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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung
von Citronensäure
(CS) mit einer genetisch veränderten
Hefe Yarrowia lipolytica (Y. lipolytica)
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Citronensäure wird
gegenwärtig
zu 99% auf biotechnologischen Weg unter Verwendung ausgewählter Stämme des
Ascomyceten Aspergillus niger großtechnisch hergestellt. Als
Kohlenstoff-Quelle (C-Quelle) werden insbesondere Melasse und andere
zuckerhaltige landwirtschaftliche Abfallprodukte verwendet. Bei
diesem Verfahren kommt es jedoch auch zur Bildung von signifikanten
Mengen an flüssigen
und festen Abfallprodukten. Die in kristalliner Form vertriebene
Citronensäure
wird in großem
Umfang in verschiedenen Industriezweigen, vorwiegend jedoch in der
Lebensmittelindustrie und der pharmazeutischen Industrie als Geschmacksträger, Konservierungsmittel,
Säuerungsmittel
und Antioxidationsmittel eingesetzt (Roehr et al. 1996, Citric acid,
Biotechnology Vol 6, Rehm and Reed, eds).
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Interessant
ist ein alternatives Produktionsverfahren für Citronensäure mit der Hefe Y. lipolytica,
mit dem aufgrund der Eigenschaften dieser Hefe eine Reihe hydrophober
Substrate, wie pflanzliche und tierische Öle und Fette oder n-Alkane, als C-Quelle
verwertet werden können.
Bereits seit Mitte der 60er Jahre ist bekannt, dass Y. lipolytica
unter spezifischen Bedingungen in der Lage ist, Citronensäure (CS)
und Isocitronensäure
(ICS), sowie andere Metabolite des Intermediärstoffwechsels wie Pyruvat
und α-Ketoglutarat,
zu sekretieren. Die entsprechenden Kultivierungsbedingungen wurden
seitdem umfassend untersucht. Wichtigste Voraussetzung für eine Überproduktion
und Ausscheidung dieser Metabolite ist eine Wachstumslimitation
der Produktionskultur bei gleichzeitigem Überschuss an verwertbarer C-Quelle
(Stottmeister et al. 1982, Z Allg Mikrobiol 22: 399–424). Die
Wachstumslimitation der Kultur wird dabei durch Begrenzung notwendiger
Nährmediumsbestandteile
wie z. B. Mineralstoffe, Vitamine und Aminosäuren erzielt. Die Art der gebildeten
Metabolite richtet sich nach der limitierenden Nährstoffkomponente und weiteren
Kultivierungsbedingungen, wie der eingesetzten C-Quelle oder dem
pH-Wert des Produktionsmediums.
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Die Überproduktion
von Citronen- und Isocitronensäure
kann durch Stickstoff-, Phosphor-, Schwefel- oder Magnesiummangel
hervorgerufen werden (Stottmeister et al. 1982, Z Allg Mikrobiol
22: 399–424).
Bei auxotrophen Stämmen
ist die CS/ICS-Bildung zudem durch Aminosäuremangel induzierbar (Barth
und Krebs 1984,
DD 227
448 A1 ). Eine Wachstumslimitation durch Mangel an Thiamin,
welches von Y. lipolytica nicht selbst gebildet wird, initiiert
hingegen die Bildung von 2-Ketoglutarsäure und Pyruvat (Weissbrodt
et al. 1988,
DD 267999
A1 , Chernyavskaya et al. 2000, Appl Microbiol Biotechnol
53: 152–158).
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Bei
einem industriellen Prozess der Citronensäureproduktion ist die gleichzeitige
Bildung von mehr als 10% Isocitronensäure bezogen auf den Gesamtsäuregehalt
(CS + ICS) unerwünscht,
da dies die Produktaufarbeitung, insbesondere die Kristallisation
der CS, erschwert.
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Das
Produktverhältnis
CS/ICS und die Produktausbeute sind bei Wildtypstämmen von
Y. lipolytica abhängig
von den eingesetzten C-Quellen. Auf Glucose und Glycerol bildet
Y. lipolytica etwa 90% CS und 10% ICS (Treton et al. 1978, Appl
Microbiol Biotechnol 6: 67–77).
Bei Verwendung von Ethanol als C-Quelle wurden ähnliche Produktverhältnisse
gefunden (Arzumanov et al. 2000, Appl Microbiol Biotechnol 53: 525–529). Auf den
für eine
industrielle Anwendung interessanten hydrophoben Substraten wie
pflanzlichen Ölen
oder n-Alkanen verschiebt sich das Produktverhältnis auf einen ICS-Anteil
von 40 bis 50% (Übersichten
bei Stottmeister et al. 1982, Z Allg Mikrobiol 22: 399–424, und
Finogenova 1991, In: Alkane metabolism and oversynthesis of metabolites
by microorganisms, Finogenova TV and Sharyshev AA, eds, Center for
Biological Research, USSR Academy of Science, Pushchino, Russia,
pp 96–114).
Die Reduzierung dieses hohen ICS-Anteils ist ein maßgeblicher
Kostenfaktor für
eine industrielle Citronensäureproduktion
mit Y. lipolytica.
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Aus
diesem Grund gab es zahlreiche Bemühungen, spontan auftretende
oder durch chemische oder UV-Mutagenese erzeugte Mutanten von Y.
lipolytica zu selektieren, die eine Verschiebung des Produktverhältnisses
CS/ICS aufweisen. Bei der weiteren Untersuchung solcher Mutanten
wurden verschiedene Veränderungen
in der Expression und Regulation von Enzymen des Citronensäure- und
Glyoxylatzyklus gefunden. Im wesentlichen konzentrierten sich diese
Untersuchungen auf die Aconitase (ACO), die Isocitratlyase (ICL)
und die Isocitratdehydrogenasen (NAD(P)-IDH).
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Von
Akiyama et al. (1972, Agric Biol Chem 36: 339–341) wurde gezeigt, dass durch
chemische Mutagenese erzeugte Mutanten mit gegenüber Wildtypstämmen erhöhter ACO-Aktivität eine Verschiebung
des Produktverhältnisses
CS/ICS zugunsten der ICS aufweisen. In Arbeiten von Finogenova et
al. (Finogenova 1991, In: Alkane metabolism and oversynthesis of
metabolites by microorganisms, Finogenova TV and Sharyshev AA, eds,
Center for Biological Research, USSR Academy of Science, Pushchino,
Russia, pp 96–114) wurde
dargestellt, dass Mutanten mit gegenüber dem Wildtyp erhöhter und
reduzierter ICS-Akkumulation eine Reihe von Veränderungen in den spezifischen
Aktivitäten
von Enzymen des Citronensäure-
und Glyoxylatzyklus zeigten. Weitere Erkenntnisse stammen aus der
gezielten Veränderung
spezifischer Enzymaktivitäten durch
definierte Kultivierungsbedingungen. So wiesen Hattori et al. (1974,
Hakko Kogatku Zasshi 52: 542–550) nach,
dass infolge Absenkung der spezifischen Aktivität der Aconitase und der NADP-abhängigen Isocitratdehydrogenase
durch pH-Regulation
mittels Ammoniak bei Kultivierung auf Paraffin eine Verschiebung
des Produktverhältnisses
zugunsten der CS auftrat.
