DE102011003387A1

DE102011003387A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol

Info

Publication number: DE102011003387A1
Application number: DE102011003387A
Authority: DE
Inventors: Dr. Pfaller Rupert
Original assignee: Wacker Chemie AG
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2012-08-02
Also published as: WO2012104244A8; WO2012104244A1; US20130316418A1; EP2670837A1; BR112013019520A2

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Produktionsstamm zur Herstellung von 2,3-Butandiol. Dieser ist herstellbar aus einem Ausgangsstamm ausgewählt ist aus der Gattung Klebsiella, Raoultella, Paenibacillus und Bacillus und weist eine mindestens 3,6 bis 34,8 fach über dem Ausgangsstamm liegende Acetoinreduktase Aktivität auf. Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung von 2,3-Butandiol mittels dieses Produktionsstammes.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol (2,3-BDL) mittels eines verbesserten Mikroorganismenstammes, der eine 3,6 bis 34,8 fach erhöhte Acetoinreduktase (gleichbedeutend mit 2,3-Butandioldehydrogenase) Aktivität gegenüber dem nicht verbesserten Ausgangsstamm aufweist.
Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstellungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe.
Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthesebausteine) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2-Baustein), Glycerin, 1,3-Propandiol, 1,2-Propandiol (C3-Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Butanol, 2-Butanol, 1,4-Butandiol oder auch 2,3-Butandiol (C4-Bausteine). Diese chemischen Bausteine sind die biogenen Ausgangsverbindungen, aus denen dann auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fermentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen. Entscheidende Kostenfaktoren sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits effiziente mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Dabei ist entscheidend, dass die eingesetzten. Mikroorganismen das gewünschte Produkt in hoher Konzentration und unter geringer Nebenproduktbildung aus dem biogenen Rohstoff herstellen. Die Optimierung der als Produktionsstämme bezeichneten Mikroorganismen in Bezug auf Produktivität und Wirtschaftlichkeit wird beispielsweise erreicht durch Metabolic Engineering.
Ein auf fermentativem Weg zugänglicher C4-Baustein ist 2,3-Butandiol. Der Stand der Technik zur fermentativen 2,3-Butandiol Herstellung ist zusammengefasst in Celinska und Grajek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725). 2,3-Butandiol ist mögliches Ausgangsprodukt für Produkte der Petrochemie mit vier C-Atomen (C4-Bausteine) wie Acetoin, Diacetyl, 1,3-Butadien, 2-Butanon (Methyl-Ethylketon, MEK). Ausserdem sind Produkte mit zwei C-Atomen (C2-Bausteine) wie Essigsäure ( DE 102010001399 ) und davon abgeleitet, Acetaldehyd, Ethanol und auch Ethylen zugänglich. Durch Dimerisierung von 2,3-Butandiol sind auch C8-Verbindungen denkbar, die Verwendung z. B. als Treibstoff im Luftfahrtbereich haben.
Der von verschiedenen Mikroorganismen beschrittene biosynthetische Weg zu 2,3-Butandiol ist bekannt (siehe Review von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725) und führt vom zentralen Stoffwechselprodukt Pyruvat über die drei folgenden enzymatischen Schritte zum 2,3-Butandiol:
Reaktion der Acetolactatsynthase: Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat unter Abspaltung von CO₂.
Reaktion der Acetolactatdecarboxylase: Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin.
Reaktion der Acetoinreduktase (2,3-Butandioldehydrogenase): NADH-abhängige Reduktion von Acetoin zu 2,3-Butandiol.
Verschiedene natürliche Produzenten von 2,3-Butandiol sind bekannt, z. B. aus den Gattungen Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Lactococcus etc. Aber auch Hefen sind als Produzenten bekannt (z. B. Bäckerhefe). Die meisten bakteriellen Produzenten sind Mikroorganismen der biologischen Sicherheitsstufe S2, können also grosstechnisch nicht ohne aufwendige und teuere technische Sicherheitsmassnahmen eingesetzt werden (dazu und zu weiteren mikrobiellen 2,3-Butandiolproduzenten siehe Review von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725). Dies würde ebenso für bisher nicht beschriebene gentechnisch optimierte Produktionsstämme basierend auf diesen Stämmen gelten.
Für eine kosteneffiziente großtechnische 2,3-BDL Produktion kommen also nur Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe S1 in Frage. Für diese wurden jedoch bisher keine ausreichend hohen 2,3-BDL Ausbeuten beschrieben. Bekannte 2,3-BDL-Produktionsstämme aus der biologischen Sicherheitsstufe S1 sind Stämme der Arten Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, Stämme der Gattung Bacillus (bzw. Paenibacillus) wie Bacillus polymyxa oder Bacillus licheniformis. In der Fachliteratur (Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925–932) werden infolge einer taxonomischen Umbenennung die Arten Klebsiella terrigena und Klebsiella planticola synonym auch als Raoultella terrigena und Raoultella planticola bezeichnet. Es handelt sich dabei um Stämme der gleichen Art.
Für diese in der Sicherheitsstufe S1 eingestuften Stämme wurden bisher 2,3-Butandiolausbeuten von nicht mehr als 57 g/l (637 mM, Produktionsdauer 60 h) berichtet (Nakashimada et al., J. Bioscience and Bioengineering (2000) 90: 661–664). Diese Ausbeuten sind für eine wirtschaftliche Produktion bei weitem zu gering. Als minimale Fermentationsausbeute für eine wirtschaftliche Produktion werden > 80 g/l 2,3-Butandiol (Fermentationsdauer maximal 72 h), bevorzugt > 100 g/l 2,3-Butandiol angesehen.
Eine gängige Definition für den Begriff „biologische Sicherheitsstufe” und die Einteilung in verschiedene Sicherheitsstufen findet sich z. B. in „Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", S. 9ff. (Tabelle 1), Centers for Disease Control and Prevention (U.S.) (Editor), Public Health Service (U.S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor), Herausgeber: U.S. Dept. of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010); ISBN-10:0160850428.
Die Steigerung der Acetoinreduktaseaktivität (bzw. 2,3-Butandioldehydrogenaseaktivität) in Bakterien wird beschrieben in US 2010/0112655 , WO 2009/151342 und WO 99/54453 .
Die heterologe Expression eines Gens in Milchsäurebakterien z. B. der Art Lactobacillus plantarum, das für ein Protein mit Butandioldehydrogenaseaktivität kodiert, ist in US 2010/0112655 beschrieben. Voraussetzung für eine erfolgreiche 2,3-Butandiolproduktion ist dabei jedoch, dass der Produktionsstamm frei von Aktivität des Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH) ist. 3 in US 2010/0112655 zeigt, dass ein rekombinanter, Acetoinreduktase aus Klebsiella pneumoniae (Bud C) und Alkoholdehydrogenase (Sad B) aus Achromobacter xylosoxidans exprimierender L. plantarum Stamm kein 2,3-Butandiol produziert, ebenso wenig wie eine L. plantarum Mutante mit einer LDH Deletion. Erst die Kombination einer rekombinanten L. plantarum Mutante mit LDH Deletion und gleichzeitig heterologer Expression von Bud C und Sad B führt zur Produktion von geringen Mengen 2,3-Butandiol mit einer Ausbeute von 80 mM (entspricht 7,2 g/l). Bezogen auf die gesamte in Molarität bestimmte Ausbeute an gebildeten Produkten (siehe 3 in US 2010/0112655 ) betrug der Anteil an 2,3-Butandiol 49 Mol % der gemessenen Produkte, die aus Glucose gebildet wurden. Die Selektivität der Umwandlung von Glucose in 2,3-Butandiol ist damit vergleichsweise gering.
