WO2011036000A1 - Verfahren zur herstellung freier carbonsäuren - Google Patents

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WO2011036000A1
WO2011036000A1 PCT/EP2010/062146 EP2010062146W WO2011036000A1 WO 2011036000 A1 WO2011036000 A1 WO 2011036000A1 EP 2010062146 W EP2010062146 W EP 2010062146W WO 2011036000 A1 WO2011036000 A1 WO 2011036000A1
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WO
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acid
process step
medium
time period
cells
Prior art date
Application number
PCT/EP2010/062146
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English (en)
French (fr)
Inventor
Achim Marx
Markus PÖTTER
Henrike Gebhardt
Murillo Villela Filho
Juraj Obuch
Nicole Decker
Alexander Mohr
Original Assignee
Evonik Röhm Gmbh
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of free carboxylic acids with the aid of yeast cells.
  • Carboxylates are usually converted into their free acids by addition of acids.
  • FIG. 1 shows, by way of example for 3-hydroxyisobutyric acid (3HIB), the proportion of free acid as a function of the pH.
  • 3HIB 3-hydroxyisobutyric acid
  • PCT / US2006 / 020782 describes a process for the production of lactic acid with yeast cells of the genera L. orientalis and P. fermentans, which have been genetically engineered to express an exogenous lactic dehydrogenase, thereby resulting in a better cultivation of the cells at low pH values is possible.
  • JP 2009000089 describes a process for the production of lactic acid with a yeast strain that has been engineered in such a way that the activity of one or more genes, which has a negative effect on product formation under acidic conditions, is suppressed. This improves the cells' ability to produce lactic acid under acidic conditions.
  • DD267999 describes an aerobic process for the preparation of 2-oxoglutaric acid in Yarrowia lipolytica DSM 8068 at pH values less than 6 and temperatures below 37 ° C.
  • DE102006057724 describes a process for the production of enzymes by means of the cultivation of fungi in a pH range of 1-4, whereby the media and vessels used in the process are not sterilized.
  • Carboxylic acid i. free acid and its salt form, are low.
  • the object of the invention was therefore a method
  • Carboxylic acids especially hydroxycarboxylic acids, provides. Description of the invention
  • the present invention therefore provides a process for the preparation of free carboxylic acids comprising
  • Part-time period a) of process step B) is carried out at a pH range of the medium of 3.0 to 1.0, preferably from 2.5 to 1.2, in particular from 2.0 to 1.5, followed by at least a part-time period b) of process step B), in which the pH of the medium is increased in comparison to the part-time period a) of process step B).
  • Another advantage of the invention is the fact that contamination is less likely at the low pH essential to the invention than at high pH.
  • the total costs for sterile technology, such. B. in the form of the necessary generation of steam and the need for pressure-resistant containers and pipes.
  • Another advantage of minimal media over complex ones Media consists in the fact that for selection of the production strain complementation markers such. B.
  • Amino Textreauxotrophien can be used. This type of selection is not only cheaper compared to the selection z. As with antibiotics, as is common in complex media, but can also be used easily in the field of food production.
  • carboxylic acid within the meaning of the present invention includes both the free carboxylic acid (-COOH) and the corresponding salt (-COO-).
  • Carboxylic acid (-COOH) and the corresponding salt (-COO-).
  • the formulation "The cells are able to form the carboxylic acid from the carbon source as a substrate” in the sense of
  • the present invention describes that the cell from the available carbon source at least one
  • Carbon atom is used to allow the carboxylic acid
  • synthesize This can be detected, for example, by an isotopic labeling of the carbon source, so that the isotope can be detected in the carboxylic acid formed.
  • Invention describes the phenomenon of pH lowering of the yeast cell surrounding medium caused by
  • the cells are preferably multiplied until a concentration of dry biomass of at least 30 g / l, based on the nutrient medium, is reached.
  • the free carboxylic acid is a free ketocarboxylic acid or a free hydroxycarboxylic acid.
  • ketocarboxylic acids are alpha-ketocarboxylic acids, in particular alpha-keto-glutaric acid;
  • hydroxycarboxylic acids are preferred, in particular selected from the group comprising, in particular from the group consisting of, 2-hydroxyisobutyric acid, 3-hydroxyisobutyric acid, with 3-hydroxyisobutyric acid being particularly preferred.
  • the cell selected from the group comprising, in particular from the group consisting of, Yarrowia lipolytica H222, H222-27 and H222-27-11 have proven to be useful in the method according to the invention.
  • H222 is described in Barth & Weber, magazine for
  • H222-27-11 also known as ZIMET 43856, H355 and DSM 8068, is described in DD267999.
  • the yeast cell used in the method according to the invention is thus preferably a genetically modified cell.
  • the cell used in the method according to the invention has been genetically engineered with respect to its wild type so that it can be used in the
  • Carboxylic acid, or at least no detectable amounts of this compound can form and only after the genetic modification detectable amounts of this component can be formed.
  • a wild-type cell is preferably referred to as a cell whose genome is in a state as naturally produced by evolution, and is used for both the entire cell and for individual genes. fall therefore in particular not such cells or genes whose gene sequences
  • yeast cells are additionally provided with the features according to the invention described in PCT / EP2007 / 055394, such as, for example, increased enzyme activities.
  • process step A) takes place at a pH of the medium of greater than 4.5, preferably greater than 4.9.
  • a pH range of the medium of greater than 4.5 to less than or equal to 7.9, in particular a pH range of the medium of greater 4.9 to less than or equal to 7.0 is preferred.
  • the pH of the medium in process step A) does not exceed a pH of 7.9.
  • the nutrient medium is passed through a medium containing a carbon source, from which the cells are able to form the carboxylic acid as substrate.
  • Carbon source is transferred, with a replacement of the
  • the carbon source in process step B) of the process of the invention may be any carbon source from which the yeast cell is capable of forming the carboxylic acid; these are, for example, alkanes, amino acids, alcohols, fats, oils and sugars.