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Obwohl
zahlreiche Anhaltspunkte für
die Beeinflussung des Produktspektrums durch die Enzyme des Citronensäure- und
Glyoxylatzyklus vorliegen, sind die biochemischen und molekularbiologischen
Zusammenhänge
bis heute nicht vollständig
geklärt.
Mit den bisher bekannten Methoden ist eine gezielte Herstellung
leistungsfähiger
Produktionsstämme
für die
CS-Produktion mit geringer ICS-Akkumulation nicht möglich.
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Aufgrund
intensiver molekularbiologischer Forschung an der Hefe Y. lipolytica
in den letzten zwei Jahrzehnten stehen heute alle notwendigen Methoden
für eine
genotypische Stammoptimierung zur Verfügung (Barth und Gaillardin
1997, FEMS Microbiol Rev 19: 219–237). Zahlreiche Gene, die
an der Verwertung hydrophober Substrate beteiligt sind, wurden bereits
charakterisiert und kloniert. Von den oben genannten Enzymen des
Glyoxylatzyklus wurde bisher eine Sequenz des Strukturgens der Isocitratlyase
(ICL1) beschrieben und kloniert (Barth und Scheuber 1993, Mol Gen
Genet 241: 422–430).
Der starke und gut regulierbare Promotor dieses Gens wurde bereits
mehrfach zur heterologen Expression von Proteinen in Y. lipolytica
genutzt (Juretzek et al. 1995,
DE19525282 ,
Juretzek et al. 1998,
DE 19932811 ,
WO0003008).
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In
DD 259 637 A1 wird
ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Enzyms Isocitratlyase
(Kurzform ICL oder Icl1p) offenbart. Dazu werden ICL-negative bakterielle
Produktionsstämme
als auch ICL-negative Hefe-Produktionsstämme mit verschiedenen Expressionsplasmiden
(pYLB40 oder pYLB90) transformiert, welche eine unter der Kontrolle
des ICL1-Promotors stehende für
die Aminosäuresequenz
von Isocitratlyase kodierende. DNS tragen.
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DE 195 25 282 A1 hat
zum Ziel, ein neuartiges, einfach zu regulierendes Expressionssystem
zur rekombinanten Herstellung von heterologen Genen in Y. lipolytica
bereitzustellen. Dazu wird eine Expressionskassette offenbart, mit
der heterologe Proteine in Yarrowia exprimiert werden können. Diese
Kassette enthält die
regulatorischen Genabschnitte des Isocitratlyasegens ICL1 aus Y.
lipolytica, nämlich
die Promotor-(plCL1) und die Terminatorsequenz (ICL1t). Der Genabschnitt,
der für
die Isocitratlyase-Aktivität,
also das Protein Isocitratlyase, selbst kodiert, ist in der Expressionskassette
jedoch nicht enthalten. Stattdessen ist zwischen Promotor- und Terminatorsequenz
die heterologe Gensequenz einkloniert:
Yigitoglu, M. Production
of citric acid by fungi (1992) Journal of Islamic Academy of Sciences,
Vol 5(2) Seite 100–106
ist ein Übersichtsartikel
zur biotechnologischen Herstellung von Citronensäure durch Pilze, insbesondere
durch den Pilz Aspergillus niger, der überwiegend zur Citronensäureproduktion
verwendet wird. Im Abschnitt „Strain
Improvement" wird
erwähnt,
dass McKay et al. (1990) die Citronensäurenausbeuten mit dem Y. lipolytica
Stamm IFO 1658 mittels UV-Mutagenese
und anschliessender Selektion verdoppeln konnten. Als Kohlenstoffquelle
wurde dabei Glucose verwendet. Aussagen über die Anteile am unerwünschten
Nebenprodukt Isocitronensäure
oder die Citronensäure-Ausbeuten
bei Verwendung von Alkanen oder Fetten als Kohlenstoffquelle werden
nicht gemacht.
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Die
gezielte Mutation oder Erhöhung
der Kopiezahl eines bestimmten Gens zur Verbesserung der Citronensäureausbeute
wird nicht genannt.
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Die
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von
Zitronensäure
mit der Hefe Y. lipolytica zu entwickeln, bei dem deutlich weniger
Isocitronensäure
anfällt
und mit dem eine wirtschaftlich effiziente Citronensäureproduktion
mit der Hefe Y. lipolytica ermöglicht
wird.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe gelöst
durch ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Citronensäure in einem
Produktverhältnis
Citronensäure/Isocitronensäure von
mindestens 94:6 in Hefezellen von Yarrowia lipolytica mit den Schritten:
- a) Transformation von Yarrowia lipolytica-Zellen
mit einem für
die mehrfache genomische Integration geeigneten Vektor, der eine
Expressionskassette mit einer für
das Enzym Isocitratlyase kodierenden Gensequenz und ein als Selektionsmarker
wirkendes Gen enthält,
- b) Selektion von Yarrowia lipolytica Zellen, die mindestens
10 zusätzliche
Kopien der für
das Enzym Isocitratlyase kodierenden Gensequenz und des Selektionsmarkers
stabil in ihr Genom integriert haben, in einem geeigneten Nährmedium,
- c) Kultivierung von Yarrowia lipolytica-Zellen, die mindestens
10 zusätzliche
Kopien der für
das Enzym Isocitratlyase kodierenden Gensequenz stabil in ihr Genom
integriert haben, unter Stickstoff-, Phosphor-, Schwefel-, Magnesium-
oder bei Verwendung auxotropher Stämme unter Aminosäuremangel
und gleichzeitigem Überschuss
an einer verwertbaren Kohlenstoffquelle,
- d) Reinigung der Citronensäure.
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Die
mehrfache Integration eines für
die Isocitratlyaseaktivität
codierenden Gens in das Hefegenom wird durch die Transformation
mit speziellen multicopy Plasmidvektoren und anschließendem Selektionsdruck erreicht.
Dazu wird in einen Vektor, der einen multicopy Selektionsmarker
enthält,
ein für
eine Isocitratlyaseaktivität
(Icl1p-Aktivität)
codierende Gensequenz einkloniert und der Vektor in einen zum Selektionsmarker
passenden Y. lipolytica Stamm transformiert.
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Vorzugsweise
wird dazu eine Gensequenz in den Vektor einkloniert, die für ein Protein
gemäß SEQ ID No.
