto condujo a un producto de aproximadamente 797 pb. La actividad de la diol deshidratasa hacia el meso-2 , 3-butandiol fue medido por la incubación del extracto celular (proteina total ~ 0.8 mg/ral) con 10 mM de butandiol y la coenzima B12 12 mM en HEPES 80 mM (pH 8.2) durante 17 h a temperatura ambiente. La formulación del producto esperado, la 2-butanona fue determinada por CLAR como se describe por los Métodos Generales. Construcción del vector pCL 1925-KoDD-ddr : T5chnA ter: Para proporcionar una actividad de la alcohol deshidrogenasa heteróloga, el gen chnA que codifica la ciclohexanol deshidrogenasa de Acetinobacter sp. (Cheng et al., J. Bacteriol. 182: 4744-4751 (2000)) fue clonado en el vector pCL 1925 con el operón de la diol deshidratasa , pCL 1925-Kodd-ddr . El gen chnA, dado como la SEC ID NO: 71 (GenBank No: AF282240, SEC ID NO: 73) fue amplificado a partir de pDCQ2, un cósmido que lleva el grupo de genes de ciclohexanol de Acinetobacter, con los cebadores ChnA F (SEC ID NO: 54) y ChnA R (SEC ID NO: 55) . El producto de PCR de 828 pb resultante fue clonado en pCR4Blunt-TOPO para crear pCR4Blunt-TOPO-chnA y los transformantes fueron seleccionados por la PCR de la colonia con los cebadores M13 delantero (SEC ID NO: 35) y M13 inverso (SEC ID NO: 36) . Los clones correctos produjeron un producto de PCR de aproximadamente 1 kbp y fueron secuenciados con los cebadores M13 delantero (SEC ID NO: 5) y M13 inverso (SEC ID NO: 36) . Después de la secuenciación de pCR4Blunt-TOPO-chnA para confirmar la secuencia correcta, el gen chnA fue succionado desde el plásmido como un fragmento de Mfel/Smal de 813 pb. El vector de expresión pQE30 (Qiagen) fue digerido con Mgel y Smal y el fragmento del vector de 3350 pb resultante fue purificado con un gel . El fragmento de chnA y el vector purificado fueron ligados y transformados en las células ToplO de E. coli. Los transformantes fueron seleccionados por PCR de las colonias con los cebadores chnSeq Fl (SEC ID NO: 56) y chnSeq Rl (SEC ID NO: 57) para un producto de PCR de 494 pb. Esta clonación colocó al gen de chnA bajo el control del promotor T5 en el plásmido, pEQ30-chnA. Para preparar el vector de pCL 1925 para llevar dos operones, se agregaron terminadores al vector. Un fragmento del terminador de tonB-mcs-terminador de trpA fue preparado por el recocido del oligonucleót ido con los cebadores Top ter Fl (SEC ID NO: 58), Top ter F2 (SEC ID NO: 59), Top ter Rl (SEC ID NO: 60), y Top ter R2 (SEC ID NO: 61) . El ADN recocido fue purificado con un gel sobre un gel de PAGE al 6 % (Embi-tec, San Diego, CA) . El vector pCl 1925 fue digerido con SacI y Xbal y purificado con un gel. El ADN recocido y el fragmento del vector fueron ligados para crear pCl 1925-ter. Los transformantes fueron seleccionados por la amplificación de PCR de las colonias con los cebadores pCL 1925 vec F (SEC ID NO: 62) y pCL 1925 vec Rl (SEC ID NO: 63) para verificar la presencia de un producto de PCR de aproximadamente 400 pb.

Los clones positivos de la selección de PCR fueron secuenciados con los mismos cebadores. El vector pCL 1925-ter fue digerido con Xhol y Pmel y el fragmento de 4622 pb resultante fue purificado con un gel. pQE30-chnA fueron digeridos con Ncol y el ADN fue tratado con la ADN polimerasa de Klenow para separar los extremos. pQE30-chnA fue digerido entonces con Xhol y el fragmento del promotor T5-chnA de 1.2 kbp resultante fue purificado con un gel. El vector de pCL 1925-ter y el fragmento del operón de chnA fueron ligados conjuntamente para dar pCL 1925-ter-T5cnhA y se transformó en ToplO de E. coli. Los transformantes fueron seleccionados por la amplificación de las PCR de las colonias con los cebadores pCL 1925 vec F (SEC ID NO: 64) y chnseq Rl (SEC ID NO: 59) para un producto de aproximadamente 1 kbp. Para terminar la construcción del vector de la ruta, el plásmido de pCL 1925-KoDD-ddr fue digerido con Xbal y SacI y el fragmento del vector de 9504 pb resultante fue purificado con un gel. El operón de chnA flanqueado por los terminadores , con el terminador de trpA (Koichi et al. (1997) volumen 272, número 51, pp . 32034-32041) 3' con respecto a la secuencia de codificación de chnA, a partir de pCL 1925-ter-T5chnA se purificó con un gel como un fragmento de Xbal/SacI de 1271 pb. Después de la ligadura de los fragmentos y la transformación en ToplO de E. coli, los transformantes fueron seleccionados por la PCR de la colonia. Los cebadores chnSeq Fl (SEC ID NO: 58) y pCL 1925 vec R2 (SEC ID NO: 64) amplificaron el producto de PCR de 1107 pb esperado en el plásmido resultante, pCL 1925-KoDD-ddr : : ter-T5chnA . Ejemplo 10 Expresión de la ruta biosintética de 2-butanol en E. coli con la alcohol deshidrogenasa endógena sobreexpresada El propósito de este ejemplo fue expresar una ruta biosintética de 2-butanol en varias cepas de E. coli. Construcción de las cepas de E. coli que expresan constitutivamente yghD: E. coli contiene un gen natural {yqhD) que fue identificado como una 1 , 3-propandiol deshidrogenasa (patente U. S. No. 6,514,733) . El gen de yqhD, provisto como la SEC ID NO: 74, tiene 40 % de identidad con respecto al gen adhD en Clostridium , una butanol deshidrogenasa dependiente de NADH probable. El gen yqhD fue colocado bajo la expresión constitutiva de una variante del promotor de la glucosa isomerasa de 1.6GI (SEC ID NO: 67) en la cepa MG1655 1.6 yqhD: :Cm de E. coli (WO 2004/033646) utilizando la tecnología de ? Red (Datsenko y Wanner, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A 97:6640 (2000)) . De manera semejante, el promotor natural