EP2791332A1 - Pilzstämme mit genetischer modifikation betreffend einen carbonsäure-transporter - Google Patents

Pilzstämme mit genetischer modifikation betreffend einen carbonsäure-transporter

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EP2791332A1
EP2791332A1 EP12808323.5A EP12808323A EP2791332A1 EP 2791332 A1 EP2791332 A1 EP 2791332A1 EP 12808323 A EP12808323 A EP 12808323A EP 2791332 A1 EP2791332 A1 EP 2791332A1
Authority
EP
European Patent Office
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strain
carboxylic acid
activity
fungal
gene
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12808323.5A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Aurich
Martina Holz
Anne Kretzschmar
Christina Otto
Gerold Barth
Isabel WAENGLER
Roland Arno MÜLLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ThyssenKrupp Industrial Solutions AG
Original Assignee
ThyssenKrupp Industrial Solutions AG
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Filing date
Publication date
Application filed by ThyssenKrupp Industrial Solutions AG filed Critical ThyssenKrupp Industrial Solutions AG
Publication of EP2791332A1 publication Critical patent/EP2791332A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids

Definitions

  • the present invention relates to fungal strains with genetic modification relating to a carboxylic acid transporter, and to processes for producing or using such fungi.
  • carboxylic acids such as the Citrate cycle
  • Citrate cycle a potential intermediate source material and as an alternative to petrochemical production processes in industry
  • Many of these carboxylic acids have the potential to act as a so-called building block chemical.
  • Important precursors for chemical synthesis, polyester production and other processes can be formed from said carboxylic acids.
  • succinate is still mainly obtained petrochemically from maleic anhydride starting from butane.
  • the petrochemical production of succinate using heavy metal catalysts, organic solvents, high temperatures and pressures is costly.
  • Carboxylic acids such as succinate are naturally produced by many microorganisms, plants and animals as an intermediate in the central metabolism or as a metabolic end product.
  • the majority of natural and optimized producers are bacterial strains that accumulate, for example, succinate, especially under anaerobic conditions. Due to the disadvantages of bacterial production methods, such.
  • microbial fungi are increasingly becoming the focus of research into the development of processes for the production of organic acids such as succinate.
  • US20110104771 discloses that a S. cerevisiae strain with an ICL gene from K. lactis, the malate synthase gene from S. cerevisiae, with a gene for PEPCK from M. succiniciproducens, the gene MDH2 from S. cerevisiae and with genes for fumarase ( from Rhizopus oryzae) and fumarate reductase (from Trypanosoma brucei) can produce up to 6.3 g of L "1 succinate after 7 days.
  • Another object of the invention is to provide processes or organisms for the production of organic acids which have advantages over the bacterial processes.
  • a fungal strain having a genetic modification that results in a reduction in the activity of at least one fungal carboxylic acid transporter.
  • the carboxylic acid transporter in question is a membrane transport protein capable of transporting carboxylic acids through the cell membrane and possibly the cell wall.
  • These are preferably transporters for dicarboxylic acids, preferably transporters for carboxylic acids of the citrate cycle or neighboring metabolic pathways.
  • These may be symporters (co-transporters), but also uniporter or antiporter, most preferably transporters for at least one organic acid selected from the group comprising fumarate, lactate, pyruvate, malate, malonate and / or succinate.
  • the term "targeting” is intended to clarify that said carboxylic acid transporter is encoded in the genome of the fungus.
  • the term “homologous” may also be used. It is particularly preferred that said fungus has increased extracellular carboxylic acid production.
  • carboxylic acids as used herein is identical to the term “organic acids” and refers to all those metabolic products of said fungus which may be referred to as carboxylic acids.
  • the term preferably denotes the carboxylic acids of the citrate cycle and of neighboring metabolic pathways, in particular pyruvate, ⁇ -ketoglutarate, Malate, oxaloacetate, citrate, isocitrate, fumarate, malonate, lactate and / or succinate. Most of these acids are dicarboxylic acids.
  • the reduction of the activity of the carboxylic acid transporter is achieved by at least one property or a step selected from the group comprising: a) inhibiting or reducing the expression of a gene coding for a carboxylic acid transporter
  • Inhibition or reduction of expression may be accomplished, for example, by inhibiting or reducing transcription of the coding gene or translation of the generated mRNA.
  • Expression of a dysfunctional or depressed active carboxylic acid transporter can be accomplished, for example, by deletion, insertion, substitution or point mutation in the coding gene.
  • gene silencing In gene silencing, gene regulation takes place by inhibiting the transfer (transcription) of genetic information from the DNA to the mRNA (transcriptional gene silencing) or the subsequent translation (translation) of the mRNA stored information into a protein (post-transcriptional gene silencing).
  • Transcriptional gene silencing is a result of epigenetic changes in DNA, such as DNA methylation or histone modifications in particular. These modifications of the histone ends create a kind of heterochromatic state around the gene which prevents it from binding to the transcription engine (RNA polymerase, transcription factors, etc.).
  • the classic example is the phenomenon called position effect variegation (PEV). It alters the chromatin state and thus controls the transcriptional activity of the gene or gene region concerned.
  • PEV position effect variegation
  • Post-transcriptional gene silencing refers to the processes of gene silencing that occur only after the transcription of the genetic information from the DNA to the transmitting mRNA.
  • forms of post-transcriptional gene silencing include, in particular, nonsense-mediated mRNA decay (NMD) and RNA interference (RNAi). While nonsense-mediated mRNA decay serves primarily to prevent nonsense point mutations, RNA interference is a predominantly regulatory process involving specific RNA molecules, such as miRNA and siRNA.
  • Post-transcriptional gene silencing can result in increased degradation of the mRNA of a particular gene. The degradation of the mRNA prevents translation and thus the formation of the specific gene product (usually a protein).
  • Gene knockout is understood to mean the complete shutdown of a gene in the genome of an organism. Switching off the gene is achieved by gene targeting.
  • a deletion also gene deletion, in genetics is a variant of the gene mutation or in which a nucleotide sequence or a part up to the entire chromosome is missing. A deletion is therefore always a loss of genetic material. Any number of nucleobases may be deleted, from a single base (point mutation) to the chromosome. A distinction is made between the interstitial and the terminal deletion. The former describes a loss within the chromosome, the latter a loss of an end portion, ie a part of the telomeric region.
  • deletion after translation, the mRNA produced from the DNA can be transformed create a faulty protein. Because deletion of base pairs can cause a frame shift mutation if a number of base pairs that are not divisible by three are removed. In site-specific or targeted mutagenesis, a targeted modification of the DNA is made possible by means of a recombinant DNA. It can be used to selectively exchange individual nucleobases of a gene or whole genes are removed. Alternatively, by means of a deletion cassette that has been integrated into a vector, a deletion can be generated in the gene to be mutated.
  • the inhibition or reduction of expression of a gene may be by cloning a heterologous promoter which is inhibitable by an exogenous factor, for example a tetracycline-regulated tetO promoter.
  • the inhibition or reduction of the expression of a gene can be carried out by cloning a heterologous promoter which is weaker than the relevant homologous promoter, for example pPOT1.
  • the inhibition or reduction of the activity of the expressed carboxylic acid transporter may be accomplished, for example, by the administration of inhibitors or the synchronous expression of suitable heterologous inhibitors.
  • the said fungus strain is preferably a strain of microbial fungi.
  • microbial fungus as used herein is intended to include in particular those fungi which can be cultured by biotechnological methods and are particularly suitable for fermentative production processes, for example in suspension cultures.
  • the fungus is a member of the group of ascomycetes (Ascomycota). Particularly preferably, it is a member of the group of Hemiascomycetes or Euascomycetes. In a further preferred embodiment, said fungal strain is um a yeast or a mold.
  • Saccharomyces Saccharomyces
  • Schizosaccharomyces Wickerhamia
  • the at least one carboxylic acid transporter originates from the group of the JEN transporters and / or the MAE transporters.
  • JEN orthologues of the K. lactis genes KlJEN1 and KUEN2 have been found in 17 different species of fungi (13 hemiascomycetes, 7 euassomycetes).
  • the number of JEN orthologues varies from one (eg, BS cerevisiae) to six orthologous genes in Y. lipolytica.
  • the following table provides an overview of the group of JEN transporters, as well as, in the last few lines, the known MAE transporters:
  • Type Type Work name EMBL Swiss-Prot Length Number of
  • the at least one carboxylic acid transporter originates from the group of JEN transporters and / or MAE transporters listed in the following table.
  • the gene in question was deleted by means of a deletion cassette integrated in a vector (SEQ ID Nos 1, 3, 5, 7, 9 and 11).
  • the vector used is in each case pUCBM21, which was originally developed by Boehringer (SEQ ID Nos 2, 4, 6, 8, 10, 12). However, all other suitable vectors known in the art are also usable.
  • the at least one carboxylic acid transporter is encoded by the gene YALI-D-J204 (EMBL-ID: CAG81250; Swiss-Prot ID: Q6C8F4).
  • said gene is always also referred to as "JEN4.” It is likewise particularly preferred for said fungus to belong to the genus Yarrowia, particularly preferably to the species Yarrowia lipolytica.
  • Y. lipolytica has a total of 6 JEW orthologs. This high number of genes for putative carboxylate transporters reflects the great potential of yeast Y. lipolytica for the production of organic acids, such as. Succinate, malate or fumarate.
  • Y. lipolytica is extensively genetically and physiologically characterized, can utilize a broad spectrum of substrates and is tolerant to low pH.
  • said fungus contains at least one further genetic modification selected from the group comprising:
  • SDH succinate dehydrogenase
  • PYC Pyruvatcarboxylase
  • ICL isocitrate lyase
  • Other candidate genetic modification that can be used in combination with the above modifications are a reduction in the activity or expression of the genes SDH1, SDH3 and / or SDH4, the introduction of a heterologous gene selected from the group coding for phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK1), fumarate reductase and / or fumarase (FUM1), and / or the reduction of the activity or expression of the gene coding for isocitrate dehydrogenase (IDHI) and at least one the genes coding for the mitochondrial dicarboxylate carrier (DIC1) and / or SDH2, and optionally at least one of the genes FUMI, osmotic growth protein (OSMl), malate dehydrogenase (MDH3) and / or citrate synthase (CIT2).
  • PCK1 phosphoenolpyruvate carboxykinase
  • FUM1 fumarate reductase and / or fumarase
  • IDHI isocit
  • the reduction of expression can be effected, for example, by a heterologous promoter which is inhibitable by an exogenous factor, preferably a tetracycline-regulated tetO promoter.
  • a heterologous promoter which is inhibitable by an exogenous factor, preferably a tetracycline-regulated tetO promoter.
  • genes mentioned are identified in the following table, taking as an example the UniProt entries for Saccharomyces cerevisiae. It is understood that the expert can easily find the corresponding genes in other fungal strains, in particular in Yarrowia, based on this information.
  • a process for the production of carboxylic acids wherein in the process a fungus strain according to one of the preceding claims is used.
  • hexoses such as, for example, glucose or sucrose, or alcohols, for example glycerol
  • Glucose and sucrose are particularly suitable because they are inexpensive substrates.
  • Glycerol is obtained in large quantities as a waste product, for example in the production of biodiesel and is therefore also a low-cost substrate.
  • For glycerol also speaks that its absorption by the fungi is not affected by an impairment of a carboxylic acid transporter.
  • the fungal strains are cultured in a medium, and further wherein the oxygen uptake rate (OUR) is adjusted to a range between> 5 and ⁇ 50 mmol 02 / l * h.
  • the oxygen uptake rate is adjusted to a range between> 10 and ⁇ 40 mmol 02 / l * h.
  • the oxygen uptake rate is adjusted to a range between> 20 and ⁇ 30 mmol 02 / l * h.
  • the oxygen uptake rate is controlled to a range between 25 + 3 mmol O 2 / l * h.
  • the oxygen input OTR in a fermenter can be influenced by the air aeration rate (1 min -1 ), the stirrer speed (U min -1 ), the pressurization of the fermenter and the gas composition (proportion O 2 in the gas mixture).
  • the oxygen uptake rate OUR can be determined from well-known equations based on the known gas composition as well as the amount of gas and the measurement of the oxygen concentration in the exhaust gas.
  • FIG. 1 Schematic representation of the expression cassette for exchanging the SDH2
  • the SDH2 ORF was fused directly to the respective promoter.
  • the pICL1-containing expression cassette was 4.9 kb in size
  • the pPOT1 cassette was 3.8 kb
  • the GPR1 B cassette was 4.2 kb in size.
  • Figure 2 Plasmids pSpIvS-Ura, pSpPS-Ura and pSpGS-U r a m i t d e n
  • the selection marker is the marker gene URA3 flanked by the / ox sites.