1 codiert. Das erfindungsgemäße Icl1-Protein
gemäß SEQ ID
No. 1 unterscheidet sich in seiner Sequenz signifikant zu der aus
Barth und Scheuber 1993, Mol Gen Genet 241: 422–430 bekannten Sequenz.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine Expressionskassette gemäß SEQ ID No. 2 in den Vektor
einkloniert. Dabei enthält
die Expressionskassette gemäß SEQ ID
No. 2 eine Gensequenz, die für
das erfindungsgemäße Protein
gemäß SEQ ID
No. 1 codiert.
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Geeignete
Vektoren und Y. lipolytica Stämme
sind dem Fachmann bekannt und zugänglich. Diese Vektoren enthalten
neben dem Selektionsmarker, wie beispielsweise allele Varianten
des URA3-Gens, eine homologe Transformationsplattform, wie den Sequenzbereich
der ribosomalen DNA (rDNA) oder die zeta genannte LTR-Sequenz (long
terminal repeat) des Retrotransposons Ylt1 aus Y. lipolytica. Eine
solche Transformationsplattform ermöglicht eine Integration durch
homologe Rekombination mit häufig
vorhandenen Sequenzen im Hefegenom (Juretzek et al. 2001, Yeast
18: 97–113).
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Die
integrative Transformation erfolgt mit den linearisierten Vektoren
unter Verwendung der Lithium-Acetat-Methode (modifiziert nach Barth
und Gaillardin 1996, Yarrowia lipolytica. In: Nonconventional Yeasts
in Biotechnology, Wolf K, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg
New York, pp 313–388).
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Transformiert
wird in einen zum Markergen passenden Y. lipolytica Stamm. Im Falle
eines URA3-Allels als Selektionsmarker, ist dies beispielsweise
ein Y. lipolytica Stamm, in dem das URA3-Gen defekt ist. Y. lipolytica
Stämme
mit defektem URA3-Gen und Methoden zu Ihrer Herstellung sind in
der Literatur beschrieben (Barth und Gaillardin 1996, Yarrowia lipolytica.
In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Wolf K, ed, Springer-Verlag,
Berlin Heidelberg New York, pp 313–388).
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Ein
Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
besteht vor allem darin, dass leistungsfähige Y. lipolytica Stämme für die Citronensäureproduktion
mit verringerter Isocitronensäurebildung
einfach und gezielt hergestellt werden können.
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Vorzugsweise
enthält
der verwendete Vektor eine Expressionskassette gemäss SEQ ID
No. 2.
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In
Ausführungsbeispiel
1 wird dazu beispielhaft die Transformation der Vektoren p64ICL1
und p67ICL1 in den Y. lipolytica Stamm H222-S4 (ura3-302) mit einem
Defekt im URA3-Gen beschrieben. Die Plasmide p64ICL1 und p67ICL1
enthalten ein im Promoterbereich verkürztes Allel des URA3-Gens,
ura3d4, als Selektionsmarker. Durch die Verkürzung des Promoterbereichs
im ura3d4-Allel wird eine mehrfache Integration von ura3d4 in das
Hefegenom notwendig, um den Defekt im URA3-Gen zu kompensieren.
Plasmide mit anderen multicopy Selektionsmarkern, wie z. B. von
entsprechenden allelen Varianten des LEU2-Gens und entsprechende
Y. lipolytica Stämme
können
auch verwendet werden.
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Die
Expression des Genproduktes Isocitratlyase wird in Y. lipolytica
Stämmen,
die das ICL1-Gen mehrfach in ihr Genom integriert haben, deutlich
erhöht.
Gleichzeitig wird eine stabile Zunahme der spezifischen Isocitratlyaseaktivität erzielt. Überraschenderweise
wird weder die erhöhte
ICL1-Expression, noch die Isocitratlyaseaktivität durch transkriptionelle,
posttranslationale und metabolische Gegenregulationsmechanismen aufgehoben
(s. Ausführungsbeispiel
2).
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Zur
Herstellung von Citronensäure
werden die erfindungsgemäßen Y. lipolytica
Stämme,
die das ICL1-Gen mehrfach in ihr Genom integriert haben, unter Mangelbedingungen,
die zu einer Überproduktion
von CS und ICS führen,
kultiviert, wie beispielsweise unter Stickstoff-, Phosphor-, Schwefel-,
Magnesium- oder bei Verwendung auxotropher Stämme durch Aminosäuremangel.
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Vorteilhaft
muss durch die stabile Integration des ICL1-Gens in das Hefegenom
der erfindungsgemäßen Stämme bei
der Citronensäureproduktion
kein weiterer Selektionsdruck mit kostenintensiven Chemikalien ausgeübt werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten
Stämme
können
zur Citronensäureproduktion daher problemlos
in großvolumigen
Bioreaktoren (Fermentern) verwendet werden.
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Ein
wichtiger wirtschaftlicher Vorteil des erfindungsgemäßen. Verfahrens
besteht darin, dass die verwendeten Y. lipolytica Stämme für die Citronensäureproduktion
eine Vielzahl verschiedener C-Quellen wie z.B. Glucose, Glycerol,
Ethanol, n-Alkane, pflanzliche oder tierische Öle bzw. Fette nutzen können. Mit
allen genannten Substraten resultiert das erfindungsgemäße Verfahren
in einer deutlich verringerten Akkumulation der nicht gewünschten
Isocitronensäure
im Vergleich zu Wildtypstämmen. Überraschend
ergibt sich somit bei der Herstellung von Citronensäure mit
Y. lipolytica Stämmen,
die das ICL1-Gen mehrfach in ihr Genom integriert haben, eine deutliche
Verschiebung des Produktverhältnisses
CS/ICS zugunsten der Citronensäure
(s. Ausführungsbeispiel
3).
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Durch
den erheblich verminderten Anteil an Isocitronensäure wird
die anschließende
Reinigung der Citronensäure
stark vereinfacht. Letztere geschieht nach bekannten Methoden, wie
beispielsweise durch Ausfällen
oder chromatographische Verfahren.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die in dem Ausführungsbeispiel
1 verwendete Expressionskassette gemäss SEQ ID No. 2.
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Gegenstand
der Erfindung sind auch Vektoren, welche die Expressionskassette
gemäss
SEQ ID No. 2 enthalten, bevorzugt die Vektoren p64ICL1 oder p67ICL1
deren Sequenzen der SEQ ID No. 3 bzw. SEQ ID No. 4 entsprechen.
Des weiteren ist Gegenstand der Erfindung ein Stamm von Y. lipolytica,
der mehrere Kopien einer für
eine Isocitratlyaseaktivität
codierenden Gensequenz stabil in sein Genom integriert hat, bevorzugt
die Sequenz gemäss
SEQ ID No. 2.
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Bevorzugt
sind auch die Stämme
von Y. lipolytica, die mit einem der Vektoren p64ICL1 oder p67ICL1 transformiert
sind.
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Des
weiteren bevorzugt ist der Stamm von Y. lipolytica N222-S4(p64ICL1)
T1 mit der Hinterlegungsnummer DSM 15105 bei der Deutschen Sammlung
für Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig gemäss dem Budapester Vertrag hinterlegt.
