DE102011056297A1

DE102011056297A1 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Dicarbonsäuren

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Publication number: DE102011056297A1
Application number: DE102011056297A
Authority: DE
Inventors: Dr.-Ing. Aurich Andreas; Benjamin Jost; Steffi Hunger; Andreas Zehnsdorf; Roland Arno Müller; Martina Holz; Prof. Dr. Barth Gerold; Waengler Isabel
Original assignee: ThyssenKrupp Uhde GmbH
Current assignee: ThyssenKrupp Industrial Solutions AG
Priority date: 2011-12-12
Filing date: 2011-12-12
Publication date: 2013-06-13

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur biotechnologischen Herstellung von organischen Säuren durch Pilzstämme. Die mikrobiellen Pilze werden in einem Medium kultiviert, und wobei ferner die Sauerstoffaufnahmerate OUR auf einen Bereich zwischen ≥ 5 und ≤ 50 mmol O2/l·h eingeregelt wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Dicarbonsäuren.
GEBIET DER ERFINDUNG
C4-Dicarbonsäuren wie Malat oder Succinat, welche im Tricarbonsäurezyklus von Bakterien, Hefen und filamentösen Pilzen, aber auch anderen Lebewesen gebildet werden, besitzen ein herausragendes Potential für industrielle Anwendungen (z.B. Building Blocks, Lebensmittelzusatz). Dementsprechend hoch sind die aktuellen Bemühungen bestehendechemische Herstellungsverfahren für diese Säuren, welche gegenwärtig auf der Nutzung petrochemischer Grundstoffe beruhen, durch mikrobielle Herstellungsverfahren unter Nutzung nachwachsender Rohstoffe oder Abprodukte zu ersetzen.
Biotechnische Verfahren für die Herstellung von Succinat (Bernsteinsäure) mit Bakterien (z.B. Actinobacillus succinigenes, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Escherichia coli) sind vielfältig beschrieben und gut etabliert. Unter Nutzung von filamentösen Pilzen (z.B. Rhizopus arrhizus, Aspergillus flavus) kann L-Malat (Äpfelsäure) in Bioprozessen hergestellt werden.
Im Gegensatz dazu ist der Einsatz von Hefen, welche verfahrenstechnische Vorteile wie hohe Robustheit der Zellen und Vielfalt utilisierbarer Substrate besitzen, für die Gewinnung von C4-Dicarbonsäuren relativ gering entwickelt. Hefen wie Yarrowia lipolytica oder Candida tropicalis sind befähigt, Citronensäure, Isocitronensäure, α-Ketoglutarsäure u.a. Säuren des Tricarbonsäurezyklus in Produktkonzentrationen von 100–190 g/l zu produzieren. Die bestehenden Verfahren für C4-Dicarbonsäuren (Malat, Succinat) mit Hefen sind dagegen durch relativ geringe Produktkonzentrationen, Produktivitäten und Selektivitäten gekennzeichnet.
Vorteilhafter Weise verfügen Hefen über Transportersysteme zum Ausschleusen von organischen Säuren wie Malat. Dies erfolgt in einigen Gattungen beispielsweise über einen Protonensymport, der neben Malat auch Succinat, Fumarat, Oxalacetat, und a-Ketoglutarat akzeptiert. Andere Gattungen verfügen über geeignete Transportproteine zum Ausschleusen organischer Säuren.
Intensive Bemühungen liegen für die letzten Jahre zur mikrobiellen Gewinnung von L-Malat mit Hefen vor. Mit der osmotoleranten Hefeart Zygosaccharomyces rouxii wurden Produktkonzentrationen bis 75 g/l Malat bei einer Produktivität von 0,54 g/l·h unter Einsatz von Glucose erzielt (Taing & Taing, 2007). Der Anteil an Nebenprodukten umfasste dabei 5,5 g/l Succinat.
Stämme der Hefeart Saccharomyces cerevisiae wurden genetisch modifiziert (Überexpression PYC2-, MDH3-Gen, Malattransporter-Gen SpMAE1) für die erhöhte Akkumulation von Malat (Zelle et al., 2008). Unter Einsatz von Glucose wurden dabei max. 59 g/l L-Malat bei einer Produktivität von 0,19 g/l·h erzielt.
Die Produktion von Succinat mit gentechnisch veränderten Stämmen der Hefeart Y. lipolytica wird in einer Patentanmeldung von Ajinomoto ( WO2010087503 A1 ) beschrieben. Dabei werden mit Glycerol als Substrat bis 28 g/l Succinat erzielt. Durch den hohen Nebenproduktanteil an α-Ketoglutarat, Pyruvat, Acetat und Citrat werden Selektivitäten für Succinat von max. 76% erreicht. In einer Publikation einer russischen Arbeitsgruppe (Yuzbashev et al., 2010), in welcher die Stämme der obigen Patentschrift WO2010087503 A1 (Y. lipolytica Y-3312, Y-3314) verwendet werden, konnten nach 7 Tagen aerober Kultivierung max. 45 g/l Succinat mit Glycerol gewonnen werden. Angaben über Nebenprodukte erfolgten nicht.
Durch umfangreiche genetische Modifizierungen (z.B. DIC-, IDH1-, SDH2-Gen) wird in der deutschen Offenlegungsschrift DE102007019184 die Succinat-Produktion mit Saccharomyces cerevisiae ermöglicht. Angaben zu Produktkonzentrationen erfolgen nicht. Von der gleichen Arbeitsgruppe (Raab et al., 2010) wird eine geringe Produktkonzentration von 3,6 g/l Succinat mit Glucose unter Einsatz eines S. cerevisiae-Stammes mit Deletion der Gene SDH1, SDH2, IDH1 und IDP1 berichtet.
Die Beeinflussung der mikrobiellen Produktion organischer Säuren durch Variation der Gelöstsauerstoffkonzentration DOC (Dissolved Oxygen Concentration), der Sauerstofftransferrate OTR (Oxygen Transfer Rate) oder der Sauerstoffaufnahmerate OUR (Oxygen Uptake Rate) während der Kultivierung wird in der Literatur mehrfach diskutiert.
Hefebasierte Produktionsverfahren werden im Regelfall unter Aufrechterhaltung einer für Wachstum und Produktbildung optimalen Gelöstsauerstoffkonzentration DOC durchgeführt. Zustände einer Sauerstofflimitation (Begrenzung der Sauerstoffaufnahmerate OUR der Zellen) während der Kultivierung sind dabei gewöhnlich zu vermeiden, da diese häufig mit einer Herabsetzung der Wachstums- und Produktbildungsraten verbunden sind.
Für die Gewinnung ausgewählter organischer Säuren des Tricarbonsäurezyklus mit der Hefeart Y. lipolytica wird die Konstanthaltung der Gelöstsauerstoffkonzentration DOC wie folgt empfohlen: für Citronensäure ein DOC = 50–55% und für α-Ketoglutarsäure ein DOC = 5–8% als optimale Bereiche bei Verwendung von Ethanol (Ilchenko et al., 2001; Chernyavskaya et al., 2000). Ein DOC von 40–50% wird für die optimale Produktion von Citrat mit n-Paraffinen und Y. lipolytica angegeben (Marchal et al.; 1977; Stottmeister et al., 1981).
Eine Verschiebung des Produktmusters von Isocitrat zu Citrat durch die Erhöhung der Gelöstsauerstoffkonzentration DOC von 10% auf 60% wird für die Kultivierung von Candida tropicalis mit Glucose beschrieben (Okoshi et al., 1987). Durch die Erhöhung des DOC kann der Isocitratgehalt von ~9 g/l auf nahezu null gesenkt werden.

