DE19619084A1 - Verfahren zur Herstellung von Poly-ß-hydroxybuttersäure und Copolymeren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly-β- hydroxybuttersäure (PHB) oder Copolymeren, das im großtechnischen Maßstab effektiv arbeitet und unter Produktionsbedingungen einfach zu handhaben ist, da keine sterilen Fermentationsbedingungen gewährleistet werden müssen.

Verfahren zur mikrobiellen Gewinnung von Poly-β- hydroxybuttersäure sind bekannt. Die am häufigsten eingesetzten Substrate sind Kohlenhydrate, bevorzugt Glucose und Saccharose. Weiterhin werden auch Alkohole, besonders Methanol, als Kohlenstoffquelle genutzt. Die am meisten eingesetzten Bakterien sind Alcaligenes eutrophus und Alcaligenes latus.

Ein Beispiel für die mikrobielle Produktion von PHB aus Methanol ist in EP 0 015 669 A2 gegeben. Beispiele für die Gewinnung von Copolymeren sind in EP 0 304 293 A2 und EP 069 497 A2 dargestellt, wobei beispielsweise Glucose/Propionsäure als Substratgemische eingesetzt werden.

Ein Verfahren zur Gewinnung von PHB mit einem guten Ertragskoeffizienten ist in EP 0 149 744 A1 mit Saccharose als Substrat beschrieben.

Nachteilig an diesen Verfahren ist, daß sie steril durchgeführt werden müssen, da Kontaminationen die Prozesse negativ beeinflussen, und dadurch das gewünschte Fermentationsziel in Frage gestellt wird. Außerdem werden keine Ergebnisse bezüglich hoher Molekulargewichte der produzierten Poly-β- hydroxybuttersäure dargelegt.

Experimentelle Arbeiten im Schüttelkolbenmaßstab beschreiben den Einsatz von reinem Methan als Substrat zur Herstellung von PHB mit den Bakterienstämmen Methylosinus sporium 12, Methylosinus trichosporium OB3B und Methylocystis parvus OBBP. Bei Biomassekonzentrationen von 2 g/l werden nach einer langen Kultivierungszeit von 180 h PHB-Gehalte in der Biomasse bis zu 70% erreicht (J.A. ASENJO et al., J. Ferment. Technol. 64 (1986), 271-278 und J.A. ASENJO et al., Biotechnol. Bioengin. Symp. 15 (1985), 225-234).

Eine andere Literaturstelle beschäftigt sich mit der Bildung von PHB aus Methan, um die Biodegradation von Trichlorethylen zu stimulieren. Im Schüttelkolben und im Bioreaktor werden in der Biomasse bis zu 50% PHB nach Kultivierungszeiten von 120 h akkumuliert (T. TAYLOR et al., Biotechnol. Bioengin. 49 (1996), 161- 171).

Auch diese Verfahren besitzen den Nachteil, daß sie steril durchgeführt werden müssen. Daneben sind derartig lange Kultivierungszeiten ökonomisch nicht vertretbar.

Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein im großtechnischen Maßstab effektiv arbeitendes Verfahren zur Herstellung von Poly-β-hydroxybuttersäure (PHB) und Copolymeren zu entwickeln, das mit billigen Substraten arbeitet, unter Produktionsbedingungen einfach zu handhaben ist, bei ökonomisch vertretbaren Kultivierungszeiten zu einer guten Anreicherung von PHB in der Biomasse führt und die Herstellung von PHB mit hohen Molekulargewichten erlaubt.

Die Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 und den dazugehörigen Unteransprüchen 2 bis 8 gelöst. Erfindungsgemäß werden als einzige Kohlenstoffquelle reines Methan, Erdgas, gereinigtes Bio- oder Deponiegas oder auch methanarme Erdgase eingesetzt und der Prozeß unsteril, entweder in diskontinuierlicher oder kontinuierlicher Fahrweise, durchgeführt, wobei der Wachstumsprozeß stets kontinuierlich geführt wird.

Die Kultivierung erfolgt in einem Temperaturbereich von 20-42°C, vorzugsweise von 32-38°C bei pH-Werten von 5,2-6,8, vorzugsweise von 5,5-6,0, bei Drücken bis zu 0,6 MPa und einem Gelöstsauerstoffgehalt von 0,5 - 90% des Sättigungswertes der ruft.