  • carbon sources selected from the group comprising, in particular from the group consisting of, methanol, glycerol, sucrose, glucose, isobutyric acid, valine, leucine and ketoisovaleric acid are used.
  • Process step B) is initiated directly at the beginning of process step B). This can take place, for example, in that the yeast cells are separated from the nutrient medium of process step A).
  • the part-time period a) of the method step B) is followed by at least one further part-time period b) of the
  • the pH of the medium of the part-time period b) in this context is preferably increased by at least 0.2, in particular by at least 0.5 and more particularly by at least 0.8 pH units, based on the lowest pH of the part-time period a ).
  • Process step B) are thus 2.0 to 5.5, preferably 2.5 to 4.0 and in particular 2.7 to 3.8.
  • Liquids up to 50 ° C. Preferred temperatures, in particular for process step B) are in a range from 25 ° C to 37 ° C.
  • the method according to the invention is preferably characterized in that method step B) is carried out at a temperature in a range of 25 ° C to 37 ° C.
  • process step B) it may be advantageous to strictly control the biomass in order to obtain an optimum product yield. Therefore, it is preferred according to the invention, if the
  • the process of the invention may further comprise one or more steps for purification and isolation of the carboxylic acids
  • Process step B) includes.
  • Process step C) can also already in the course of
  • Process step B) take place to a possible
  • Suitable process steps include concentration, crystallization, ion exchange chromatography, salification on solid or liquid ion exchangers with the following thermal cleavage, electrodialysis, extraction with organic solvents and / or liquid reactants, with reactive
  • Carboxylic acid is purified from the medium, but not mandatory.
  • the purified carboxylic acid obtained in process step C) can advantageously be converted into secondary products.
  • An object of the invention is thus the use of the free carboxylic acid obtained by inventive method for
  • Hydroxycarboxylic acids are known to the person skilled in the art for example, in PCT / EP2007 / 055394, US 3,666,805 and US 5,225,594
  • FIG. 1 Influence of the pH on the proportion of the free acid on 3HIB in solution
  • Figure 2 fermentation course of 3HIB production when driving a pH profile to pH 2 and supplementation with
  • FIG. 3 fermentation course of 3HIB production while driving a pH profile and supplementation with ketoisovaleric acid
  • Example 1 (according to the invention): Preparation of 3-hydroxyisobutyric acid in Yarrowia lipolytica with ketoisovalerate as substrate with shift to pH 2
  • the Yarrowia lipolytica yeast was chosen as the production strain.
  • the pH during the fermentation was chosen as the production strain.
  • Second preculture The second preculture of Y. lipolytica H222-27-11 was carried out as a sterile shaking culture in 1 L Erlenmeyer flasks (with baffle, wide neck design) with 100 ml mineral salt medium each. As inoculum, 2-3 inocula of the first preculture were used. The cultures were incubated at 30 ° C for 48 h on a shaker with incubation hood. The
  • Shaking frequency was 170 rpm. To regulate the pH in the range pH 4.5 to 5.5 after 24 h with 20% NaOH readjusted.
  • the carbon source used was 80 g / 1 glycerol. After 48 h at the latest, cultivation was stopped due to increased acid formation. After completion of the
  • Cultivation was a residual glycerol content of 12-20 g / 1 before.
  • Seed Fermenter - Seed fermentation was performed in a 2 L bioreactor (Sartorius). This was 1 L
  • Mineral salt medium 10% inoculated from the 2nd preculture and cultured for 24 h.
  • the following fermentation parameters were set: stirrer speed at start: 400 rpm; p0 2 : 20%; Temperature: 30 ° C; pH during growth: 5.5.
  • Production fermenter The production fermentation was performed in a 2 L bioreactor (Sartorius). For this purpose, 1 L minimal medium 10% was inoculated from the seed fermenter and cultured for 70 h. The source of carbon was crude glycerol (80%). When Substrate for the biotransformation to 3HIB, a solution of ketoisovalerate and valine was added. It was ensured that no limitation of ketoisovaleric acid occurred.
  • the cultivation was carried out in mineral salt medium having the following composition: 6.17 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 ; 2 g / 1 KH 2 P0 4 ; 1 g / 1 MgSO 4 ⁇ 7 H 2 O; 44 mg / l ZnSO 4 x 7 H 2 O; 10 mg / 1 FeSO 4 ⁇ 7 H 2 O; 50 yg / l
  • Trace elements (1000 times) 1 ml / 1.
  • the trace elements had the following composition: 50 mg / 100 ml H 3 BO 3 ; 4 mg / 100 ml CuSO 4 ⁇ 5 H 2 O; 10 mg / 100 ml KI; 20 mg / 100 ml MnSO 4 ⁇ 4 H 2 O; 40 mg / 100 ml Na 2 MoO 4 ⁇ 2 H 2 O; 40 mg / 100 ml ZnSO 4 ⁇ 7 H 2 O.
  • Example 2 (not according to the invention): Preparation of 3-hydroxyisobutyric acid in Yarrowia lipolytica with ketoisovalerate as substrate without pH shift to pH 2
  • the Yarrowia lipolytica yeast was chosen as the production strain.
  • the pH during the fermentation was chosen as the production strain.
  • Third preculture The third preculture of Y. lipolytica H222-27-11 was carried out as a sterile shaking culture in 1 L Erlenmeyer flasks (with baffle, wide neck design) with 100 ml mineral salt medium each. As inoculum, 2-3 inocula of the first preculture were used. The cultures were incubated at 30 ° C for 48 h on a shaker with incubation hood. The
  • Shaking frequency was 170 rpm. To regulate the pH in the range pH 4.5 to 5.5 after 24 h with 20% NaOH readjusted.
  • the carbon source used was 80 g / 1 glycerol. After 48 h at the latest, cultivation was stopped due to increased acid formation. After completion of the
  • Cultivation was a residual glycerol content of 12-20 g / 1 before.
  • Production fermenter The production fermentation was performed in a 2 L bioreactor (Sartorius). For this purpose, 1 L minimal medium 10% was inoculated from the third preculture and cultured for 70 h.