Ein Zusammenhang zwischen der Gelöstsauerstoffkonzentration DOC und der Sauerstoffaufnahmerate OUR wird bei Produktion von Citrat mit dem Stamm Y. lipolytica Y1095 unter Einsatz von n-Paraffinen dargestellt (Rane & Sims, 1993). Eine Erhöhung des DOC von 20 auf 80% führt zu einer Erhöhung der spezifischen Sauerstoffaufnahmerate qO₂ von 3,4 mg O₂/g Biomasse·h auf 8,8 mg/g·h und spezifischen Produktbildungsrate q_CS für Citrat von 17 mg Citrat/g Biomasse·h auf 29 g/g·h. Angaben über eine etwaige Verschiebung des Produktmusters erfolgten dabei nicht. In der folgenden Tabelle sind die aus dem Stand der Technik bekannten Sauerstoffregimes bei der hefebasierten Produktion von organischen Säuren zusammengefasst.

Quelle	Organismus	Substrat	Produkt	Regulierte Größe
Ilchenko et al 2001, Chernyavskaya et al, 2000	Y. lipolytica	Ethanol	Citrata	DOC*	50–55 %
Ilchenko et al 2001, Chernyavskaya et al, 2000	Y. lipolytica	Ethanol	α-Ketoglutarat	DOC	5–8 %
Marchal et al. 1977; Stottmeister et al., 1981	Y. lipolytica	Paraffin	Citrat	DOC	40–50 %
Okoshi et al., 1987	Candida tropicalis	Glucose	Citrat, Minimierung Isocitrat-Bildung	DOC	60%
Rane & Sims, 1993	Y. lipolytica Y1095	Glucose	Citrat	DOC	20–80%
Wiebe et al 2008	S. cerevisiae	Glucoselimitiert	Intrazelluläres Succinat, Citrat bzw. Fumarat	qO2***	0 mmol O₂/g Biomasse·h