  • Fig. 3 Vector construction of the plasmid p64PIC starting from p64PYCl and p64ICL l. In addition to the desired genes with their own promoter and terminator region, p64PIC contained the URA3-AWe ⁇ ura3d4 as multicopy marker gene and rDNA as integration sequence.
  • Fig. 4 PYC and ICL activities of the wild-type strain Y. lipolytica ⁇ 222 and the
  • H222 and the transformants H222-AZ7 Tl 1 and T23 in YNB medium were cultured in 150 ml of culture medium in 500 ml Erlenmeyer flasks at 28 ° C. and 220 rpm with 5% glycerol.
  • the succinate contents in the culture supernatant were determined by ion chromatography.
  • Transformants H222-AZ 10 T l, T5 and T9 in MG medium were cultured in 100 ml of MG medium (growth medium) in 500 ml Erlenmeyer flasks at 28 ° C. and 220 rpm. The sampling for the activity measurement took place after 4 h.
  • H222 and the transformants H222-AZ7 TU, H222-AZ8 T3 and H222-AZ10 Tl, T5 and T9 in YNB medium were cultured in 150 ml of culture medium in 500 ml Erlenmeyer flasks at 28 ° C. and 220 rpm with 5% glycerol. The succinate contents in the culture supernatant were determined by ion chromatography.
  • Fig. 11 Percent of the organic acids succinate (SA), malate (MA), ⁇ -ketoglutarate (AKG) and fumarate (FA) in the total acid product when cultivating the strains Y. lipolytica H222, H222-AZ8 T3, H222-AZ7 TU and H222-AZ10 Tl, T5 and T9 in YNB medium. Cultivation in YNB medium with 5% glycerol as C source.
  • SA organic acids succinate
  • MA malate
  • AKG ⁇ -ketoglutarate
  • FA fumarate
  • Fig. 12 Maximum acid production of the MAE1 deleted transformants. Shown was the mean, maximum acid amount of the H222-SW2AMAE1 transformants TF3, TF7 and TF8, as well as the reference strain H222 from 3-fold cultivation in production medium according to Tabuchi et al. (1981).
  • AKG ⁇ -ketoglutarate
  • FU fumarate
  • MA malate
  • SUC succinate
  • Fig. 13 Vector construction of plasmid p64PYCl starting from p64T.
  • Fig. 14 Southern blot analysis confirming the multiple integration of p64PYCl in Y. lipolytica H222-S4.
  • the genomic DNA was completely digested with the EcoRV restriction enzyme.
  • PYCl a specific probe was used for the PYC1-OKF (2, 1 kb), which was obtained by means of PCR and the primers PYC ORF for and PYC ORF rev.
  • the black arrow indicates the 8.9 kb genomic (g) PYCl fragment and the red arrow indicates the 6.2 kb vectorial (v) PYC1 fragment.
  • FIG. 15 Kinetics of the specific pyruvate carboxylase activity of the transformants with a multiple integration of the PYCI expression cassette in comparison to the wild-type H222.
  • the specific activities were determined during culture in 100 ml of minimal medium containing 1% glucose. The characteristic course of the specific activities resulted from the enzyme activity determinations of three independent cultivations.
  • Table la Composition of the YNB culture medium 2. Trace elements YNB
  • Table lb Composition of the medium modified according to Tabuchi et al. (1981):
  • H222 was selected for the investigation of succinate production. H222 had already proven to be a very good acid producer with respect to citrate or AKG production compared to other Y. lipolytica strains. H222 was cultured in a culture medium optimized for itaconic acid production by Candida strains. As C sources, glucose (10%), glycerol (10%) and sunflower oil (5%) were selected. Cultivation was carried out in 500 ml Erlmeyer flasks without baffling in 100 ml culture medium at 28 ° C. and 220 rpm. When using sunflower oil as C source, the liquid cultures were shaken in 500 ml Erlenmeyer flasks with baffles.
  • the preculture was carried out in 50 ml of the same medium and was incubated for 2 to 3 days at 28 ° C and 220 rpm.
  • the preculture was harvested by centrifugation (3,500 rpm, 5 min, RT) and taken up in production medium without C source, yeast extract and iron sulfate.
  • the main cultures were inoculated with 100 ml each of the production medium at an optical density of 2 OD ml -1 , followed by cultivation at 28 ° C. and 220 rpm for up to 500 h
  • the analysis of the concentrations during cultivation Organic acids secreted by Y.
  • the lipolytica were obtained by ion chromatography using the Ion Chromatography System ICS-2100 from Dionex (Sunnydale, USA).
  • the ion chromatography systems contained the following components: Isocratic pump and conductivity detector IC20, eluent generator EG40, autosampler AS40 / autosampler AS50, self-regenerating suppressor ASRS, separation column IonPac AS 19 (2 x 250 mm) with pre-column IonPac AS 19 (2 x 50 mm), analysis software Chromeleon version 6.8.
  • the separation parameters of the separation method are listed in Table 2.
  • the resulting aqueous lower phase was transferred to a new reaction vessel and added again with 0.3 ml of n-hexane, shaken and centrifuged again. Again, the aqueous phase was removed and used with appropriate dilution for the ion chromatographic analysis. Since the culture medium used here has not been optimized for Succinat conveyor and cultivating conditions such. B. pH and p0 2 , in Scrissalko Ibenage stab can not be kept permanently stable, was waived in this and in all subsequent cultivation experiments on the calculation of maximum productivity or maximum specific product formation rates.
  • H222-S4 The uracil-auxotrophic strain H222-S4 was already present at the beginning of the work (Mauersberger et al., 2001). Additional auxotrophic strains were constructed. Within this project only one uracil auxotrophic strain (H222-SW2) was used. H222-SW2 was generated by deletion of the Ku70 gene whose gene product plays a role in DNA recombination in H222-S4.
  • Expression cassettes were constructed which, in addition to the selection marker URA3, contained the corresponding promoter (pICL1, GPR1B or pPOT1) fused to the beginning of the SDH2-OKF and a homologous region of pSDH2 (FIG. 1).
  • the selection marker URA3 was flanked by the so-called / ox sites, which enabled a possible later removal of this marker by means of the Cre / ox system.
  • the homologous regions from pSDH2 and SDH2-OKF should serve for the homologous integration of this expression cassette.
  • the starting plasmid was pUCBM21 ( Figure 2).
  • the 5DH2 promoter fragment pSDH2 (569 bp) amplified with the primers pSDH2-fw and pSDH2-rv was first integrated into the NcoI site.
  • a 1242 bp fragment of the SDH2 ORF (primer: SDH2-fw and SDH2-rv)
  • a 776 bp pICL1 fragment primer: pICL1-fw and pICL1-rv
  • were amplified by means of PCR and these were fused by means of overlap PCR (Primer: overlap-fw and overlap-rv).
  • this pICL1-SDH2 'fragment was integrated into the vector containing pSDH2, likewise BamH1 and EcoRI.
  • this construct was cloned the KpnI and BamRI digest from the plasmid p64PT (Gerber, 1999), the 2.16 kb / / / CZJ fragment between the KpnI and 5 amHI sites, and finally integration the loxR-URA J-ox cassette into this plasmid with the pSDH2-pICL1-SDH2 'cassette digested with XbaI and KpnI.
  • the 1.4 kb expression cassette was isolated from plasmid JMP1 13 (Fickers et al., 2003) using XbaI / KpnI digestion. Finally, the 8196 bp plasmid pSpIvS-Ura ( Figure 2) was obtained which contained the expression cassette pSDH2-loxR-URA3-loxP-pICL1-SDH2 'to replace the native SZ ) H2 promoter with the / CZJ promoter.
  • pSpPS-Ura plasmid which contained the expression cassette pSDH2-loxR-URA3-loxP-pPOT1-SDH2 'to replace the native 5DH2 promoter with the POT1 promoter.
  • This expression cassette could also be isolated from the plasmid by means of ⁇ TspAI / M digestion and used for transformation into the uracil-auxotrophic recipient strain H222-SW2 (MATA ura3-302 ku70A-1572) (Werner 2008).
  • GPR1B was isolated from plasmid pTBS1 by PCR (primers: KpnI-pGPR1-fw and pGPR1-SDH2-rv, fragment size: 1971 bp).
  • the PCR-derived SDH2'- (838 bp, primer: SDH2-pGPR1-fw, SDH2-MluI-rv) was converted to a 2769 bp size in an overlap PCR with the primers KpnI-pGPR1-fw and SDH2-MluI-rv Construct merged.
  • This construct was digested with KpnI and Mlul and ligated to the 4773 bp fragment of pSpIvS-Ura.
  • pSpGS-Ura plasmid which contained the expression cassette pSDH2-loxR-URA3-loxP-GPR1B-SDH2 'to replace the native 5DH2 promoter with the Gijii promoter. To verify the sequence, the expression cassettes were sequenced.
  • Initial strain was ⁇ 222- ⁇ 2. Furthermore, starting from ⁇ 222- ⁇ 2, strains were constructed in which both PYCl and the isocitrate lyase-encoding gene ICL1 are simultaneously overexpressed.
  • ⁇ 222- ⁇ 2 For the construction of a strain ( ⁇ 222- ⁇ 8) in which both the 5DH2 promoter exchanged against the POT1 promoter and the pyruvate carboxylase-encoding gene PYCl are overexpressed, ⁇ 222- ⁇ 2 was used as starting strain. In order to be able to use this for further manipulation, uracil auxotrophy had to be generated in ⁇ 222- ⁇ 2.
  • the expression cassette for the replacement of the 5DH2 promoter was constructed such that the marker gene URA3, which is essential for the cell's own uracil synthesis, was flanked by the so-called / ox sites. In order to remove this marker gene and thereby achieve the loss of uracil prototrophy, the so-called Crelox system was used.
  • ⁇ 222- ⁇ 2 was transformed with the plasmid pUB4-Cre, which contained both a gene for the Cre recombinase and a hygromycin B resistance-mediating gene.
  • the cells were then selected on hygromycin B-containing complete medium and then on minimal medium with or without uracil. Transformants in which recombination of the / ox sites occurred with the help of Cre recombinase could no longer produce uracil due to the loss of URA3 caused by it and therefore could no longer grow on uracil-free medium.
  • uracil-auxotrophic transformants From these uracil-auxotrophic transformants, a transformant was selected and used as H222-AZ2U for further work. This was followed by the integrative multicopy plasmid p64PYCl, which contained the PYCl gene with its own promoter and terminator regions coding for pyruvate carboxylase in Y. lipolytica and the URA3 allele ura3d4 as multicopy marker gene and rDNA as integration sequence by means of lithium acetate method (Barth and Gaillardin 1996) into uracil auxotrophic strain H222-AZ2U. There was a selection of the uracil prototrophic transformants uracil-free minimal medium with glucose as C source.
  • H222-AZ9 For the construction of a strain (H222-AZ9), in which both the 5DH2 promoter replaced by the POT1 promoter and over-expressed PYC1 and ICL1, was analogous to the construction of H222-AZ8 and a uracil auxotrophic derivative of H222-AZ2 as Initial strain used.
  • the plasmid p64PIC to be transformed was constructed by restriction and ligation from the plasmids p64PYCl and p64ICL1 (Kruse et al., 2004). For this purpose, the approximately 4.6 kb Sphl-Fsp AI fragment was isolated from p64ICLI and integrated into the Sphl-FspAI cut vector p64PYCl (FIG. 3).
  • the resulting plasmid p64PIC had a size of 15.4 kb and was linearized for transformation in the SacII site.
  • the integration was verified by means of PCR or Southern Blot. Two selected transformants were checked for PYC and ICL activity (Table 3) according to Dixon and Kornberg, (1959) and finally cultured in YNB medium.
  • HC1 Table 3 Composition of the reaction mixture for determining ICL activity.
  • H222-AZ8 T3 - T5
  • H222-AZ9 T2 + T3
  • FIG. 4 shows the results of these activity measurements.
  • Both transformants of H222-AZ8 and H222-AZ9 showed increased PYC activity (2.6-3.7 fold) compared to wild-type H222.
  • transformants H222-AZ9 T2 and T3 showed a 24-25 fold increase in ICL activity compared to H222.
  • the inventors have conducted studies to characterize the proteins encoded by JEW orthologs in Y. lipolytica. These studies provided clues to the functioning of these JEW gene products as dicarboxylate importers with several specific substrates.
  • strains were constructed in which individual JEN genes were deleted. When these strains were cultivated, larger amounts of extracellular succinate were detected in part, especially in the deletion of JEN4.
  • a JEN4 deletion cassette (approximately 4.5 kb) was transformed into the uracil-auxotrophic Yarrowia lipolytica strain H222-AZ2U.
  • the J £ 7V ⁇ deletion cassette ( Figure 5) contained the promoter and terminator regions of JEN4, with the URA3 flanked by TcR sequences in between (Hübner 2010).