Für den Fachmann ergibt sich daraus, dass die einfache Überexpression einer Acetoinreduktase nicht zur Steigerung der 2,3-Butandiolausbeute in einem Produktionsstamm führt, sondern dass dazu zuvor eine aufwändige Stammoptimierung erforderlich ist, bei der einerseits eine oder mehrere störende LDH-Aktivitäten (im Fall von L. plantarum Ldh D und Ldh L1) entfernt und zusätzlich eine Alkoholdehydrogenaseaktivität rekombinant eingeführt werden muss. Darüber hinaus ist eine Ausbeute von 49 Mol % 2,3-Butandiol für eine wirtschaftliche Verwertung zu gering, da mehr als die Hälfte der verwerteten Glucose in der Bildung von Nebenprodukten resultiert.
WO 2009/151342 offenbart die Produktion von 2,3-BDL durch anaerobe Fermentation mit dem Bakterium Clostridium autoethanogenum und Kohlenmonoxid als C-Quelle. Maximal erzielte 2,3-BDL Ausbeuten betrugen 9,27 g/l nach einer Fermentationsdauer von 14 Tagen. In den genetisch nicht veränderten Stämmen wurde, als Mass der Expressionsstärke, der RNS-Gehalt der 2,3-Butandioldehydrogenase in 2,3-BDL produzierenden Ansätzen (hervorgerufen durch Kohlenmonoxidbegasung im Überschuss) im Vergleich zu einem Acetat produzierenden Ansatz (limitierte Kohlenmonoxidbegasung) bestimmt und eine Induktion der RNS des Wildtypgens der 2,3-Butandioldehydrogenase um den Faktor 7,64 (entspechend einer 2,3-BDL Produktion von 8,67 g/l nach 13 Tagen) gemessen. Die Induktion der Genexpression wurde durch verstärkte Begasung mit Kohlenmonoxid erreicht. Es wurde nicht offenbart, ob mit der Genexpression auch eine Steigerung der Acetoinreduktase Enzymaktivität verbunden war und wie hoch die vermeintliche Steigerung der Enzymaktivität im Vergleich zum Ausgangszustand war. Dem Fachmann ist bekannt, dass zwischen Transkription (RNS-Gehalt) und Translation (Enzymgehalt) kein linearer Zusammenhang besteht, sodass eine 7,64-fache Steigerung der Acetoinreduktase RNS in WO 2009/151342 nicht zwingend einer 7,64-fachen Steigerung der Acetoinreduktase Enzymaktivität entspricht. Bei dem gewählten Ansatz kann nicht unterschieden werden, ob die erhöhte 2,3-BDL Produktion durch den verstärkten Eintrag der C-Quelle Kohlenmonoxid erfolgte oder durch verstärkte Expression des 2,3-Butandioldehydrogenase Enzyms.
Kohlenmonoxid ist unter Bedingungen des aeroben Stoffwechsels toxisch, so dass sich aus der speziellen Situation der anaeroben Fermentation von C. autoethanogenum keine allgemeine Anleitung für eine Produktion unter aeroben oder mikroaeroben Bedingungen zur Steigerung der 2,3-Butandiolproduktion infolge der Kombination aus Begasung mit Kohlenmonoxid und einer gesteigerten 2,3-Butandioldehydrogenase Aktivität ableiten lässt. Darüber hinaus sind 2,3-BDL Ausbeuten von 8,67 g/l in 13 Tagen für eine wirtschaftliche Produktion bei weitem ungenügend, speziell unter Berücksichtigung eines erhöhten technischen Aufwands einer anaeroben Fermentation im großtechnischen Maßstab.
WO 99/54453 offenbart Milchsäurebakterien mit 10 fach erhöhter Aktivität entweder der Diacetylreduktase, der Acetoinreduktase, bzw. 2,3-Butandioldehydrogenase. Überraschenderweise wurde dabei nur eine Beeinflussung des Diacetylgehalts der als Starterkulturen in der Lebensmittelindustrie benutzten Milchsäurebakterien beobachtet. Es wurde jedoch nicht offenbart, ob sich eine erhöhte Aktivität der Acetoinreduktase, bzw. 2,3-Butandioldehydrogenase auf den 2,3-BDL Gehalt der Milchsäurebakterienkulturen auswirkte. Weder wurde offenbart, ob die in der Erfindung offenbarten Stämme überhaupt 2,3-BDL produzieren noch, ob die 10-fache Überexpression der Acetoinreduktase in einer Steigerung der 2,3-BDL Produktion resultierte. Wie bereits für US 2010/0112655 diskutiert, produzieren Milchsäurebakterien in Gegenwart des Milchsäure produzierenden Enzyms Lactatdehydrogenase kein 2,3-BDL auch nach Überexpression der Acetoinreduktase, so dass der Fachmann auch für die in WO 99/54453 offenbarten Milchsäurestämme keine signifikante Produktion von 2,3-BDL erwartet.
Die in WO 99/54453 offenbarte Erfindung ist beschränkt auf Milchsäurebakterien. Es handelt es sich um neuartige Starterkulturen für die Lebensmittelindustrie und die daraus hergestellten Lebensmittel sollen keinen erhöhten Gehalt an 2,3-Butandiol enthalten. Für den Fachmann ist es deshalb nicht offensichtlich, dass eine Steigerung der Acetoinreduktaseaktivität zwingend in einer erhöhten 2,3-BDL Ausbeute resultiert.
Aufgabe der Erfindung war es, Produktionsstämme zur Herstellung von 2,3-Butandiol bereitzustellen, die deutlich höhere 2,3-Butandiolausbeuten ermöglichen als der Ausgangsstamm.
Gelöst wurde die Aufgabe durch einen Produktionsstamm der aus einem Ausgangsstamm herstellbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgangsstamm ausgewählt ist aus der Gattung Klebsiella, Raoultella, Paenibacillus und Bacillus und der Produktionsstamm eine mindestens 3,6 bis 34,8 fach über dem Ausgangsstamm liegende Acetoinreduktase Aktivität aufweist.
In der vorliegenden Erfindung wird unterschieden zwischen einem Ausgangsstamm und einem Produktionsstamm. Beim Ausgangsstamm kann es sich um einen nicht weiter optimierten, aber zur 2,3-Butandiolproduktion befähigten Wildtypstamm oder einen bereits weiter optimierten Wildtypstamm handeln. Bei einem bereits weiter optimierten Wildtypstamm (z. B. durch einen gentechnischen Eingriff erfolgt) ist jedoch nicht die Acetoinreduktase Aktivität von der Optimierung betroffen.
Unter einem Produktionsstamm im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein bezüglich der 2,3-Butandiolproduktion optimierter Ausgangsstamm zu verstehen, der durch eine im Vergleich zum Ausgangsstamm erhöhte Aktivität des Enzyms Acetoinreduktase (AR) gekennzeichnet ist. Vorzugsweise ist der Produktionsstamm aus dem Ausgangsstamm hergestellt. Wenn ein bereits optimierter Ausgangsstamm durch eine Erhöhung der Acetoinreduktase Aktivität nochmals verbessert werden soll, so ist es natürlich ebenso möglich zunächst in einem unverbesserten Stamm die Acetoinreduktase Aktivität zu erhöhen und anschließend weitere Verbesserungen einzubringen.
Die Erhöhung der Acetoinreduktaseaktivität im Produktionsstamm kann dabei hervorgerufen sein durch eine beliebige Mutation im Genom des Ausgangsstammes (z. B. eine die Promotoraktivität steigernde Mutation), eine die Enzymaktivität steigernde Mutation im Acetoinreduktasegen oder durch Überexpression eines homologen oder aber auch heterologen Acetoinreduktasegens im Ausgangsstamm.
Bevorzugt ist die Überexpression eines homologen oder eines heterologen Acetoinreduktasegens im Ausgangsstamm.
Bevorzugt ist die Acetoinreduktase Aktivität um mindestens den Faktor 3,6 bis 20 und besonders bevorzugt um den Faktor 3,6 bis 10 erhöht.
Besonders bevorzugt wird diese erhöhte Acetoinreduktase Aktivität durch eine gegenüber dem Ausgangsstamm erhöhte Expression eines homologen oder heterologen, für ein Acetoinreduktaseenzym kodierendes Gen erreicht.
Bei dem Ausgangsstamm kann es sich um einen beliebigen 2,3-Butandiol produzierenden Stamm der Sicherheitsstufe S1 handeln.
Bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa oder Bacillus licheniformis wobei ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola nochmals bevorzugt ist.
Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Ausgangsstamm und einen Produktionsstamm eingestuft in der Sicherheitsstufe S1 und von diesen, darüber hinaus bevorzugt, Stämme der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola.
Entsprechend dem Stand der Technik (siehe US 2010/0112655 , WO 2009/151342 und WO 99/54453 ) musste der Fachmann davon ausgehen, dass die Überexpression der Acetoinreduktase keine Verbesserung der 2,3-Butandiol Produktion in einem Produktionsstamm bewirken kann. Im Rahmen von Versuchen, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurde überraschend gefunden, dass durch eine begrenzte (3,6 bis 34,8 fach) erhöhte Acetoinreduktase Aktivität in einem Produktionsstamm die Ausbeute an 2,3-Butandiol signifikant gesteigert werden kann. Vorzugsweise wird die erhöhte Acetoinreduktase Aktivität durch rekombinante Überexpression einer Acetoinreduktase in einem Produktionsstamm erreicht.
Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt, ist eine Überexpression der Acetoinreduktase um den Faktor 3,6 bis bis zu einem Faktor 34,8 (siehe 3. Beispiel) dazu geeignet, die 2,3-Butandiolausbeute (bestimmt als Volumenausbeute 2,3-Butandiol in g/l) in der Fermentation um mehr als 20%, bevorzugt mehr als 30%, besonders bevorzugt mehr als 40% und insbesondere bevorzugt um mehr als 100% zu steigern.
Wie im 4. Beispiel weiter offenbart, ermöglicht die rekombinante Überexpression der Acetoinreduktase auch eine Erhöhung der 2,3-Butandiolausbeute im Schüttelkolben um 20–29%.
Bei der Acetoinreduktase (AR) kann es sich um jedes genkodierte Enzym handeln, das nach Formel (III) durch Oxidation des Cofaktors NADH (oder auch NADPH) zu NAD (oder NADP) die Synthese von 2,3-Butandiol aus Acetoin bewirkt.
In einer bevorzugten Ausführung stammt das Gen der Acetoinreduktase aus einem Bakterium der Gattung Klebsiella (Raoultella) oder Bacillus (Paenibacillus).
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammt das Gen der Acetoinreduktase aus einem Stamm der Art Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, Bacillus polymyxa oder Bacillus licheniformis und insbesondere aus einem Stamm der Art Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola oder Bacillus licheniformis. Diese Stämme, darunter auch der in der vorliegenden Erfindung verwendete Stamm Klebsiella terrigena DSM 2687, sind alle käuflich erhältlich z. B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig).
Der erfindungsgemäße Stamm ermöglicht somit die Steigerung der fermentativen Produktion von 2,3-Butandiol. Die Erfindung ermöglicht somit nicht nur die Produktion von 2,3-Butandiol sondern auch die Produktion anderer Stoffwechselprodukte, die sich vom 2,3-Butandiol ableiten lassen. Zu diesen Stoffwechselprodukten gehören Diacetyl, Acetoin, Ethanol und Essigsäure.
Ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm ist in einer bevorzugten Ausführungsform auch dadurch charakterisiert, dass er aus einem Ausgangsstamm, wie in der Anmeldung definiert, hergestellt wurde und eine Acetoinreduktase in rekombinanter Form produziert mit der Folge, dass seine 2,3-BDL Produktion (Volumenproduktion ausgedrückt in g/l 2,3-BDL) gegenüber dem nicht gentechnisch optimierten Ausgangsstamm um mindestens 20%, bevorzugt 30%, besonders bevorzugt 40% und insbesondere bevorzugt um 100% gesteigert wird, wobei die 2,3-Butandiol Ausbeute des Ausgangsstammes mindestens 80 g/l beträgt.
Der erfindungsgemäße Produktionsstamm wird vorzugsweise hergestellt durch Einbringen eines Genkonstruktes in einen der genannten Ausgangsstämme.
Das Genkonstrukt in seiner einfachsten Form ist definiert als bestehend aus dem Acetoinreduktase Strukturgen, dem operativ verbunden, ein Promotor vorgeschaltet ist. Gegebenenfalls kann das Genkonstrukt auch einen Terminator umfassen, der dem Acetoinreduktase Strukturgen nachgeschaltet ist. Bevorzugt ist ein starker Promotor, der zu einer starken Transkription führt. Unter den starken Promotoren bevorzugt ist der sog. dem Fachmann aus der Molekularbiologie von E. coli geläufige „Tac-Promotor”.
Das Genkonstrukt kann in an sich bekannter Weise in Form eines autonom replizierenden Plasmids vorliegen, wobei die Kopienzahl des Plasmids variieren kann. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Plasmiden bekannt, die abhängig von ihrer genetischen Struktur in einem gegebenen Produktionsstamm in autonomer Form replizieren können.
Das Genkonstrukt kann jedoch auch im Genom des Produktionsstammes integriert sein, wobei jeder Genort entlang des Genoms als Integrationsort geeignet ist.
Das Genkonstrukt, entweder in Plasmidform oder mit dem Ziel der genomischen Integration, wird in an sich bekannter Weise durch genetische Transformation in den Produktionsstamm eingebracht. Verschiedene Methoden der genetischen Transformation sind dem Fachmann bekannt (Rune and Aachmann, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 85: 1301–1313), darunter beispielsweise die Elektroporation.
Zur Selektion transformierter Produktionsstämme enthält das Genkonstrukt, ebenfalls in bekannter Weise, einen sog. Selektionsmarker zur Auswahl von Transformanten mit dem gewünschten Genkonstrukt. Bekannte Selektionsmarker sind ausgewählt aus sog. Antibiotika-Resistenzmarkern oder aus den eine Auxotrophie komplementierenden Selektionsmarkern.
Bevorzugt sind Antibiotika-Resistenzmarker, besonders bevorzugt solche, die Resistenz gegen Antibiotika ausgewählt aus Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol oder Zeocin verleihen.
Ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm enthält somit in einer bevorzugten Ausführungsform das Genkonstrukt, entweder in Plasmidform oder in das Genom integriert und produziert ein Acetoinreduktase Enzym in rekombinanter Form. Das rekombinante Acetoinreduktase Enzym ist in der Lage, unter Oxidation von NADH (bzw. alternativ auch NADPH) zu NAD (bzw. alternativ zu NADP) aus Acetoin 2,3-Butandiol zu produzieren. Nun wurde überraschend gefunden, dass durch geeignete rekombinante Überexpression des Acetoinreduktase Enzyms im Produktionsstamm die 2,3-Butandiol Ausbeute gegenüber dem Ausgangsstamm in signifikanter Weise gesteigert werden kann.
Beim Ausgangsstamm kann es sich um einen nicht weiter optimierten Wildtypstamm handeln. Der Ausgangsstamm kann jedoch bereits vorher optimiert worden sein, bzw. als erfindungsgemässer Acetoinreduktase produzierender Produktionsstamm weiter optimiert werden. Die von der Erfindung umfasste Optimierung eines erfindungsgemässen Acetoinreduktase produzierenden Produktionsstammes kann einerseits durch Mutagenese und Selektion von Mutanten mit verbesserten Produktionseigenschaften erfolgen. Die Optimierung kann jedoch auch gentechnisch erfolgen durch zusätzliche Expression eines oder mehrerer Gene, die zur Verbesserung der Produktionseigenschaften geeignet sind. Beispiele solcher Gene sind die bereits genannten 2,3-Butandiol Biosynthesegene Acetolactatsynthase und Acetolactatdecarboxylase. Diese Gene können in an sich bekannter Weise als jeweils eigene Genkonstrukte oder aber auch kombiniert als eine Expressionseinheit (als sog. Operon) im Produktionsstamm exprimiert werden. So ist beispielsweise bekannt, dass in Klebsiella terrigena alle drei Biosynthesegene des 2,3-Butandiols (sog. BUD-Operon, Blomqvist et al., J. Bacteriol. (1993) 175: 1392–1404), bzw. in Stämmen der Gattung Bacillus die Gene der Acetolactatsynthase und der Acetolactatdecarboxylase in einem Operon organisiert sind (Renna et al., J. Bacteriol (1993) 175: 3863–3875).
Weiterhin kann der Produktionsstamm dadurch optimiert werden, dass ein oder mehrere Gene inaktiviert werden, deren Genprodukte sich negativ auf die 2,3-Butandiol Produktion auswirken. Beispiele dafür sind Gene, deren Genprodukte für die Nebenproduktbildung verantwortlich sind. Dazu zählen z. B. die Lactatdehydrogenase (Milchsäurebildung), die Acetaldehyddehydrogenase (Ethanolbildung) oder aber auch die Phosphotransacetylase, bzw. die Acetatkinase (Acetatbildung).
Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Produktion von 2,3-Butandiol mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Produktionsstammes.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Zeilen eines erfindungsgemäßen, Acetoinreduktase produzierenden Produktionsstammes in einem Anzuchtmedium kultiviert werden. Dabei wird einerseits Biomasse des Produktionsstammes und andererseits das Produkt 2,3-BDL gebildet. Die Bildung von Biomasse und 2,3-BDL kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die Anzucht in Schüttelkolben (Labormaßstab) erfolgen oder aber auch durch Fermentation (Produktionsmaßstab).
Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmaßstab durch Fermentation, wobei als Produktionsmaßstab ein Fermentationsvolumen größer 10 l besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolumen größer 300 l insbesondere bevorzugt ist.
Anzuchtmedien sind dem. Fachmann aus der Praxis der mikrobiellen Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle), einer Stickstoffquelle (N-Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen, durch die das Zellwachstum und die 2,3-BDL Produktbildung optimiert werden. C-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur 2,3-BDL Produktbildung genützt werden können. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6-Zucker wie z. B. Glucose, Mannose oder Fructose sowie C5-Zucker wie z. B. Xylose, Arabinose, Ribose oder Galactose.
Das erfindungsgemäße Produktionsverfahren umfasst jedoch auch alle C-Quellen in Form von Disacchariden, insbesondere Saccharose, Lactose, Maltose oder Cellobiose.
Das erfindungsgemässe Produktionsverfahren umfasst weiterhin auch alle C-Quellen in Form höherer Saccharide, Glycoside oder Kohlehydrate mit mehr als zwei Zuckereinheiten wie z. B. Maltodextrin, Stärke, Cellulose, Hemicellulose, Pektin bzw. daraus durch Hydrolyse (enzymatisch oder chemisch) freigesetzte Monomere oder Oligomere. Dabei kann die Hydrolyse der höheren C-Quellen dem erfindungsgemässen Produktionsverfahren vorgeschaltet sein oder aber in situ während des erfindungsgemässen Produktionsverfahrens erfolgen.
Andere verwertbare, von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C-Quellen sind Essigsäure (bzw. davon abgeleitete Acetatsalze), Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze), Milchsäure (sowie deren Salze) oder Pyruvat (und dessen Salze). Es sind aber auch gasförmige C-Quellen wie Kohlendioxid oder Kohlenmonoxid denkbar.
Die vom erfindungsgemässen Produktionsverfahren betroffenen C-Quellen umfassen sowohl die isolierten Reinsubstanzen oder aber auch, zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit, nicht weiter aufgereinigte Gemische der einzelnen C-Quellen, wie sie als Hydrolysate durch chemischen oder enzymatischen Aufschluss der pflanzlichen Rohstoffe gewonnen werden können. Dazu gehören z. B. Hydrolysate der Stärke (Monosaccharid Glucose), der Zuckerrübe (Monosaccharide Glucose, Fructose und Arabinose), des Zuckerrohrs (Disaccharid Saccharose), des Pektins (Monosaccharid Galacturonsäure) oder auch der Lignozellulose (Monosaccharid Glucose aus Cellulose, Monosaccharide Xylose, Arabinose, Mannose, Galactose aus Hemicellulose sowie das nicht zu den Kohlehydraten gehörende Lignin). Weiterhin können als C-Quellen auch Abfallprodukte aus dem Aufschluss pflanzlicher Rohstoffe dienen, so z. B. Melasse (Zuckerrübe) oder Bagasse (Zuckerrohr).
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der Produktionsstämme sind Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Xylose, Arabinose sowie pflanzliche Hydrolysate, die aus Stärke, Lignozellulose, Zuckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können.
Besonders bevorzugte C-Quelle ist Glucose, entweder in isolierter Form oder als Bestandteil eines pflanzlichen Hydrolysats.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomassebildung genützt werden können. Dazu gehören Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH₄OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des weiteren sind als N-Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KNO₃, NaNO₃, Ammoniumnitrat, Ca(NO₃)₂, Mg(NO₃)₂ sowie andere N-Quellen wie z. B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Aminosäuregemische wie z. B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das Anzuchtsmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt.
Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed), um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C-Quelle, der N-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion. wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die 2,3-BDL Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed.
Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed-Batch Modus.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Glucose, Saccharose, Melasse, oder pflanzliche Hydrolysate, die aus Stärke, Lignozellulose, Zuckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH₄OH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KNO₃, NaNO₃ und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Ammoniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form).
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die 2,3-BDL Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der nützliche pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 8. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 7,5. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7.
Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produktionsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 35°C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauerstoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr (aerobe Kultivierung). Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff, wobei die Sauerstoffversorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet wird. Besonders bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft.
Die Kultivierungsdauer zur 2,3-BDL Produktion beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.
Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das 2,3-BDL Produkt, vorzugsweise im Kulturüberstand. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene 2,3-BDL Produkt kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterverwendet werden oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Zur Isolierung des 2,3-BDL Produkts stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Verfügung, darunter Zentrifugation, Dekantierung, Filtration, Extraktion, Destillation oder Kristallisation, bzw. Fällung., Diese Verfahrensschritte können dabei in jeder beliebiger Form kombiniert werden, um das 2,3-BDL Produkt in der gewünschten Reinheit zu isolieren. Der dabei zu erzielende Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung des 2,3-BDL Produkts.
Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades des 2,3-BDL Produktes sind verfügbar, darunter NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden.
Die Figuren zeigen die in den Beispielen genannten Plasmide.
1 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 3,65 kb grossen Acetoinreduktase Expessionsvektor pBudCkt.
2 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 3,67 kb grossen Acetoinreduktase Expessionsvektor pARbl.
3 zeigt das in Beispiel 1 genutzte Plasmid pACYC184.
4 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 5,1 kb grossen Expessionsvektor pBudCkt-tet.
5 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 5,1 kb grossen Expessionsvektor pARbl-tet.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert:
1. Beispiel:
Herstellung von Acetoinreduktase Expressionsvektoren
Verwendet wurden die Acetoinreduktase Gene aus K. terrigena und B. licheniformis. Die DNS-Sequenz des Acetoinreduktasegens aus K. terrigena ist offenbart in der „GenBank” Gendatenbank unter der Zugangsnummer L04507, bp 2671–3440. Es wurde in einer PCR-Reaktion (Tag DNS-Polymerase, Qiagen) aus genomischer K. terrigena DNS (Stamm DSM 2687, käuflich erhältlich bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) mit den Primern BUD7f und BUD9r als DNS-Fragment von 0,78 kb Grösse isoliert.