fue reemplazado por el promotor 1.5GI (WO 2003/089621) (SEC ID NO: 68), creando la cepa MG1655 1.5 yqhD: :Cm, reemplazando por consiguiente el promotor de 1.6GI de MG1655 1.6yqhD: :Cm con el promotor de 1.5GI. Los promotores de 1.5GI y 1.6GI difieren en 1 pb en la región -35, por lo cual se altera la fuerza de los promotores (WO 2004/033646) . Aunque el reemplazo del promotor de yqhD natural con el promotor ya sea de 1.5GI o de 1.6GI, el gen de yqhC que codifica el regulador transcripcional supuesto para el operón de yqh fue delecionado. La actividad de la butanol deshidrogenasa fue confirmada por el ensayo de la enzima utilizando los métodos que son bien conocidos en el arte. Transformación de las cepas de E. coli: Los plásmidos pCL 1925-Kodd-ddr y pTrc99a-budABC de la ruta, descritos en el ejemplo 9, fueron co-transformados en las cepas G1655, MG1655 1.6yqhD, y MG1655 1.5yqhD de E. coli. Estas últimas dos cepas sobreexpresan la 1 , 3-propandiol deshidrogrenasa, YqhD, que también tiene actividad de la butanol deshidrogenasa. Las cepas fueron examinadas para verificar la producción de 2-butanona y 2-butanol esencialmente como se describió anteriormente. Las células fueron inoculadas en recipientes de agitación (aproximadamente 175 mi del volumen total) que contiene ya sea 50 ó 150 mi del medio de TM3a/glucosa (con 0.1 mg/1 de vitamina B12, antibióticos apropiados e IPTG) para representar el medio y las condiciones bajas de oxigeno, respectivamente. La espectinomicina (50 µg/ml) y carbenicilina (100 µg/ml) fueron utilizados como los plásmidos pCL 1925-Kodd-ddr y pRC99a-budABC, respectivamente. Los recipientes fueron inoculados a una OD6oo de partida de < 0.04 unidades e incubados a 34 °C con agitación a 300 rpm. Los recipientes que contienen 50 mi del medio fueron tapados con tapas ventiladas; los frascos que contienen 150 mi, fueron tapados con tapas no ventiladas para minimizar el intercambio de aire. La IPTG estuvo presente en el tiempo cero a una concentración de cero hasta 0.04 mM. Los resultados analíticos para la producción de 2-butanona y 2-butanol son presentados en la tabla 7. Todas las cepas de E. coli que comprenden una ruta biosintética de 2-butanol produjeron la 2-butanona bajo condiciones de oxígeno bajas y medias y produjeron el 2-butanol bajo condiciones bajas de oxígeno. Tabla 7 Producción de 2-butanona y 2-butanol por los plásmidos pCL1925-Kodd-ddr y Terc99a-budABC de la ruta que colecta las cepas MG1655 de E. Coli Cepa"'" IPTG, mM Volumen del 2-butanona, mM 2-butanol mM medio, mi MG 1655 # 1 0 50 0.08 No detectado MG1655 # 2 0 50 0.1 1 No detectado MG 1655 # 1 0.04 50 0.12 No detectado MG 1655 # 2 0.04 50 0.1 1 No detectado MG 1655 # 1 0 150 0.15 0.047 MG 1655 # 2 0 150 0.19 0.041 a#l y #2 representan aislados independientes. MG1655 es MG1655/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC MG1655 1.6yqhD es MG1655 1.6yqhD/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC MG1655 1.6 yqhD es MG1655 1.5yqhD/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC. Ejemplo 11 Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol en E. coli con la alcohol deshidrogenasa heterologa Los plásmidos pCL 1925-KoDD-ddr : : ter-T5chnA y pTrc99a-budABC, descritos en el ejemplo 9, fueron transformados en las cepas MG1655 y MG1655AyqhCD de E. coli para una demostración de la producción de 2-butanol. MG1655AyqhCD lleva una inactivación de yqhCD que se hizo utilizando el método de Datsenko y anner (Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 97 ( 12 ) : 6640-6645 (2000)) . Después del reemplazo de la región con el cassete de FRT-CmR-FRT de pKD3, el marcador de la resistencia al cloranfenicol fue removido utilizando la FLP recombinasa. La secuencia de la región delecionada es provista como la SEC ID NO: 66. Las cepas de MG1655/pTrc99a-budABC/pCL 1925KoDD-ddr: :Ter-T5 chnA y MG1655AyqhCD/pTrc99a-budABC/pCL 1925KoDD-ddr: :Ter-T5 chnA fueron examinados para la producción de 2-butanona y 2-butanol esencialmente como se describió anteriormente. La cepa MG1655 AyqhCD/pCL 1925 fue utilizada como un control negativo. Las células fueron inoculadas con recipientes de agitación (de aproximadamente 175 mi de volumen total) que contiene 50 o 150 mi del medio TM3a/glucosa (con 0.1 mg/1 de vitamina B12 y antibióticos apropiados) para representar las condiciones de oxigeno intermedias y bajas, respectivamente. La espect inomicina (50 µg/ml) y la ampicilina (100 µg/ml) fueron utilizadas para la selección de los plásmidos basados en pCL 1925 y pTrc99a-budABC, respectivamente. La actividad de la enzima derivada de pTrc99a-budABC fue detectada por el ensayo de la enzima en la ausencia del inductor de IPTG, por consiguiente, IPTG no fue agregado al medio. Los frascos fueron inoculados a una OD6oo de partida de < 0.01 unidades e incubados a 34 °C con agitación a 300 rpm durante 24 h. Los frascos que contienen 50 mi del medio fueron tapados con tapas ventiladas; Los frascos que contienen 150 mi, fueron tapados sin tapas ventiladas para minimizar el intercambio de aire. Los resultados analíticos para la producción de 2-butanona y 2-butanol son presentados en la tabla 8. Ambas cepas de E. coli que comprenden una ruta biosintética de 2-butanol produjeron 2-butanona bajo condiciones medias y bajas de oxígeno y produjeron 2-butanol bajo condiciones bajas de oxígeno, mientras que la cepa de control negativo no produjo niveles detectables ya sean de 2-butanona o de 2-butanol.

Tabla 8 Producción de 2-butanona y 2-butanol por las cepas de E. coli a #1 y #2 representan aislados independientes.