  • the deletion cassette was transformed by lithium acetate method. Homologous recombination in the promoter and terminator regions should result in the deletion of JEN4 ( Figure 5).
  • Two uracil prototrophic transformants in which the deletion of JEN4 was detected by PCR and Southern blot were isolated. Both transformants were cultured in YNB. The two transformants studied, H222-AZ7 T II and T23, behaved similarly to H222-AZ2 in terms of growth ( Figure 3). Both transformants also produced more succinate than the parent strains H222 and H222-AZ2 ( Figure 6, Table 2).
  • Table 4 Maximum succinate levels, volume specific and biomass specific product formation rate of strains H222, H222-AZ7 T1 and T23 in YNB medium.
  • the integrative multicopy plasmid p64PYC was constructed by integration of the PCR-amplified ORF of the corresponding gene together with its own promoter and terminator regions of about 1 kb into the recipient vector p64T.
  • the pyruvate carboxylase is encoded in Y. lipolytica by a gene ⁇ PYCl) (Flores and Gancedo 2005). Since the region of the ORF of PYCl (3844 bp) together with the associated 1 kb promoter and 0.3 kb terminator region each had a size of 5149 bp, this expression cassette was amplified in two steps in order to introduce any sequence errors decrease by the polymerase.
  • the oligonucleotides PYCa for and PYCa rev amplified the 2442 bp region, which included the 1 kb promoter region and part of the ORF of PYCl.
  • oligonucleotides PYCa for Pael and PYCb rev added an i g / II site, and the Bgl II site included in the ORF was used for vector integration and fusion of the two fragments.
  • the 2442 bp PYCa fragment (promoter region with part of the FC ORF) was digested with Pael and BglII and cloned into the P64 and BglII digested p64T vector.
  • the resulting p64PYCla vector was sequenced. Sequencing of the plasmid of clone T22 yielded a defect-free 7C7 ORF, and an error-free promoter region was detected for the plasmid of clone T97. An error-free p64PYCla vector was obtained by the integration of the error-free aeI-i? AmHI promoter region from p64PYCla from clone T97 into the Pael and BamHI digested p64PYCla vector from clone T22. In the resulting p64PYCla vector, the i?
  • the additionally detected band at 6.2 kb in the transformants served as evidence for the integration of the multicopy vector p64PYC l. These bands showed an increased intensity compared to the genomic band of the reference strain H222-S4, whereby a multiple integration of the corresponding expression cassette was confirmed.
  • the transformants H222-AK1-2, H222-AK1-5, and H222-AK1-7 were selected for further study because of their high vector band intensities.
  • the gene-donor effect on pyruvate carboxylase activity was in the strains H222-AK1-2, H222-AK1-5 and H222-AK1-7 examined.
  • PYC activity For the determination of PYC activity, all selected transformants were cultured in 100 ml of minimal medium containing 1% glucose. After harvesting a sample of the culture, the yeast cells were disrupted by means of glass beads. The PYC activity was determined in the cell-free extract according to the method of van Urk et al. (1989). The composition of the reaction mixture is listed in the following table. The photometric measurement was carried out at 340 nm.
  • the increased gene dose of the PYC-encoding gene showed a positive effect on the specific PYC activities of the strains studied.
  • the specific activities for the transformants H222-AK1 -2 and H222-AK1 -7 reached a maximum after 6 h. In contrast, no detectable maximum of the specific enzyme activity was detected for the transformants H222-AK1-5 and for the wild-type H222.
  • the transformants H222-AK1-2 and H222-AK1-7 showed the highest specific PYC activities at 0.48 ⁇ 0.04 U / mg and 0.51 ⁇ 0.02 U / mg compared to the other strains investigated, their enzyme activities at 0.42 ⁇ 0. 1 U / mg (H222-AK1-5) and at 0.16 ⁇ 0.06 U / mg (H222) were determined.
  • the strain with increased PYC activity showed moderate differences in growth and production behavior.
  • the wild type H222 produced a maximum of 3.3 ⁇ 0.02 g L "1 succinate with an average productivity of 5, 4 ⁇ 0.6 mg L " 1 h "1.
  • For H 2 2 2-AM3 slightly increased amounts of succinate could be produced of 4.1 ⁇ 0.1 g L "1 .
  • H222-AZ10 H222-AZ10
  • JEN4 H222-AZ7
  • uracil auxotrophy was introduced in H222-AZ7 using FOA-selection.
  • FOA 5 'fluororotic acid
  • URA3 oritidine 5'-phosphate decarboxylase encoded by URA3.
  • 5-fluorouracil is toxic to the cell. Therefore, in the presence of FOA only cells can grow in which no URA3 is present or in which URA3 was removed by recombination of the flanking TcR sequences.
  • H222-AZ7 10 3 cells of H222-AZ7 were streaked with glucose on FOA- and uracil-containing minimal medium and the colonies obtained were checked for uracil auxotrophy by means of a punch test. The loss of URA3 was also detected by PCR. From the colonies tested, a uracil auxotrophic was selected (H222-AZ7U) and transformed with the integrative PYCl multicopy vector p64PYCl. After one to two weeks transformants were isolated, which were checked by PCR for the integration of the vector. All tested Transformants were positive. From these positive transformants, 3 were selected and tested for PYC activity. For this purpose, these 3 transformants and the wild type were cultured in minimal medium with glucose. After 4 hours, a sample was taken for the determination of PYC activity and the activity of pyruvate carboxylase was determined.
  • the three transformants tested were cultured in YNB medium to examine effects on succinate production.
  • FIG. 9 shows growth behavior and succinate production of H222 (wild type) and the new transformants H222-AZ 10 T1, T5 and T9.
  • H222-AZ7 TU and H222-AZ 8 T 3 were also included.
  • Table 5 The average values from all experiments carried out are summarized in Table 5.
  • Table 5 Average maximum succinate levels, volume specific productivities and biomass specific product formation rates of strains H222 (wild-type), H222-AZ10 Tl, T5, T9, H222-AZ8 T3 and H222-AZ7 TU. Cultivation in shake flasks at 28 ° C., 220 rpm in 150 ml of YNB medium with 5% glycerol as C source (+ 3% after 168 h) in two
  • Table 6 Maximum product levels of the organic acids malate (MA), ⁇ -ketoglutarate (AKG) and fumarate (FA) when cultivating the strains Y. lipolytica H222, H222-AZ 10 T 1, T5 and T9 in YNB medium. Cultivation in YNB medium at 5%
  • the gene of the carboxylate transporter Mael was deleted in Yarrowia lipolytica.
  • the deletion cassettes and plasmids used can be found in the table presented at the beginning.
  • the deletion strain H222-SW2AMAE1 the deletion of the SpMAE1 homologous gene MAE1, coding for a putative dicarboxylate transporter, was performed.
  • Cultures of the H222-SW2AMAE1 transformants 3, 7, and 8 were analyzed for the accumulated organic acids ⁇ -ketoglutarate, fumarate, malate, pyruvate, and succinate in comparison to the parent strain H222.
  • the determination of formed biosoluble masses continued to take place.
  • the formed dry biomass of the ⁇ 1 transformants when cultivated in 10% glycerol was 40% lower compared to the reference strain H222, but showed little difference in comparison of the transformants with each other. This significant difference in growth may be due to a reduced uptake of the tricarboxylic acid cycle
  • Intermediate ⁇ -ketoglutarate, fumarate, malate and succinate result, which are educts of many biosyntheses, such as for amino or fatty acids.
  • all transformants showed an increase in the production of the organic acids ⁇ -ketoglutarate, fumarate, malate and succinate studied. On average, a maximum of 30% more AKG, fumarate and succinate and 40% more malate (TF7 only 10%) were formed.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Pilzstämme aufweisend mindestens eine genetische Modifikation die zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt, sowie Verfahren zu deren Herstellung bzw. deren Verwendung.

Description

Thyssen Krupp Uhde GmbH
Pilzstämme mit genetischer Modifikation betreffend einen Carbonsäure-Transporter
Die vorliegende Erfindung betrifft Pilzstämme mit genetischer Modifikation betreffend einen Carbonsäure-Transporter, sowie Verfahren zur Herstellung bzw. Verwendung solcher Pilze. GEBIET DER ERFINDUNG
Das Interesse an biotechnologisch hergestellten Carbonsäuren etwa des Citratzyklus als ein potentielles intermediäres Ausgangsmaterial und als Alternative zu petrochemischen Produktionsprozessen in der Industrie steigt stetig. Viele dieser Carbonsäuren haben das Potenzial, als sogenannte Building-Block-Chemikalie zu fungieren. Wichtige Vorstufen für die chemische Synthese, Polyesterproduktion und andere Prozesse können aus besagten Carbonsäuren gebildet werden. So wird beispielswiese das für industrielle Zwecke wichtige Succinat derzeit noch hauptsächlich petrochemisch aus Maleinsäureanhydrid ausgehend von Butan gewonnen. Die petrochemische Herstellung von Succinat unter Verwendung von Schwermetallkatalysatoren, organischen Lösungsmitteln, hohen Temperaturen und Drücken ist kostenintensiv.
Daher war der Markt für Succinat bisher relativ klein. Aufgrund steigender Ölpreise, aber auch wegen das anhaltenden Bedarfs an Syntheseprodukten rückt die biotechnologische Produktion von Carbonsäuren, insbesondere von Succinat, und die Entwicklung entsprechender Prozesse immer stärker in den Fokus der produzierenden Industrie.
Carbonsäuren wie Succinat werden natürlicherweise durch viele Mikroorganismen, Pflanzen und Tiere als Intermediat im zentralen Stoffwechsel oder als Stoffwechselendprodukt gebildet. Die Mehrheit der natürlichen und optimierten Produzenten stellen Bakterienstämme dar, die beispielsweise Succinat vor allem unter anaeroben Bedingungen akkumulieren. Aufgrund der Nachteile der bakteriellen Produktionsverfahren, wie z. B. der Notwendigkeit von komplexen Kultivierungsmedien, der potenziellen Pathogenität und besonders der geringen Säuretoleranz, rücken jedoch mikrobielle Pilze immer stärker in den Fokus der Untersuchungen zur Entwicklung von Verfahren zur Produktion organischer Säuren wie Succinat.
Verschiedene genetische Modifikationen werden diskutiert, um in Pilzen insbesondere die Succinatbildung zu beeinflussen. So wurden mehrere Gene des Citratcyclus disruptiert, wobei gezeigt wurde, dass die Deletion von SDH1, das für eine Untereinheit der SDH (Succinatdehydrogenase) kodiert, zu einer l,6fachen Steigerung der Succinatproduktion, in Kombination mit einer FUM1 -Deletion (Gen, das für Fumarase kodiert) sogar zu einer 2,6fachen Steigerung der Succinatproduktion führte (Arikawa et al. 1999b). Die Disruption der Gene der SDH, die in S. cerevisiae aus mindestens vier Untereinheiten besteht (Ghezzi et al. 2009) in Sake-Stämmen der Gattung Saccharomyces resultierte in einer Reduktion der SDH-Aktivität und einer Erhöhung der Succinatbildung, wobei maximal 0,3 g L"1 Succinat gebildet wurden (Kubo et al. 2000). Mit Hilfe dieser Erkenntnisse wurden später S. cerevisiae Stämme mit dem Ziel der Succinatproduktion für den industriellen Einsatz konstruiert (Raab und Lang 201 1). Bei gleichzeitiger Deletion von SDH1, SDH2, IDH1 (dem Gen für die Isocitratdehydrogenase), und IDP1 (das für ein mitochondriales Isoenzym der IDH kodiert), wurden maximal 3,62 g L" 1 Succinat nach 168 h produziert. Allerdings wurden auch Ethanol, Glycerol, Acetat, a- Ketoglutarat (AKG) und Pyruvat als Nebenprodukte gebildet. Weitere Veränderungen, wie die durch einen reprimierbaren Promotor kontrollierte Expression von IDHl und SDH2 oder IDHl und DICI, das für einen Dicarboxylattransporter zum Transport von Succinat und Malat aus dem Cytosol in die Mitochondrien kodiert, wurden in der Literatur beschrieben (Raab und Lang 2011).
Im Zuge dessen wurde versucht, die Expression weiterer Gene (PYC1, ACS1, CIT1, ACOl, ICLI, MLSI, MDH2 und CIT2) durch Kontrolle durch einen konstitutiven Promotor (pADHI - Promotor der Alkoholdehydrogenase) zu deregulieren oder durch Gene von Craptree- negativen Hefen zu ersetzen (Raab und Lang 2011).