  • the source of carbon was crude glycerol (80%).
  • a solution of ketoisovalerate and valine was added. It was ensured that no limitation of ketoisovaleric acid occurred.
  • the cultivation was carried out in mineral salt medium having the following composition: 6.17 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 ; 2 g / 1 KH 2 P0 4 ; 1 g / 1 MgSO 4 ⁇ 7 H 2 O; 44 mg / l ZnSO 4 x 7 H 2 O; 10 mg / 1 FeSO 4 ⁇ 7 H 2 O; 50 ⁇ g / l thiamine x HCl; 60 mg / l CaCl 2 ⁇ 6 H 2 O; 100-140 g / 1 glycerol;
  • Trace elements (100 times) 1 ml / 1.
  • the trace elements had the following composition: 50 mg / 100 ml H 3 BO 3 ; 4 mg / 100 ml CuSO 4 ⁇ 5 H 2 O; 10 mg / 100 ml KI; 20 mg / 100 ml MnSO 4 ⁇ 4 H 2 O; 40 mg / 100 ml Na 2 MoO 4 ⁇ 2 H 2 O; 40 mg / 100 ml ZnSO 4 ⁇ 7 H 2 O.

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren umfassend die Verfahrensschritte A) das in Kontakt Bringen einer Hefezelle, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Yarrowia lipolytica, Candida ultilis und Saccharomyces cerevisiae, mit einem Nährmedium, in welchem die Zelle sich vermehren lässt; B) das in Kontakt Bringen der Zellen aus Verfahrensschritt A) mit einem Medium enthaltend eine Kohlenstoffquelle, unter Bedingungen, bei denen die Zellen die Carbonsäure aus der Kohlenstoffquelle als Substrat zu bilden vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) bei einem pH-Wert-Bereich des Mediums von 3,0 bis 1,0, bevorzugt von 2,5 bis 1,2, insbesondere von 2,0 bis 1,5 durchgeführt wird, gefolgt von mindestens einer Teilzeitperiode b) des Verfahrensschrittes B), bei der der pH-Wert des Mediums im Vergleich zur erstgenannten Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) erhöht ist.

Description

Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren
Gebiet der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren mit Hilfe von Hefezellen.
Stand der Technik
Die biochemische Herstellung von Carbonsäuren ist aufgrund von z.B. der Milch- oder Zitronensäureproduktion gut bekannt. Da die meisten Fermentationsprozesse bei einem pH-Wert des Mediums durchgeführt werden, der oberhalb des pKs-Wertes der
herzustellenden Carbonsäure liegen, fallen die Carbonsäuren zum Grossteil als Salze und nicht als freie Säuren an. Diese
Carboxylate werden meist durch Zugabe von Säuren in ihre freien Säuren überführt.
Die Produktion freier Säuren ist entscheidend für eine Vereinfachung der Produktaufreinigung . Bei beispielsweise einem Extraktionsverfahren geht oft nur die freie Säure von der Fermentationsbrühe ins Extraktionsmittel über. In der Kulturbrühe sollte demzufolge idealerweise die freie Säureform zur Verfügung gestellt werden. Solange der Bioprozess bei pH Werten oberhalb des pKs Wertes der jeweiligen Säure durchgeführt wird, wird hauptsächlich die Salzform der Säure gebildet.
Figur 1 zeigt exemplarisch für 3-Hydroxyisobuttersäure (3HIB) den Anteil freier Säure in Abhängigkeit vom pH-Wert. Solange keine freie Säure gebildet wird, ist ein Ansäuern der Kulturbrühe zur Produktaufreinigung erforderlich. Dabei entstehen Salze wie beispielsweise CaSC , deren Entsorgung aufwändig ist. Die PCT/US2006/020782 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Milchsäure mit Hefezellen der Gattung L. orientalis und P. fermentans, die derart gentechnisch verändert wurden, dass sie eine exogene Lact atdehydrogenase exprimieren, wodurch eine bessere Kultivierung der Zellen bei niedrigen pH-Werten ermöglicht wird.
Die JP 2009000089 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Milchsäure mit einem Hefestamm, der derart gentechnisch verändert wurde, dass die Aktivität eines oder mehrer Gene, die sich unter sauren Bedingungen negativ auf die Produktbildung auswirkt, unterdrückt wird. Dadurch wird die Fähigkeit der Zellen, Milchsäure unter sauren Bedingungen zu produzieren, verbessert .
Die DD267999 beschreibt ein aerobes Verfahren zur Herstellung von 2-Oxoglutarsäure in Yarrowia lipolytica DSM 8068 bei pH- Werten kleiner 6 und Temperaturen unter 37 °C.
Die DE102006057724 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen mit Hilfe der Kultivierung von Pilzen in einem pH- Bereich von 1-4, wobei die im Verfahren eingesetzten Medien und Gefäße nicht sterilisiert werden.