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Gegenstand
der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Stammes
von Y. lipolytica zur Herstellung von Citronensäure.
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Die
Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.
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In
diesen Beispielen werden folgende Hefestämme und Vektoren verwendet:
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Wildtyp- und Laborstämme für die Transformation
von Yarrowia lipolytica
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- • H222
(MATA): Wildtypstamm (Mauersberger et al. 2001, J Bacteriol 183:
5102–5109).
- • H222-S4
(MATA ura3-302): Herstellung durch Genzerstörung des URA3-Gens in H222 infolge
Insertion des SUC2-Gens aus Saccharomyces cerevisiae durch integrative
Transformation mit einem 4,3 kb SalI aus dem Plasmid pINA302 (Mauersberger
et al. 2001, J Bacteriol 183: 5102–5109). Dieser Stamm enthält, wie H222,
keine freien zeta Elemente bzw. kein intaktes Ylt1 (Juretzek et
al. 2001, Yeast 18: 97–113).
- • E129L1
(MATA lys11-23 ura3-302 xpr2-322): Herstellung durch Komplementation
der Leucin-Auxotrophie aus dem Laborstamm E129 (MATA lys11-23 leu2-270
ura3-302 xpr2-322) mit dem Plasmid pINA62 (Barth und Gaillardin
1996, Yarrowia lipolytica. In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology,
Wolf K, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp 313–388).
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Die
in den Ausführungsbeispielen
verwendeten Stämme
entstammen der Stammsammlung des Institutes für Mikrobiologie an der TU Dresden.
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Ausführungsbeispiel 1:
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Multiple Integration des
ICL1-Gens in Yarrowia lipolytica
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Integrative
Vektoren für
die multicopy Transformation von Yarrowia lipolytica Für die multiple
Integration des ICL1-Genes in das Hefegenom wurden die multicopy
Vektoren p64ICL1 und p67ICL1 (1, SEQ ID No.
3 und 4) auf der Grundlage der Plasmide p64IP und p67IP für die heterologe
Expression von Proteinen unter Kontrolle des ICL1-Promotors in Y.
lipolytica (Juretzek et al. 2001, Yeast 18: 97–113) konstruiert. Die verwendeten
Ausgangsvektoren p64IP und p67IP enthalten ein ICL1-Promotorfragment
aus Y. lipolytica. Als multicopy Selektionsmarker wurde das ura3d4-Allel
des URA3-Gens von Y. lipolytica eingesetzt. Diese Markersequenz
ermöglicht
die multicopy Transformation von Y. lipolytica Stämmen mit
einem Defekt im URA3-Gen (Ura–). Als homologe Transformationsplattform
tragen die Vektoren die rDNA Sequenz (p64IP) bzw. die als zeta bezeichnete
long terminal repeat (LTR) Sequenz des Retrotransposons Ylt1 aus
Y. lipolytica (p67IP). Im Gegensatz zur rDNA tritt zeta nicht in
allen Y. lipolytica Stämmen
auf, so dass die Vektoren p67IP bzw. p67ICL1 für die Transformation zeta freier
Stämme
mit deutlich geringerer Transformationseffizienz einsetzbar sind.
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In
die Vektoren p64IP bzw. p67IP wurde das 2,3 kb BamHI Fragment des
ICL1-Strukturgens
eingesetzt. Die so erhaltenen Vektoren p64ICL1 und p67ICL1 (1)
enthalten damit als Expressionskassette das vollständige ICL1-Gen
(gemäß Seq ID
No. 2).
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Multiple Integration des
ICL1-Gens in Yarrowia lipolytica
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Für die Amplifikation
der Integrationsvektoren wurde der E. coli Stamm DHSαc verwendet.
Die E. coli Zellen wurden dazu in LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin
bei 37°C
kultiviert. Die Isolierung der Vektor-DNA erfolgte mittels Plasmidpräparation
nach Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
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Die
Vektoren (1) wurden nach Linearisierung
mit SacII (p64ICL1) bzw. NotI (p67ICL1) unter Verwendung der modifizierten
Lithium-Acetat-Methode nach Barth und Gaillardin (Barth und Gaillardin
1996, Yarrowia lipolytica. In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology,
Wolf K, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp 313–388) integrativ
in die Rezipientenstämme
H222-S4 und E129L1
transformiert. Für
die Transformation wurden jeweils 2–5 μg Plasmid-DNA eingesetzt. Die
Transformanden mit einer Kompensation des Uracil-Defektes infolge
der multicopy Integration des Vektors wurden auf Agarplatten mit
Minimalmedium M (nach Reader, modifiziert: Mauersberger et al. 1996,
Candida maltosa. In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Wolf
K, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp 411–580) mit
Glucose als C-Quelle durch Kultivierung bei 28°C über 3 bis 10 Tage selektiert.
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Transformanden
(TF) mit dem rDNA Vektor p64ICL1 wurden mit den beiden Ausgangsstämmen N222-S4
und E129L1 mit einer Frequenz von 30 bis 70 TF/μg DNA erhalten. Mit dem zeta
Vektor p67ICL1 konnte der zeta freie Stamm H222-S4 jedoch nur mit
der deutlich geringeren Effizienz von etwa 0,5–1 TF/μg DNA transformiert werden.
Der viele zeta Kopien tragende Stamm E129L1 war dagegen mit dem
Vektor p67ICL1 mit einer Effizienz von 30 TF/μg DNA transformierbar. Im Vergleich
dazu war die integrative Transformation dieser Stämme mit
den single copy Plasmiden p65ICL1 und p66ICL1 (enthalten das ura3d1-Allel
als Selektionsmarker anstelle ura3d4, bei sonst gleichem Aufbau
wie die Plasmide des Typs p64 bzw. p67, vgl. Juretzek et al. 2001,
Yeast 18: 97–113)
mit einer deutlich höheren
Effizienz von 1600 bis 2400 TF/μg
DNA möglich.
Jedoch fällt
auch in diesem Fall die Transformationseffizienz des Stammes H222-S4
mit dem zeta Plasmid p67ICL1 auf 30 TF/μg DNA deutlich ab.
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Die
Gewinnung der schwerer zu isolierenden p67ICL1 Transformanden von
N222-S4 war von Interesse, da frühere
Befunde zeigten, dass Transformanden mit Plasmiden des p67-Typs
durch Tandem- und/oder Mehrfachintegration an verschiedenen Orten
des Genoms offensichtlich eine größere Stabilität besitzen als
die Transformanden des p64-Typs, da letztere durch Integration in
die sich durch größere Flexibilität auszeichnenden
ribosomalen DNA (rDNA) Regionen entstehen (Juretzek et al. 2001,
Yeast 18: 97–113).