Die US20110104771 offenbart, dass ein S. cerevisiae Stamm mit einem ICL Gen aus K. lactis, dem Malatsynthasegen aus S. cerevisiae, mit einem Gen für die PEPCK aus M. succiniciproducens, dem Gen MDH2 aus S. cerevisiae sowie mit Genen für Fumarase (aus Rhizopus oryzae) und Fumaratreduktase (aus Trypanosoma brucei) bis zu 6,3 g L"1 Succinat nach 7 Tagen produzieren kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verfahren bzw. Organismen zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe die Produktion von organischen Säuren wirtschaftlich bewerkstelligt werden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verfahren bzw. Organismen zur Produktion von organischen Säuren zur Verfügung zu stellen, die gegenüber den bakteriellen Verfahren Vorteile aufweisen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Diese Aufgaben werden mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Die Unteransprüche geben bevorzugte Ausführungsformen an.
Demnach ist ein Pilzstamm vorgesehen, aufweisend eine genetische Modifikation, die zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt.
Bei besagtem Carbonsäure-Transporter handelt es sich um ein Membrantransport-Protein, das in der Lage ist, Carbonsäuren durch die Zellmembran und ggf. die Zellwand zu transportieren. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Transporter für Dicarbonsäuren, vorzugsweise um Transporter für Carbonsäuren des Citratcyclus bzw. benachbarter Stoffwechselwege. Dies können Symporter (Co-Transporter) sein, aber auch Uniporter oder Antiporter sein, ganz besonders bevorzugt Transporter für mindestens eine organische Säure ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Fumarat, Lactat, Pyruvat, Malat, Malonat und/oder Succinat.
Für Kluyveromyces lactis und Schizosaccharomyces pombe wurden bereits Dicarboxylatpermeasen beschrieben, die den Transport von Succinat/Malat/Fumarat (KUen2p) bzw. Lactat/Pyruvat (KLJenlp) sowie den Transport von Succinat/Malat/Malonat (SpMaelp) vermitteln. Die beiden erstgenannten gehören zur Gruppe der JEN-Transporter, während letztgenannte der Gruppe der MAE-Transporter zugehören.
Der Begriff "pilzeigen", wie hier verwendet, soll klarstellen, dass der besagte Carbonsäure- Transporter im Genom des Pilzes kodiert ist. Alternativ kann auch der Begriff "homolog" verwendet werden. Besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass besagter Pilz eine erhöhte extrazelluläre Carbonsäureproduktion aufweist.
Der Begriff "Carbonsäuren", wie hier verwendet, ist identisch mit dem Begriff "organische Säuren" und bezieht sich auf all jene Stoffwechselprodukte des besagten Pilzes, die als Carbonsäuren bezeichnet werden können. Bevorzugt bezeichnet der Begriff die Carbonsäuren des Citratcyklus und benachbarter Stoffwechselwege, insbesondere Pyruvat, a-Ketoglutarat, Malat, Oxalacetat, Citrat, Isocitrat, Fumarat, Malonat, Lactat und/oder Succinat. Bei den meisten dieser Säuren handelt es sich um Dicarbonsäuren.
Ebenso ist ein Verfahren zur genetischen Modifikation eines Pilzstamms zwecks Erhöhung der extrazellulären Carbonsäureproduktion vorgesehen, wobei besagtes Verfahren zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt.
Bevorzugt ist dabei vorgesehen, dass die Verminderung der Aktivität des Carbonsäure- Transporters erreicht wird durch mindestens eine Eigenschaft bzw. einen Schritt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: a) Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens codierend für einen Carbonsäure-Transporter
b) Expression eines dysfunktionalen oder vermindert aktiven Carbonsäure- Transporters, und/oder
c) Inhibierung oder Verminderung der Aktivität des exprimierten Carbonsäure- Transporters bewerkstelligt ist bzw. wird.
Die Inhibierung oder Verminderung der Expression kann beispielsweise durch Inhibierung oder Verminderung der Transkription des codierenden Gens oder der Translation der generierten mRNA erfolgen. Die Expression eines dysfunktionalen oder vermindert aktiven Carbonsäure-Transporters kann beispielsweise durch Deletion, Insertion, Substitution oder Punktmutation in dem codierenden Gen bewerkstelligt werden.
Hierzu kommen beispielsweise die folgenden Methoden in Frage: Beim Gen-Silencing erfolgt die Genregulation durch eine Hemmung der Übertragung (Transkription) einer genetischen Information von der DNA auf die mRNA (transkriptionelles Gen-Silencing) oder der nachfolgenden Übersetzung (Translation) der auf der mRNA gespeicherten Information in ein Protein (post-transkriptionelles Gen-Silencing). Transkriptionelles Gen-Silencing ist ein Resultat von epigenetischen Veränderungen der DNA, wie insbesondere DNA- Methylierung oder Histonmodifikationen. Durch diese Modifikationen der Histonenden wird eine Art heterochromatischer Zustand um das Gen geschaffen, welcher es der Transkriptionsmaschine (RNA-Polymerase, Transkriptionsfaktoren, etc.) verwehrt, zu binden. Das klassische Beispiel ist das als Positionseffekt-Variegation (PEV) bezeichnete Phänomen. Es verändert den Chromatinzustand und kontrolliert somit die Transkriptionsaktivität des betroffenen Gens oder der Genregion. Als posttranskriptionelles Gen-Silencing (PTGS) werden die Prozesse der Genstilllegung bezeichnet, die erst nach der Transkription der genetischen Information von der DNA auf die übertragende mRNA stattfinden. Zu den Formen des posttranskriptionellen Gen-Silencings zählen insbesondere der Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) und die RNA-Interferenz (RNAi). Während der Nonsense-mediated mRNA decay vorrangig der Vermeidung von Nonsense- Punktmutationen dient, ist die RNA-Interferenz ein überwiegend regulatorischer Prozess unter Beteiligung spezifischer RNA-Moleküle, wie miRNA und siRNA. Das posttranskriptionelle Gen-Silencing kann zu einem intensivierten Abbau der mRNA eines bestimmten Gens führen. Durch den Abbau der mRNA wird die Translation und somit die Bildung des spezifischen Genproduktes (meist ein Protein) verhindert. Darüber hinaus ist eine genspezifische direkte Hemmung der Translation als Folge des posttranskriptionellen Gen-Silencings möglich. Unter Gen-Knockout wird das vollständige Abschalten eines Gens im Genom eines Organismus verstanden. Das Abschalten des Gens wird durch Gene- Targeting erreicht. Eine Deletion, auch Gendeletion, ist in der Genetik eine Variante der Genmutation bzw. bei der eine Nukleotidsequenz bzw. ein Teil bis hin zum gesamten Chromosom fehlt. Eine Deletion ist daher immer ein Verlust von genetischem Material. Jegliche Anzahl von Nukleinbasen können deletiert sein, von einer einzelnen Base (Punktmutation) bis hin zum Chromosom. Es wird zwischen der interstitiellen und der terminalen Deletion unterschieden. Die erstere beschreibt einen Verlust innerhalb des Chromosoms, die letztere ein Verlorengehen eines Endabschnittes, also eines Teils des Telomerbereiches.
Als Folge der Deletion, kann nach der Translation aus der aus der DNA entstandenen mRNA ein fehlerhaftes Protein entstehen. Denn durch die Deletion von Basenpaaren kann eine Leserasterverschiebung-Mutation hervorgerufen werden, wenn eine Anzahl von Basenpaaren entfernt wurde, die nicht durch drei teilbar ist. Bei der ortsspezifischen oder gezielten Mutagenese wird mit Hilfe einer rekombinanten DNA eine gezielte Veränderung der DNA ermöglicht. Es können damit gezielt einzelne Nukleinbasen eines Gens ausgetauscht oder auch ganze Gene entfernt werden. Alternativ kann mittels einer Deletionskassette, die in einen Vektor integriert wurde, eine Deletion in dem zu mutierenden Gen erzeugt werden.
Alternativ kann die Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens durch Einklonierung eines heterologen Promotors erfolgen, der durch einen exogenen Faktor hemmbar ist, beispielsweise einen Tetracyclin-regulierten tetO-Promotor. Ebenso kann die Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens durch Einklonierung eines heterologen Promotors erfolgen, der schwächer ist als der betreffende homologe Promotor, beispielsweise pPOTl.
Die Inhibierung oder Verminderung der Aktivität des exprimierten Carbonsäure-Transporters kann beispielsweise durch Gabe von Inhibitoren oder synchrone Expression von geeigneten, heterologen Inhibitoren erfolgen. Bei besagtem Pilzstamm handelt es sich bevorzugt um einen Stamm mikrobieller Pilze.
Der Begriff "mikrobieller Pilz", wie hier verwendet, soll insbesondere solche Pilze umfassen, die mit biotechnologischen Methoden kultiviert werden können und sich insbesondere für fermentative Produktionsverfahren eignen, beispielsweise in Suspensionskulturen.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass es sich bei dem Pilz um ein Mitglied der Gruppe der Schlauchpilze (Ascomycota) handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um ein Mitglied der Gruppe der Hemiascomycetes oder der Euascomycetes. In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei besagtem Pilzstamm um eine Hefe oder einen Schimmelpilz. Besagter Pilz gehört besonders bevorzugt einer Gattung an, die ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Saccharomyces; Schizosaccharomyces; Wickerhamia; Debayomyces; Hansenula; Hanseniospora; Pichia; Kloeckera; Candida; Zygosaccharomyces ; Ogataea; Kuraishia; Komagataella (=Pichia); Yarrowia; Metschnikowia; Wiüiopsis; Nakazawaea; Kluyveromyces; Cryptococcus; Torulaspora; Torulopsis; Bullera; Rhodotorula; Sporobolomyces; Pseudozyma; Saccharomycopsis; Saccharomycodes; Aspergillus; Penicillium; Rhizopus; Trichosporon und/oder Trichoderma.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der mindestens eine Carbonsäure-Transporter aus der Gruppe der JEN-Transporter und/oder der MAE- Transporter entstammt.
Für Kluyveromyces lactis und Schizosaccharomyces pombe wurden bereits Dicarboxylatpermeasen beschrieben, die den Transport von Succinat/Malat/Fumarat (KUen2p) bzw. Lactat/Pyruvat (KLJenlp) sowie den Transport von Succinat/Malat/Malonat (SpMaelp) vermitteln. Die beiden erstgenannten gehören zur Gruppe der JEN-Transporter, während letztgenannte der Gruppe der MAE-Transporter zugehören.
Bislang wurden 35 Proteine, die durch putative Orthologe der K. lactis Gene KlJENl und KUEN2 kodiert wurden, in 17 verschiedenen Pilzarten ( 13 Hemiascomyceten, 7 Euascomyceten) gefunden. Dabei variiert die Anzahl an JEN-Orthologen von einem (z. B. S. cerevisiae) bis zu 6 orthologen Genen in Y. lipolytica. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die Gruppe der JEN-Transporter, sowie, in den letzten Zeilen, über die bekannten MAE-Transporter:
Typ Art Arbeitsname EMBL Swiss-Prot Länge Anzahl der
(aa) Transmembrandomänen
JEN K. lactis KLLA-E-KLJEN1 AJ585426 Q70DJ7 600 12
KLLA-F-KLJEN2 AJ627630 Q701Q9 528 1 1
Sac. cerevisiae SACE-K-JEN1 U24155 P36035 616 12
Sac. paradoxus SAPA-X1 -J101 616 12
Sac. mikatae SAMI-X1-J101 616 12
Sac. kudriavzevii SAKU-X1 -J101 614 10
Sac. bayanus SABA-X1 -J101 615 12
K. thermotolerans KLTH-G-J201 542 1 1
K. waltii KLWA-X1-J201 534 1 1
Sac. kluyveri SAKL-X1 -J101 598 10
SAKL-X2-J201 523 1 1
SAKL-X3-J001 531 1 1
A. gossypii ASGO-A-J001 AAS50559 Q75E88 500 10
ASGO-B-J201 AAS50561 Q75E76 478 9
ASGO-F-J101 AAS53704 Q753H9 500 9
D. hansenii DEHA-D-J202 CAG87482 Q6BR62 51 1 10
DEHA-F-J101 CAG89500 Q6BL03 513 12
DEHA-F-J201 CAG89946 Q6BJV3 506 12
C. albicans CAAL-D-J001 EAK98054 Q5A5U2 513 10
CAAL-C-J101 EAK97104 Q5A2W4 541 10
Y. lipolytica YALI-B-J101 CAG83351 Q6CE14 529 10
YALI-C-J102 CAG82184 Q6CBU1 499 10
YALI-C-J201 CAG82410 Q6CB72 523 10
YALI-D-J204 CAG81250 Q6C8F4 502 10
YALI-D-J202 CAG81440 Q6C7X3 503 10
YALI-E-J203 CAG80310 Q6C3Q6 524 10
N. crassa NECR-X1 -J201 EAA33605 Q7SB47 557 1 1
NECR-X2-J202 EAA32361 Q9P732 518 9
A. fumigatus ASFU-G-J202 EAL86916 Q4WGM5 501 1 1
ASFU-H-J001 EAL85090 Q4WB22 520 10
ASFU-B-J201 EAL93241 Q4X1 M4 51 1 9
A. nidulans ASNI-A-J201 495 10
ASNI-A-J202 514 1 1
A. oryzae ASOR-A-J201 508 1 1
ASOR-G-J202 512 10
MAE S. pombe n/a n/a P50537 438 10
Y. lipolytica n/a n/a n/a
Bekannte Carbonsäure-Transporter aus der Gruppe der JEN- bzw. MAE-Transporter in mikrobiellen Pilzstämmen. A = Aspergillus; Sac = Saccharomyces; N = Neurospora; Y =
Yarrowia; C = Candida; D = Debaromyces und K = Kluyveromyces Bevorzugt ist dabei vorgesehen, dass der mindestens eine Carbonsäure-Transporter aus der in der folgenden Tabelle aufgeführten Gruppe der JEN-Transporter und/oder der MAE- Transporter entstammt.