Den Verfahren des Standes der Technik ist gemein, dass generell eine Herstellung von freien Carbonsäuren in Hefezellen bei niedrigem pH-Wert gelingt, jedoch die Ausbeuten an gesamter
Carbonsäure, d.h. freie Säure und deren Salzform, gering sind.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren
bereitzustellen, welches effektiv und produktiv freie
Carbonsäuren, insbesondere Hydroxycarbonsäuren, bereitstellt. Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise wurde gefunden, dass das in Anspruch 1 beschriebene Verfahren die gestellte Aufgabe löst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren umfassend die
Verfahrensschritte A) das in Kontakt Bringen einer Hefezelle, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, Yarrowia lipolytica, Candida ultilis und Saccharomyces cerevisiae, mit einem Nährmedium, in welchem die Zelle sich vermehren lässt; B) das in Kontakt Bringen der Zellen aus Verfahrensschritt A) mit einem Medium enthaltend eine Kohlenstoffquelle, unter Bedingungen, bei denen die Zellen die Carbonsäure aus der Kohlenstoffquelle als Substrat zu bilden vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine
Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) bei einem pH-Wert- Bereich des Mediums von 3,0 bis 1,0, bevorzugt von 2,5 bis 1,2, insbesondere von 2,0 bis 1,5 durchgeführt wird, gefolgt von mindestens einer Teilzeitperiode b) des Verfahrensschrittes B) , bei der der pH-Wert des Mediums im Vergleich zur Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) erhöht ist.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht in der Tatsache, dass eine Kontamination bei dem erfindungswesentliche, niedrigen pH- Wert unwahrscheinlicher ist als bei hohem pH-Wert. Dadurch erniedrigt sich insgesamt der Aufwand für Steriltechnik, wie z. B. in Form der notwendigen Erzeugung von Dampf und der Notwendigkeit von druckstabilen Behältnissen und Leitungen. Dadurch kann auch ein Prozess mit geringeren Produktivitäten wirtschaftlich sein, was den Einsatz von Minimalmedien ohne die teuren komplexen Bestandteile in der Fermentation ermöglicht. Ein weiterer Vorteil von Minimalmedien gegenüber komplexen Medien besteht in der Tatsache, dass zur Selektion des Produktionsstammes Komplementationsmarker wie z. B.
Aminosäureauxotrophien eingesetzt werden können. Diese Art der Selektion ist nicht nur preisgünstiger im Vergleich zur Selektion z. B. mit Antibiotika, wie in komplexen Medien üblich, sondern kann auch im Bereich der Nahrungsmittelherstellung problemlos eingesetzt werden.
Unter „Hefen" im Sinne der vorliegenden Erfindung werden
einzellige Pilze, insbesondere Schlauchpilze, die sich durch Sprossung oder Teilung vermehren, verstanden.
Der Begriff „Carbonsäure" im Sinne der vorliegenden Erfindung beinhaltet sowohl die freie Carbonsäure (-COOH) als auch das korrespondierende Salz (-COO-) .
Der Begriff „Hydroxycarbonsäure" im Sinne der vorliegenden
Erfindung beschreibt Carbonsäuren mit mindestens einer Hydroxyl- und einer Carbonsäuregruppe und beinhaltet sowohl die freie
Carbonsäure (-COOH) als auch das korrespondierende Salz (-COO-) . Die Formulierung „Die Zellen vermögen die Carbonsäure aus der Kohlenstoffquelle als Substrat zu bilden" im Sinne der
vorliegenden Erfindung beschreibt, dass die Zelle aus der ihr zur Verfügung stehenden Kohlenstoffquelle mindestens ein
Kohlenstoffatom nutzt, um damit die Carbonsäure zu
synthetisieren. Dies kann etwa durch eine Isotopenmarkierung der Kohlenstoffquelle nachgewiesen werden, so dass sich das Isotop in der gebildeten Carbonsäure nachweisen lässt.
Der Begriff „Eigenansäuerung" im Sinne der vorliegenden
Erfindung beschreibt das Phänomen der pH-Wert-Erniedrigung des eine Hefezelle umgebenden Mediums hervorgerufen durch
Substanzen, die von der Hefezelle abgegeben werden.
Alle angegebenen Prozent (%) sind wenn nicht anders angegeben Massenprozent . Alle im Zusammenhang mit dem Verfahren angegebenen pH-Werte und insbesondere auch die in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit dem Verfahrensschritt B) angegebenen pH-Werte sind „unter den Kultivierungsbedingungen" zu messen. Wenn also beispielsweise die Mikroorganismen im Verfahrensschritt A) oder im Verfahrensschritt B) bei 30°C kultiviert werden, ist auch der pH-Wert bei 30°C zu bestimmen.
In Verfahrensschritt A) werden die Zellen vorzugsweise bis zum Erreichen einer Konzentration an Biotrockenmasse von mindestens 30 g/1 bezogen auf das Nährmedium vermehrt.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die freie Carbonsäure eine freie Ketocarbonsäure oder eine freie Hydroxycarbonsäure ist. Als Ketocarbonsäuren kommen insbesondere alpha- Ketocarbonsäuren in Frage, insbesondere alpha-Keto-Glutarsäure ; in diesem Zusammenhang sind Hydroxycarbonsäuren bevorzugt, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, 2-Hydroxyisobuttersäure, 3- Hydroxyisobuttersäure, wobei 3- Hydroxyisobuttersäure besonders bevorzugt ist.
Als vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar haben sich insbesondere die Zelle ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, Yarrowia lipolytica H222, H222-27 und H222-27-11 herausgestellt.
H222 wird beschrieben in Barth & Weber, Zeitschrift für
allgemeine Mikrobiologie 1983, Genetic studies on the yeast Saccharomycopsis lipolytica. Inactivation and mutagenesis . und in Barth & Gaillardin, FEMS microbiology reviews 1996, Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica; H222-27, auch bekannt als ZIMET 43728 und H422, wird in der DD227448 beschrieben;
H222-27-11, auch bekannt als ZIMET 43856, H355 und DSM 8068, wird in der DD267999 beschrieben.
Es ist dem Fachmann hinlänglich bekannt, dass mit Hilfe
rekombinanter Gentechnik Produktausbeuten in biologischen
Systemen verbessert werden können. Bevorzugt handelt es sich bei der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Hefezelle somit um eine gentechnisch veränderte Zelle.
Daher ist es erfindungsgemäß weiterhin bevorzugt, dass die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Zelle gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im
Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäure zu bilden vermag. Die Formulierung „dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäure zu bilden vermag" betrifft auch den Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt keine
Carbonsäure, zumindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser Verbindung, zu bilden vermag und erst nach der gentechnischen Veränderung nachweisbare Mengen dieser Komponente gebildet werden können.
Unter einem „Wildtyp" einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen
zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.