Ejemplo 12 Clonación de amino : piruvato transaminasa (APT) Una amino : piruvato transaminasa (APT) de Vibrio Fluvialis JS17 fue identificado por Shin et al. (Appl. Biol. Biotechnol. (2003) 61:463-471). La secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 122) se encontró que tiene una homología significativa con las ?-aminoácido: piruvato transaminasas (Shin y Kim {J. Org. Chem. 67:2848-2853 (2002)). Se ha mostrado que Vibrio Fluvialis APT tiene la actividad de transaminasa hacia la acetoína. Para la expresión de la enzima de APT en E. coli, una región de codificación de APT optimizada en el codón (SEC ID NO: 144) fue diseñada utilizando los codones de E. coli preferidos con consideraciones adicionales tales como el balance del codón y la estabilidad del ARNm, y sintetizados (por DNA2.0; Redwood City, CA) . El fragmento del ADN de la región de codificación fue subclonada en el vector pBAD.HisB (Invitrogen) entre los sitios de Ncol y HindIII y el plásmido resultante, referido después de esto, pBAD.APTl, fue transformado en las células ToplO. Ejemplo 13 Caracterización de la actividad de la APT alanina : acetoína aminotransferasa de Vibrio fluvialis Un volumen de 5 mi del caldo de LB + 100 µ?/p?? de ampicilina fue inoculado con una colonia fresca de las células TOPlO/pBAD : APTl . El cultivo se incuba a 37 °C durante aproximadamente 16 h con agitación (225 rpm) . Una alícuota de 300 µ? de este cultivo fue utilizada para inocular 300 mi del mismo medio, que fue incubado a 37 °C con agitación (225 rpm) . Cuando el cultivo alcanzó una OD6oo de 0.8, se agrega la L-arabinosa a una concentración final de 0.2 % (p/v) . el cultivo se inocula durante unas 16 h adicionales, luego se colecta. Las células fueron colectadas una vez con el amortiguador de fosfato de potasio 100 mM (pH 7.8) y luego congeladas y almacenadas a -80 °C. Para aislar la enzima, las pelotillas de las células fueron descongeladas y se resuspendieron en 8 mi del amortiguador de fosfato de potasio 100 mM (pH 7) que contiene 0.2 mM de tetraacetato de et iendiamina , ditiotreitol 1 mM y una tableta del cóctel del inhibidor de proteasa (Roche, Indianápolis , IN) . Las células fueron lisadas por dos pasadas a través de una celda de una prensa French a 63.33 kg/cm2 (900 psi), y el lisado resultante fue aclarado por centrifugación durante 30 minutos a 17000 x g. Se agrega sulfato de amoníaco a una saturación del 35 %, y la solución fue agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente, punto en el cual los sólidos precipitados fueron removidos por centrifugación (30 minutos, 17000 x g) . Se agrega sulfato de amonio adicional al sobrenadante para dar 55 % de saturación, y la solución se agita nuevamente durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los sólidos precipitados fueron removidos por centrifugación (30 minutos, 17000 x g) y luego se resuspenden en 5 mi del amortiguador de fosfato de potasio 100 mM (pH 7) que contiene 5' -fosfato de piridoxal 10 µ? y ditiotreitol 1 mM. La solución fue desalada por el paso a través de una columna de PD10 equilibrada con el amortiguador A (amortiguador de bis-tris propano 50 mM (pH 6) , que contiene 5' -fosfato de piridoxal 10 µ? y ditiotreitol 1 mM) . El extracto desalado fue localizado entonces sobre una columna Q-Fast Flow de 20 mi pre-equilibrada con el amortiguador A. La APT fue eluida con un gradiente lineal de NaCl 0-0.1 M en el amortiguador A. La enzima fue detectada en fracciones eluidas por la presencia de una banda de proteina de tamaño de ~ 50 kD cuando es analizada por electrofóresis con un gel de SDS-poliacrilamida y por la absorbancia característica a 418 mm. Las fracciones contienen la enzima eluida a ~ 0.3 M NaCl . Estas fracciones fueron agrupadas para dar un total de 6 mi de 5.45 mg/ml de la solución de enzima, la cual fue > 90 % pura, como se juzga por la electroforesis con un gel de SDS-poliacrilamida. La actividad de la alanina : acetoína aminotransferasa de la APT fue ensayada utilizando un ensayo relacionado con la deshidrogenasa láctica. Las mezclas de reacción contuvieron bis-tris propano 100 mM (pH 9.0), 5' -fosfato de piridoxal 10 µ?, acetoína 0-50 mM, L-alanina 0-5 mM, enzima purificada en una cantidad de 0.14 o 0.28 mg/ml, NADH 200 µ? y 20 U/ml de la deshidrogenasa láctica (Sigma; St . Louis, MO) . La reacción fue seguida por la medición del cambio en la absorbancia a 340 mm, indicativa de la oxidación de NADH . Bajo estas condiciones, la Kcat/Km para la acetoina fue de 10 M"1 s"1 y aquella para la alanina fue de 400 M"1 s"1. La identidad del producto de 3-amino-2-butanol fue confirmada por la comparación con un estándar sintético. Una mezcla de (R,R)- y ( S , S ) -3-amino-2-butanol fue sintetizada por el método de Dickey et al [J. Amer Chem Soc 74:944 (1952)] : 5 g del trans-2 , 3-epoxibutano fueron agitados lentamente en 150 mi de NH4OH frió (4 °C) . La reacción fue calentada lentamente a temperatura ambiente, sellada y agitada a temperatura ambiente durante unos 10 días adicionales. En este tiempo, el amoniaco en exceso y el agua y el epoxibutano residual fueron removidos por evaporación rotatoria bajo vacio a 40 °C. El aceite claro resultante (2.9 g) se resuspende en agua hasta una concentración del 10 % (p/v) . La producción del producto deseado fue confirmada por análisis de RMN y la comparación del espectro con aquel reportado por Levi et al. [Org. Magnetic Resonante 14:214 (1980)] . Una mezcla de los isómeros (2R, 3S) y (2S, 3R) correspondientes fue producida utilizando el método idéntico con excepción de que el material de partida fue el isómero cis de 2 , 3-epoxibutano . Un método analítico para la detección del 3-amino-2- butanol fue desarrollado con base en el método de derivación de o-ftaldialdehído para la determinación de los aminoácidos reportado por Roth [Anal. Chem. 43:880 (1971)] . Una alícuota de 200 µ? del 3-amino-2-butanol 1 mM (mezcla de isómeros) fue mezclada con 200 µ? de una solución 50 mM del borato (pH 9.5), a la cual se agregan 10 µ? del 2-mercaptoetanol 5 µ?/ml en etanol y 10 µ? del o-ftalaldehído 10 mg/ml en etanol. La solución se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos, tiempo en el cual el derivado fue extraído en 200 µ? de hexano. El hexano fue separado de la solución acuosa por decantación, y 10 µ? fueron inyectados sobre una columna de CLAR Chiralcel OD (Daicel Chemical Industries; Fort Lee, NJ) . La columna fue corrida isocrát icamente con una fase móvil de hexano : isopropanol 90:10 a una velocidad de 1 ml/min. Los isómeros derivados del 3-amino-2-butanol fueron detectados por absorbancia a 340 nm con los tiempos de retención de aproximadamente 15.7 y de 16.8 minutos [ (2S,3S) y (2R,3R)], y 18.4 y 21.9 minutos [(2R,3S) y (2S,3R)] . Para diferenciar los enantiómeros en la primera mezcla, el isómero (2R,3R) puro (Bridge Organics; Vicksburg, MI) también fue corrido bajo las condiciones idénticas y se encontró que va a estar en el pico de 16.8 minutos. Para diferenciar los enantiómeros en la segunda mezcla, la mezcla fue primero resuelta cinéticamente utilizando la alanina : acetoína aminotransferasa . 