***qO₂ = spezifische Sauerstoffaufnahmerate
**OUR = Sauerstoffaufnahmerate
*DOC = Gelöstsauerstoffkonzentration

Tabelle 1: Aus dem Stand der Technik bekannte Sauerstoffregimes bei der Hefebasierten Produktion von organischen Säuren
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, hefebasierte biotechnologische Verfahren zur Gewinnung von organischen Säuren, insbesondere C4-Dicarbonsäuren des Tricarbonsäurezyklus bereitzustellen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren bzw. einem Fermenter gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Die Unteransprüche geben bevorzugte Ausführungsformen an.
Demnach ist ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von organischen Säuren durch Pilzstämme vorgesehen, wobei die Pilzstämme in einem Medium kultiviert werden. Die Sauerstoffaufnahmerate OUR wird dabei auf einen Bereich zwischen ≥ 5 und ≤ 50 mmol O₂/l·h eingeregelt.
Der Begriff "organische Säuren", wie hier verwendet, ist identisch mit dem Begriff "Carbonsäuren" und bezieht sich auf all jene Stoffwechselprodukte der besagten Pilze, die als Carbonsäuren bezeichnet werden können. Bevorzugt bezeichnet der Begriff die Carbonsäuren des Citratcyklus und benachbarter Stoffwechselwege, insbesondere Pyruvat, a-Ketoglutarat, Malat, Oxalacetat, Citrat, Isocitrat, Fumarat, Malonat, Lactat und/oder Succinat. Bei den meisten dieser Säuren handelt es sich um Dicarbonsäuren.
Bevorzugt wird die Sauerstoffaufnahmerate auf einen Bereich zwischen ≥ 10 und ≤ 40 mmol O₂/l·h eingeregelt. Besonders bevorzugt wird die Sauerstoffaufnahmerate auf einen Bereich zwischen ≥ 20 und ≤ 30 mmol O₂/l·h eingeregelt. Äußerst bevorzugt wird die Sauerstoffaufnahmerate auf einen Bereich zwischen 25 ± 3 mmol O₂/l·h eingeregelt.
Technisch kann in einem Fermenter der Sauerstoffeintrag OTR durch die Luftbegasungsrate (l min^–1), die Rührerdrehzahl (U min^–1), die Druckbeaufschlagung des Fermenters und die Gaszusammensetzung (Anteil O₂ im Gasgemisch) beeinflusst werden. Die Sauerstoffaufnahmerate OUR kann anhand der bekannten eingetragenen Gaszusammensetzung sowie der Gasmenge und der Messung der Sauerstoffkonzentration im Abgas mit Hilfe allgemein bekannter Gleichungen bestimmt werden.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass die mikrobiellen Pilze in einem Submersmedium kultiviert werden. Die Kultivierung erfolgt stammspezifisch bei einem pH-Wert von ≥ 2,0 bis ≤ 8,0 und einer Temperatur von ≥ 20 bis ≤ 40°C, vorzugsweise bei einem pH-Wert von ≥ 3,0 bis ≤ 5,0 sowie einer Temperatur von ≥ 26 bis ≤ 33°C.
Die Regulierung des pH-Wertes im für das Wachstum und die Produktbildung geeigneten Bereich erfolgt bevorzugt mit Substanzen wie CaCO₃, KOH, NaOH, NaHCO₃, NH₄OH, (NH₄)₂CO₃, NH₄HCO₃ und Gemischen dieser Substanzen.
Bei besagtem Pilzstamm handelt es sich bevorzugt um einen Stamm Mikrobieller Pilze.
Der Begriff "mikrobieller Pilz", wie hier verwendet, soll solche Pilze umfassen, die mit biotechnologischen Methoden kultiviert werden können und sich insbesondere für fermentative Produktionsverfahren eignen, beispielsweise in Suspensionskulturen.
Bevorzugt ist weiterhin vorgesehen, dass es sich bei besagten Pilzstämmen um Mitglieder der Gruppe der Schlauchpilze (Ascomycota) handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um ein Mitglied der Gruppe der Hemiascomycetes oder der Euascomycetes.
Ferner ist bevorzugt vorgesehen, dass es sich bei besagten Pilzstämmen um Hefen oder Schimmelpilze handelt.
Besonders bevorzugt gehören besagte Pilze mindestens einer Gattung zu, die ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Saccharomyces; Schizosaccharomyces; Wickerhamia; Debayomyces; Hansenula; Hanseniospora; Pichia; Kloeckera; Candida; Zygosaccharomyces; Ogataea; Kuraishia; Komagataella (= Pichia); Yarrowia; Metschnikowia; Williopsis; Nakazawaea; Kluyveromyces; Cryptococcus; Torulaspora; Torulopsis; Bullera; Rhodotorula; Sporobolomyces; Pseudozyma; Saccharomycopsis; Saccharomycodes; Aspergillus; Penicillium; Rhizopus; Trichosporon und/oder Trichoderma.
Bevorzugt ist weiterhin vorgesehen, dass es sich bei den zu produzierenden organischen Säuren um C4-Dicarbonsäuren handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den zu produzierenden organischen Säuren um L-Malat und/oder Succinat.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei den besagten Pilzstämmen um Stämme der Gattung Yarrowia, bevorzugt der Hefeart Yarrowia lipolytica. Hefen der Gattung Yarrowia sind in der Lage, eine Vielzahl von Substraten zu verwerten, darunter Kohlenhydrate, n-Paraffine, Alkohole sowie Triglyceride.
Äußerst bevorzugt handelt es sich bei den besagten Pilzstämmen um mindestens einen Hefestamm ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Yarrowia lipolytica H222 (Wildtyp), Yarrowia lipolytica H222-AZ7 T23 (pPOT1-SDH2 ΔJEN4 URA3), Yarrowia lipolytica H222-AZ9 T3 (pPOT1-SDH2 mcPYC1 mcICL1 ura3d4) und/oder Yarrowia lipolytica H222-AZ10 T5 (pPOT1-SDH2 ΔJEN4 URA3 mcPYC1 ura3d4).
Diese Pilzstämme sowie deren Erzeugung sind in der parallel eingereichten Patentanmeldung DE102011056290 desselben Anmelders bzw. den Anmeldungen, die die Priorität derselben beanspruchen, beschrieben.
Bevorzugt ist weiterhin vorgesehen, dass besagte Pilzstämme mindestens eine genetische Modifikation aufweisen, die zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt.
Ferner ist bevorzugt weiterhin vorgesehen, dass die Verminderung der Aktivität des Carbonsäure-Transporters erreicht wird durch mindestens eine Eigenschaft bzw. einen Schritt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend:

a) Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens codierend für einen Carbonsäure-Transporter
b) Expression eines dysfunktionalen oder vermindert aktiven Carbonsäure-Transporters
c) Inhibierung oder Verminderung der Aktivität des exprimierten Carbonsäure-Transporters