Als methanotropher Bakterienstamm wird vorzugsweise der Stamm Methylocystis spec. ZIMET B 502 eingesetzt. Dieser Stamm wird erstmalig in DD 1 48 465 beschrieben. Der Stamm wurde in der ZIMET-Hinterlegungsstelle Jena unter der Nummer ZIMET B 502 hinterlegt und in die Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM) überführt. Es ist jedoch erfindungsgemäß auch möglich, eine andere methanotrophe Bakterienkultur einzusetzen, die unter unsterilen Bedienungen kultiviert werden kann und mit methanenthaltenden Gasen als einziger Kohlenstoffquelle eine gute Anreicherung von PHB in der Biomasse (mindestens 40%) gewährleistet.

Als methanenthaltendes Gas können im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von PHB sowohl reines Methan als auch Bio- oder Deponiegas eingesetzt werden. Letztere müssen je nach Qualität einer Reinigung zur Entfernung von Schwefelverbindungen und Kohlendioxid unterzogen werden.

Erfindungsgemäß wird zur Herstellung von Copolymeren enthaltend β-Hydroxybuttersäure- und β-Hydroxyvaleriansäure-Einheiten, Erdgas, vorzugsweise mit einem Gehalt an Methanhomologen wie Ethan, Propan, Butan von < 15%, eingesetzt. Die erfindungsgemäß erhaltenen Copolymere weisen bis zu 50% PHB und bis zu 10% Polyhydroxyvaleriansäure (PHV) auf.

Methanenthaltendes Gas und sauerstoffenthaltendes Gas werden im Gemisch eingeblasen, wobei das Begasungsgemisch zwischen 15% bis 50% Methan enthält, vorzugsweise ca. 20%.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Wachstums- und Produktbildungsprozeß alternierend durchgeführt. Der Wachstumsprozeß erfolgt bei Durchflußraten D = 0,1-0,2 h^-1, vorzugsweise bei 0,13-0,15 h^-1, der Produktbildungsprozeß bei D = 0,04-0,05 h^-1 oder diskontinuierlich. Der Produktbildungsprozeß wird unmittelbar aus dem Wachstumsprozeß gestartet, nachdem die Ammoniumstickstoffdosierung auf 10% des Bedarfs reduziert wird. Nach einer Produktbildungsphase von 6-10 h, vorzugsweise 8 h, wird ein Teil des Fermentorinhaltes, vorzugsweise 50%, geerntet und der verbleibende Rest mit Nährlösung aufgefüllt. Nach ausreichender Ammoniumstickstoffzugabe setzt sofort wieder das Wachstum ein, und nach Erreichen der ursprünglichen Biomassekonzentration kann nach 12-20 h, vorzugsweise 16-17 h, wieder der Produkt­ bildungsprozeß gestartet werden. Auf diese Weise kann PHB ohne Unterbrechung durch zyklische Wachstums- und Produktbildungsprozesse über Monate erzeugt werden.

Desweiteren kann in einer bevorzugten Variante, um die Biomassekonzentration im Wachstumsprozeß weiter zu erhöhen, ein Teil der Biomasse nach Mikrofiltration in den Fermentor zurückgeführt werden.

Ökonomisch besonders vorteilhaft ist es, wenn Nährmedium und/oder Begasungsgemisch im Kreislauf geführt werden, d. h., wieder in den Prozeß eingespeist werden.