Die Art und Weise, wie die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte, gentechnisch veränderte Hefezelle derart gentechnisch verändert werden kann, dass sie mehr Carbonsäure als ihr Wildtyp zu bilden vermag, ist für den Fall der 3- Hydroxyisobuttersäure insbesondere in der PCT/EP2007/055394 beschrieben, auf deren Offenbarung hier explizit abgestellt wird. Die in der PCT/EP2007/055394 als erfindungemäß bevorzugt beschriebenen Zellen sind ebenfalls auf die vorliegende
Erfindung übertragen bevorzugte im vorliegenden
erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Zellen; in diesem
Zusammenhang bedeutet „auf die vorliegende Erfindung
übertragen", dass die oben genannten Hefezellen mit den in der PCT/EP2007/055394 beschriebenen erfindungsgemäßen Merkmalen, wie beispielsweise erhöhten Enzymaktivitäten, zusätzlich versehen werden .
Für den Fall der 2-Hydroxyisobuttersäure werden im
erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt gentechnisch veränderte Hefezellen eingesetzt, die wie insbesondere in der
PCT/EP2007/052830 und der DE102008002715, auf deren Offenbarung hier explizit abgestellt wird, beschrieben gentechnisch
verändert wurden.
Weiterhin ist es in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, dass Verfahrensschritt A) bei einem pH-Wert des Mediums von größer 4,5, vorzugsweise von größer 4,9, erfolgt. Insbesondere ist in diesem Zusammenhang ein pH-Wert-Bereich des Mediums von größer 4,5 bis kleiner gleich 7,9, insbesondere ein pH-Wert- Bereich des Mediums von grösser 4,9 bis kleiner gleich 7,0, bevorzugt .
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass der pH-Wert des Mediums in Verfahrensschritt A) einen pH-Wert von 7,9 nicht übersteigt. Zwischen Verfahrensschritt A) und Verfahrensschritt B) wird das Nährmedium durch ein Medium enthaltend eine Kohlenstoffquelle, aus der die Zellen die Carbonsäure als Substrat zu bilden vermögen, ersetzt.
Dies kann derart erfolgen, dass das Nährmedium durch das Medium enthaltend die Kohlenstoffquelle ersetzt wird, aber auch derart vorgenommen werden, dass das Nährmedium durch Zusatz von
Substanzen wie beispielsweise der Kohlestoffquelle und/oder durch Wegnahme oder nicht weitere Zufuhr von Substanzen, wie beispielsweise Stoppen etwaiger Gas-Einleitungen, Ausfällen von Nährmediumkomponenten, in das Medium enthaltend die
Kohlenstoffquelle überführt wird, wobei ein Ersetzen des
Nährmediums durch beispielsweise Abziehen über
Tangentialfiltration und Neuzufuhr des Mediums enthaltend die Kohlenstoffquelle oder durch Abzentrifugieren der Zellen und anschließendes Resuspendieren der Zellen in dem Medium
enthaltend die Kohlenstoffquelle bevorzugt ist.
Die Kohlenstoffquelle kann in dem Verfahrensschritt B) des erfindungsgemäßen Verfahrens jegliche Kohlenstoffquelle sein, aus denen die Hefezelle in der Lage ist, die Carbonsäure zu bilden; dies sind beispielsweise Alkane, Aminosäuren, Alkohole, Fette, Öle und Zucker. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden insbesondere Kohlenstoffquellen ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, Methanol, Glycerin, Saccharose, Glukose, Isobuttersäure, Valin, Leucin und Ketoisovaleriansäure eingesetzt.
Es kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft sein, wenn die erfindungswesentliche Teilzeitperiode a) des
Verfahrensschrittes B) direkt zu Beginn des Verfahrensschrittes B) eingeleitet wird. Dies kann etwa dadurch erfolgen, dass die Hefezellen von dem Nährmedium des Verfahrensschritts A)
abgetrennt werden und direkt in einem Medium mit einem entsprechend niedrigen pH-Wert überführt werden, oder aber das Nährmedium des Verfahrensschrittes A) mit Hilfe einer Säure, insbesondere einer anorganischen Säure, auf den gewünschten pH- Wert eingestellt wird.
Es ist in diesem Zusammenhang bevorzugt, dass die pH-Wert- Einstellung in der Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) durch Eigenansäuerung erfolgt.
Die Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) wird gefolgt von mindestens einer weiteren Teilzeitperiode b) des
Verfahrensschrittes B) , bei der der pH-Wert des Mediums im
Vergleich zur Teilzeitperiode a) erhöht ist. Der pH-Wert des Mediums der Teilzeitperiode b) ist in diesem Zusammenhang bevorzugt um mindestens 0,2, insbesondere um mindestens 0,5 und ganz besonders um mindestens 0,8 pH-Einheiten erhöht, bezogen auf den tiefsten pH-Wert der Teilzeitperiode a) . Bevorzugte pH- Wert-Bereiche des Mediums der Teilzeitperiode b) des
Verfahrensschrittes B) sind somit 2,0 bis 5,5, bevorzugt 2,5 bis 4,0 und insbesondere 2,7 bis 3,8.
Es ist des Weiteren möglich, in Verfahrenschritt B) die
vorbeschriebenen Teilzeitperioden mit unterschiedlichen pH- Werten mehrfach hintereinander durchzuführen, so dass sich über den zeitlichen Verlauf des Verfahrensschritte B) ein
wellenförmiges pH-Profil ergibt.
Die Temperatur, bei der das erfindungsgemäße Verfahren
durchgeführt werden kann liegt sowohl für Verfahrensschritt A) als auch für Verfahrensschritt B) in einem Bereich von kurz oberhalb des Gefrierpunktes der die Zellen umgebenden
Flüssigkeiten bis 50 °C. Bevorzugte Temperaturen, insbesondere für Verfahrensschritt B) liegen in einem Bereich von 25 °C bis 37 °C.
Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt B) bei einer Temperatur in einem Bereich von 25 °C bis 37 °C durchgeführt wird.
In Verfahrensschritt B) kann es vorteilhaft sein, die Biomasse streng zu kontrollieren, um eine optimale Produktausbeute zu erhalten. Daher ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die
Konzentration an Biotrockenmasse in Verfahrensschritt B) in einem Bereich von 30 g/1 bis 100 g/1 bezogen auf die Kulturbrühe liegt .