Die DNS-Sequenz des Acetoinreduktase Gens aus B. licheniformis ist offenbart in der „GenBank” Gendatenbank unter der Zugangsnummer NC 006322.1, unter der die gesamte Genomsequenz von B. licheniformis offenbart ist. Das Acetoinreduktase Gen ist dort in komplementärer Form von bp 2007068–2007850 zu finden. Es wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS-Polymerase, Qiagen) aus genomischer B. licheniformis DNS (Stamm DSM 13, käuflich erhältlich bei der DSMZ GmbH) mit den Primern BLar-1f und BLar-2r als DNS-Fragment von 0,78 kb Grösse isoliert.
Die für die PCR-Reaktionen verwendete genomische DNS war zuvor in an sich bekannter Weise mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht von K. terrigena DSM 2687 und B. licheniformis DSM 13 in LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl) gewonnen worden.
Primer BUD7f (SEQ ID NO: 1) und BUD9r (SEQ ID NO: 2) hatten folgende DNS-Sequenzen:
SEQ ID NO: 1:
5'-GAA TTC ATG CAA AAA GTC GCA CTT GTC ACC-3'
SEQ ID NO: 2:
5'-AAG CTT TTA GTT GAA TAC CAT GCC GCC GTC-3'
Primer BLar-1f (SEQ ID NO: 3) und BLar-2r (SEQ ID NO: 4) hatten folgende DNS-Sequenzen:
SEQ ID NO: 3:
5'-GAA TTC ATG AGT AAA GTA TCT GGA AAA ATT G-3'
SEQ ID NO: 4:
5'-CTG CAG TTA ATT AAA TAC CAT TCC GCC ATC-3'
Die PCR-Produkte wurden mit Eco RI (in Primer BUD7f und BLar-1f enthalten) und Hind III (in Primer BUD9r enthalten), bzw. Pst I (in Primer BLar-2r enthalten), nachverdaut und in den Expressionsvektor pKKj kloniert. Dabei entstanden die jeweils 4,9 kb grossen Acetoinreduktase Expessionsvektoren pBudCkt (1) und pARbl (2).
Der Expressionsvektor pKKj ist ein Derivat des Expressionsvektors pKK223-3. Die DNS-Sequenz von pKK223-3 ist offenbart in der „GenBank” Gendatenbank unter der Zugriffnummer M77749.1. Aus dem 4,6 kb Plasmid wurden ca. 1,7 kb entfernt (bp 262–1947 der in M77749.1 offenbarten DNS-Sequenz), wodurch der 2,9 kb Expressionsvektor pKKj entstand.
Die Expressionsvektoren pBudCkt und pARbl wurden durch Einbau einer Expressionskassette für das Tetracyclin Resistenzgen modifiziert. Dazu wurde das Tetracyclin Resistenzgen zuerst aus dem Plasmid pACYC184 (3) isoliert. Die DNS-Sequenz von pA-CYC184 ist zugänglich in der „Genbank” Gendatenbank unter der Zugangnummer X06403.1). Durch PCR (Taq DNS Polymerase, Qiagen) mit den Primern tet1f und tet2r und anschließendem Verdau mit Bgl II (Schnittstellen enthalten in den Primern tet1f und tet2r) wurde die Tetracyclin Expressionskassette als 1,45 kb Fragment aus pACYC184 isoliert und dann in die jeweils mit Bam HI geschnittenen Vektoren pBudCkt und pARbl kloniert. Dadurch entstanden die jeweils 6 kb grossen Expressionsvektoren p-BudCkt-tet (4) und pARbl-tet (5). Wie in 4 und 5 dargestellt, wurde jeweils ein Klon ausgewählt, bei dem die Tetracyclin- und die Acetoinreduktase Expressionskassetten jeweils in der gleichen Richtung orientiert waren.
Primer tet1f (SEQ ID NO: 5) und tet2r (SEQ ID NO: 6) hatten folgende DNS-Sequenzen:
SEQ ID NO: 5:
5'-TCA TGA GAT CTC AGT GCA ATT TAT CTC TTC-3'
SEQ ID NO: 6:
5'-TCA TGA GAT CTG CCA AGG GTT GGT TTG CGC ATT C-3'
2. Beispiel:
Expressionsanalyse in E. coli
Plasmid-DNS der Expressionsvektoren pBudCkt-tet und pARbl-tet wurde nach an sich bekannten Methoden in den E. coli Stamm JM105 transformiert. Als Kontrolle diente E. coli JM105, transformiert mit dem Vektor pACYC184. Jeweils ein Klon wurde ausgewählt und in einer Schüttelkolbenanzucht kultiviert. Von den E. coli-Stämmen wurde in LBtet-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 15 μg/ml Tetracyclin) eine Vorkultur hergestellt (Anzucht bei 37°C und 120 rpm über Nacht). Je 2 ml Vorkultur wurden als Inokulum einer Hauptkultur von 100 ml Lötet Medium (300 ml Erlenmeyerkolben) verwendet. Die Hauptkulturen wurden bei 30°C und 180 rpm geschüttelt, bis eine Zelldichte OD600 von 2,0 erreicht wurde. Dann wurde der Induktor IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid, 0,4 mM Endkonzentration) zugegeben und über Nacht bei 30°C und 180 rpm geschüttelt.
Zur Analyse der Acetoinreduktase Expression wurden 50 ml der E. coli Zellen zentrifugiert (10 min 15000 rpm, Sorvall Zentrifuge RC5C, ausgestattet mit einem SS34 Rotor), das Zellpellet in 2 ml KPi-Puffer (0,1 M Kaliumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0) aufgenommen, in an sich bekannter Weise mit einem sog. „French^®Press” Hochdruckhomogenisator (SLM-AMINCO) aufgeschlossen und ein Zellextrakt durch Zentrifugation (15 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor) isoliert. Aliquots der Zellextrakte wurden zur spektralphotometrischen Bestimmung der Acetoinreduktase Aktivität verwendet. Während im Kontrollstamm keine Aktivität gemessen werden konnte, betrug die spezifische Acetoinreduktase Aktivität in Zellextrakten, abhängig vom jeweiligen Konstrukt, zwischen 70 und 122 U/mg Protein.
Spektralphotometrische Bestimmung der Acetoinreduktase Aktivität: Die Bestimmung der Acetoinreduktase Aktivität wurde in an sich bekannter Weise durchgeführt. Dabei wird das Substrat Acetoin durch AR in einer NADH-abhängigen Reaktion reduziert. Es entsteht 2,3-Butandiol und NADH wird in stöchiometrischen Mengen verbraucht. Der Verbrauch von NADH wird photometrisch bei 340 nm bestimmt. 1 U Acetoinreduktase Aktivität ist definiert als die Enzymmenge, die 1 μmol Acetoin/min unter Testbedingungen reduziert.
Der Messansatz von 1 ml Volumen zur photometrischen Bestimmung von AR-Aktivität war zusammengesetzt aus Messpuffer (0,1 M K-Phosphat, pH 7,0; 0,1 M NaCl; 1 mM MgCl2 × 7 H2O), 10 μl Acetoin, 0,2 mM NADH und AR-haltigem Zellextrakt. Messtemperatur war 25°C. Der Messansatz wurde durch Zugabe des AR-haltigen Zellextrakts gestartet und die Extinktionsabnahme infolge des Verbrauchs von NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen (Extinktionskoeffizient NADH: ε = 0,63 × 10⁴ l × Mol^–1 × cm^–1).
Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die Proteinkonzentration der Zellextrakte in an sich bekannter Weise mit dein sog. „BioRad Proteinassay” der Fa. BioRad bestimmt.
3. Beispiel:
Expression von Acetoinreduktase in Klebsiella terrigena Ausgangsstamm war Klebsiella terrigena. DSM 2687. Die Transformation mit den Plasmiden pBudC, pBudCkt-tet, pARbl und pARbl-tet erfolgte in an sich bekannter Weise analog der dem Fachmann geläufigen Methoden zur Transformation von E. coli. Als Kontrollstamm wurde der nicht transformierte Wildtyp Stamm Klebsiella terrigena DSM 2687 verwendet.
Transformanten wurden isoliert und durch Schüttelkolbenanzucht auf Acetoinreduktase Aktivität getestet. Dazu wurden jeweils 50 ml FM2amp-Medium (Plasmide pBudCkt und pARbl), bzw. FM2tet-Medium (Plasmide pBudCkt-tet und pARbl-tet), bzw. FM2-Medium ohne Antibiotikum (K. terrigena Wildtyp Kontrollstamm) mit einer Transformante beimpft und 24 h bei 30°C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert.
FM2-Medium enthielt Glucose 60 g/l; 10 g/l; Hefeextrakt (Oxoid) 2,5 g/l; Ammoniumsulfat 5 g/l; NaCl 0,5 g/l; FeSO₄ × 7 H₂O 75 mg/l; Na₃Citrat × 2 H₂O 1 g/l; CaCl₂ × 2 H₂O 14,7 mg/l; MgSO₄ × 7 H₂O 0,3 g/l; KH₂PO₄ 1,5 g/l; Spurenelementemix 10 ml/l und, im Falle von FM2amp, Ampicillin 100 mg/l, bzw. im Falle von FM2tet, Tetracyclin 15 mg/l. Der pH des FM2tet Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt.
Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H₃BO₃ 2,5 g/l; CoCl₂ × 6 H₂O 0,7 g/l; CuSO₄ × 5 H₂O 0,25 g/l; MnCl₂ × 4 H₂O 1,6 g/l; ZnSO₄ × 7 H₂O 0,3 g/l und Na₂MoO₄ × 2 H₂O 0,15 g/l.