Die Inhibierung oder Verminderung der Expression kann beispielsweise durch Inhibierung oder Verminderung der Transkription des codierenden Gens oder der Translation der generierten mRNA erfolgen. Die Expression eines dysfunktionalen oder vermindert aktiven Carbonsäure-Transporters kann beispielsweise durch Deletion, Insertion, Substitution oder Punktmutation in dem codierenden Gen bewerkstelligt werden.
Hierzu kommen beispielsweise Gen-Silencing, Gen-Knockout, oder ortsspezifische Mutagenese in Frage. Alternativ kann die Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens durch Einklonierung eines heterologen Promotors erfolgen, der durch einen Exogenen Faktor hemmbar ist, beispielsweise einen Tetracyclin-regulierten tetO-Promotor. Ebenso kann die Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens durch Einklonierung eines heterologen Promotors erfolgen, der schwächer ist als der betreffende homologe Promotor, beispielsweise pPOT. Die Inhibierung oder Verminderung der Aktivität des exprimierten Carbonsäure-Transporters kann beispielsweise durch Gabe von Inhibitoren oder synchrone Expression von geeigneten, heterologen Inhibitoren erfolgen.
Die erwähnten Verfahren sind in der parallel eingereichten Patentanmeldung DE102011056290 desselben Anmelders bzw. den Anmeldungen, die die Priorität derselben beanspruchen, beschrieben.
Bevorzugt ist ferner vorgesehen, dass der mindestens eine Carbonsäure-Transporter aus der Gruppe der Jen-Transporter und/oder der Mae-Transporter entstammt.
Für Klyveromyces lactis und Schizosaccharomyces pombe wurden bereits Dicarboxylatpermeasen beschrieben, die den Transport von Succinat/Malat/Fumarat (KlJen2p) bzw. Lactat/Pyruvat (KLJen1p) sowie den Transport von Succinat/Malat/Malonat (SpMae1p) vermitteln. Die beiden erstgenannten gehören zur Gruppe der JEN-Transporter, während letztgenannte der Gruppe der MAE-Transporter zugehören.

Bislang wurden 35 Proteine, die durch putative Orthologe der K. lactis Gene KlJEN1 und KlJEN2 kodiert wurden, in 17 verschiedenen Pilzarten (13 Hemiascomyceten, 7 Euascomyceten) gefunden. Dabei variiert die Anzahl an JEN-Orthologen von einem (z. B. S. cerevisiae) bis zu 6 orthologen Genen in Y. lipolytica. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die Gruppe der JEN-Transporter, sowie, in den letzten Zeilen, über die bekannten MAE-Transporter:

Typ	Art	Arbeitsname	EMBL	Swiss-Prot	Länge (aa)	Anzahl der Transmembran domänen
JEN	K. lactis	KLLA-E-KLJEN1	AJ585426	Q70DJ7	600	12
		KLLA-F-KLJEN2	AJ627630	Q701Q9	528	11
	Sac. cerevisiae	SACE-K-JEN1	U24155	P36035	616	12
	Sac. paradoxus	SAPA-X1-J101			616	12
	Sac. mikatae	SAMI-X1-J101			616	12
	Sac. kudriavzevii	SAKU-X1-J101			614	10
	Sac. bayanus	SABA-X1-J101			615	12
	K. thermotolerans	KLTH-G-J201			542	11
	K. waltii	KLWA-X1-J201			534	11
	Sac. kluyveri	SAKL-X1-J101			598	10
		SAKL-X2-J201			523	11
		SAKL-X3-J001			531	11
	A. gossypii	ASGO-A-J001	AAS50559	Q75E88	500	10
		ASGO-B-J201	AAS50561	Q75E76	478	9
		ASGO-F-J101	AAS53704	Q753H9	500	9
	D. hansenii	DEHA-D-J202	CAG87482	Q6BR62	511	10
		DEHA-F-J101	CAG89500	Q6BL03	513	12
		DEHA-F-J201	CAG89946	Q6BJV3	506	12
	C. albicans	CAAL-D-J001	EAK98054	Q5A5U2	513	10
		CAAL-C-J101	EAK97104	Q5A2W4	541	10
	Y. lipolytica	YALI-B-J101	CAG83351	Q6CE14	529	10
		YALI-C-J102	CAG82184	Q6CBU1	499	10
		YALI-C-J201	CAG82410	Q6CB72	523	10
		YALI-D-J204	CAG81250	Q6C8F4	502	10
		YALI-D-J202	CAG81440	Q6C7X3	503	10
		YALI-E-J203	CAG80310	Q6C3Q6	524	10
	N. crassa	NECR-X1-J201	EAA33605	Q7SB47	557	11
		NECR-X2-J202	EAA32361	Q9P732	518	9
	A. fumigatus	ASFU-G-J202	EAL86916	Q4WGM5	501	11
		ASFU-H-J001	EAL85090	Q4WB22	520	10
		ASFU-B-J201	EAL93241	Q4X1M4	511	9
	A. nidulans	ASNI-A-J201			495	10
		ASNI-A-J202			514	11
	A. oryzae	ASOR-A-J201			508	11
		ASOR-G-J202			512	10
MAE	S. pombe	n/a	n/a	P50537	438	10
MAE	Y. lipolytica	n/a	n/a	n/a

Tabelle 2: Bekannte Carbonsäure-Transporter aus der Gruppe der JEN- bzw. MAE-Transporter in mikrobiellen Pilzstämmen. A = Aspergillus; Sac = Saccharomyces; N = Neurospora; Y = Yarrowia; C = Candida; D = Dabaromyces und K = Klyveromyces

Bevorzugt ist dabei vorgesehen, dass der mindestens eine Carbonsäure-Transporter aus der in der folgenden Tabelle aufgeführten Gruppe der JEN-Transporter und/oder der MAE-Transporter entstammt.

Organismus	Zugehörig zur Dicarboxylatpermeasen-Gruppe:	Arbeitsname	Aliasname
Y. lipolytica	KlJEN1	YALI-B-J101	JEN2
	KlJEN1	YALI-C-J102	JEN1
	KlJEN2	YALI-C-J201	JEN6
	KlJEN2	YALI-D-J204	JEN4
	KlJEN2	YALI-D-J202	JEN3
	KlJEN2	YALI-E-J203	JEN5
Schizosaccharomyces pombe	SpMae1		SPMAE1
Y. lipolytica	SpMae1		MAE1

Tabelle 1: Übersicht über auisgewählte JEN- und MAE-Transporter.