Experimentell wurde das betreffende Gen mittels einer in einem Vektor integrierten Deletionskassette deletiert (SEQ ID Nos 1, 3, 5, 7, 9 und 11). Bei dem verwendeten Vektor handelt es sich jeweils um pUCBM21, der ursprünglich von Boehringer entwickelt wurde (SEQ ID Nos 2, 4, 6, 8, 10, 12). Es sind jedoch auch alle anderen geeigneten aus dem Stand der Technik bekannten Vektoren verwendbar.
Besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass der mindestens eine Carbonsäure-Transporter durch das Gen YALI-D-J204 (EMBL-ID: CAG81250; Swiss-Prot ID: Q6C8F4) kodiert ist. Besagtes Gen wird im Rahmen dieser Anmeldung stets auch als ,JEN4" bezeichnet. Ebenso ist besonders bevorzugt vorgesehen, dass besagter Pilz der Gattung Yarrowia, besonders bevorzugt der Art Yarrowia lipolytica zugehört.
Wie oben gezeigt, weist die Y. lipolytica insgesamt 6 JEW-Orthologen auf. Diese hohe Anzahl an Genen für putative Carboxylattransporter spiegelt das große Potenzial der Hefe Y. lipolytica für die Produktion von organischen Säuren, wie z. B. Succinat, Malat oder Fumarat, wider. Außerdem ist Y. lipolytica umfangreich genetisch und physiologisch charakterisiert, kann ein breites Spektrum an Substraten verwerten und ist tolerant gegenüber niedrigen pH- Werten.
Ferner ist bevorzugt vorgesehen, dass besagter Pilz mindestens eine weitere genetische Modifikation ausgewählt aus der Gruppe enthaltend:
• Reduktion der Aktivität bzw. Expression der Succinatdehydro genäse (SDH), beispielsweise durch Austausch des nativen Promotors von SDH2 gegen einen schwachen Promotor, (bei Glucose und Glycerol als Substrat eignet sich beispielsweise pPOTl), o der durch Verwendung einer geeigneten Deletionskassette,
• Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Pyruvatcarboxylase (PYC), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens PYC1, und/oder
• Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Isocitratlyase (ICL), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens ICL1
aufweist.
All diese genetischen Modifikationen stehen im Zusammenhang mit der Bildung von Carbonsäuren im Rahmen des Citratzyklus. Die genannten Modifikationen sind im Methodenteil ausführlich beschrieben.
Weitere in Frage kommende genetische Modifikation, die in Kombination mit den genannten Modifikationen verwendet werden können, betreffen eine Reduktion der Aktivität bzw. Expression der Gene SDH1, SDH3 und/oder SDH4, das Einbringen eines heterologen Gens ausgewählt aus der Gruppe codierend für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PCK1), Fumarat Reduktase und/oder Fumarase (FUM1), und/oder die Reduktion der Aktivität bzw. Expression des Gens codierend für Isocitrat-Dehydrogenase (IDHl) sowie mindestens eines der Gene codierend für den mitochondrialen Dicarboxylat-Carrier (DIC1) und/oder SDH2, und optional mindestens eines der Gene FUMl, osmotic growth Protein (OSMl), Malat Dehydrogenase (MDH3) und/oder Citrat Synthase (CIT2). Die Reduktion der Expression kann beispielsweise durch einen heterologen Promotor erfolgen, der durch einen exogenen Faktor hemmbar ist, bevorzugt einen Tetracyclin-regulierten tetO-Promotor. Alternative Methoden (Gene Silencing, Gene Knock out, Deletion) sind weiter oben dargestellt
Die genannten Gene sind in der folgenden Tabelle identifiziert, dabei wurden als Beispiel die UniProt-Einträge für Saccharomyces cerevisiae gewählt. Es versteht sich, dass der Fachmann anhand dieser Angaben die korrespondierenden Gene in anderen Pilzstämmen, insbesondere in Yarrowia, ohne weiteres finden kann.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren vorgesehen, wobei in dem Verfahren ein Pilzstamm gemäß einem der vorherigen Ansprüche verwendet wird. Besonders bevorzugt ist dabei vorgesehen, dass als Kohlenstoffquelle Hexosen, wie z.B. Glucose oder Saccharose, oder Alkohole, wie z.B. Glycerol, verwendet wird. Glucose und Saccharose sind besonders geeignet, weil sie kostengünstige Substrate darstellen. Glycerol fällt in großen Mengen als Abfallprodukt beispielsweise in der Produktion von Biodiesel an und ist daher ebenfalls ein kostengünstiges Substrat. Für Glycerol spricht überdies, dass seine Aufnahme durch die Pilze durch eine Beeinträchtigung eines Carbonsäure-Transporters nicht berührt wird. Ferner ist bevorzugt vorgesehen, dass die Pilzstämme in einem Medium kultiviert werden, und wobei ferner die Sauerstoffaufnahmerate (OUR) auf einen Bereich zwischen > 5 und < 50 mmol 02/l*h eingeregelt wird.
In diesem Bereich, so haben Untersuchungen der Anmelderin ergeben, werden die höchsten Produktionsraten erzielt. Bevorzugt wird die Sauerstoffaufnahmerate auf einen Bereich zwischen > 10 und < 40 mmol 02/l*h eingeregelt. Besonders bevorzugt wird die Sauerstoffaufnahmerate auf einen Bereich zwischen > 20 und < 30 mmol 02/l*h eingeregelt. Äußerst bevorzugt wird die Sauerstoffaufnahmerate auf einen Bereich zwischen 25 + 3 mmol 02/l*h eingeregelt.
Technisch kann in einem Fermenter der Sauerstoffeintrag OTR durch die Luftbegasungsrate (1 min"1), die Rührerdrehzahl (U min"1), die Druckbeaufschlagung des Fermenters und die Gaszusammensetzung (Anteil O2 im Gasgemisch) beeinflusst werden. Die Sauerstoffaufnahmerate OUR kann anhand der bekannten eingetragenen Gaszusammensetzung sowie der Gasmenge und der Messung der Sauerstoffkonzentration im Abgas mit Hilfe allgemein bekannter Gleichungen bestimmt werden.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN Es zeigen: Fig. 1 Schematische Darstellung der Expressionskassette zum Austausch des SDH2-
Promotors gegen den Promotor der Gene ICL1, GPR1 oder POT1. Alle Expressionskassetten enthielten URA3 als Selektionsmarker, flankiert durch die /ox-sites und homologe Bereiche des SZ)H2-Promotors und SDH2-ORF.
Der SDH2-ORF wurde direkt mit dem jeweiligen Promotor fusioniert. Die pICLl enthaltende Expressionskassette hatte eine Größe von 4,9 kb, die pPOTl -Kassette 3,8 kb und die GPR1 B-Kassette war 4,2 kb groß. Fig. 2 Plasmide pSpIvS-Ura, pSpPS-Ura und pSpGS-U r a m i t d e n
Expressionskassetten zum Austausch des SZ)H2-Promotors gegen pICLl, pPOTl bzw. GPRIB. Als Selektionsmarker ist das mit den /ox-Sites flankierte Markergen URA3 enthalten. Fig. 3 Vektorkonstruktion des Plasmids p64PIC ausgehend von p64PYCl und p64ICL l . Neben den gewünschten Genen mit eigenem Promotor- und Terminatorbereich enthielt p64PIC das URA3-AWe\ ura3d4 als multicopy Markergen und rDNA als Integrationssequenz. Fig. 4 PYC- und ICL-Aktivitäten des Wildtypstamms Y. lipolytica Η222 und der
Transformanden Η222-ΑΖ8 T3, T4, T5 und Η222-ΑΖ9 T2 und T3 in MG- Medium. Die Stämme wurden in je 100 ml MG-Medium (Wachstumsmedium) in 500-ml Erlenmeyerkolben bei 28°C und 220 rpm kultiviert. Die Probenahme für die Aktivitätsmessung erfolgte nach 4 h.
Fig. 5 Schematische Darstellung zur Deletion von JEN 4 durch homologe
Rekombination in Promotor- und Terminatorregion mit der URA3 enthaltenen Deletionskassette. Fig. 6 Wachstum (a) und Succinatproduktion (b) des Wildtypstamms Y. lipolytica
H222 und der Transformanden H222-AZ7 Tl 1 und T23 in YNB-Medium. Die Stämme wurden in je 150 ml Kultur-Medium in 500-ml Erlenmeyerkolben bei 28°C und 220 rpm mit 5 % Glycerol kultiviert. Die Succinatgehalte im Kulturüberstand wurden ionenchromatografisch bestimmt.
Fig. 7 Strategie zur Konstruktion des Stamms H222-AZ10.
Fig. 8 PYC-Aktivitäten des Wildtypstamms Y. lipolytica H222 und der
Transformanden H222-AZ 10 T l , T5 und T9 in MG-Medium. Die Stämme wurden in je 100 ml MG-Medium (Wachstumsmedium) in 500-ml Erlenmeyerkolben bei 28°C und 220 rpm kultiviert. Die Probenahme für die Aktivitätsmessung erfolgte nach 4 h.
Fig. 9 Wachstum (a) und Succinatproduktion (b) des Wildtypstamms Y. lipolytica
H222 und der Transformanden H222-AZ7 TU, H222-AZ8 T3 sowie H222- AZ10 Tl, T5 und T9 in YNB-Medium. Die Stämme wurden in je 150 ml Kultur-Medium in 500-ml Erlenmeyerkolben bei 28°C und 220 rpm mit 5 % Glycerol kultiviert. Die Succinatgehalte im Kulturüberstand wurden ionenchromatografisch bestimmt.
Fig. 10 Maximal gebildete Produktmengen der organischen Säuren Succinat, Malat, α-Ketoglutarat (AKG) und Fumarat bei Kultivierung der Stämme Y. lipolytica H222, H222-AZ8 T3, H222-AZ7 T U und H222-AZ10 T l , T5 und T9 in YNB-Medium. Kultivierung in YNB-Medium mit 5 % Glycerol als C-Quelle.
Fig. 11 Prozentualer Anteil der organischen Säuren Succinat (SA), Malat (MA), α-Ketoglutarat (AKG) und Fumarat (FA) am Gesamtsäureprodukt bei Kultivierung der Stämme Y. lipolytica H222, H222-AZ8 T3, H222-AZ7 TU und H222-AZ10 Tl, T5 und T9 in YNB-Medium. Kultivierung in YNB- Medium mit 5 % Glycerol als C-Quelle.
Fig. 12 Maximale Säureproduktion der MAE1 deletierten Transformanden. Gezeigt wurde die gemittelte, maximale Säuremenge der H222-SW2AMAE1- Transformanden TF3, TF7 und TF8, sowie des Referenzstammes H222 aus 3- facher Kultivierung in Produktionsmedium nach Tabuchi et al. (1981).
AKG = α-Ketoglutarat, FU = Fumarat, MA = Malat, SUC = Succinat
Fig. 13: Vektorkonstruktion des Plasmids p64PYCl ausgehend von p64T.
Fig. 14: Southern Blot Analyse zur Bestätigung der multiplen Integration von p64PYCl in Y. lipolytica H222-S4. Die genomische DNA wurde mit der Restriktase EcoRV vollständig verdaut. Für die Detektion von PYCl wurde eine spezifische Sonde für den PYC1-OKF (2, 1 kb) verwendet, die mittels PCR und den Primern PYC ORF for und PYC ORF rev gewonnen wurde. Der schwarze Pfeil kennzeichnet das 8 ,9 kb große genomische (g) PYCl -Fragment und der rote Pfeil zeigt das 6,2 kb vektorielle (v) PYC1- Fragment. λ-Molekulargewichtsstandard; 1-Rezipientenstamm H222-S4; 2- Transformande H222-AK1-1; 3-Transformande H222-AK1-2; 4- Transformande H222-AK1-3; 5-Transformande H222-AK1-4; 6-Transformande H222-AK1-5; 7-Transformande H222-AK1-6; 8- Transformande H222-AK1-7.