Die multicopy Transformanden von H222-S4 mit p67ICL1 wurden deshalb
mit den Transformanden des Typs H222-S4(p64ICL1) verglichen.
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Ausführungsbeispiel 2:
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Charakterisierung von
ICL1-multicopy Transformanden
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Southern-Blot
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Der
Nachweis der Mehrfachintegration des ICL1-Genes in ausgewählten Transformanden
erfolgte mittels Southern-Hybridisierung. Dazu wurde die genomische
DNA der eingesetzten Rezipientenstämme und ausgewählter Transformanden
unter Verwendung der Methode von Hoffmann und Winston (1987, Gene
57: 267–272)
nach mechanischem Zellaufschluss präpariert. Die Sondenpräparation
und -detektion erfolgte mittels des "Gene Images random prime labelling and
detection system" der
Firma Amersham Life Sciences.
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Zur
Bestimmung der Kopiezahl des ICL1-Genes (2) wurde
die genomische DNA vollständig
mit dem Restriktionsenzym NcoI gespalten. Nach Auftrennung der Präparate in
der Gelelektrophorese und anschließendem Membranblotting wurde
das 2,3 kb BamHI Fragment des ICL1-Strukturgens als Detektionssonde
für die
Hybridisierung verwendet. Bei beiden analysierten Ausgangsstämmen wurden
3 spezifische Banden (Banden a, d, e in 2) der genomischen
Kopie des ICL1-Gens bei ca. 4.500, ca. 1.300 und 1.233 bp detektiert.
Die untersuchte Transformande T1 des Typs N222-S4(p64ICL1) wies
zusätzliche
Banden bei 2,9 kb und 1,9 kb (Banden b und c in 2)
auf, welche aus dem mehrfach integrierten Vektor resultierten. Zusätzlich wurde
die genomische Bande bei 1.233 bp (Bande e in 2,
NcoI Fragment des ICL1) durch das äquivalente Fragment aus dem
integrierten Vektor verstärkt.
Zur Abschätzung
der Kopiezahl wurde der durch Southern-Hybridisierung erhaltene
Röntgenfilm
eingescannt und mit der Software ImageQuant für den Phosphoimager STORM (Amersham
Pharmacia Biotech) bearbeitet. Das Programm vergleicht dabei die unterschiedliche
Intensität
der auf dem Film vorliegenden Banden und setzt diese miteinander
ins Verhältnis.
Aus einer vergleichenden Bewertung der Bandenintensitäten von
Ausgangsstamm H222-S4 und Transformande konnte für H222-S4(p64ICL1) T1 eine
Kopiezahl von 15 bis 25 zusätzlichen
ICL1-Kopien abgeschätzt werden.
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In
einer weiteren Analyse (3) wurde die Kopiezahl der integrierten
Vektoren auch durch den Nachweis des in den Transformationsvektoren
als Markergen eingesetzten ura3d4-Allels bestimmt. Dazu wurde nach
vollständiger
Restriktion der genomischen DNA mit SalI ein 1,7 kb Fragment aus
dem URA-Gen von Y. lipolytica als Detektionssonde für den Southern-Blot
verwendet. Der Ausgangsstamm H222-S4 wies unter diesen Bedingungen
eine spezifische Bande bei 4,3 kb (Bande a in 3)
auf, welche aus dem verbliebenen genomischen Fragment des weitgehend
deletierten URA3-Gens (Genzerstörung
des URA3-Gens in
H222 infolge Deletion des URA3-ORF und Insertion des SUC2-Genes
aus Saccharomyces cerevisiae durch integrative Transformation mit
einem 4,3 kb SalI Fragment aus dem Plasmid pINA302) resultiert.
Bei den untersuchten H222-S4(p64ICL1) Transformanden T1, T9 und
T11 trat zusätzlich
eine kräftige
spezifische Bande bei 2,8 kb (Bande b in 3) auf,
welche aus dem ura3d4 Allel des mehrfach integrierten Vektors stammt.
Die Erhöhung der
Kopiezahl wird durch die hohe Intensität dieser spezifischen ura3d4
Bande b (3) bei den Transformanden N222-S4(p64ICL1)
gegenüber
der Bande des ura3-302-Allels
(Bande a) im Ausgangsstamm (eine Kopie) verdeutlicht. Eine Abschätzung der
Kopiezahlen der integrativen Plasmide im Hefegenom aus dem Vergleich der
Bandenintensitäten
(Bande a mit b in 3) ergab etwa 10–24 Kopien
für die
untersuchten Transformanden mit p64ICL1, was gut mit den dargestellten
Befunden zur ICL1-Kopienzahl übereinstimmt.
-
Vergleich der Isocitratlyaseaktivitäten von
Ausgangsstamm und Transformanden
-
Die
spezifische Aktivität
der Isocitratlyase des Ausgangsstammes H222-S4 und ausgewählter ICL1-multicopy
Transformanden wurde bei Kultivierung auf unterschiedlichen C-Quellen
bestimmt.
-
Dazu
wurden die Stämme
zunächst über Nacht
in 100 ml Schüttelkolben
mit 25 ml Hefe-Minimalmedium M mit 2% Glucose als C-Quelle sowie
notwendigen Supplementen (0,3 μg/ml
Thiaminhydrochlorid für
alle Kulturen, 40 mg/l Uracil für
H222-S4) bei 28°C
auf einem Horizontalschüttler
bei 230 rpm (Umdrehungen pro Minute) kultiviert (1. Vorkultur).
Nach pH-Abgleich mittels 2,5 mol/l NaOH auf pH 5,5 bis 6,0 wurden
jeweils 20 ml der 1. Vorkultur in 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100
ml des gleichen Nährmediums übertragen
(2. Vorkultur). Die 2. Vorkultur wurde unter den oben genannten
Bedingungen über
15 bis 24 h inkubiert und nach pH-Abgleich für die Beimpfung der Hauptkulturen
in 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml Hefe Minimalmedium M und notwendigen
Supplementen (Thiamin, Uracil) sowie verschiedenen C-Quellen (2%
Glucose, 1% Ethanol, 5% Sonnenblumenöl oder 5% Hexadecan) eingesetzt.
Die Inokulierung erfolgte mit einer Animpfkonzentration von 2 bis
3·107 Zellen/ml. Die Kultivierung wurde wie für die Vorkulturen
beschrieben durchgeführt.