Experimentell wurde das betreffende Gen mittels einer in einem Vektor integrierten Deletionskassette deletiert. Die betreffenden Verfahren sind in der parallel eingereichten Patentanmeldung DE102011056290 desselben Anmelders bzw. den Anmeldungen, die die Priorität derselben beanspruchen, beschrieben.
Besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass der mindestens eine Carbonsäure-Transporter durch das Gen YALI-D-J204 (EMBL-ID: CAG81250; Swiss-Prot ID: Q6C8F4) codiert ist. Besagtes Gen wird im Rahmen dieser Anmeldung stets auch als „JEN4“ bezeichnet. Ebenso ist besonders bevorzugt vorgesehen, dass besagter Pilz der Gattung Yarrowia, besonders bevorzugt der Art Yarrowia lipolytica zugehört.
Wie oben gezeigt, weist die Y. lipolytica insgesamt 6 JEN-Orthologen auf. Diese hohe Anzahl an Genen für putative Carboxylattransporter spiegelt das große Potenzial der Hefe Y. lipolytica für die Produktion von organischen Säuren, wie z. B. Succinat, Malat oder Fumarat, wider. Außerdem ist Y. lipolytica umfangreich genetisch und physiologisch charakterisiert, kann ein breites Spektrum an Substraten verwerten und ist tolerant gegenüber niedrigen pH-Werten.
Ferner ist bevorzugt vorgesehen, dass besagter Pilz mindestens eine weitere genetische Modifikation ausgewählt aus der Gruppe enthaltend:

– Reduktion der Aktivität bzw. Expression der Succinatdehydrogenase (SDH), beispielsweise durch Austausch des nativen Promotors von SDH2 gegen einen schwachen Promotor, beispielsweise pPOT, oder durch Verwendung einer geeigneten Deletionskassette,
– Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Pyruvatcarboxylase (PYC), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens PYC1, und/oder
– Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Isocitratlyase (ICL), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens ICL1

All diese genetischen Modifikationen stehen im Zusammenhang mit der Bildung von Carbonsäuren im Rahmen des Citratzyklus. Die genannten Modifikationen sind im Methodenteil ausführlich beschrieben.
Weitere in Frage kommende genetische Modifikationen, die in Kombination mit den genannten Modifikationen verwendet werden können, betreffen eine Reduktion der Aktivität bzw. Expression der Gene SDH1, SDH3 und/oder SDH4, das Einbringen eines heterologen Gens ausgewählt aus der Gruppe codierend für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PCK1), Fumarat Reduktase und/oder Fumarase (FUM1), und/oder die Reduktion der Aktivität bzw. Expression des Gens codierend für Isocitrat-Dehydrogenase (IDH1) sowie mindestens eines der Gene codierend für den Mitochondrialen Dicarboxylat-Carrier (DIC1) und/oder SDH2, und optional mindestens eines der Gene FUM1, (Osmotic growth Protein (OSM1), Malat Dehydrogenase,(MDH3) und/oder Citrat Synthase (CIT2). Die Reduktion der Expression kann beispielsweise durch einen heterologen Promotor erfolgen, der durch einen Exogenen Faktor hemmbar ist, bevorzugt einen Tetracyclin-regulierten tetO-Promotor. Alternative Methoden (Gene Silencing, Gene Knock out, Deletion) sind weiter oben dargestellt

Die genannten Gene sind in der folgenden Tabelle identifiziert, dabei wurden als Beispiel die UniProt-Einträge für Saccharomyces cerevisiae gewählt. Es versteht sich, dass der Fachmann anhand dieser Angaben die korrespondierenden Gene in anderen Pilzstämmen, insbesondere in Yarrowia, ohne weiteres finden kann.

Name	Abkürzung	UniProt
Succinat Dehydrogenase Komplex, subunit	SDH2 bzw. SDHB	P21801
Succinat Dehydrogenase Komplex, subunit	SDH1 bzw SDHA	Q00711
Succinat Dehydrogenase Komplex, subunit b	SDH3 bzw CYB3	P33421
Succinat Dehydrogenase Komplex, small subunit b	SDH4 bzw ACN18	P37298
Pyruvatcarboxylase	PYC1	P11154
Isocitratlyase	ICL1	P28240
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase	PCK1	P10963
Fumarat Reduktase, subunit A
Fumarat Reduktase, subunit C
Fumarat Reduktase, subunit D
Fumarase	FUM1	P08417
Isocitrat-Dehydrogenase	IDH1	P28834
Mitochondrialer Dicarboxylat-Carrier	DIC1	Q06143
Osmotic growth Protein	OSM1	P21375
Malat Dehydrogenase	MDH3	P32419
Citrat Synthase	CIT2	P08679

Tabelle 2: Weitere in Frage kommende genetische Modifikationen.