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin eine oder mehrere Schritte zur Reinigung und Isolierung der Carbonsäuren
enthalten. Es kann daher erfindungsgemäß vorteilhaft sein, wenn das Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt C) Aufreinigung der Carbonsäure aus den Zellen und/oder dem Medium aus
Verfahrensschritt B) beinhaltet.
Verfahrensschritt C) kann auch schon im Laufe von
Verfahrensschritt B) erfolgen, um eine mögliche
Produktinhibierung zu umgehen und/oder um die Anzahl der
Aufreinigungsschritte insgesamt zu verringern.
Verfahren zu Aufreinigung von Carbonsäuren sind dem Fachmann bekannt, solche werden beispielsweise in US 5,464,760, US
5, 641, 406, US 6, 630, 603, US 6, 942, 803, US 6, 280, 985, US
6,368,819, US 5,132,456, US 7,186,856 und US 5,210,296
beschrieben .
Geeignete Verfahrensschritte sind unter anderen Konzentrierung, Kristallisation, Ionenaustauschchromatographie, Umsalzung an festen oder flüssigen Ionenaustauschern mit nachfolgender thermischer Spaltung, Elektrodialyse, Extraktion mit organischen Lösemitteln und/oder flüssigen Reaktanden, mit reaktiven
Lösungsmitteln und die Reinigung durch Veresterung der
Carbonsäure mit geeigneten Alkoholen, nachfolgender Destillation des erhaltenen Esters und anschließender Hydrolyse des Esters zur freien Säure sowie Kombinationen dieser Schritte.
Eine Abtrennung der Zellen durch z.B. Filtration oder
Zentrifugation vor Anwendung der oben genannten
Verfahrensschritte ist in dem Falle vorteilhaft, dass die
Carbonsäure aus dem Medium aufgereinigt wird, jedoch nicht zwingend erforderlich.
Die in Verfahrensschritt C) erhaltene aufgereinigte Carbonsäure kann vorteilhaft zu Folgeprodukten umgesetzt werden.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung der freien Carbonsäure erhalten durch erfindungsgemäße Verfahren zur
Herstellung von ungesättigten Carbonsäuren, Carbonsäureestern oder Polymere derselben durch Dehydratisierung sowie
gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation. Insbesondere die Verwendung, bei der die freie Carbonsäuren ausgewählt ist aus 2- oder 3-Hydroxyisobuttersäure zur
Herstellung von Methacrylsäure, Methacrylsäureestern oder
Polymere derselben durch Dehydratisierung sowie gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation, ist
erfindungsgemäß bevorzugt.
Bevorzugt im Sinne der Erfindung ist beispielsweise die
Dehydratisierung von Hydroxycarbonsäuren zu ungesättigten
Carbonsäuren .
Eine Reihe von Verfahren zur Dehydratisierung von
Hydroxycarbonsäuren ist dem Fachmann bekannt, solche werden beispielsweise in der PCT/EP2007/055394, US 3,666,805 und US 5,225,594 beschrieben
In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten
Aus führungs formen beschränkt sein soll.
Folgende Figuren sind Bestandteil der Offenbarung:
Figur 1: Einfluss des pH-Wertes auf den Anteil der freien Säure an 3HIB in Lösung
Figur 2 : Fermentationsverlauf der 3HIB-Produktion bei Fahren eines pH-Profils bis pH 2 und Supplementierung mit
Ketoisovaleriansäure
Figur 3: Fermentationsverlauf der 3HIB-Produktion bei Fahren eines pH-Profils und Supplementierung mit Ketoisovaleriansäure
Beispiele :
Beispiel 1 (erfindungsgemäß) : Herstellung von 3- Hydroxyisobuttersäure in Yarrowia lipolytica mit Ketoisovalerat als Substrat mit Shift auf pH 2
Als Produktionsstamm wurde die Hefe Yarrowia lipolytica gewählt. Im beschriebenen Beispiel wurde der pH-Wert während der
Kultivierung durch Eigenansäuerung auf pH 2,0 abgesenkt. In einem Zeitraum von 2,5 h wurde bei pH 2,0 in einem Volumen von 1 L Kulturbrühe 0,498 g/L 3HIB als freie Säure gebildet. Das
Zielprodukt 3-Hydroxyisobuttersäure wurde durch
Biotransformation aus Ketoisovalerat synthetisiert. Die Kultivierungsbedingungen im Detail: Die Animpfschiene für die Fermentation im 2 L Maßstab bestand aus drei Stufen: einer ersten Vorkultur auf Agarplatten, einer zweiten Vorkultur im Schüttelkolben und einem Seed-Fermenter .
Erste Vorkultur - Ausstrich aus Cryokultur von Y. lipolytica H222-27-11 auf YPD-Agar (10 g/1 Hefeextrakt, 20 g/1 Pepton, 20 g/1 Dextrose), Kultivierung für 24 h bei 30 °C
Zweite Vorkultur - Die zweite Vorkultur von Y. lipolytica H222- 27-11 erfolgte als sterile Schüttelkultur in 1 L- Erlenmeyerkolben (mit Schikane, Weithalsausführung) mit je 100 ml Mineralsalzmedium. Als Inokulum wurden je 2-3 ImpfÖsen der ersten Vorkultur verwendet. Die Kulturen wurden bei 30 °C für 48 h auf einem Schüttler mit Inkubationshaube inkubiert. Die
Schüttelfrequenz betrug 170 rpm. Zur Regulierung des pH-Wertes im Bereich pH 4,5 bis 5,5 wurde nach 24 h mit 20 %iger NaOH nachgestellt. Als Kohlenstoffquelle wurde 80 g/1 Glycerol eingesetzt. Nach spätestens 48 h wurde die Kultivierung wegen verstärkter Säurebildung beendet. Nach Abschluss der
Kultivierung lag ein Restglycerolgehalt von 12-20 g/1 vor.