Die Zellen wurden, wie im 2. Beispiel für E. coli beschrieben, analysiert. Klebsiella Zellen wurden mit der „French^®Press” aufgeschlossen und die Zellextrakte auf Acetoinreduktase Aktivität untersucht. Die spezifische Acetoinreduktase Aktivität in Rohextrakten der verschiedenen Stämme (bestimmt wie im 2. Beispiel beschrieben) ist in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1: Vergleich der Acetoinreduktase Aktivität in rekombinanten K. terrigena Stämmen

Stamm	Konstrukt	Acetoinreduktase (U/mg)	relative Aktivität
K. terrigena WT	-	1,6	1
K. terrigena pARbl	pARbl	5,7	3,6
K. terrigena pARbl-tet	pARbl-tet	24,9	15,6
K. terrigena pBudCkt	pBudCkt	19,4	12,1
K. terrigena pBudCkt-tet	pBudCkt-tet	55,7	34,8

4. Beispiel:
2,3-BDL-Produktion durch Schüttelkolbenanzucht rekombinanter K. terrigena Stämme
Die Kultivierung der mit dem Plasmiden pBudCkt-tet und pARbl-tet transformierten K. terrigena Stämme erfolgte wie im 3. Beispiel beschrieben. Die Kultivierungsdauer betrug jedoch 72 h.
Dabei wurde die Glucosekonzentration in Abständen von 24 h bestimmt (Glucoseanalysator 7100MBS der Fa. YSI) und Glucose bei Bedarf aus einer 40% (w/v) Stocklösung nachgefüttert. Nach einer Kultivierungsdauer von 48 h und 72 h wurden Proben auf ihren 2,3-BDL Gehalt untersucht. Das Ergebnis der 2,3-BDL Produktion ist in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: BDL-Produktion im Schüttelkolben von Acetoinreduktase überexprimierenden Klebsiella terrigena Transformanten