Die Pilzstämme werden ferner unter aeroben Bedingungen in üblichen, bekannten synthetischen, halbsynthetischen oder komplexen Nährmedien für die Ausscheidung von organischen Säuren kultiviert.
Bevorzugt werden als Substrat für die Pilzstämme folgende Substanzen eingesetzt: Glucose, Fructose, Saccharose, Essigsäure, Ethanol, Glycerol, Raps-, Soja- und Sonnenblumenöl oder Gemische dieser Substanzen. Diese werden dem Kulturmedium nach bekannten Kultivierungsregimes entweder bereits zu Beginn der Kultivierung (Batch-Betrieb) vollständig zugeführt oder es erfolgt zu bestimmten Zeitpunkten eine Nachdosierung des Substrates (Fed-Batch). Semikontinuierliche (Repeated Fed-batch) und kontinuierliche Verfahren sind ebenfalls durchführbar.
Besonders bevorzugt ist weiterhin vorgesehen, dass als Substrat für die mikrobiellen Pilze Glycerol verwendet wird. Der Begriff Glycerol umfasst alle verfügbaren Formen von Glycerol, z.B. Pharma-, Rohglycerol oder Glycerolwasser. Insbesondere Rohglycerol ist ein preiswertes Abprodukt. Seine Verwendung erhöht so die Wirtschaftlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu bekannten Verfahren erheblich, insbesondere deswegen, weil erfindungsgemäß mit dem Einsatz von Rohglycerol als Substrat die höchsten Produktkonzentrationen für mikrobielle Succinat- und L-Malat-Produktionsprozesse mit Bakterien, Hefen und Pilzen gezeigt werden konnten (siehe Beispiele unten).
Ferner ist bevorzugt vorgesehen, dass die Pilze in einer Batch-, einer Fed-Batch-, einer Repeated Fed-batch- oder kontinuierlichen Kultur kultiviert werden.
Dabei kann vorgesehen sein, dass für die Kultivierung der Sauerstoffeintrag OTR in den Bioreaktor durch Fixierung der Dispergierung (Rührerdrehzahl) und Luftbegasungsrate und Druckbeaufschlagung so eingestellt wird, dass die maximale Sauerstoffaufnahmerate OUR im erfindungsgemäßen Bereich liegt.
Die Kultivierung beginnt im Regelfall mit einer Wachstumsphase, welche nach 12 bis 48 h in eine parallele Wachstums- und Produktbildungsphase übergeht. Diese parallele Phase ist durch ein verringertes Wachstum gekennzeichnet. Die Kultivierung wird fortgesetzt, bis die Produktbildung durch Substratauszehrung zum Erliegen kommt. Gewöhnlich wird sie jedoch zu einem ökonomisch sinnvollen Zeitpunkt hinsichtlich der Produktkonzentration und Produktivität abgebrochen.
Bevorzugt ist weiterhin vorgesehen, dass das Verfahren

– eine Produktkonzentration von ≤ 90 g/l Succinat
– eine Succinatbezogene Selektivität von ≤ 93 %, und/oder
– eine Produktkonzentration von ≤ 25 g/l L-Malat

Erfindungsgemäß ist ferner eine Vorrichtung zur biotechnologischen Herstellung von organischen Säuren durch mikrobielle Pilze vorgesehen, wobei die Vorrichtung Mittel zur Kultivierung der mikrobiellen Pilze in einem Medium aufweist, und wobei die Vorrichtung ferner Mittel aufweist, die es ermöglichen, die Sauerstoffaufnahmerate OUR auf einen Bereich zwischen ≥ 5 und ≤ 50 mmol O₂/l·h einzuregeln.
Der Sauerstoffaufnahmerate OUR wird über einen spezifischen Gaseintrag und den Sauerstoffanteil im Abgas (Online-Abgasanalye) prozessbegleitend berechnet und kann als Steuerparameter genutzt werden. Dieser kann die Parameter Rührer, Luftflow, Gasmix oder Druck regeln und den Sauerstoffübergang bzw. die Sauerstoffkonzentration im Fermentationsmedium beeinflussen.
Es versteht sich, dass die in Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren oben geschilderten Merkmale und Rückfallpositionen auch in Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung als offenbart gelten sollen.
Experimente
Die vorliegende Erfindung wird durch die im Folgenden diskutierten Experimente genauer erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Figuren nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken.
BEISPIEL 1
Der gentechnisch modifizierte Stamm Yarrowia lipolytica H222-AZ9 T3 (pPOT1-SDH2 mcPYC1 mcICL1 ura3d4), welcher neben dem Austausch des SDH2- gegen den POT1-Promoter, zusätzlich eine Überexpression der Gene der PYC1-Pyruvarcarboxylase und ICL1-Isocitratlyase besitzt, wurde auf YPD-Agar folgender Zusammensetzung für 24 bis 48 Stunden bei 28°C kultiviert:

Hefeextrakt 10 g/l

Pepton 20 g/l

Glucose 20 g/l

Agar 20 g/l

Von der gewachsenen Agarkultur wurden als Vorkultur 2 bis 3 Impfösen auf 100 ml sterilisiertes mit destilliertem Wasser hergestelltes modifiziertes YNB-Medium folgender Zusammensetzung überimpft:

NH₄Cl	10,0 g/l
KH₂PO₄	1,1 g/l
MgSO₄ × 7H₂O	1,0 g/l
Na₂HPO₄ × 2H₂O	1,3 g/l
FeSO₄ × 7H₂O	35 mg/l
CaCl₂ × 6H₂O	200 mg/l
Spurensalzlösung	1 ml/l
Thiamin × HCl	1,0 mg/l
Glycerol	45 g/l

wobei die Spurensalzlösung folgende Zusammensetzung hatte:

H₃BO₃	500 mg/l
CuSO₄ × 5H₂O	63 mg/l
KI	100 mg/l

MnSO₄ × H₂O	450 mg/l
Na₂MoO₄ × 2H₂O	240 mg/l
ZnSO₄ × 7H₂O	710 mg/l

Die Vorkultur wurde in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen bei 28°C bei pH 4–5 (eingestellt mit NaOH) für 48 h auf einer Schüttelapparatur bei einer Schüttelfrequenz von 130 bis 150 rpm kultiviert.
Von der Vorkultur erfolgte die Überimpfung von 75 ml Inokulum bei einem Animpfverhältnis 1:10 in einen 1 l-Rührreaktor (Multifors) mit 750 ml Arbeitsvolumen. Die sterilisierte mit destilliertem Wasser hergestellte Kulturlösung enthielt als Produktionsmedium ebenfalls das modifizierte YNB-Medium (Zusammensetzung siehe oben). Dabei wurde Rohglycerol anstelle von Glycerol eingesetzt. Durch regelmäßige Substratnachdosierung wurde die Glycerol-Konzentration während der Kultivierung in einem Bereich von 10 bis 40 g/l gehalten.
Die Kultivierung erfolgte unter sterilen Bedingungen bei einer Temperatur von 28°C. Der pH-Wert wurde bei pH 3,7 mit 15% NaOH statiert (Angaben in Tabelle 5).
Die Luftbegasungsrate (20,9% O₂-Gehalt) wurde für alle Kultivierungen konstant bei 0,4 l/min gehalten. Verschiedene Stufen einer Begrenzung der Sauerstoffaufnahmerate (OUR = 10,25 oder 40 mmol O₂/l·h) wurden durch Variation der Rührerdrehzahl eingestellt (Angaben in Tabelle 5).
Eine Vergleichskultivierung ohne Sauerstofflimitation erfolgte bei konstanter Gelöstsauerstoffkonzentration DOC = 50%. Dieser Kultivierungszustand wurde über eine variable Luftbegasungsrate im Bereich von 0,2 bis 1,2 l/min und 800 rpm Rührerdrehzahl realisiert. Damit wurden Sauerstoffaufnahmeraten von OUR > 50 mmol/l·h ermöglicht.
Die Kultivierungsansätze mit Sauerstofflimitation (OUR = 10, 25 oder 40 mmol O₂/l·h) waren dadurch gekennzeichnet, dass ausgehend von einer DOC im Bereich von 90–100% zu Beginn der Kultivierung, die Gelöstsauerstoffkonzentration nach 10 bis 24 h auf Werte von DOC = 0% abfielen und in diesem Bereich bis Abbruch der Kultivierung verblieb.
In Tabelle 5 wird die Abhängigkeit der Succinat-Bildung mit Yarrowia lipolytica H222-AZ9 vom eingestellten Grad der Sauerstofflimitation (Begrenzung der Sauerstoffaufnahmerate OUR) dargestellt. Die höchsten Succinat-Konzentrationen lagen mit 78 g/l (mit NaOH) für die Kultivierungen bei einer Limitation der Sauerstoffaufnahmerate in Höhe von OUR = 25 mmol/l·h vor (siehe Tabelle 5). Für diese Varianten konnten auch die höchsten Produktbildungsraten Q_SUC und Selektivitäten ermittelt werden. Dagegen war bei OUR = 40 mmol/l·h neben einer Absenkung der Succinat-Konzentration auf 21 g/l bereits eine verstärkte Akkumulation von unerwünschtem Citrat und Isocitrat (in Summe 8,6 g/l) zu beobachten. Unter den Bedingungen ohne Begrenzung der Sauerstoffaufnahmerate OUR, aber unter Konstanthaltung der Gelöstsauerstoffkonzentration (DOC = 50% konst.) wurde von Yarrowia lipolytica H222-AZ9 nahezu ausschließlich Citronensäure und Isocitronensäure (in Summe 48 g/l) akkumuliert. Succinat wurde nur im Spurenbereich gebildet.
Tabelle 5: Kultivierungsbedingungen und Ergebnisse der Succinat-Produktion mit dem Stamm Yarrowia lipolytica H222-AZ9 T3 (mcPYC1 mcICL1 ura3d4)
BEISPIEL 2
Mit dem gentechnisch veränderten Stamm Yarrowia lipolytica H222-AZ7 T23 (pPOT1-SDH2 ΔJEN4 URA3), welcher neben dem Austausch des SDH2- gegen den POT1-Promoter zusätzlich eine neuartige Deletion des JEN4-Gens für den Transport von Dicarbonsäuren besitzt, erfolgte die Kultivierung wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei eine Beschränkung auf die Variante mit einer Sauerstofflimitation OUR = 10 mmol/l·h erfolgte. Zur Regulierung des pH-Wertes wurde 15%ige NaOH eingesetzt. Nach 212 Stunden betrug die Menge an gebildeten Säuren im Medium 39,3 g/l wovon 34,2 g/l Succinat waren. Dies entsprach einer Selektivität von 87%. Die Produktivität Q_SUC betrug 0,16 g/l·h. Im Kultivierungszeitraum wurden 24 g/l Biomasse gebildet.
BEISPIEL 3
Mit dem gentechnisch veränderten Stamm Yarrowia lipolytica H222-AZ10 T5 (pPOT1-SDH2 ΔJEN4 URA3 mcPYC1 ura3d4), welcher neben dem Austausch des SDH2-gegen den POT1-Promoter zusätzlich eine neuartige Deletion des JEN4-Gens für den Transport von Dicarbonsäuren und eine Überexpression der Gene der PYC1-Pyruvarcarboxylase besitzt, erfolgte eine Kultivierung wie im Beispiel 1 beschrieben. Bezüglich der Sauerstoffaufnahmerate erfolgte die Beschränkung auf die Variante mit OUR = 25 mmol/l·h. Zur Regulierung des pH-Wertes wurde 15%ige NaOH eingesetzt. Nach 262 Stunden betrug die Menge an produziertem Succinat 57,2 g/l. Zusätzlich wurden 4,5 g/l α-Ketoglutarat und 2,4 g/l L-Malat im Medium akkumuliert. Dies entsprach einer Selektivität von 89% für Succinat. Die Produktivität Q_SUC betrug 0,22 g/l·h. Bei Abbruch der Kultivierung lagen 38,3 g/l Biomasse vor.
BEISPIEL 4
Die Kultivierung erfolgte mit dem Yarrowia lipolytica H222 (Wildtyp) wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei eine Beschränkung auf die Variante mit einer Sauerstofflimitation OUR = 10 mmol/l·h erfolgte. Anstelle von Rohglycerol wurde Pharmaglycerol im Produktionsmedium verwendet. Zur Regulierung des pH-Wertes wurde 15%ige NaOH eingesetzt.