0.28 mg de la enzima purificada fueron incubados con el piruvato 10 mM y el 3-amino-2-butanol 10 mM [mezcla 1:1 de los isómeros (2R,3S) y (2S,3R)] en 1 mi del bis-tris propano 100 mM (pH 9.0) . Después de 24 horas a temperatura ambiente, una alícuota fue removida y analizada como se describió anteriormente. El análisis reveló que el pico de 18.4 minutos fue agotado en el 95 %, mientras que el pico de 21.9 minutos fue retenido en > 90 %. Una alícuota de 100 µ? de la mezcla de reacción restante fue mezclada con 50 µ? de NADH 20 mM y 10 µ? del extracto de la cepa ToplO/pTrc99a-budC descrita en el ejemplo 9. La enzima de BudC ya se sabe que reduce la (R)-acetoína al meso-2 , 3-butandiol y (S)-acetoína a (S,S)-2,3-butandiol [Ui et al (2004) Letters in Applied Microbiology 39:533-537] . Después de 3 h, las muestras fueron tomadas de la reacción y analizadas como se describió anteriormente para verificar la acetoína y el butandiol. El análisis indicó que el producto primario de la reducción fue el meso-2, 3-butandiol, indicando que el producto de la reacción de aminotransferasa fue la (R) -acetoína, y por lo tanto el isómero de 3-amino-2-butanol consumido fue el isómero {2R,3S) . Por consiguiente, el tiempo de retención de 18.4 minutos puede ser asignado a este isómero y 21.9 al isómero (2S,3R) . Para confirmar que el producto de la reacción de alanina : acetoína aminotransferasa catalizada por APT fue el 3-amino-2-butanol , se incubaron 0.28 mg de la enzima purificada con acetoina 10 mM, L-alanina 10 mM, 50 U de deshidrogenasa láctica y 200 µ? de NADH en 1 mi del bis-tris propano 100 mM (pH 9.0) . La mezcla de reacción fue incubada a temperatura ambiente durante 1 h, después de lo cual una alícuota de 200 µ? fue removida y derivada como se describió anteriormente. Los tiempos de retención de los productos derivados fueron de 15.8 min (producto principal) y 18.5 min (producto menor), que corresponde con aquel de los estándares del (2S, 3S)- y ( 2R, 3S ) -3-amino-2-butanol. Ejemplo 14 Identificación y clonación de la amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora subespecie atroseptica El propósito de este ejemplo es describir la identificación y clonación de las secuencias que codifican una amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa de la bacteria Erwinia carotovora. Estas dos enzimas son parte de la ruta 1 para la conversión del 3-amino-2-butanol a la 2-butanona por medio del compuesto intermedio de fosfato de 3-amino-2-butanol como se muestra en la figura 1. Predicción de la amino alcohol cinasa y la amino alcohol 0-fosfato liasa de Erwinia Las actividades de la amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa dependiente de ATP han sido detectadas en varias especies de Pseudomonas y Erwinia, incluyendo Pseudomonas sp. P6 {NCIB 10431), Pseudomonas putida NCIB 10558 (Jones et al., (1973) Biochem J. 134:167-182), Erwinia carotovora, Erwinia amanas, Erwinia milletiae, y Erwinia atroseptica (Jones et al. (1973) Biochem J. 134:959-968) . En estos estudios, los extractos de las especies anteriores se mostró que tienen actividad hacia la conversión enzimática del aminopropanol por medio del O-fosfato aminopropanol hasta el propionaldehido, y la conversión de etanolamina a través del O-fosfato de etanolamina hasta acetaldehido . La secuencia genómica de la cepa de Erwinia atroseptica en la cual estas actividades se reportó que existen (ahora designadas como la cepa SCRI1043 de Erwinia carotovora subespecie atroseptica (ATCC BAA-672) ) ha sido determinada en el Sanger Institute (Bell et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(30) : 11105-11110) . El análisis de las cinasas supuestas en el genoma de Erwinia carotovora subespecie atroseptica reveló una secuencia del operón (SEC ID NO: 164) que codifica una proteina supuesta (ECA2059; SEC ID NO: 124) que es 39 % idéntica a una homoserina cinasa de Rhizobium loti y una aminot ransferasa dependiente del fosfato de piridoxal (PLP) de la clase III supuesta (ECA2060; SEC ID NO: 126) que es 58 % idéntica a una aminotransferasa supuesta de Rhizobium meliloti. Basado en lo anterior, se espera que ECA2059 tenga una amino alcohol cinasa y ECA2060 fue una amino alcohol O-fosfato liasa que utiliza PLP como el cofactor . Clonación de la amino alcohol cinasa supuesta y la amino alcohol O-fosfato liasa supuesta de Erwinia carotovora subespecie atroseptica El ADN genómico de Erwinia carotovora subespecie atroseptica (ATCC #: BAA-672D) fue obtenido del American Type Culture Collection (ATCC) . El operón que codifica la amino alcohol cinasa supuesta (KA) y la amino alcohol O-fosfato liasa (AT) fue nombrada KA-AT (SEC ID NO: 164) . Este operón fue amplificado a partir del ADN genómico de Erwinia por la ADN polimerasa de Phusion (Finnzymes, por medio del New England Biolabs; Ipswich, MA) utilizando los cebadores OT372 (SEC ID NO: 127) y OT873 (SEC ID NO: 128) . Un fragmento del ADN de 2.4 kb fue obtenido por la reacción de PCR, la cual corresponde al tamaño del operón de KA-AT. El producto de PCR fue digerido con las enzimas de restricción de EcoRI y PstI, y clonados en el vector pKK223-3 (Amersham Biosciences ; Piscataway NJ) el cual fue digerido con las mismas enzimas de restricción. Este plásmido producido pKK223. KA-AT, que contuvo el operón de amino alcohol cinasa-liasa de Erwinia supuesto, bajo el control del promotor tac. De manera semejante, los plásmidos pKK223.KA y pKK223.AT fueron hechos, y en los cuales se colocaron las regiones de codificación de la cinasa de Erwinia supuesta y de liasa de Erwinia supuesta en vectores separados, cada uno bajo el control del promotor tac. Para la clonación de PCR de la región de codificación de KA (SEC ID NO: 123), se utilizaron los cebadores OT872 (SEC ID NO: 127) y OT859 (SEC ID NO: 129); y para la clonación de PCR de la región de codificación de AT (SEC ID NO: 125), se utilizaron los cebadores OT873 (SEC ID NO: 128) y OT880 (SEC ID NO: 130) en las amplificaciones de PCR, las cuales generaron los productos de PCR de 1.1 kb y de 1.3 kb respectivamente. Los productos de PCR fueron digeridos cada uno con EcoRI y PstI, y ligados en el vector pKK223-3 para generar pKK-223.KA y pKK223.AT. Actividad in vivo de la amino alcohol cinasa supuesta y la amino alcohol O-fosfato liasa supuesta de Erwinia carotovora subespecie atroseptica Los plásmidos pKK223. KA-AT , pKK223.KA, pKK223.AT y pKK223-3 fueron transformados en la cepa MG1655 de E. coli. Los transformantes fueron aplicados otra vez como lineas sobre una placa con un medio mínimo de MOPS que contiene 1 % de glucosa, 0.5 % de aminopropanol como la única fuente de nitrógeno, IPTG 1 mM y 100 µ?