K. terrigena WT K. t.-pBudCkt-tet K. t.-pARbl-tet

Zeit (h) 2,3 BDL (g/l) 2,3 BDL (g/l) 2,3 BDL (g/l)

48 26,4 31,6 34,6

72 32,0 41,3 38,6
Wie in Tabelle 2 ersichtlich, resultierte die Überexpression der Acetoinreduktase Gene aus K. terrigena, bzw. B. licheniformis in Klebsiella terrigena in einer unerwartet hohen Steigerung der 2,3-BDL Produktion in der Schüttelkolbenanzucht um 20–29%. Die Steigerung der 2,3-Butandiolproduktion wird offensichtlich durch Überexpression der Acetoinreduktase bewirkt.
Die Bestimmung des 2,3-Butandiolgehalts in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch ¹H-NMR. Dazu wurde ein Aliquot der Anzucht zentrifugiert (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) und 0,1 ml des Kulturüberstandes mit 0,6 ml TSP (3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3-d₄ Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/l) in D₂O gemischt. Die ¹H-NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruker. Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analyten in folgenden Bereichen integriert:

TSP: 0,140–0,145 ppm (9H)

2,3-Butandiol: 1,155–1,110 ppm (6H)

Ethanol: 1,205–1,157 ppm (3H)

Essigsäure: 2,000–1,965 ppm (3H)

Acetoin: 2,238–2,200 ppm (3H)
5. Beispiel:
2,3-BDL Produktion mit Acetoinreduktase überexprimierenden K. terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation
Verwendet wurden „Labfors II” Fermenter der Fa. Infors. Das Arbeitsvolumen betrug 1,5 l (3 l Fermentervolumen). Die Fermenter waren entsprechend dem Stand der Technik mit Elektroden zur Messung des pO₂ und des pH sowie mit einer Schaumsonde ausgerüstet, welche bei Bedarf die Zudosierung einer Antischaumlösung regulierte. Die Werte der Messsonden wurden über ein Computerprogramm aufgezeichnet und graphisch dargestellt. Die Fermentationsparameter Rührerdrehzahl (rpm), Belüftung (Versorgung mit Pressluft in vvm, Volumen Pressluft pro Volumen Fermentationsmedium pro Minute), PO₂ (Sauerstoffpartialdruck, auf einen Anfangswert von 100% kalibrierter relativer Sauerstoffgehalt), pH und Fermentationstemperatur wurden über ein vom Fermenterhersteller bereitgestelltes Computerprogramm gesteuert und aufgezeichnet. Feed Medium (74% Glucose, w/v) wurde entsprechend dem Glucoseverbrauch über eine peristaltische Pumpe zudosiert. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde ein alkoxylierter Fettsäureester auf vegetabilischer Basis, käuflich erhältlich unter der Bezeichnung Struktol J673 bei. Schill & Seilacher (20–25% v/v in Wasser verdünnt), verwendet.
In der Fermentation eingesetzte Stämme waren der Klebsiella terrigena Wildtyp Stamm (Kontrollstamm aus dem 3. und 4. Beispiel) und die Acetoinreduktase überproduzierenden Stämme Klebsiella terrigena-pBudCkt-tet und Klebsiella terrigena-pARbl-tet (siehe 3. und 4. Beispiel). Batch-Fermentationsmedium war FM2tet Medium (siehe 3. Beispiel, Medium ohne Tetracyclin für den K. terrigena Wildtyp Kontrollstamm).
1,35 l des Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Batch-Fermentationsmedium hergestellt. Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,0.
In regelmässigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter:
Die Zelldichte OD600 als Mass der gebildeten Biomasse wurde. photometrisch bei 600 nm bestimmt (BioRad Photometer SmartSpec^TM 3000).
Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Dreifachbestimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert, das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Glucosegehalt wurde bestimmt wie im 4. Beispiel beschrieben.
Der 2,3-BDL-Gehalt wurde durch NMR bestimmt wie im 4. Beispiel beschrieben.
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Glucose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. Watson Marlow) eine 74 (w/v) Glucoselösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Glucose Verbrauchsrate bestimmt.
Tabelle 3 zeigt die zeitabhängige 2,3-BDL-Bildung im K. terrigena Kontrollstamm und in den Acetoinreduktase überproduzierenden, rekombinanten Klebsiella terrigena Stämmen.