Nach 310 Stunden Kultivierung wurden 25,5 g/l L-Malat gebildet. Als weitere Säuren konnten 4 g/l α-Ketoglutarsäure, 3,6 g/l Fumarsäure und 4,8 g/l Succinat detektiert werden. Dies entsprach einer Selektivität von 67% für L-Malat. Die Produktivität für L-Malat konnte mit 0,1 g/l·h ermittelt werden. Bei Abbruch der Kultivierung betrug die Biomassebildung 19 g/l.
BEISPIEL 5
Mit dem gentechnisch veränderten Stamm Yarrowia lipolytica H222-AZ9 T3 (mcPYC1 mcICL1 ura3d4), erfolgte die Kultivierung wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei abweichend ein 5 l-Rührreaktor (ISF205; Infors) eingesetzt wurde. Von der Vorkultur erfolgte die Überimpfung von 500 ml Inokulum bei einem Animpfverhältnis 1:10. Das Arbeitsvolumen des Rührreaktors betrug 5 l. Die Luftbegasungsrate (20,9% O₂-Gehalt) wurde für die Kultivierung konstant bei 0,7 l/min gehalten. Die Rührerdrehzahl wurde auf 700 rpm eingestellt. Zusätzlich erfolgte eine Druckbeaufschlagung in Höhe von 0,2 bar Überdruck. In 1 ist der Verlauf der Kultivierung dargestellt. Parallel mit der Biomassebildung war bis 12 h ein Anstieg der Sauerstoffaufnahmerate OUR bis auf 24 mmol O₂/l·h zu verzeichnen. Ab diesem Zeitpunkt lag unter den eingestellten Kultivierungsbedingungen (Luftbegasungsrate, Rührerdrehzahl, Druck) im Bioreaktor eine Begrenzung der Sauerstoffaufnahmerate für die Hefezellen vor. Gleichzeitig erfolgte ab diesem Zeitpunkt die Akkumulation von Succinat.
Die Succinat-Konzentration betrug 75,8 g/l bei Abbruch der Kultivierung nach 359 h. Für die Kultivierung wurde eine Produktivität für die Succinat Q_SUC in Höhe von 0,21 g/l·h ermittelt. An Nebenprodukten wurden 0,2 g/l Fumarsäure, 3,5 g/l α-Ketoglutarat, 1,4 g/l Malat, und 0,4 g/l Pyruvat gebildet. Dies entsprach einer Selektivität der Succinat-Bildung von 93,7%.
Bei Abbruch der Kultivierung lagen 29,6 g/l Hefebiomasse vor.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von organischen Säuren durch Pilzstämme, wobei die Pilzstämme in einem Medium kultiviert werden, und wobei ferner die Sauerstoffaufnahmerate (OUR) auf einen Bereich zwischen ≥ 5 und ≤ 50 mmol O₂/l·h eingeregelt wird.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei besagten Pilzstämmen um Mitglieder der Gruppe der Schlauchpilze (Ascomycota) handelt.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei besagte Pilzstämme mindestens einer Gattung zugehören, die ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Saccharomyces; Schizosaccharomyces; Wickerhamia; Debayomyces; Hansenula; Hanseniospora; Pichia; Kloeckera; Candida; Zygosaccharomyces; Ogataea; Kuraishia; Komagataella (= Pichia); Yarrowia; Metschnikowia; Williopsis; Nakazawaea; Kluyveromyces; Cryptococcus; Torulaspora; Torulopsis; Bullera; Rhodotorula; Sporobolomyces; Pseudozyma; Saccharomycopsis; Saccharomycodes; Aspergillus; Penicillium; Rhizopus; Trichosporon und/oder Trichoderma.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den zu produzierenden organischen Säuren um L-Malat und/oder Succinat handelt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei besagte Pilzstämme mindestens eine genetische Modifikation aufweisen, die zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Verminderung der Aktivität des Carbonsäure-Transporters erreicht wird durch mindestens eine Eigenschaft bzw. einen Schritt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: a) Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens codierend für einen Carbonsäure-Transporter b) Expression eines dysfunktionalen oder vermindert aktiven Carbonsäure-Transporters c) Inhibierung oder Verminderung der Aktivität des exprimierten Carbonsäure-Transporters bewerkstelligt ist bzw. wird.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei der mindestens eine Carbonsäure-Transporter aus der Gruppe der Jen-Transporter und/oder der Mae-Transporter entstammt.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei besagter Pilz mindestens eine weitere genetische Modifikation ausgewählt aus der Gruppe enthaltend – Reduktion der Aktivität bzw. Expression der Succinatdehydrogenase (SDH), beispielsweise durch Austausch des nativen Promotors von SDH2 gegen einen schwachen Promotor, beispielsweise pPOT, oder durch Verwendung einer geeigneten Deletionskassette, – Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Pyruvatcarboxylase (PYC), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens PYC1, und/oder – Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Isocitratlyase (ICL), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens ICL1 aufweist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Verfahren – eine Produktkonzentration von ≤ 90 g/l Succinat – eine Succinatbezogene Selektivität von ≤ 93 %, und/oder – eine Produktkonzentration von ≤ 25 g/l L-Malat ermöglicht.
Vorrichtung zur biotechnologischen Herstellung von organischen Säuren durch Pilzstämme, wobei die Vorrichtung Mittel zur Kultivierung der Pilze in einem Medium aufweist, und wobei die Vorrichtung ferner Mittel aufweist, die es ermöglichen, die Sauerstoffaufnahmerate OUR auf einen Bereich zwischen ≥ 5 und ≤ 50 mmol O₂/l·h einzuregeln.