/p?? de ampicilina. La expresión de los genes KA-AT, KA y AT fue inducida por el IPTG. Una placa de control no tiene el IPTG incluido. Las placas fueron incubadas a 37 °C durante 7 días. En la placa con IPTG, solamente creció la cepa MG1655/pKK223. KA-AT, mientras que la totalidad de las otras tres cepas no crecieron. Sobre la placa sin IPTG agregado, creció la cepa MG1655/KK223. KA-AT, pero las colonias fueron significativamente más pequeñas que aquellas sobre la placa que contiene IPTG, que corresponde a los niveles de expresión inferior de KA y AT en las células no inducidas. Ninguna de las otras tres cepas creció en esta placa. Esto indica que la co-expresión de los genes de KA y AT de Erwinia , supuestos, proporcionaron suficientes actividades de la enzima que permitieron que la cepa MG1655/pKK223. KA-AT de E. coli utilice el aminopropanol como la única fuente de nitrógeno. La expresión de cada enzima individual sobre ya sea KA o AT no fue suficiente para proporcionar tal actividad de la enzima in vivo. Ejemplo 15 La actividad in vitro de la amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa supuestas de Erwinia Subclonación del operón KA-AT de Erwinia en el vector pBAD.HisB y la inducción de la expresión de la proteina Los niveles de expresión de la proteina de las enzimas de KA y AT supuestas de Erwinia, expresadas en las células de MG1655 del vector de pKK223. KA-AT fueron analizados por el análisis de SDS-PAGE. El nivel de expresión de la enzima AT de Erwinia fue relativamente bajo, con una nueva banda de proteina detectada en el peso molecular correcto de 46 kD en la fracción soluble de un extracto celular, mientras que ninguna nueva banda de proteina fue detectada en el tamaño predicho para la enzima KA. En un esfuerzo por mejorar la expresión de los genes de AA y AT supuestas de Erwinia, el operón de KA-AT fue subclonado en los sitios de EcoRI y HindIII del vector pBAD. HisB-EcoRI . El pBAD . HisB-EcoRI fue derivado del vector pBAD-HisB ( Invitrogen) , por el reemplazo del sitio Ncol en pBAD.HisB con un sitio EcoRI a través de la mutagénesis dirigida al sitio de QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando los cebadores OT909 (SEC ID # 131) y OT910 (SEC ID. # 132) . En el plásmido construido pBAD. KA-AT, el operón de KA-AT fue colocado directamente bajo el control del promotor araB (sin His-tag) . El plásmido pBAD. KA-AT fue transformado en la cepa TOP10 de E. coli. Un cultivo de 50 mi de la cepa TOPlO/pBAD. KA-AT se hizo crecer hasta la fase logarítmica intermedia (OD6oo = 0.6) en LB, 100 µg/ml del medio de ampicilina a 37 °C con agitación a 250 rpm. El cultivo fue inducido por la adición de L-arabinosa a una concentración final de 0.1 % (p/v) , y fue incubado adicionalmente a 37 °C durante 5 h antes de la colección por centrifugación. Las pelotillas celulares fueron resuspendidas en Tris-HCl 50 mM enfriado con hielo, pH 8.0, y alteradas por sonicación sobre hielo con un aparato Fischer Sonic Model 300 Dismembrator (Fischer, Pittsburgh, PA) a 50 % de potencia, repitiendo cuatro ciclos de 30 segundos de sonicación con 60 segundos de descanso entre cada ciclo. Cada muestra sonicada fue centrifugada (15,000 x g, 4 min, 4 °C) . Los extractos de las células libres, aclarados, fueron analizados para verificar el nivel de expresión de la proteina y la actividad de la araino alcohol O-fosfato liasa. Síntesis química de O-fosfato de aminobutanol y el O-fosfato de aminopropanol El substrato de O-fosfato de (R, R) -3-amino-2-propanol fue sintetizado por un método basado en el aquel reportado por Ferrari y Ferrari (patente US 2730542

[1956]) para la fosfoetanolamina : 10 mmol de H3P04 en una solución acuosa al 50 % (p/v) fueron mezclados con una solución al 50 % (p/v) de los isómeros de 3-amino-2-butanol (~ 20:1 (R, R) : (S, S) ; Bridge Organics; Vicksburg, MI) mientras que se agita sobre hielo. Después del mezclado, la solución se calienta lentamente a temperatura ambiente y luego se agita bajo vacío y se calienta a 70 °C. Después de 1 h a 70 °C, la temperatura se incrementó lentamente hasta 185 °C y se mantuvo allí durante unas 2 h adicionales. En este instante, la reacción se enfría a temperatura ambiente y se libera el vacío. El material restante se disuelve en agua, y el análisis por RMN indicó que el 80 % de la materia prima se convirtió al producto con 20 % restante que no reaccionó. No se observo ningún producto adicional. Los substratos adicionales de O-fosfato de (2R,3S)-3-amino-2-butanol y O-fosfato de (2S, 3R) -3-amino-2-butanol fueron sintetizados por el mismo procedimiento utilizando una mezcla 1:1 del ( 2R, 3S ) -3-amino-2-butanol y ( 2S , 3R) -3-amino-2-butanol (sintetizado como se describe en el ejemplo 13) como la materia prima. El O-fosfato de DL-l-amino-propanol , el O-fosfato de ( S ) -2-amino-l-propanol , y el O-fosfato de ( R) -2-amino-l-propanol fueron sintetizados por el mismo procedimiento utilizando el DL-amino-2-propanol, (R)-2-amino-l-propanol , o ( S ) -2-amino-l-propanol como la materia prima . Análisis de la actividad de la aminopropanol O-fosfato liasa codificada por el operón de KA-AT de Erwinia, supuesto El ensayo de aminopropanol O-fosfato liasa fue efectuado como se describe por Jones et al. (1973, Biochem. J. 134:167-182) y G. Gori et al. (1995, Chromatographia 40:336) . La formación de propionaldehido a partir del 0-fosfato de aminopropanol fue ensayado colorimétricamente con MBTH, que permite la detección de la formación del aldehido. La reacción fue efectuada como sigue. En 1 mi de la reacción, se agregaron 100 µg del extracto libre de células de TOPlO/pBAD. KA-AT de E. coli al O-fosfato de DL-l-amino-2-propanol 10 mM en Tris-HCl 100 mM, pH 7.8, con PLP 0.1 mM. La reacción fue incubada a 37 °C durante 10 minutos y 30 minutos, con una alícuota de 100 µ? de la mezcla de reacción removida en cada instante del tiempo y mezclada con 100 µ? de 6 mg/ml de MBTH en glicina-HCl 375 mM, pH 2.7. Esta mezcla se incuba a 100 °C durante 3 minutos, se enfría sobre hielo durante 15-30 s, y se agrega 1 mi de 3.3 mg/ml de FeCl3.6H20 (en HC1 10 mM) , seguido por incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia de la mezcla de reacción que contiene el aducto del aldehí do-MBTH , fue medida a 670 nm . Los resultados del ensayo son listados en la tabla 9. En la presencia del substrato de fosfato de aminopropanol , PLP y el extracto libre de células, se detectó la formación del aldehido, como está indicado por AbS67o que fue más elevado que el fondo de control de hasta 0.3. En la ausencia ya sea del substrato o del extracto libre de células, no se detectó ninguna formación del aldehido. En la ausencia de PLP agregado, se detectó una cantidad algo menor del aldehido, presumiblemente debido a la presencia de PLP en el extracto libre de células. El extracto libre de células del cultivo de TOP10/pBAD. KA-AT no inducido, no produjo ningún aldehido detectable en la reacción. Estos resultados indicaron que la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia supuesta cataliza la conversión del O-fosfato de aminopropanol al propionaldehído .