Seed-Fermenter - Die Seed-Fermentation wurde in einem 2 L- Bioreaktor (Sartorius) durchgeführt. Dazu wurde 1 L
Mineralsalzmedium 10 %ig aus der 2. Vorkultur angeimpft und 24 h kultiviert. Folgende Fermentationsparameter wurden eingestellt: Rührerdrehzahl beim Start: 400 rpm; p02: 20 %; Temperatur: 30 °C; pH während des Wachstums: 5,5.
Produktionsfermenter - Die Produktionsfermentation wurde in einem 2 L-Bioreaktor (Sartorius) durchgeführt. Dazu wurde 1 L Minimalmedium 10 %ig aus dem Seed-Fermenter angeimpft und 70 h kultiviert. Als Kohlenstoffquelle diente Rohglycerol (80%) . Als Substrat für die Biotransformation zu 3HIB wurde eine Lösung aus Ketoisovalerat und Valin zudosiert. Es wurde sichergestellt, dass keine Limitierung von Ketoisovaleriansäure eintrat.
Folgende Fermentationsparameter wurden eingestellt:
Rührerdrehzahl beim Start: 400 rpm; p02 : 20 %; Temperatur: 30 °C; pH während des Wachstums: 5,5 und mit Beginn der
Produktbildung nach 16 h pH-Shift auf pH 2 durch
Eigenansäuerung; pH-Regulierung mit 25 %igem NH4OH.
Die Kultivierung erfolgte in Mineralsalzmedium mit folgender Zusammensetzung: 6,17 g/1 (NH4)2S04; 2 g/1 KH2P04; 1 g/1 MgS04 x 7 H20; 44 mg/1 ZnS04 x 7 H20 ; 10 mg/1 FeS04 x 7 H20; 50 yg/l
Thiamin x HCl; 60 mg/1 CaCl2 x 6 H20; 100-140 g/1 Glycerin;
Spurenelemente (1000fach) 1 ml/1. Die Spurenelemente hatten folgende Zusammensetzung: 50 mg/100 ml H3BO3; 4 mg/100 ml CuS04 x 5 H20; 10 mg/100 ml KI; 20 mg/100 ml MnS04 x 4 H20; 40 mg/100 ml Na2Mo04 x 2 H20; 40 mg/100 ml ZnS04 x 7 H20.
Nach 2,5 h Fermentation bei pH 2 waren 0,500 g/L 3 HIB
synthetisiert worden, davon lagen 0,498 g/L als freie Säure vor. Von 20 h bis 40 h Fermentationszeit steigerten wir den pH-Wert langsam auf pH 3,8 durch Zugabe von Ammoniumwasser. In diesem Zeitraum wurden zusätzlich 2,7 g/L gebildet. Insgesamt lagen nach 40 h also 3,2 g/L 3 HIB - davon 2,8 g/L als freie Säure - vor. Von 40 h bis 70 h Fermentationszeit ließen wir den pH-Wert durch Eigenansäuerung auf pH 3 absinken. In diesem Zeitraum wurden zusätzlich 3,2 g/L 3-HIB synthetisiert. Von den nach 70 h vorliegenden 6,4 g/L 3HIB lagen 6,2 g/L als freie Säure vor, bei einem pH-Wert von pH 3. Bei einem für die meisten Fermentation üblichen neutralen pH-Wert von pH 7 hätte zu diesem Zeitpunkt der Anteil freier Säure 0,035 g/L betragen (s. Fig. 2 und Tab. 1) · Tabelle 1: Fermentationsverlauf der 3HIB-Produktion - insbesondere der Bildung freier Säure- bei Fahren eines
Profils
Figure imgf000017_0001
Beispiel 2 (nicht erfindungsgemäß) : Herstellung von 3- Hydroxyisobuttersäure in Yarrowia lipolytica mit Ketoisovalerat als Substrat ohne pH-Shift auf pH 2
Als Produktionsstamm wurde die Hefe Yarrowia lipolytica gewählt. Im beschriebenen Beispiel wurde der pH-Wert während der
Kultivierung durch Eigenansäuerung auf pH 3,8 abgesenkt. In einem Zeitraum von 47,3 h wurde bei pH 3,8-pH4 in einem Volumen von 1 L Kulturbrühe 1,04 g/L 3HIB als freie Säure gebildet. Das Zielprodukt 3-Hydroxyisobuttersäure wurde durch
Biotransformation aus Ketoisovalerat synthetisiert.
Die Kultivierungsbedingungen im Detail: Die Animpfschiene für die Fermentation im 2 L Maßstab bestand aus drei Stufen: zwei Vorkulturen auf Agarplatten und einer Vorkultur im
Schüttelkolben . Erste Vorkultur - Ausstrich aus Cryokultur von Y. lipolytica H222-27-11 auf Reader-Agar (3 g/1 (NH4)2S04;
0,7 g/1 MgS04 x 7 H20; 1 g/1 KH2P04; 0,16 g/1 K2HP04; 0,5 g/1 NaCl; 0,4 g/1 Ca(N03)2 x 4 H20; 30 g/1 Agar) und Kultivierung für 24 h bei 30 °C
Zweite Vorkultur - Ausstrich von 2-3 Impfösen von Y. lipolytica H222-27-11 aus erster Vorkultur auf Mineralsalzmedium-Agar, Kultivierung für 24 h bei 30 °C.
Dritte Vorkultur - Die dritte Vorkultur von Y. lipolytica H222- 27-11 erfolgte als sterile Schüttelkultur in 1 L- Erlenmeyerkolben (mit Schikane, Weithalsausführung) mit je 100 ml Mineralsalzmedium. Als Inokulum wurden je 2-3 ImpfÖsen der ersten Vorkultur verwendet. Die Kulturen wurden bei 30 °C für 48 h auf einem Schüttler mit Inkubationshaube inkubiert. Die
Schüttelfrequenz betrug 170 rpm. Zur Regulierung des pH-Wertes im Bereich pH 4,5 bis 5,5 wurde nach 24 h mit 20 %iger NaOH nachgestellt. Als Kohlenstoffquelle wurde 80 g/1 Glycerol eingesetzt. Nach spätestens 48 h wurde die Kultivierung wegen verstärkter Säurebildung beendet. Nach Abschluss der
Kultivierung lag ein Restglycerolgehalt von 12-20 g/1 vor.