-
Nach
ausgewählten
Inkubationszeiten wurden 5 bis 10 ml der Hefesuspension geerntet
und 5 min bei 3000 rpm und 4°C
zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 2 ml eiskaltem Aufschlusspuffer
(100 mmol/l Tris-HCl, 5 mmol/l MgCl2, pH
7,0) gewaschen und anschließend
in 1 ml dieses Puffers resuspendiert. Die suspendierten Zellen wurden
anschließend
durch kräftiges
Vortexen (3 mal 1 min, dazwischen jeweils mindestens 2 min Inkubation
auf Eis) in einem Reagenzglas mit Glasperlen (0,45–0,5 mm)
aufgeschlossen. Der zellfreie Extrakt wurde nach 5 min Zentrifugation
bei 3000 rpm und 4°C
gewonnen und für
die Bestimmung der Isocitratlyaseaktivität sowie der Proteinkonzentration
verwendet. Die Messung der Isocitratlyaseaktivität erfolgte photometrisch nach
Dixon und Kornberg (1959, Biochem J 72:3) auf Grundlage der Bildung
von Phenylhydrazon aus Phenylhydrazin und Glyoxylat über einen
Zeitraum von 3 bis 5 min bei 324 nm und 30°C. Zur Ermittlung der spezifischen
Isocitratlyaseaktivitäten
wurde die Proteinkonzentrationen der zellfreien Extrakte nach Lowry
et al. (1951, J Biol Chem 193: 265–275) bestimmt.
-
Bei
Kultivierung von N222-S4 und der Transformande H222-S4(p64ICL1)
T1 unter Einsatz von Glucose und Ethanol als C-Quelle (4)
wurde auf beiden Substraten nach einer Inkubationszeit von 9 h eine
15- bis 16-fach höhere
spezifische Isocitratlyaseaktivität des transformierten Stammes
gegenüber
dem Ausgangsstamm gefunden. Unter den gewählten Versuchsbedingungen tritt
nach ca. 9 h bei allen untersuchten Stämmen ein Maximum der spezifischen
Isocitratlyaseaktivität
auf. Auch Messungen vor und nach diesem Aktivitätsmaximum belegten die hohe
relative Zunahme der spezifischen ICL-Aktivität der Transformande im Vergleich
zum Ausgangsstamm. Die Untersuchung von zwei weiteren multicopy
Transformanden des Typs H222-S4(p64ICL1) auf Ethanol als C-Quelle
bestätigte
den oben genannten Befund. Nach 12 h Kultivierung wurde für den Ausgangsstamm
H222-S4 eine spezifische ICL-Aktivität von 221 mU/mg Protein ermittelt.
Die Transformanden H222-S4(p64ICL1) T9 und T18 wiesen hingegen eine
etwa 20-fach höhere
spezifische ICL-Aktivität
von 4264 bzw. 4790 mU/mg Protein auf.
-
Die
erhöhte
Isocitratlyaseaktivität
der Transformande H222-S4(p64ICL1) T1 im Vergleich zum Ausgangsstamm
wurde auch bei Einsatz der hydrophoben Substrate Sonnenblumenöl und Hexadecan
für die
Citronensäureproduktion
bestätigt
(5). Dazu wurde Hefe-Minimalmedium M mit einem
reduzierten Ammoniumstickstoffgehalt von 1 g/l (NH4)2SO4 eingesetzt,
wodurch nach ca. 3 Tagen Kultivierung eine durch Stickstoffmangel
bedingte Wachstumslimitation der Kulturen eintrat und die Produktion
von Citronen- und Isocitronensäure
induziert wurde. Messungen der spezifischen Isocitratlyaseaktivität in der
Wachstums- und Produktionsphase zeigten, dass über die gesamte Kultivierungsdauer
eine etwa 20-fache Erhöhung
der spezifischen ICL-Aktivität in
der Transformande N222-S4(p64ICL1) T1 gegenüber dem Ausgangsstamm gefunden
wurde.
-
Die
durch die Bestimmung der spezifischen enzymatischen Aktivitäten nachgewiesene Überexpression
der Isocitratlyase infolge der Mehrfachintegration des ICL1-Gens
in das Hefegenom wurde auch in der Polyacrylamidgelelektrophorese
(SDS-PAGE) nach Laemmli (1970, Nature 227: 680–685) von zellfreien Extrakten
der auf Ethanol kultivierten Zellen des Ausgangssstammes H222-S4
und der Transformande N222-S4(p64ICL1) T1 besonders deutlich (6).
Im Bereich von ca. 60 kDa (Molekulargewicht der ICL) wurde in der
Transformande gegenüber
dem Ausgangsstamm schon in der Coomassie-Färbung eine deutliche Zunahme
einer Proteinbande in der SDS-PAGE beobachtet.
-
Ausführungsbeispiel 3:
-
Citronensäureproduktion
mit den Ausgangsstämmen
H222, H222-S4 und ausgewählten
ICL1-multicopy Transformanden
-
Vorkulturen für die Kultivierung
zur Citronensäureproduktion
-
Die
Kulturen wurden in 500 ml Schüttelkolben
in 100 ml YPD über
24 h auf einem Horizontalschüttler bei
28°C und
230 rpm inkubiert, anschließend
unter sterilen Bedingungen bei 5000 rpm 5 min zentrifugiert und das
Pellet in Hefe-Minimalmedium
M ohne Stickstoffzusatz zweimal gewaschen. Das Zellpellet wurde
anschließend
in 5 ml Minimalmedium M ohne Stickstoffzusatz aufgenommen und für die Beimpfung
der Hauptkulturen verwendet.
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Hauptkulturen für die Citronensäureproduktion
-
Die
Kultivierung zur Citronensäureproduktion
erfolgte in 500 ml Erlenmeyerkolben mit jeweils 100 ml Hefe-Minimalmedium
M mit einem reduziertem Ammoniumsulfatgehalt von 1 g/l. Als C-Quelle
wurden je nach Versuchsziel 3 bis 10% Glucose, Sonnenblumenöl, Altfett
(pflanzliches Fettgemisch) oder Hexadecan zugegeben. Sonnenblumenöl wurde
ohne vorherige Substrataufbereitung, Altfett hingegen als wäßrige Emulsion (Emulgierung
von 20% Altfett mit 1% Tween 80 in Wasser mittels Ultraschall) eingesetzt.
Weiterhin wurden allen Kulturen 0,3 μg/ml Thiaminhydrochlorid und
bei H222-S4 zusätzlich
40 mg/l Uracil zugegeben. Die Kultivierung erfolgte nach Beimpfung
der Kulturen (Animpftiter 0,5 bis 2 OD-Optische Dichte bei 600 nm)
auf einem Horizontalschüttler
bei 230 rpm und 28°C
unter regelmäßigem pH-Abgleich
auf pH 6,0 mittels 2,5 mol/l, 5 mol/l oder 10 mol/l NaOH über einen
Zeitraum von 5 bis 12 Tagen.
-
Die
Analyse des Ammoniumstickstoffgehaltes im Kulturmedium erfolgte
mit einem enzymatischen Testkit der Fa. Dr. Lange GmbH & Co KG (Düsseldorf).
Die Analyse der Citronensäure-
und Isocitronensäurekonzentration
erfolgte unter Verwendung von enzymatischen Testkits (Kit-Nr. 0139076
bzw. 0414433) der Firma R-Biopharm GmbH (Darmstadt), bzw. mittels
eines Ionenchromatographie-Systems DX-320 der Firma Dionex (Sunnyvale,
USA – Trennsäule IonPac
AS 15, 2 mm Durchmesser, Leitfähigkeitsdetektor
CD 25a, Autosampler AS 40).