Tabla 9 Ensayo de aminopropanol O-fosfato liasa. La muestra 1 fue el extracto libre de células de un control no inducido de TOPlO/pBAD. KA-AT de E. coli. Las muestras 2-5 contuvieron el extracto libre de células del cultivo inducido por TOPlO/pBAD. KA-AT de E. Coli Análisis de la actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia hacia el substrato de O-fosfato de aminobutanol La actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa hacia los substratos de O-fosfato de aminobutanol fue estudiada bajo las mismas condiciones que se describieron anteriormente. La reacción se llevó a cabo a 37 °C durante toda la noche en 1 mi de la reacción que contuvo 100 µg del extracto libre de TOPlO/pBAD. KA-AT de E. coli, O-fosfato de aminobutanol 10 mM (ya sea la mezcla de (R,R) + (S,S) o la mezcla de los isómeros (R,S) + (S,R) descrita en el ejemplo 15) en Tris-HCl 100 mM, pH 7.8, con PLP 0.1 mM. Una alícuota de 100 µ? de la mezcla de reacción fue removida y el producto de 2-butanona fue detectado utilizando el método de derivación de BTH descrito en los Métodos Generales. Los dos picos que representan los dos isómeros de 2-butanona derivados fueron observados. Por lo tanto, la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia es una aminobutanol fosfato fosfo-liasa además de un aminopropanol fosfato fosfo-liasa. Análisis de la actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia hacia los estereoisómeros de la O-fosfato de aminopropanol y el O-fosfato de aminobutanol La actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia hacia varios estereoisómeros del O-fosfato de aminopropanol y el O-fosfato de aminobutanol fue estudiada bajo las mismas condiciones que se describieron anteriormente. En la presencia de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia, tanto el O-fosfato de (R) como de (S)-2-amino-l-propanol fueron convertidos a la propanona por la enzima, pero el rendimiento del producto fue mucho más elevado con el isómero (S) . La enzima también produjo la butanona a partir de ambas mezclas de los isómeros de 0-fosfato de 3-amino-2-butanol , con el rendimiento del producto más elevado encontrado en la reacción que contiene los isómeros (R,S) y (S,R) del substrato. Ambos productos de propanona y butanona fueron derivados por MBTH, y se detectaron por CLAR como se describió en los Métodos Generales . La optimización del nivel de expresión del gen para la amina alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia Para mejorar los niveles de expresión para la amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia en E. coli, las regiones de codificación optimizadas por el codón para ambas enzimas (llamadas EKA: SEC ID NO: 155 y EAT : SEC ID NO: 156 respectivamente) fueron sintetizadas por DNA:2.0 (Redwood City, CA) . Cada región de codificación fue sintetizada con las extremidades 5' y 3' incluyendo los sitios de restricción para la clonación: EKA tiene los sitios de 5' Bbsl y 3' EcoRI, HindIII, EAT tiene los sitios de 5' EcoRI y 3' HindIII. Las regiones de codificación de EKA y EAT fueron provistas a partir de DNA2.0 como los plásmidos pEKA y pEAT, que estuvieron en el vector pJ51 de DNA2.0. La región de codificación optimizada por EKA fue subclonada por la ligadura de un fragmento digerido por Bbsl y HindIII de pEKA en el vector pBAD.HisB entre los sitios de Ncol y HindIII para generar el plásmido pBAD.EKA. En el plásmido resultante, la región de codificación está colocada 5' con respecto a su etiqueta His, de modo que una región de codificación para una etiqueta de His6 de la terminación N fusionada a la amino alcohol cinasa de Erwinia fue construida efectuando una reacción de mutagénesis dirigida al sitio de QuickChange utilizando los cebadores SEC ID NO: 157 y SEC ID NO: 158 para generar el vector pBAD . His-EKA . pBAD.His-EKA fue transformado en la cepa BL21-A1 ( F~ ompThsdSB (rB~ mB~) gal dcm araB: : T7RNAP-tetA de E . coli; Invitrogen para producir la cepa BL21-Al/pBAD. His-EKA. Un cultivo de 50 mi de BL21-AI /pBAD . HisA-EKA se hizo crecer hasta una etapa logarítmica intermedia (OD6oo = 0.6), inducida con 0.1 % de arabinosa, y se incubó adicionalmente a 30 °C toda la noche. Los extractos de las células libres fueron preparados por sonicación. La proteína de fusión etiquetada con His6 de la amino alcohol cinasa de Erwinia fue purificada utilizando el sistema de purificación de ProBond™ (Invitrogen) bajo condiciones de purificación no desnaturalizantes siguiendo las instrucciones del fabricante. Resultados proféticos La actividad de la cinasa de la amino alcohol cinasa de Erwinia etiquetada con His6 es analizada por el ensayo de ADP Quest (DiscoverRX, Fremont, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este es un ensayo bioquímico que mide la acumulación de ADP, un producto de la reacción de amino alcohol cinasa utilizando ya sea el aminopropanol o el aminobutanol como el substrato. El substrato 10 mM es mezclado con la amino alcohol cinasa de Erwinia etiquetada con His6, en Tris-HCl 100 mM, pH 7.8, MgCl2 10 mM, KC1 2 mM, ATP 0.1 mM, y se incuba a 37 °C durante 1 h en 0.2 mi de la reacción. El reactivo A de ADP (100 µ?) y el reactivo B de ADP (200 µ?) son agregados y la mezcla es incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. La señal fluorescente que indica la actividad es medida con una longitud de onda de excitación de 530 mm y una longitud de onda de la emisión de 590 nm. Ejemplo 16 Expresión de la Ruta 3 Completa Construcción del vector pCLBudAB-ter-T5chnA El vector pTrc99a : : BudABC (descrito en el ejemplo 9) es digerido con EcoRI) y el ADN es tratado con la ADN polimerasa de Klenow para separar los extremos. El vector separado es digerido subsiguientemente con Spel para dar un fragmento de 2.5 kb que contiene los genes BudA y BudB. El vector pCL 1925-ter-T5chnA (descrito en el ejemplo 9) es digerido con HindIII, y el ADN fue tratado con la ADN polimerasa de Klenow para dividir los extremos. El vector separado es digerido subsiguientemente con Xbal para dar un fragmento de 4.6 kb que es ligado entonces al fragmento BudAB de pTrc99a : : BudABC . El plásmido resultante, designado pCLBudAB-ter-T5chnA, es utilizado para transformar las células ToplO de E. coli, y las colonias únicas fueron seleccionadas para la estructura del plásmido apropiada por PCR