Die Gewinnung der PHB bzw. der Copolymere aus der Biomasse erfolgt mit Standardextraktionsmethoden, z. B. durch Vorextraktion mit Methanol (Feststoff- Lösungsmittelverhältnis 1 : 5), anschließende Extraktion mit 1,2-Dichlorethan (Feststoff-Lösungsmittelverhältnis 1 : 10, Temperatur 83°C, 4stufig, Extraktionsdauer 15 min.) und nachfolgende Ausfällung mit Aceton (4-8°C, Lösungsmittel-Lösungsmittelverhältnis 1 : 1), wobei es für den Fachmann kein Problem darstellt, diese Methoden entsprechend zu modifizieren und zu optimieren.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bei Kultivierungszeiten von ca. 10 h PHB-Gehalte in der Biomasse von mindestens 35% und ein Gehalt an Copolymeren bis zu 10% erreicht. Die Molekulargewichte der erfindungsgemäß hergestellten Poly-β- hydroxybuttersäure liegen zwischen 1,2-1,6 Mio. Das erfindungsgemäße Verfahren ist leicht handhabbar, da es unter unsterilen Bedingungen arbeitet, die Substrate stellen billige Rohstoffe dar.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von Erdgas mit einem Gehalt von Methanhomologen unter 15% zur biotechnologischen Herstellung von Copolymeren enthaltend β-Hydroxybuttersäure- und β-Hydroxyvaleriansäure- Einheiten sowie die Verwendung des Bakterienstammes Methylocystis spec. ZIMET B 502 zur biotechnologischen Herstellung von Poly-β-Hydroxybuttersäure und Copolymeren.

Nachfolgend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne sie jedoch darauf einzuschränken.

Beispiel 1: Kontinuierlicher Produktbildungsprozeß

In einen Rührfermentor werden 4 kg vorgezüchtetes Impf­ material einer methanotrophen Mischkultur mit der Hauptkomponente Methylocystis spec. ZIMET B 502 (< 90% bezogen auf Biomasse, 10% Begleitflora) mit einer Konzentration von 28 g/l eingesetzt. Die Zusammen­ setzung der Nährlösung ist pro Liter Wasser folgende:

H₃PO₄ (80%ig)|0,028 ml
KH₂PO₄	35 mg
MgSO₄ * 7 H₂O	25 mg
CuSO₄ * 5 H₂O	0,785 mg
MnSO₄ * H₂O	1,389 mg
FeSO₄ * 7 H₂O	1,678 mg
ZnCl₂	0,322 mg
CoSO₄ * 7 H₂O	0,036 mg
NiSO₄ * 7 H₂O	0,109 mg
Al₂(SO₄)₃ * 18 H₂O	0,186 mg
Ca(NO₃)₂ * 4 H₂O	0,883 mg
Na₂MoO₄ * 2 H₂O	0,041 mg
H₃BO₃	1,286 mg
CrCl₃ * 6 H₂O	0,077 mg.

Diese Salze sind ausreichend für einen Zuwachs von 1 g Biomassetrockensubstanz, die Stickstoffversorgung der Bakterien erfolgt mit einer 2%igen Ammoniaklösung über die pH-Regelung. Ein Überschuß an Nähr- und Spurensalzen wird ständig in Abhängigkeit von der Biomassekonzentration geschaffen. Die Temperatur wird auf 38°C, der pH-Wert auf 5,7 und eine Durchflußrate von 0,17 h^-1 eingestellt. Das Begasungsgemisch enthält 20% Methan, die Begasung beträgt 600 l/h, Rührerdrehzahl und Druck werden automatisch so geregelt, daß die Konzentration des Gelöstsauerstoffes bei 0,5% der Sättigung liegt.

Nach 3 h wird der Produktbildungsprozeß gestartet, indem eine Durchflußrate von 0,04 h^-1 und eine Limitation von Ammoniumstickstoff eingestellt werden. Dies geschieht dadurch, daß die pH-Regelung mit Natronlauge, bei Bedarf auch mit verdünnter Schwefelsäure, erfolgt und nur 10% des Ammoniumstickstoffbedarfs über die Nährlösung dosiert werden. Alle anderen Parameter werden konstant gehalten. Um die Konzentration pO₂=0,5% einhalten zu können, werden außer der automatischen Druck- /Drehzahlregelung die Gasmengen sukzessive erniedrigt.

Am Start betrug die Biomassenkonzentration 28,9 g/l der PHB-Gehalt 1,5%. Nach 8 h Versuchszeit wird eine Biomassekonzentration von 39,1 g/l mit einem PHB-Gehalt von 44,2% erreicht.

Die Aufarbeitung der Biomasse erfolgt durch Gefriertrocknung und Standardextraktionsmethoden. Das Molekulargewicht der PHB beträgt 1,6 Mio.