-
Bildung von Citronen-
und Isocitronensäure
-
Unter
den gewählten
Kultivierungsbedingungen wurde nach 3 bis 4 Tagen eine deutliche
Limitierung des Wachstums der Hefekulturen infolge Stickstoffmangels
bei gleichzeitigem C-Quellenüberschuss
erreicht. Dadurch wurde die Produktion von Citronensäure und
Isocitronensäure
induziert. Diese für
alle Untersuchungen zur Citronensäure-/Isocitronensäureproduktion
eingesetzte Kulturführung
zur Erzeugung der Stickstofflimitation in Schüttelkolben ist in 7 beispielhaft
am Wildtypstamm H222 bei Einsatz von Sonnenblumenöl als C-Quelle
dargestellt. Die unter den gewählten
Bedingungen der Schüttelkulturen
mit H222 auf Sonnenblumenöl
erzielten Produktbildungsraten lagen zwischen 190 bis 250 mg/l·h für Citronensäure (Gesamtsäure CS +
ICS 340 bis 390 mg/l·h)
bei einer Biomassekonzentration (Hefetrockenmasse) von 13 bis 14
g/l. Die in 7 gezeigte Produktbildung an
CS/ICS konnte durch längere
Kulturführung
(bis zu 20 Tage) und Substratkonzentrationen von 8–10% Sonnenblumenöl auf 100
bis 150 g/l (Gesamtsäuregehalt)
gesteigert werden.
-
Unter
Verwendung dieser Kultivierungsbedingungen wurde das Produktverhältnis Citronensäure/Isocitronensäure (CS/ICS)
der Ausgangsstämme
H222 und H222-S4 sowie ausgewählter
ICL1-multicopy Transformanden des Typs N222-S4(p64ICL1) und H222-S4(p67ICL1)
auf verschiedenen C-Quellen untersucht (8, Tab.
1). Auf Sonnenblumenöl
wurde für
H222-S4 nach bis zu 15- bis 18-tägiger
Kultivierung mit 8–10% Sonnenblumenöl als C-Quelle
eine CS/ICS-Verhältnis
von durchschnittlich 60:40 bei einem Gesamtsäuregehalt (CS + ICS) von ca.
80–85
g/l gefunden. Die unter gleichen Bedingungen untersuchten Transformanden H222-S4(p64ICL1)
T8, T9, T11, T12, T16, T17 und T18 wiesen ein deutlich günstigeres
CS/ICS-Produktspektrum
von 94:6 bis 96:4 bei einem Gesamtsäuregehalt von 80 bis 100 g/l
auf (8). Vergleichbare Ergebnisse wurden mit ausgewählten Transformanden
des Typs H222-S4(p67ICL1) erzielt. Diese deutliche Verschiebung des
Produktverhältnisses
zugunsten der Citronensäure
bei den ICL1-multicopy Transformanden wurde bei Kultivierung auf
Glucose, Altfett (Gemisch pflanzlicher Fette) und Hexadecan bestätigt (Tab.
1).
-
Tab.
1: Verhältnis
der CS/ICS-Produktion mit Y. lipolytica H222, N222-S4 (ura3-302)
sowie den ICL1-multicopy Transformanden H222-S4(p64ICL1) und H222-S4(p67ICL1)
auf verschiedenen C-Quellen.
-
Die
Hefezellen wurden in 500 ml Schüttelkolben
mit 100 oder 200 ml Minimalmedium M mit 1 g/l (NH4)2SO4) und 5–6% C-Quelle über 5 bis
12 Tage, bzw. bis zu 18 Tagen für
die Versuche mit Sonnenblumenöl kultiviert.
Bei längerer
Kultivierung erfolgte eine Nachdosierung der C-Quelle bei Auszehrung
des Substrates (insgesamt 8–10%
Substrat). Die mit1) gekennzeichneten Daten
wurden nach kürzerer
Kulturzeit von 5–7
Tagen erhalten.
-
Anhand
der folgenden Abbildungen (Figuren) werden die Ausführungsbeispiele
weiter erläutert:
-
1: Aufbau
der multicopy Transformationsvektoren p64ICL1 und p67ICL1.
-
Dargestellt
sind die für
die Erhöhung
der Kopiezahl des ICL1-Genes durch integrative Transformation eingesetzten
multicopy Vektoren mit rDNA Sequenz (p64ICL1) bzw. der zeta Sequenz
(p67ICL1) als homologe Transformationssequenzen. Die Vektoren enthalten
als funktionsfähige
Expressionskassette das ICL1-Gen aus Y. lipolytica mit Promotor
(pICL1), Intron (ICLi), offener Leserahmen des ICL1 (ICL1 ORF) und
Terminator (ICLt), sowie das ura3d4 Allel des URA3-Gens von Y. lipolytica
als multicopy Selektionsmarker. Die Vektoren werden nach Linearisierung
mit SacII (p64ICL1) bzw. NotI (p67ICL1) integrativ in das Genom
von Y. lipolytica transformiert.
-
2: Nachweis
der erhöhten
Kopiezahl des ICL1-Gens.
-
Dargestellt
ist ein Southern-Blot nach vollständigem Verdau der genomischen
DNA durch das Restriktionsenzym NcoI und Detektion spezifischer
Banden mittels des 2,3 kb BamHI Fragmentes des ICL1-Gens aus Y.
lipolytica.
Auftragung:
1: Ausgangsstamm N222-S4; 2: Ausgangsstamm
E129L1; 3: Multicopy Transformande H222-S4(p64ICL1) T1; MW: Molekulargewichtsstandard.
Detektierte
Banden:
a, d: Genomische ICL1-Fragmente bei ca. 4500 und 1300
bp;
e: ICL1-Fragment aus Genom bzw. dem Vektor bei 1233 bp;
b,
c: ICL1-haltige Fragmente aus dem Vektor p64ICL1 bei 1,9 kb und
2,9 kb.
-
3: Nachweis
der erhöhten
Kopiezahl des ura3d4 Allels.
-
Dargestellt
ist ein Southern-Blot nach vollständigem Verdau der genomischen
DNA durch das Restriktionsenzym SalI und Detektion spezifischer
Banden mittels eines 1,7 kb SalI Fragmentes des URA3-Gens aus Y.
lipolytica.
Auftragung:
1: Ausgangsstamm N222-S4; 2–4: Multicopy
Transformanden H222-S4(p64ICL1)
T1, T9 und T11; MW: Molekulargewichtsstandard.
Detektierte
Banden:
a: Genomisches Fragment mit dem ura3-302 Allel bei
4,3 kb;
b: Das ura3d4-haltige Fragment aus dem Vektor p64ICL1
bei 2,8 kb.