Fig. 15 Kinetik der spezifischen Pyruvatcarboxylase- Aktivität der Transformanden mit einer Mehrfachintegration der PYCl -Expressionskassette im Vergleich zu dem Wildtyp H222. Die spezifischen Aktivitäten wurden während der Kultivierung in 100 ml Minimalmedium mit 1 % Glucose bestimmt. Der charakteristische Verlauf der spezifischen Aktivitäten ergab sich aus den Enzymaktivitätsbestimmungen von drei unabhängigen Kultivierungen. Wachstum (a) und Succinatproduktion (b) der Stämme Y. lipolytica H222 (Wildtyp) und H222-AM3 in Tabuchi-Medium. Zur Beurteilung des Wachstums wurde die optische Dichte der Kultur bei 600 nm zu bestimmten Zeitpunkten bestimmt. Die Stämme wurden in je 100 ml Produktionsmedium nach Tabuchi et al. (1981) in 500-ml Erlenmeyerkolben bei 28°C und 220 rpm mit 10 % Glycerol kultiviert. Die Bestimmung der Succinatgehalte erfolgte lonenchromatografisch. Dargestellt sind Verlauf der optischen Dichten (OD6oo) sowie der Succinatproduktion jeweils eines der Versuche aus mehreren Wiederholungen.
Zusammensetzung des Kulturmediums
1. YNB-Medium
Tabelle la: Zusammensetzung des YNB-Kulturmediums 2. Spurenelemente YNB
3. Tabuchi-Medium
Tabelle lb: Zusammensetzung des Mediums modifiziert nach Tabuchi et al. (1981):
Zu Beginn der Arbeiten wurde der Y. lipolytica Wildtypstamm H222 für die Untersuchung der Succinatproduktion ausgewählt. H222 hatte sich bereits hinsichtlich der Citrat- bzw. AKG-Produktion als sehr guter Säureproduzent gegenüber anderen Y. lipolytica Stämmen bewährt. H222 wurde in einem Kultivierungsmedium, das für die Itaconsäureproduktion durch Candida-Stämme optimiert wurde, kultiviert. Als C-Quellen wurden Glucose (10 %), Glycerol (10 %) und Sonnenblumenöl (5 %) ausgewählt. Die Kultivierung erfolgte in 500-ml- Erlmeyerkolben ohne Schikanen in 100 ml Kultivierungsmedium bei 28 °C und 220 rpm. Bei Verwendung von Sonnenblumenöl als C- Quelle wurden die Flüssigkulturen in 500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen geschüttelt. Die Vorkultur erfolgte in 50 ml des gleichen Mediums und wurde 2 - 3 Tage bei 28°C und 220 rpm inkubiert. Die Vorkultur wurde durch Zentrifugation (3.500 rpm, 5 min, RT) geerntet und in Produktionsmedium ohne C-Quelle, Hefeextrakt und Eisensulfat aufgenommen. Nach Bestimmung der optischen Dichten wurden die Hauptkulturen mit je 100 ml des Produktionsmediums mit einer optischen Dichte von 2 OD ml"1 beimpft. Anschließend erfolgte eine Kultivierung bei 28°C und 220 rpm bis zu 500 h. Die Analyse der Konzentrationen der während der Kultivierung von Y. lipolytica sekretierten organischen Säuren erfolgte mittels Ionenchromatografie unter Verwendung des Ionenchromatographie- Systems ICS-2100 der Firma Dionex (Sunnydale, USA). Die Ionenchromatographie-Systeme enthielten folgende Komponenten: Isokratische Pumpe und Leitfähigkeitsdetektor IC20, Eluentengenerator EG40, Autosampier AS40/Autosampler AS50, Selbstregenerierender Suppressor ASRS, Trennsäule IonPac AS 19 (2 x 250 mm) mit Vorsäule IonPac AS 19 (2 x 50 mm), Analytiksoftware Chromeleon Version 6.8. Die Trennparameter der Trennmethode sind in Tabelle 2 aufgelistet. Vorbereitung der Proben für die Ionenchromatografie: Zu bestimmten Zeiten der Kultivierung wurden je 1 ml der Kultur entnommen und je nach enthaltener C-Quelle aufbereitet. Abgesehen von den Kulturen, in denen Sonnenblumenöl als C-Quelle verwendet wurde, wurden die Proben bei maximaler Geschwindigkeit (5 min, 4°C) zentrifugiert und der Überstand mit entsprechender Verdünnung in bidestilliertem Wasser für die Ionenchromatografie eingesetzt. Wurde Sonnenblumenöl als C-Quelle verwendet, so musste dieses vor der Analyse entfernt werden. Dazu wurde die Probe mit 0,5 ml n-Hexan versetzt, 5 min stark geschüttelt und anschließend 5 min bei maximaler Geschwindigkeit und 4°C zentrifugiert. Die dabei entstehende wässrige untere Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und erneut mit 0,3 ml n-Hexan versetzt, geschüttelt und nochmals zentrifugiert. Wieder wurde die wässrige Phase abgenommen und mit entsprechender Verdünnung für die ionenchromatografische Analyse eingesetzt. Da das hier verwendete Kultur-Medium bisher nicht für die Succinatproduktion optimiert wurde und die Kultivierungsbedingungen, wie z. B. pH und p02, im Schüttelko Ibenmaß stab nicht dauerhaft stabil gehalten werden können, wurde in diesem und in allen folgenden Kultivierungsexperimenten auf die Berechnung maximaler Produktivitäten bzw. maximaler spezifischer Produktbildungsraten verzichtet.
Säule IonPac AS 19
Flussrate 0,3 ml min-1
Inj ektions vo lumen 10 μΐ
Laufmittel ddH20
KOH
0-3 min: isokratisch, 5 mM
3-25 min: linear auf 38 mM
Eluent
25-36 min: isokratisch 38 mM
36-38 min: linear auf 5 mM
38-40 min: isokratisch, 5 mM
Pyruvat 7,5 min
Malat 19,6 min
Retentionszeiten (min) Succinat 20,3 min
a-Ketoglutarat 23,4 min
Fumarat 27,4 min
Tabelle 2: Trennparameter der Ionenchromatografie
Retensionszeiten für die organischen Säuren.
1. Ausgangsorganismen
Für eine weitere molekularbiologische Bearbeitung dieses Stamms war eine Einführung von Auxotrophien/Selektionsmarkern notwendig. Der uracilauxotrophe Stamm H222-S4 war zu Beginn der Arbeiten bereits vorhanden (Mauersberger et al. 2001). Weitere auxotrophe Stämme wurden konstruiert. Innerhalb dieses Projekts wurde nur ein weiterer uracilauxotropher Stamm (H222-SW2) eingesetzt. H222-SW2 wurde durch Deletion des Ku70 Gens, dessen Genprodukt eine Rolle bei der DNA-Rekombination spielt, in H222-S4 erzeugt.
Es wurden Expressionskassetten konstruiert, die neben dem Selektionsmarker URA3 den entsprechenden Promotor (pICLl, GPR1B oder pPOTl) fusioniert mit dem Beginn des SDH2-OKFs sowie einen homologen Bereich von pSDH2 enthielten (Fig. 1). Der Selektionsmarker URA3 wurde durch die sogenannten /ox-sites flankiert, wodurch eine eventuelle spätere Entfernung dieses Markers mittels Cre/ox-System ermöglicht wurde. Die homologen Bereiche aus pSDH2 und SDH2-OKF sollten zur homologen Integration dieser Expressionskassette dienen.
Als Ausgangsplasmid diente pUCBM21 (Fig. 2). In diesen wurde zuerst das mit den Primern pSDH2-fw und pSDH2-rv amplifizierte 5DH2-Promotorfragment pSDH2 (569 bp) in die Ncol-Schnittstelle integriert. Mittels PCR wurden ein 1242 bp großes Fragment des SDH2 ORFs (Primer: SDH2-fw und SDH2-rv) und ein 776 bp großes pICLl -Fragment (Primer: pICLl-fw und pICL l-rv) amplifiziert und diese mittels Overlap-PCR fusioniert (Primer: overlap-fw und overlap-rv). Nach Verdau mit den Restriktionsenzymen BamHl und EcoRI wurde dieses pICLl-SDH2 '-Fragment in den pSDH2 enthaltenen Vektor, ebenfalls BamHl und EcoRI verdaut, integriert. In dieses Konstrukt wurde das 2, 16 kb große /?/CZJ -Fragment, das mittels Kpnl und BamRl Verdau aus dem Plasmid p64PT (Gerber (1999) gewonnen wurde, zwischen die Kpnl- und 5amHI-Schnittstellen kloniert. Zum Schluss erfolgte die Integration der loxR-URA J-/ox -Kassette in dieses Plasmid mit der pSDH2-pICLl-SDH2 '- Kassette, das mit Xbal und Kpnl verdaut wurde.
Die 1 ,4 kb große Expressionskassette wurde aus dem Plasmid JMP1 13 (Fickers et al. 2003) mittels Xbal/Kpnl-V erdaus isoliert. Schließlich wurde das 8196 bp große Plasmid pSpIvS- Ura (Fig. 2) erhalten, welches die Expressionskassette pSDH2-loxR-URA3-loxP-pICLl- SDH2 ' zum Austausch des nativen SZ)H2-Promotors gegen den /CZJ -Promotor enthielt. Diese wurde durch KspMIMlul-V Qxdau aus dem Plasmid isoliert und für die Transformation mittels LiAc-Methode in den uracilauxotrophen Rezipientenstamm H222-SW2 (MATA ura3- 302 ku70A-1572) (Werner 2008) verwendet. Das pSDH2-loxR-URA3-loxP-pPOTl-SDH2 ' enthaltene Plasmid pSpPS-Ura (Fig. 2) wurde ausgehend von pSpIvS-Ura konstrui ert . D afür wurde p S p Iv S-Ura mit den Restriktionsenzymen Kpnl und Mlul verdaut und das 4773 bp große Fragment (mit pSDH2 und URA3) isoliert. Dann wurden das mittels PCR gewonnene SDH2 '- (838 bp, Primer: SDH2-pPOTl-fw, SDH2-MluI-rv) und das pPOTl -Fragment ( 1538 bp, Primer: Kpnl- pPOTl-fw und pPOT l-SDH2-rv) in einer Overlap-PCR mit den Primern KpnI-pPOTl-fw und SDH2-MluI-rv zu einem 2336 bp großen Konstrukt fusioniert. Dieses Konstrukt wurde mit Kpnl und Mlul verdaut und mit dem 4773 bp Fragment von pSpIvS-Ura ligiert. Schließlich wurde ein pSpPS-Ura Plasmid mit einer Größe von 7, 1 kb isoliert, das die Expressionskassette pSDH2-loxR-URA3-loxP-pPOTl-SDH2 ' zum Austausch des nativen 5DH2-Promotors gegen den POT1 -Promotor enthielt. Auch diese Expressionskassette konnte mittels ÄTspAI/ M-Verdau aus dem Plasmid isoliert und für die Transformation in den uracilauxotrophen Rezipientenstamm H222-SW2 (MATA ura3-302 ku70A-1572) (Werner 2008) verwendet werden. Analog zu pSpPS-Ura wurde das pSDH2-loxR-URA3-loxP-GPRlB-SDH2 ' enthaltene Plasmid pSpGS-Ura (Fig. 2) konstruiert. GPR1B wurde mittels PCR (Primer: Kpnl-pGPRl- fw und pGPRl-SDH2-rv, Fragmentgröße: 1971 bp) aus dem Plasmid pTBS l isoliert. Das mittels PCR gewonnene SDH2'- (838 bp, Primer: SDH2-pGPRl-fw, SDH2-MluI-rv) wurde in einer Overlap-PCR mit den Primern Kpnl-pGPRl-fw und SDH2-MluI-rv zu einem 2769 bp großen Konstrukt fusioniert. Dieses Konstrukt wurde mit Kpnl und Mlul verdaut und mit dem 4773 bp Fragment von pSpIvS-Ura ligiert. Schließlich wurde ein pSpGS-Ura Plasmid mit einer Größe von 7,5 kb isoliert, das die Expressionskassette pSDH2-loxR-URA3-loxP- GPR1B-SDH2 ' zum Austausch des nativen 5DH2-Promotors gegen den G i?ii?-Promotor enthielt. Zur Überprüfung der Sequenz wurden die Expressionskassetten sequenziert.