utilizando los cebadores pCL1925vecF (SEC ID NO: 62) y N84seqR3 (SEC ID NO: 159) . El plásmido es preparado a partir de una sola colonia que produce un producto de PCR del tamaño esperado de 1.4 kb. Construcción del vector pKK223. KA-AT-APT El gen APT es amplificado a partir del vector pBAD.APT (descrito en el ejemplo 12) por PCR utilizando los cebadores APTfor (SEC ID NO: 162; 5' incluye el sitio RBS y Smal) y APTrev (SEC ID NO: 163; 3' se agrega el sitio Smal) . El producto del tamaño esperado de 1.7 kbp es purificado con un gel y digerido con Smal para dar los extremos separados. El vector pKK223.KA-AT (descrito en el ejemplo 14) es digerido con PstI, y el ADN es tratado con la ADN polimerasa de Klenow para separar los extremos. El fragmento de ADN resultante es ligado con el producto de PCR digerido con Smal, y el producto de la ligadura es utilizado para transformar las células ToplO de E. coli. Las colonias resistentes a la ampicilina, individuales, son seleccionadas por PCR utilizando los cebadores OT872 (SEC ID NO: 127) y APTrev (SEC ID NO: 163) . La presencia de un producto de PCR del tamaño esperado de 4.1 kbp indica que el gen que codifica APT está presente y está orientado en la misma dirección que los genes que codifican KA y AT . La secuencia del inserto es verificado utilizando los cebadores APTseqRev (SEC ID NO: 160) y APTseqFor (SEC ID NO: 161) . Este plásmido es nombrado pKK223. KA-AT-APT . La expresión apropiada de la totalidad de los tres genes es verificada haciendo crecer un cultivo de 5 mi de ToplO/pKK223. KA-AT-APT en LB + 100 µq/ml de ampicilina a 37 °C con agitación. Cuando la OD6oo alcanza ~ 0.8, la expresión de los genes del plásmido es inducida por la adición de IPTG a 0.4 mM. La expresión es evaluada por SDS PAGE y los ensayos de la actividad como se describieron anteriormente. Construcción de la cepa de producción de 2-butanol y producción de 2-butanona y 2-butanol La cepa MG1655 de E. coli es transformada tanto con pKK223. KA-AT-APT como pCLBudAB-ter-T5chnA, y los transformantes seleccionados para la resistencia a la ampicilina y espectinomicina, indicativo de la presencia de los plásmidos. Las células son inoculadas en los recipientes de agitación (de aproximadamente 175 mi de volumen total) que contienen 50 ó 150 mi del medio de TM3a/glucosa (con los antibióticos apropiados) para representar las condiciones de oxigeno bajas e intermedias, respectivamente. IPTG es agregado a 0.4 mM para inducir la expresión de los genes de pKK223. KA-AT-APT . Como un control negativo, las células de MG1655 se hacen crecer en el mismo medio que carece de antibióticos. Los recipientes son inoculados a una OD600 de partida de < 0.01 y se incuban a 34 °C con agitación a 300 rpm durante 24 h. Los frascos que contienen 50 mi del medio son tapados con tapas ventiladas, los frascos que contienen 150 mi son tapados con tapas no ventiladas para minimizar el intercambio de aire. La cepa MG1655/pKK223. KA-AT- APT/pCLBudAB-ter-T5chnA que comprende una ruta biosintética de 2-butanol produce tanto la 2-butanona como el 2-butanol bajo condiciones de oxigeno intermedias y bajas mientras que la cepa de control negativo no produce niveles detectables ya sea de 2-butanona o de 2-butanol. Ejemplo 17 Caracterización de la actividad de la glicerol deshidratasa butandiol deshidratasa La glicerol deshidratasa (E.C. 4.2.1.30) y la diol deshidratasa (E.C. 4.2.1.28), aunque están relacionadas estructuralmente , frecuentemente son distinguidas en el arte basada en varias diferencias que incluyen la especificidad del substrato. Este ejemplo demuestra que la glicerol deshidratasa convierte el meso-2 , 3-butandiol a 2-butanona. La cepa KLP23/pSYC012 de E. coli recombinante, que comprende los genes de Klebsiella pneumoniae que codifican las subunidades múltiples de glicerol deshidratasa (alfa: SEC ID NO: 145 (región de codificación) y 146 (proteina), beta: SEC ID NO: 147 (región de codificación) y 148 (proteina) ; y gamma: SEC ID NO: 149 (región de codificación) y 150 (proteina)) y los genes de Klebsiella pneumoniae que codifica las subunidades múltiples de la glicerol deshidratasa reactivasa (subunidad grande, SEC ID NO: 151 (región de codificación) y 152 (proteina); y la subunidad pequeña, SEC ID NO: 153 (región de codificación) y 154 (proteina) ) , es descrita en Emptage et al., US 6, 514, 733 y en WO 2003089621, que son incorporados aquí para referencia. Un extracto libre de células, sin refinar, de KLP23/pSYC012 fue preparado por los métodos conocidos en el arte. El ensayo de enzima fue efectuado en la ausencia de la luz en el amortiguador HEPES 80 mM, pH 8.2 a 37 °C con la coenzima ??2 12 µ? y el meso-2 , 3-butandiol 10 mM. La formación de la 2-butanona fue verificada por CLAR (columna Shodex SH-1011 y una columna protectora SH-G con una detección del índice de refracción; H2S04 0.01 M como la fase móvil a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min y una temperatura de la columna de 50 °C; tiempo de retención de la 2-butanona = 40.2 min) . La velocidad de formación de la 2-butanona por la preparación de glicerol deshidratasa se determinó que va a ser de 0.4 nmol/min/mg de proteína sin refinar. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una célula hospedera microbiana recombinante, caracterizada porque comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir una conversión, seleccionado del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iii) acetoina al 3-amino-2-butanol ; iv) 3-amino-2-butanol al fosfato de 3-amino-2-butanol ; v) fosfato de 3-amino-2-butanol a la 2-butanona; y vi) 2-butanona al 2-butanol; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana y en donde la célula hospedera microbiana produce 2-butanol. 2. Una célula hospedera microbiana recombinante, caracterizada porque comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir la conversión, seleccionado del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iii) acetoina al 3-amino-2-butanol ; iv) 3-amino-2-butanol al fosfato de 3-amino-2-butanol; y v) fosfato de 3-amino-2-butanol a la 2-butanona; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana y en donde la célula hospedera microbiana produce 2-butanona. 3. Una célula hospedera de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de piruvato a alfa-acetolactato es la acetolactato sintasa. . Una célula hospedera de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de alfa-acetolactato a la acetoina es la acetolactato descarboxilasa . 5. Una célula hospedera de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de acetoina al 3-amino-2-butanol es la acetoina amilasa. 6. Una célula hospedera de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de 3-amino-2-butanol al fosfato de 3-amino-2-butanol es la aminobutanol cinasa. 