-
4: Nachweis
der Erhöhung
der spezifischen Isocitratlyaseaktivität infolge multicopy Integration
des ICL1-Gens bei Kultivierung auf den C-Quellen Glucose und Ethanol.
-
Die
Abbildung zeigt den Verlauf der spezifischen Isocitratlyaseaktivität bei Kultivierung
des Ausgangsstamms H222-S4 und der multicopy Transformande H222-S4(p64ICL1)
T1 auf Glucose bzw. Ethanol als C-Quelle über eine Kultivierungszeit
von 27 h. Aufgrund der ICL-Repression durch Glucose werden auf diesem Substrat
deutlich niedrigere ICL-Aktivitäten
gefunden als bei Ethanol. Unabhängig
von dieser Transkriptionsregulation und weiteren metabolischen Regulationsmechanismen
ist ab 6 h Kultivierung bei vergleichbaren Bedingungen stets eine
mindestens 10- bis 20-fach höhere
spezifische ICL-Aktivität
der Transformande H222-S4(p64ICL1) T1 im Vergleich zum Ausgangsstamm
nachweisbar.
-
5: Nachweis
der Erhöhung
der spezifischen Isocitratlyaseaktivität infolge multicopy Integration
des ICL1-Genes bei Kultivierung auf den C-Quellen Sonnenblumenöl und Hexadecan.
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Die
Abbildung zeigt die spezifischen Isocitratlyaseaktivitäten des
Ausgangsstammes H222-S4 und der multicopy Transformande H222-S4(p64ICL1) T1 nach
16-, 40- und 162-stündiger
Kultivierung auf Sonnenblumenöl
(Öl) bzw.
Hexadecan. Unter den gewählten
Kultivierungsbedingungen wurde nach ca. 40 h bis 50 h die Produktion
von Citronen- und Isocitronensäure
induziert (Produktionsphase). Über
die gesamte Kulturzeit (Wachstums- und Produktionsphase) wurde eine
20-fach höhere
ICL-Aktivität der Transformande H222-S4(p64ICL1)
T1 gegenüber
dem Ausgangsstamm nachgewiesen.
-
6: Bestätigung der Überexpression
der Isocitratlyase in ICL1-multicopy
Transformanden mittels SDS-PAGE.
-
Dargestellt
ist die elektrophoretische Auftrennung zellfreier Proteinextrakte
in der SDS-PAGE nach 3, 6, 9 und 12-stündiger Kultivierung auf Ethanol
als C-Quelle (vgl. 4).
Die Auftrennung der Proteine (Auftragung von 20 μg Protein je Probe) erfolgte
in 8%igem Polyacrylamidgel bei 20 bis 50 mA. Im Vergleich zum Ausgangsstamm
H222-S4 wurden für
die untersuchte ICL1-multicopy Transformande H222-S4(p64ICL1) T1 über die
gesamte Kultivierungszeit deutlich stärkere Proteinbanden bei ca.
60 kDa (Molekulargewicht der Isocitratlyase) nachgewiesen.
-
7: Kulturverlauf
zur Citronensäureproduktion
mit Y. lipolytica unter den Bedingungen der Stickstofflimitation
am Beispiel von H222 auf Sonnenblumenöl.
-
Die
Abbildung zeigt den Verlauf der Kultivierung von Y. lipolytica H222
zur Citronensäureproduktion
im modifizierten Hefe-Minimalmedium M mit reduziertem Gehalt an
Ammoniumsulfat von 1 g/l (Produktionsmedium) und 5% Sonnenblumenöl als C-Quelle
im Schüttelkolbenversuch.
Die Produktion von Citronen- und Isocitronensäure setzt nach ca. 60 h bis
70 h Kultivierung nach Auszehrung der Stickstoffquelle und Beginn
einer Wachstumslimitation der Kultur ein. Die unter diesen Bedingungen
mit H222 auf Sonnenblumenöl
erzielten Produktbildungsraten lagen zwischen 190 bis 250 mg/l·h für Citronensäure (Gesamtsäure CS und
ICS: 340 bis 390 mg/l·h)
bei einer Biomassekonzentration (Hefetrockenmasse) von 13 bis 14
g/l.
-
8: Nachweis
der Verschiebung des Produktverhältnisses
CS/ICS infolge multicopy Integration des ICL1-Genes bei Kultivierung
auf Sonnenblumenöl.
-
Die
Abbildung zeigt das Produktverhältnis
Citronensäure/Isocitronensäure (CS/ICS)
des Ausgangsstammes N222-S4 und der Transformanden H222-S4(p64ICL1) T8, T9,
T11, T12, T16, T17 und T18 nach 18-tägiger Kultivierung mit 8% bis
10% Sonnenblumenöl
als C-Quelle. Der Ausgangsstamm wies ein CS/ICS-Verhältnis von
etwa 60:40 (57:43 bis 65:35) bei einem Gesamtsäuregehalt (CS und ICS) von
80 g/l bis 85 g/l auf. Die unter gleichen Bedingungen untersuchten
Transformanden wiesen ein deutlich günstigeres Produktspektrum von
94:6 bis 96:4 bei einem Gesamtsäuregehalt
von 80 bis 100 g/l auf.
-
Im
Beschreibungstext und in den Figuren werden folgende Abkürzungen
verwendet:
- bp
- Basenpaare
- C-Quelle
- Kohlenstoff-Quelle
- CS
- Citronensäure
- DNA
- Desoxyribonukleinsäure
- DSMZ
- Deutsche Sammlung
für Mikroorganismen
und Zellkulturen
- E. coli
- Eschericha coli
- ICL
- Isocitratlyase
- ICS
- Isocitronensäure
- kb
- Kilo-Basenpaare
- KDa
- Kilodalton
- MW
- Molekulargewichtstandard
- OD
- Optische Dichte
- PAGE
- Polyacrylamidgelelektrophorese
- LTR
- long terminal repeat
- rDNA
- ribosomale DNA
- rpm
- rounds per minute
(Umdrehungen pro Minute)
- SDS
- Sodiumdodecylsulfat
- TF
- Transformande(n)
- URA-3
- Den 3. Schritt der
Uracil-Biosynthese katalysierende Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylase
- Y. lipolytica
- Yarrowia lipolytica
- Zeta
- LTR des Retrotransposons
Ylt1 aus Y. lipolytica
-
SEQUENZPROTOKOLL
1 – SEQUENCE
LISTING 1 – SEQ
ID No 1
-
-
-
SEQUENZPROTOKOLL
2 – SEQUENCE
LISTING 2 – SEQ
ID NO 2
-
-
-
-
-
SEQUENZPROTOKOLL
3 – SEQUENCE
LISTING 3 – SEQ
ID No 3
-
-
-
-
-
-
-
SEQUENZPROTOKOLL
4 – SEQUENCE
LISTING 4 – SEQ
ID No 4
-
-
-
-
-
-