Diese Expressionskassetten wurden in den uracilauxotrophen Rezipientenstamm H222-SW2 (MATA ura3-302 ku 70A-1572) (Werner 2008) transformiert. Schließlich wurden die uracilprototrophen Transformanden H222-AZ 1 (pICLl-SDH2), und H222-AZ2 (pPOTl- SDH2) und H222-AZ3 (pGPRl-SDH2) erhalten. Die Integration der entsprechenden Expressionskassetten wurde mittels PCR oder Southern Hybridisierung nachgewiesen. 2. Kombination von Überexpression von PYCl und SDH2-Promotoraustausch bzw. PYC1+ICL1 und SDH2-Promotoraustausch
Ausgangsstamm war Η222-ΑΖ2. Weiterhin wurden ausgehend von Η222-ΑΖ2 Stämme konstruiert, in denen sowohl PYCl als auch das Isocitratlyase kodierende Gen ICLl simultan überexprimiert vorliegen.
Für die Konstruktion eines Stamms (Η222-ΑΖ8), in dem sowohl der 5DH2-Promotor gegen den POT1 -Promotor ausgetauscht als auch das Pyruvatcarboxylase kodierende Gen PYCl überexprimiert vorliegen, wurde Η222-ΑΖ2 als Ausgangsstamm verwendet. Um diesen für weitere Manipulationen einsetzen zu können, musste in Η222-ΑΖ2 eine Uracilauxotrophie erzeugt werden. Die Expressionskassette zum Austausch des 5DH2-Promotors wurde so konstruiert, dass das Markergen URA3, das essenziell für die zelleigene Uracilsynthese ist, von den sogenannten /ox-sites flankiert wurde. Um dieses Markergen wieder zu entfernen und dadurch den Verlust der Uracilprototrophie zu erreichen, wurde das sogenannte Crelox- System angewendet. Dazu wurde Η222-ΑΖ2 mit dem Plasmid pUB4-Cre transformiert, das sowohl ein Gen für die Cre-Rekombinase als auch ein HygromycinB-Resistenz-vermittelndes Gen enthielt. Die Zellen wurden anschließend auf HygromycinB-haltigem Vollmedium und dann auf Minimalmedium mit bzw. ohne Uracil selektiert. Transformanden, in denen es mit Hilfe der Cre-Rekombinase zu einer Rekombination der /ox-Sites kam, konnten aufgrund des dadurch verursachten Verlusts von URA3 kein Uracil mehr produzieren und somit nicht mehr auf uracilfreien Medium wachsen.
Aus diesen uracilauxotrophen Transformanden wurde eine Transformande ausgewählt und als H222-AZ2U für die weiteren Arbeiten verwendet. Im Anschluss wurde das integrative multicopy Plasmid p64PYCl, welches das in Y. lipolytica für die Pyruvatcarboxylase kodierende Gen PYCl mit eigenem Promotor- und Terminatorbereichen sowie das URA3- Allel ura3d4 als multicopy Markergen und rDNA als Integrationssequenz enthielt, mittels Lithiumacetat-Methode (Barth und Gaillardin 1996) in den uracilauxotrophen Stamm H222- AZ2U transformiert. Es erfolgte eine Selektion der uracilprototrophen Transformanden auf uracilfreiem Minimalmedium mit Glucose als C-Quelle. Aus den erhaltenen Transformanden wurden drei ausgewählt und hinsichtlich der multiplen Integration von p64PYCl mittels PCR und Southern Blot überprüft. Zum Nachweis der PYC-Aktivität wurden alle drei Transformanden sowie der Wildtyp H222 in Minimalmedium mit Glucose kultiviert. Nach 4 Stunden wurden Zellen geerntet und mechanisch aufgeschlossen. Die Bestimmung der PYC-Aktivität im zellfreien Extrakt erfolgte nach van Urk et al. (1989). Die Kultivierung erfolgte analog zu beschriebenen Kultivierung der Stämme H222-AZ1 bis H222-AZ3.
Für die Konstruktion eines Stamms (H222-AZ9), in dem sowohl der 5DH2-Promotor gegen den POT1 -Promotor ausgetauscht als auch PYC1 und ICL1 überexprimiert vorliegen, wurde analog zur Konstruktion von H222-AZ8 verfahren und ein uracilauxotropher Abkömmling von H222-AZ2 als Ausgangsstamm verwendet. Das zu transformierende Plasmid p64PIC wurde durch Restriktion und Ligation aus den Plasmiden p64PYCl und p64ICLl (Kruse et al. 2004) konstruiert. Dazu wurde das ca. 4,6 kb große Sphl-Fsp AI-Fragment aus p64ICLl isoliert und in den Sphl-FspAI geschnitten Vektor p64PYCl integriert (Fig. 3). Das entstandene Plasmid p64PIC hatte eine Größe von 15,4 kb und wurde für die Transformation in der SacII-Schnittstelle linearisiert. Die Integration wurde mittels PCR bzw. Southern Blot verifiziert. Zwei ausgewählte Transformanden wurden hinsichtlich der PYC- und ICL- Aktivität (Tabelle 3) nach Dixon und Kornberg, (1959) überprüft und schließlich in YNB- Medium kultiviert.
Stammlösung Endkonzentration
Tris-HCl, pH 7,0 100 mM 53,3 mM
Cystein-HCl 20 mM 2 mM
MgCl2 50 mM 5 mM
D,L-Na-Isocitrat 16,7 mM 1,67 mM
Phenylhydrazin-
33 mM 3,3 mM
HC1 Tabelle 3: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes zur Bestimmung der ICL-Aktivität. Das Prinzip des Assays basiert auf der Messung des Anstiegs der Extinktion bei 324 nm resultierend aus der Bildung von Glyoxylat-Phenylhydrazon (ε = 17 L mmol"1 cm 1) aus
Glyoxylat und Phenylhydrazine.
Zur Charakterisierung wurden drei Transformanden von H222-AZ8 (T3 - T5) sowie zwei Transformanden von H222-AZ9 (T2 + T3) ausgewählt. In allen Transformanden wurde die PYC-Aktivität und in den H222-AZ9 Transformanden wurde zusätzlich die Aktivität der ICL untersucht. In Fig. 4 sind die Ergebnisse dieser Aktivitätsmessungen dargestellt. Sowohl alle Transformanden von H222-AZ8 als auch H222-AZ9 zeigten eine gesteigerte PYC-Aktivität (2,6 - 3,7fach) im Vergleich zum Wildtyp H222. Die Transformanden H222-AZ9 T2 und T3 zeigten darüber hinaus eine 24-25 fach Steigerung der ICL- Aktivität verglichen mit H222.
3. Deletion von JEN4
Die Erfinder haben Untersuchungen zur Charakterisierung der durch JEW-Orthologe kodierten Proteine in Y. lipolytica durchgeführt. Diese Untersuchungen lieferten Hinweise auf die Funktionsweise dieser JEW-Genprodukte als Dicarboxylat-Importer mit mehreren spezifischen Substraten. Dabei wurden Stämme konstruiert, in denen einzelne JEN-Gene deletiert wurden. Bei Kultivierung dieser Stämme wurden teilweise, besonders bei der Deletion von JEN4, größere Mengen an extrazellulärem Succinat detektiert.
Dabei wurde in den uracilauxotrophen Yarrowia lipolytica-Stamm H222-AZ2U eine JEN4- Deletionskassette (ca. 4,5 kb) transformiert. Die J£7V¥-Deletionskassette (Fig. 5) enthielt die Promotor- und Terminatorregionen von JEN4, dazwischen das von TcR-Sequenzen flankierte URA3 (Hübner 2010). Die Deletionskassette wurde mittels Lithium- Acetat-Methode transformiert. Durch homologe Rekombination in Promotor- und Terminatorregion sollte es zu einer Deletion von JEN4 kommen (Fig. 5). Zwei uracilprototrophe Transformanden, in denen die Deletion von JEN4 mittels PCR und Southern Blot nachgewiesen wurde, wurden isoliert. Beide Transformanden wurden in YNB kultiviert. Die beiden untersuchten Transformanden H222-AZ7 T l l und T23 verhielten sich hinsichtlich des Wachstums ähnlich zu H222-AZ2 (Fig. 3). Beide Transformanden produzierten außerdem mehr Succinat als die Ausgangsstämme H222 und H222-AZ2 (Fig. 6, Tab. 2).
H222 3,6 ± 0,4 9,8 ± 0,6 0,60 ± 0,01
AZ2 15,0 ± 4,0 31,8 ± 7,9 2,50 ± 0,68
AZ7 T11 21,1 ± 0,4 50,7 ± 2,2 3,00 ± 0,09
AZ7 T23 20,8 ± 1,1 54,7 ± 13,3 3,06 ± 0,07
Tabelle 4: Maximale Succinatgehalte, volumenspezifische und biomassespezifische Produktbildungsrate der Stämme H222, H222-AZ7 Tl 1 und T23 in YNB-Medium.
Kultivierung in YNB-Medium mit 5 % Glycerol als C-Quelle.
4. Überexpression von PYCl
Für die Überexpression der Pyruvatcarboxylase (PYC) in Y. lipolytica wurde das integrative multicopy Plasmid p64PYC durch Integration des PCR-amplifizierten ORFs des entsprechenden Gens zusammen mit den eigenen Promotor- und Terminatorregionen von ca. 1 kb in den Empfängervektor p64T konstruiert.
Die Pyruvatcarboxylase wird in Y. lipolytica durch ein Gen {PYCl) kodiert (Flores und Gancedo 2005). Da der Bereich, des ORFs von PYCl (3844 bp) gemeinsam mit den zugehörigen jeweils 1 kb großen Promotor- und 0,3 kb großen Terminatorbereich eine Größe von 5149 bp umfasste, wurde diese Expressionskassette in zwei Schritten amplifiziert, um das Einbringen von eventuellen Sequenzfehlern durch die Polymerase zu verringern. Die Oligonukleotide PYCa for und PYCa rev amplifizierten den 2442 bp großen Bereich, welcher den 1 kb großen Promotorbereich und einen Teil des ORFs von PYCl beinhaltete. Der 2822 bp große Bereich, des restlichen ORFs von PYCl gemeinsam mit dem 300 bp großen Terminatorbereich, wurde durch die Oligonukleotide PYCb for und PYCb rev amplifiziert. Für die vereinfachte Integration in den Expressionsvektor p64T wurden durch die Oligonukleotide PYCa for eine Pael und durch PYCb rev eine i?g/II-Schnittstelle angefügt, außerdem wurde die in dem ORF enthaltene Bglll Schnittstelle für die Vektorintegration und die Fusion der zwei Fragmente genutzt. Das 2442 bp große PYCa- Fragment (Promotorbereich mit einem Teil des FC-ORFs) wurde mit Pael und Bglll verdaut und in den ebenfalls mit Pael und Bglll verdauten p64T Vektor kloniert. Der entstandene p64PYCla Vektor wurde sequenziert. Die Sequenzierung des Plasmides des Klons T22 ergab einen fehlerfreien 7C7-ORF und für das Plasmid des Klons T97 wurde ein fehlerfreier Promotorbereich nachgewiesen. Ein fehlerfreier p64PYCla Vektor wurde durch die Integration des fehlerfreien aeI-i?amHI-Promotorbereiches aus p64PYCla von dem Klon T97 in den mit Pael und BamHl verdauten p64PYCla Vektor von dem Klon T22 erzielt. In den resultierenden p64PYCla Vektor wurde das i?g/II-PYCb-Fragment (Teil des FCi-ORFs und der Terminatorbereich) kloniert und anschließend sequenziert. Es wurde der Vektor p64PYCl erhalten, der eine fehlerfreie Expressionskassette (pPYCl-PYCl-PYClt) für die Überexpression des Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gens enthielt. Für die Transformation in die Y. lipolytica Stämme H222-S4 und H222-AK7 ( scs2) wurde dieser Vektor mit Sacll linearisiert. Die Integration der Expressionskassette in den erhaltenen Trans formanden H222-AK1 wurde mittels Southern Hybridisierung überprüft (Abb. 9). Für den Elternstamm H222-S4 wurde eine dem genomischen 7C7-ORF entsprechende Bande bei 8,9 kb nachgewiesen. Die zusätzlich detektierte Bande bei 6,2 kb in den Trans formanden diente als Nachweis für die Integration des multicopy Vektors p64PYC l . Diese Banden wiesen gegenüber der genomischen Bande des Vergleichsstammes H222-S4 eine verstärkte Intensität auf, wodurch eine mehrfache Integration der entsprechenden Expressionskassette bestätigt wurde. Die Transformanden H222-AK1-2, H222-AK1-5 und H222-AK1-7 wurden aufgrund ihrer hohen Vektorbandenintensitäten für weitere Untersuchungen ausgewählt. Der Gen-Do sis-Effekt auf die Pyruvatcarboxylase Aktivität wurde in den Stämmen H222-AK1-2, H222-AK1-5 und H222-AK1-7 untersucht.