Produktionsfermenter - Die Produktionsfermentation wurde in einem 2 L-Bioreaktor (Sartorius) durchgeführt. Dazu wurde 1 L Minimalmedium 10 %ig aus der dritten Vorkultur angeimpft und 70 h kultiviert. Als Kohlenstoffquelle diente Rohglycerol (80%) . Als Substrat für die Biotransformation zu 3HIB wurde eine Lösung aus Ketoisovalerat und Valin zudosiert. Es wurde sichergestellt, dass keine Limitierung von Ketoisovaleriansäure eintrat.
Folgende Fermentationsparameter wurden eingestellt:
Rührerdrehzahl beim Start: 400 rpm; p02 : 20 %; Temperatur: 30 °C; pH während des Wachstums: 5,5 und mit Beginn der Produktbildung nach 16 h pH-Shift auf pH 3,5 durch
Eigenansäuerung; pH-Regulierung mit 25 %igem NH4OH.
Die Kultivierung erfolgte in Mineralsalzmedium mit folgender Zusammensetzung: 6,17 g/1 (NH4)2S04; 2 g/1 KH2P04; 1 g/1 MgS04 x 7 H20; 44 mg/1 ZnS04 x 7 H20; 10 mg/1 FeS04 x 7 H20; 50 μg/l Thiamin x HCl; 60 mg/1 CaCl2 x 6 H20; 100-140 g/1 Glycerin;
Spurenelemente (lOOOfach) 1 ml/1. Die Spurenelemente hatten folgende Zusammensetzung: 50 mg/100 ml H3BO3; 4 mg/100 ml CuS04 x 5 H20; 10 mg/100 ml KI; 20 mg/100 ml MnS04 x 4 H20; 40 mg/100 ml Na2Mo04 x 2 H20; 40 mg/100 ml ZnS04 x 7 H20.
Nach 47,3 h Fermentation bei pH 4 waren 1,28 g/L 3 HIB
synthetisiert worden, davon lagen 1,04 g/L als freie Säure vor (s. Fig. 3 und Tab. 2) .
Tabelle 2: Fermentationsverlauf der 3HIB-Produktion - insbesondere der Bildung freier Säure- bei Fahren eines pH- Profils pH- Produktivität
Zeit Wert 3HIB [g/L]
gebild
[h] et kumuliert freie Säure [g/L/h]
27, 7-
75 4, 0 1,28 1,28 1, 04 0, 017

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren umfassend die Verfahrensschritte
A) das in Kontakt Bringen einer Hefezelle ausgewählt aus der Gruppe umfassend
Yarrowia lipolytica, Candida ultilis und
Saccharomyces cerevisiae
mit einem Nährmedium, in welchem die Zelle sich vermehren lässt;
B) das in Kontakt Bringen der Zellen aus
Verfahrensschritt A) mit einem Medium enthaltend eine Kohlenstoffquelle, unter Bedingungen, bei denen die Zellen die Carbonsäure aus der
Kohlenstoffquelle als Substrat zu bilden vermögen, dadurch gekennzeichnet,
dass mindestens eine Teilzeitperiode a) des
Verfahrensschrittes B) bei einem pH-Wert-Bereich des Mediums von 3,0 bis 1,0 durchgeführt wird, gefolgt von mindestens einer Teilzeitperiode b) des
Verfahrensschrittes B) , bei der der pH-Wert des Mediums im Vergleich zur Teilzeitperiode a) erhöht ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
dass die freie Carbonsäure eine Hydroxycarbonsäure oder eine Ketocarbonsäure ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Hydroxycarbonsäure ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend 2-Hydroxyisobuttersäure und 3- Hydroxyisobuttersäure . Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Hefezelle ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Yarrowia lipolytica H222, H222-27 und H222- 27-11.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass Verfahrensschritt A) bei einem pH-Wert von grösser 4,5 erfolgt .
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Kohlenstoffquelle ausgewählt ist aus der
Gruppe umfassend Alkane, Aminosäuren, Alkohole, Fette, Öle, Zucker, insbesondere Methanol, Glycerin,
Saccharose, Glukose, Isobuttersäure, Valin, Leucin und Ketoisovaleriansäure .
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Teilzeitperiode a) direkt zu Beginn des
Verfahrensschrittes B) eingeleitet wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die pH-Wert-Einstellung in der Teilzeitperiode a) durch Eigenansäuerung erfolgt.
9. Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass der pH-Wert des Mediums der Teilzeitperiode b) um mindestens 0,2 pH-Einheiten erhöht, bezogen auf den tiefsten pH-Wert der Teilzeitperiode a) , ist.
10. Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass der pH-Wert-Bereich des Mediums der
Teilzeitperiode b) 2,0 bis 5,5 ist.
11. Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass Verfahrensschritt B) bei einer Temperatur in einem Bereich von 25 °C bis 37 °C durchgeführt wird.
12. Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Konzentration an Biotrockenmasse in
Verfahrensschritt B) in einem Bereich von 30 g/l bis 100 g/l bezogen auf die Kulturbrühe liegt.
13. Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt C) Aufreinigung der Carbonsäure aus den Zellen
und/oder dem Medium aus Verfahrensschritt B) beinhaltet .
14. Verwendung der freien Carbonsäure erhalten durch
mindestens ein Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche zur Herstellung von ungesättigten Carbonsäuren, Carbonsäureestern oder Polymere derselben durch Dehydratisierung sowie gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation.
15. Verwendung gemäß Anspruch 14 wobei die freie
Carbonsäuren ausgewählt ist aus 2- oder 3- Hydroxyisobuttersäure zur Herstellung von
Methacrylsäure, Methacrylsäureestern oder Polymere derselben durch Dehydratisierung sowie gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation.
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