7. Una célula hospedera de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto del fosfato de 3-amino-2-butanol a 2-butanona es la aminobutanol fosfato fosfo-liasa. 8. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de 2-butanona a 2-butanol es la butanol deshidrogenasa . 9. Una célula hospedera de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque es seleccionada del grupo que consiste de: una bacteria, una cianobacteria , un hongo filamentoso y una levadura. 10. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque es un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste de: Clostridium , Zymomonas, Escherichia , Salmonella , Rhodococcus , Pseudomonas , Bacillus , Lactobacillus , Enterococcus , Pediococcus , Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus , Arthrobacter, Corynebacterium , Brevibacterium , Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces . 11. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la acetolactato sintasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 77, y SEC ID NO: 79 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0 . 1 , y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. 12. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la acetolactato descarboxilasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 81 y SEC ID NO: 83 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina . 13. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la acetoina aminasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 122 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. 14. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la aminobutanol cinasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 124 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina . 15. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la aminobutanol fosfato fosfo-liasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 126 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. 16. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la butanol deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 75, y SEC ID NO: 91 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. 17. Un método para la producción de 2-butanol, caracterizado porque comprende: 1) proporcionar una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir la conversión seleccionada del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iii) acetoina al 3-amino-2-butanol ; iv) 3-amino-2-butanol al fosfato de 3-amino-2-butanol; v) fosfato de 3-amino-2-butanol a la 2-butanona; y vi) 2-butanona al 2-butanol; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana; y 2) poner en contacto la célula hospedera de (1) con un substrato de carbón fermentable en un medio de fermentación bajo condiciones por las cuales es producido el 2-butanol . 18. Un método para la producción de 2-butanona, caracterizado porque comprende: 1) proporcionar una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir la conversión seleccionada del grupo que consiste de: 1) piruvato al alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iii) acetoina al 3-amino-2-butanol ; iv) 3-amino-2-butanol al fosfato de 3-amino-2-butanol; y v) fosfato de 3-amino-2-butanol a la 2-butanona; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana; y 2) poner en contacto la célula hospedera de (1) con un substrato de carbón fermentable en un medio de fermentación bajo condiciones por las cuales se produce la 2-butanona . 19. Un método de conformidad con las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque el substrato de carbón fermentable es seleccionado del grupo que consiste de monosacáridos , oligosacáridos , y polisacáridos . 20. Un método de conformidad con las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de piruvato al alfa acetolactato es la acetolactato sintasa. 21. Un método de conformidad con las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto del alfa-acetolactato a la acetoina es la acetolactato descarboxilasa . 22. Un método de conformidad con las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de acetoina al 3-amino-2-butanol es la acetoina aminasa. 23. Un método de conformidad con las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de 3-amino-2-butanol al fosfato de 3-amino-2-butanol es la aminobutanol cinasa. 24. Un método de conformidad con las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto del fosfato de 3-amino-2-butanol a la 2-butanona es la aminobutanol fosfato fosfo-liasa. 25. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de la 2-butanona con respecto al 2-butanol es la butanol deshidrogenasa . 26. Un método de conformidad con las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque la célula es seleccionada del grupo que consiste de: una bacteria, una cianobacteria , un hongo filamentoso, y una levadura. 27. Un método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la célula es un elemento seleccionado del grupo que consiste de: Clostridium, Zymomonas , Escherichía , Salmonella , Rhodococcus , Pseudomonas , Bacillus , Lactobacillus , Enterococcus , Pediococcus , Alcaligenes , Klebsiella , Paeníbacillus , Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium , Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces . 28. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la acetolactato sintasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 77 y SEC ID NO: 79 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteína. 29. Un método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la acetolactato descarboxilasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 81 y SEC ID NO: 83 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. 30. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la acetoina aminasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 122 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. 31. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la aminobutanol cinasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 124 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. 32. Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la aminobutanol fosfato fosfo-liasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos como se describen en la SEC ID NO: 126 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina . 33. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la butanol deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 75 y SEC ID NO: 91 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. 34. Un medio de producto de fermentación que contiene 2-butanol, caracterizado porque es producido por el método de conformidad con la reivindicación 17. 35. Un medio de producto de fermentación que contiene 2-butanona, caracterizado porque es producido por el método de conformidad con la reivindicación 18.