Wie bereits in den Schüttelkolbenexperimenten beobachtet (4. Beispiel), führt die Überexpression der Acetoinreduktase mit den Expressionsplasmiden pBudCkt-tet und pARbl-tet zu einer signifikanten Steigerung der 2,3-Butandiolproduktion um 34,2 (heterologes AR-Gen) – 43,7% (homologes AR-Gen), bezogen auf die Maximalausbeute bei 72 h Fermentationsdauer. Die Produktionsverläufe sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Produktion von 2,3-BDL. in K. terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation

	K. terrigena WT	K. t.-pBudCkt-tet	K. t.-pARbl-tet
Zeit (h)	2,3 BDL (g/l)	2,3 BDL (g/l)	2,3 BDL (g/l)
24	60,8	69,7	71,3
27	68,1	80,8	76,6
31	69,1	90,2	86,2
48	81,3	121,2	110,1
51	80,5	114,0	113,5
55	86,9	115,8	118,3
72	91,7	131,8	123,1

6. Beispiel:
2,3-BDL Fermentation im 330 l Maßstab
Fermentiert wurde der Stamm Klebsiella terrigena-pBudCkt-tet (siehe 4. und 5. Beispiel).
Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter: Ein Inokulum von Klebsiella terrigena-pBudCkt-tet in Lötet Medium (siehe 2. Beispiel) wurde hergestellt, indem 2 × 100 ml Lötet Medium, jeweils in einem 1 l Erlenmeyerkolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (Über-Nacht Kultur des Stammes in Lötet Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20 % v/v versetzt und bei –20°C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte OD₆₀₀/ml von 0,5–2,5). 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 l Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 l Fermentermedium.
Vorfermenter: Die Fermentation wurde in zwei Biostat^® C-DCU 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt.
Fermentationsmedium war FM2tet (siehe 3. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Batch Modus.
2 × 8 l FM2tet wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH₄OH, bzw. 6 N H₃PO₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoffpartialdruck pO₂ wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450–1.000 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol. J673 (20–25% v/v in Wasser) verwendet. Nach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD₆₀₀/ml von 30–40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwendet.
Hauptfermenter: Die Fermentation wurde in einem Biostat^® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 l, Kesselvolumen 500 l) der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2tet (siehe 3. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus.
180 l FM2tet wurden mit 16 l Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25% NH₄OH, bzw. 6 N H₃PO₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm (siehe 4. Beispiel, bezogen auf das An fangsvolumen). Der Sauerstoffpartialdruck pO2 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 200–500 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20–25% v/v in Wasser) verwendet. Im Verlauf der Fermentation wurde der Glucoseverbrauch durch off-line Glucose-Messung mit einem Glucose-Analysator der Fa. YSI bestimmt (siehe 4. Beispiel). Sobald die Glucosekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/l betrug (8–10 h nach Inokulation), wurde die Zudosierung einer 60% w/w Glucose Feedlösung gestartet. Die Flußrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Glucosekonzentration von 10–20 g/l eingehalten werden konnte. Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 330 l.
Die Analyse der Fermentationsparameter erfolgte wie im 5. Beispiel beschrieben. Der Gehalt an 2,3-Butandiol und der Nebenprodukte Acetoin, Ethanol und Acetat wurde durch NMR bestimmt (siehe 4. Beispiel). Der Lactatgehalt wurde in an sich bekannter Weise (siehe z. B. US 2010/0112655 ) durch HPLC bestimmt.
Der Produktionsverlauf der Fermentation ist in Tabelle 4 dargestellt. Die mit dem erfindungsgemässen Stamm Klebsiella terrigena-pBudCkt-tet erzielte Ausbeute von 128,8 g/l 2,3-Butandiol war unerwartet hoch und war mehr als 40 höher als die mit einem Klebsiella terrigena Wildtypstamm üblicherweise erzielte Ausbeute von ca. 90 g/l (siehe 5. Beispiel). Tabelle 4 Produktion von 2,3-BDL durch Fed-Batch. Fermentation im 330 l Massstab

K. t.-pBudCkt-tet

Zeit (h) 2,3 BDL (g/l)

23 76,1

27 78,9

31 92,6

46 114,7

50 121,2

54,5 127

70,5 128,8

Nach Beendigung der Fermentation (70,5 h) wurde die Fermenterbrühe auf den Gehalt weiterer bekannter Fermentationsprodukte untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Der 2,3-Butandiol Anteil, bezogen auf die molare Ausbeute der analytisch nachweisbaren Produkte, betrug 77,6 und war damit signifikant- höher als die in US 2010/0112655 offenbarte Ausbeute von 49%. Tabelle 5 Analyse der Fermentationsprodukte des Stammes K. terrigenapBudCkt-tet

Produkt	Gehalt (g/l)	Gehalt (mM)	Mol-Gehalt bezogener Produktanteil (%)
2,3-Butandiol	128,8	1431	77,6
Acetoin	8,8	100	5,4
Diacetyl	0	0	0
Acetat	4,7	78,3	4,2
Ethanol	6,1	132,6	7,2
Lactat	9,1	101,1	5,5

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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US 2010/0112655 [0012, 0013, 0013, 0013, 0017, 0030, 0118, 0120]
WO 2009/151342 [0012, 0015, 0015, 0030]
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Claims

Produktionsstamm zur Herstellung von 2,3-Butandiol herstellbar aus einem Ausgangsstamm dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgangsstamm ausgewählt ist aus der Gattung Klebsiella, Raoultella, Paenibacillus und Bacillus und der Produktionsstamm eine mindestens 3,6 bis 34,8 fach über dem Ausgangsstamm liegende Acetoinreduktase Aktivität aufweist.
Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass er eine um den Faktor 3,6 bis 20, besonders bevorzugt um den Faktor 3,6 bis 10 erhöhte Acetoinreduktase Aktivität aufweist.
Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Acetoinreduktase Aktivität durch eine gegenüber dem Ausgangsstamm erhöhte Expression eines für das Acetoinreduktaseenzym kodierenden Gens erreicht wird.
Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa oder Bacillus licheniformis verwendet wird und bevorzugt ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola verwendet wird und es sich besonders bevorzugt um einen Stamm der Sicherheitsstufe S1 handelt.
Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen der Acetoinreduktase aus einem Bakterium der Gattung Klebsiella (Raoultella) oder Bacillus stammt.
Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem nicht gentechnisch optimierten Ausgangsstamm hergestellt wurde und eine Acetoinreduktase in rekombinanter Form produziert mit der Folge, dass seine 2,3-BDL Produktion (Volumenproduktion, ausgedrückt in g/l 2,3-BDL) gegenüber dem nicht gentechnisch optimierten Ausgangsstamm um mindestens 20%, bevorzugt 30%, besonders bevorzugt 40% und insbesondere bevorzugt um 100% gesteigert wird, wobei die 2,3-Butandiol Ausbeute des Ausgangsstammes mindestens 80 g/l beträgt.
Verfahren zur Herstellung von 2,3-Butandiol, dadurch gekennzeichnet, dass ein Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 bis 6 in einem Anzuchtmedium kultiviert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem pH-Bereich von pH 5 bis pH 8 und einem Temperaturbereich von 20°C bis 40°C und anaerob oder aerob mit einer Sauerstoffversorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff erfolgt und eine Kultivierungsdauer zur 2,3-BDL Produktion zwischen 10 h und 200 h vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem Fermentationsvolumen größer als 300 l erfolgt.