Für die Bestimmung der PYC- Aktivität wurden alle ausgewählten Transformanden in 100 ml Minimalmedium mit 1 % Glucose kultiviert. Nach Ernte einer Probe der Kultur wurden die Hefezellen mittels Glasperlen aufgeschlossen. Die Bestimmung der PYC-Aktivität erfolgte im zellfreien Extrakt nach der Methode von van Urk et al. (1989). Die Zusammensetzung des Reaktionansatzes ist in folgender Tabelle aufgelistet. Die photometrische Messung erfolgte bei 340 nm.
Stammlösung Endkonzentration
Tris-
HC1, pH 1 M 100 mM
7,8
MgS04 100 mM 6,7 mM
Pyrazol 15 mM 1,5 mM
NADH 1,5 mM 0,15 mM
Acetyl- lO mM 90 μΜ
CoA
Pyruvat 100 mM lO mM
Malat-
6 U μΓ 6 U
DH
ATP 33 mM 3,3 mM
Die erhöhte Gen-Dosis des PYC kodierenden Gens zeigte einen positiven Effekt auf die spezifischen PYC- Aktivitäten der untersuchten Stämme. Die spezifischen Aktivitäten für die Transformanden H222-AK1 -2 und H222-AK1 -7 erreichten ein Maximum nach 6 h. Im Gegensatz dazu wurde für die Transformande H222-AK1-5 sowie für den Wildtyp H222 kein erkennbares Maximum der spezifischen Enzymaktivität nachgewiesen. Die Transformanden H222-AK1-2 und H222-AK1-7 zeigten mit 0,48 ± 0,04 U/mg und mit 0,51 ± 0,02 U/mg die höchste spezifische PYC Aktivitäten im Vergleich zu den weiteren untersuchten Stämmen, deren Enzymaktivitäten bei 0,42 ± 0, 1 U/mg (H222-AK1-5) und bei 0,16 ± 0,06 U/mg (H222) bestimmt wurden. Der Stamm H222-AK1-7 zeigte neben der höchsten spezifischen Aktivität ein mit dem Wildtyp vergleichbares Wachstum und wurde somit für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Diese Transformande H222-A 1-7 wird im Folgenden als Transformande H222-AK1 (= H222-AM3) bezeichnet.
Im Vergleich zum Wildtypstamm H222 zeigte der Stamm mit erhöhter PYC-Aktivität moderate Unterschiede hinsichtlich Wachstums- und Produktions verhalten. Der Wildtyp H222 produzierte maximal 3,3 ± 0,02 g L"1 Succinat mit einer durchschnittlichen Produktivität von 5 ,4 ± 0,6 mg L"1 h"1. F ü r H 2 2 2-AM3 konnten leicht erhöhte Succinatmengen von 4,1 ± 0,1 g L"1 detektiert werden.
5. Kombination von JETW-Deletion mit Überexpression von PYCl
Da sowohl Überexpression von PYCl als auch die Deletion von JEN 4 ausgehend von H222- AZ2 (mit SZ)H2-Promotoraustausch) zu einer gesteigerten Succinatproduktion führten, wurden Stämme für die Succinatproduktion konstruiert, in denen diese drei Modifikationen kombiniert enthalten sind.
Die Konstruktion dieses neuen Stamms (H222-AZ10) erfolgte ausgehend von H222-AZ7 ( JEN4). Dazu wurde in H222-AZ7 mittels FOA-Seletion eine Uracilauxotrophie eingeführt. Die Strategie ist in Fig. 7 dargestellt. FOA (5 '-Fluororotsäure) wird durch die Oritidin-5'- Phosphat-Decarboxylase, die durch URA3 kodiert wird, zu 5-Fluoruracil umgesetzt. 5- Fluoruracil ist toxisch für die Zelle. Daher können in Anwesenheit von FOA nur Zellen wachsen, in denen kein URA3 vorhanden ist bzw. in denen URA3 durch Rekombination der flankierenden TcR-Sequenzen entfernt wurde. Dazu wurden 103 Zellen von H222-AZ7 auf FOA- und uracilhaltigem Minimalmedium mit Glucose ausgestrichen und die erhaltenen Kolonien mittels Stempeltest auf Uracilauxotrophie überprüft. Der Verlust des URA3 wurde außerdem mittels PCR nachgewiesen. Aus den getesteten Kolonien wurde eine uracilauxotrophe ausgewählt (H222-AZ7U) und mit dem integrativen PYCl multicopy Vektor p64PYCl transformiert. Nach ein bis zwei Wochen wurden Transformanden isoliert, die mittels PCR auf die Integration des Vektors überprüft wurden. Alle getesteten Transformanden waren positiv. Aus diesen positiven Transformanden wurden 3 ausgewählt und hinsichtlich der PYC-Aktivität getestet. Dazu wurden diese 3 Transformanden sowie der Wildtyp in Minimalmedium mit Glucose kultiviert. Nach 4 Stunden wurde eine Probe für die Bestimmung der PYC-Aktivität genommen und die Aktivität der Pyruvatcarboxylase bestimmt.
Drei ausgewählte Transformanden wurden hinsichtlich der PYC-Aktivität und Succinatproduktion untersucht. Die Ergebnisse der Aktivitätsmessungen sind in Fig. 8 dargestellt. Alle Trans formanden zeigen eine im Vergleich zum Wildtyp zwei- bis dreifach gesteigerte PYC-Aktivität.
Die drei getesteten Transformanden wurden in YNB-Medium kultiviert, um die Auswirkungen auf die Succinatproduktion zu untersuchen.
In Fig. 9 sind Wachstums verhalten und Succinatproduktion von H222 (Wildtyp) und den neuen Transformanden H222-AZ 10 T l , T5 und T9 dargestellt. Als Vergleich wurden außerdem die Stämme H222-AZ7 TU und H222-AZ 8 T 3 mitg e führt . Die Durchschnittswerte aus allen durchgeführten Versuchen sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Succinat
Stämme Q
[g L 1] [mg L 1 h 1]
H222 3,0 ± 0,0 6,0 ± 0,1
AZ10 T1 16,8 ± 1,0 34,8 ± 3,1
AZ10 T5 17,7 ± 1,3 36,1 ± 3,4
AZ10 T9 18,3 ± 1,3 36,8 ± 4,4
AZ8 T3 19,3 ± 0,9 45,5 ± 2,7
AZ7 T11 13,2 ± 2,4 36,6 ± 10,5
Tabelle 5 : Durchschnittliche maximale Succinatgehalte, volumenspezifische Produktivitäten und biomassespezifische Produktbildungsraten der Stämme H222 (Wildtyp), H222-AZ10 Tl, T5, T9, H222-AZ8 T3 und H222-AZ7 TU . Kultivierung in Schüttelkolben bei 28°C, 220 rpm in 150 ml YNB-Medium mit 5% Glycerol als C-Quelle (+3% nach 168h) in zwei
Versuchsdurchläufen.
Zusätzlich zur Succinatproduktion wurde auch das Nebenproduktspektrum aus den organischen Säuren Malat, AKG und Fumarat betrachtet. Alle veränderten Stämme zeigten allerdings im Vergleich zum Wildtyp deutlich reduzierte Gehalte an Malat, AKG und Fumarat (Tab. 6).
-MAmax AKGmax FAmax
[g L 1] [g L 1] [g L 1]
H222 7,5 ± 2,1 2,0 ± 0,7 2,8 ± 0,2
AZ10 T1 3,2 ± 0,1 1,7 ± 0,1 1,7 ± 0,1
AZ10 T5 1,3 ± 0,0 1,3 ± 0,2 1,3 ± 0,1
AZ10 T9 1,5 ± 0,0 1,2 ± 0,0 1,3 ± 0,1
Tabelle 6: Maximal gebildete Produktmengen der organischen Säuren Malat (MA), α-Ketoglutarat (AKG) und Fumarat (FA) bei Kultivierung der Stämme Y. lipolytica H222, H222- AZ 10 T 1 , T5 und T9 in YNB-Medium. Kultivierung in YNB-Medium mit 5 %
Glycerol als C-Quelle.
6. Deletion von MAE1
In ähnlicher Weise wie oben beschrieben wurde in Yarrowia lipolytica das Gen des Carboxylat-Transporter Mael deletiert. Die verwendeten Deletionskassetten und Plasmide finden sich in der eingangs gezeigten Tabelle. Im Deletionsstamm H222-SW2AMAE1 erfolgte die Deletion des SpMAEl -homologen Gens MAE1, codierend für einen putativen Dicarboxylat-Transporter. Bei den Kultivierungen der H222-SW2AMAE1 -Transformanden 3, 7 und 8 wurden die akkumulierten organischen Säuren α-Ketoglutarat, Fumarat, Malat, Pyruvat und Succinat im Vergleich zum Ausgangsstamm H222 untersucht. Ergänzend erfolgte weiterhin während der Kultivierung die Bestimmung gebildeter Biotrockemassen. Die gebildete Biotrockenmasse der ΔΜΑΕ1 -Transformanden bei Kultivierung in 10 % Glycerol war im Vergleich zum Referenzstamm H222 um 40 % geringer, zeigte aber im Vergleich der Transformanden untereinander kaum Unterschiede. Dieser deutliche Unterschied im Wachstum kann aus einer reduzierten Aufnahme der Tricarbonsäurezyklus- Intermediate α-Ketoglutarat, Fumarat, Malat und Succinat resultieren, welche Edukte vieler Biosynthesen, wie etwa für Amino- oder Fettsäuren darstellen. Bei Betrachtung der Säureproduktion wiesen alle Transformanten eine Erhöhung der Produktion der untersuchten organischen Säuren α-Ketoglutarat, Fumarat, Malat und Succinat auf. Durchschnittlich wurden dabei maximal 30 % mehr AKG, Fumarat und Succinat, sowie 40 % mehr Malat (TF7 nur 10 %) gebildet. Die Resultate finden sich in Tabelle 7. Dargestellt sind die Mittelwerte der maximale Mengen an Malat-, Succinat-, α-Ketoglutarat und Fumarat der Transformanden 3, 7, 8 von H222-SW2AMAE1 verglichen mit Referenzstamm H222 bei Kultivierung in Produktionsmedium nach Tabuchi et al. ( 1 98 1 ) . SA ΔΜΑΕ 1 = Standardabweichung der Maximalwerte der 3 Trans formanden:
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Claims

Patentansprüche
1. Pilzstamm, aufweisend mindestens eine genetische Modifikation die zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt.
2. Pilzstamm gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Pilz eine erhöhte extrazelluläre Carbonsäureproduktion aufweist.
3. Verfahren zur genetischen Modifikation eines Pilzstamms zwecks Erhöhung der extrazellulären Carbonsäureproduktion, wobei besagtes Verfahren zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt.
4. Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Verminderung der Aktivität des Carbonsäure-Transporters erreicht wird durch mindestens eine Eigenschaft bzw. einen Schritt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: a) Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens codierend für einen Carbonsäure-Transporter
b) Expression eines dysfunktionalen oder vermindert aktiven Carbonsäure- Transporters
c) Inhibierung oder Verminderung der Aktivität des exprimierten Carbonsäure- Transporters bewerkstelligt ist bzw. wird.
5. Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagtem Pilzstamm um ein Mitglied der Gruppe der Schlauchpilze (Ascomycota) handelt.
6. Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei besagter Pilzstamm einer Gattung zugehört, die ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Saccharomyces; Schizosaccharomyces; Wickerhamia; Debayomyces; Hansenula; Hanseniospora; Pichia; Kloeckera; Candida; Zygosaccharomyces; Ogataea; Kuraishia; Komagataella; Yarrowia; Metschnikowia; Williopsis; Nakazawaea; Kluyveromyces; Cryptococcus; Torulaspora; Torulopsis; Bullera; Rhodotorula; Sporobolomyces; Pseudozyma; Saccharomycopsis; Saccharomycodes; Aspergillus; Penicillium; Rhizopus; Trichosporon und/oder Trichoderma.
7. Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei der mindestens eine Carbonsäure-Transporter aus der Gruppe der Jen-Transporter und/oder der Mae-Transporter entstammt.
8. Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei besagter Pilzstamm mindestens eine weitere genetische Modifikation ausgewählt aus der Gruppe enthaltend
• Reduktion der Aktivität bzw. Expression der Succinatdehydrogenase (SDH), beispielsweise durch Austausch des nativen Promotors von SDH2 gegen einen induzierbaren Promotor, beispielsweise pPOTl oder durch Verwendung einer geeigneten Deletionskassette,
• Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Pyruvatcarboxylase (PYC), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens PYC1, und/oder
• Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Isocitratlyase (ICL), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens ICL1 aufweist.
9. Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei besagter Pilzstammstamm der Art Yarrowia lipolytica zugehört.
10. Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren, wobei in dem Verfahren ein Pilzstamm gemäß einem der vorherigen Ansprüche verwendet wird.
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