Beispiel 2: Diskontinuierlicher Produktbildungsprozeß

In einen 10fach größeren Rührfennentor werden 40 kg vorgezüchtetes Impfmaterial der gleichen Kultur wie in Beispiel 1 mit einer Biomassekonzentration von 20 g/l eingesetzt. Alle Parameter werden wie in Beispiel 1 beschrieben eingestellt, nur wird der Prozeß als batch geführt. Nach 2 h Versuchsdauer wurde der Produktbildungsprozeß gestartet, der pH-Wert wurde auf 6,5 angehoben, auf Natronlauge umgestellt und somit kein Ammoniumstickstoff mehr dosiert. Zu diesem Zeitpunkt betrugen die Biomassekonzentration 22,2 g/l und der PHB-Gehalt 2,5%. Die anfängliche Begasung von 4.800 l/h wurde ebenso wie Druck und Rührerdrehzahl reduziert, so daß die Gelöstsauerstoffkonzentration bei 0,5% der Sättigung gehalten wurde. Unter diesen diskontinuierlichen Bedingungen wurden nach 8 h eine Biomassekonzentration von 33,2 g/l mit einem PHB-Gehalt von 43,0% erreicht. Das Molekulargewicht der PHB beträgt 1,2 Mio.

Beispiel 3: Kontinuierlicher Produktbildungsprozeß

In einen Rührfermentor werden 40 kg vorgezüchtetes Impfmaterial der Kultur wie in Beispiel 1 eingesetzt. Der Prozeß für Wachstum und Produktbildung wird unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchge­ führt, nur wird die Gelöstsauerstoffkonzentration bei 90% Sättigung gehalten. Die Begasung wurde auf 4.200 l/h eingestellt. Beim Start des Produktbildungsprozes­ ses beträgt die Biomassekonzentration 20,1 g/l, der PHB-Gehalt liegt bei 4,8%. Nach 8 h wird eine Biomasse­ konzentration von 22,4 g/l erreicht, der PHB-Gehalt der Biomasse beträgt 33,9%, als Molekulargewicht wurden 1,6 Mio. ermittelt.

Beispiel 4: Herstellung von Copolymeren

In einen Rührfermentor werden 4 kg vorgezüchtetes Impfmaterial der Kultur aus Beispiel 1 eingesetzt. Alle Parameter werden wie in Beispiel 1 beschrieben eingestellt, nur wurde der Prozeß als batch geführt. Eine weitere Veränderung gegenüber Beispiel 1 bestand darin, daß das Begasungsgemisch aus 25% Erdgas und 75% Luft bestand. Das Erdgas hatte folgende Zusammensetzung: 77,6% Methan, 7,4% Ethan, 5,0% Propan, 2,0% Butan, 7,5% Stickstoff, 0,5% Kohlendioxid. Nach 4 h Fermentation unter Wachstumsbedingungen wird der Produktbildungsprozeß gestartet, indem die Stickstoffquelle entzogen wird. Am Startpunkt betrug die Biomassekonzentration 19,6 g/l mit einem PHB-Gehalt von 3,8%. Nach 10 h batch-Prozeß wurde eine Biomassekonzentration von 27,9 g/l mit einem Gehalt an PHB von 37,5% und einem Gehalt an PHV (Polyhydroxyvaleriansäure) von 9,4% erreicht.

Beispiel 5: Alternierende Durchführung des Wachstums- und Produktbildungsprozesses

In eine Rührfermentor werden 4 kg vorgezüchtetes Impf­ material der Kultur aus Beispiel 1 eingesetzt, die Pa­ rameter werden ebenfalls wie in Beispiel 1 eingestellt. Nach 2 h Kultivierungszeit wird der Produktbildungs­ prozeß durch Entzug der Ammoniumstickstoffquelle ge­ startet, lediglich 10% des Stickstoffbedarfs werden mit der Nährlösung mit D=0,04 h^-1 dosiert. Zum Startpunkt beträgt die Biomassekonzentration 22,1 g/l, der PHB-Ge­ halt 4,6%. Nach 7 h Versuchszeit hat die Biomasse­ konzentration auf 28,5 g/l zugenommen, der PHB-Gehalt beträgt 39,8%. Zu diesem Zeitpunkt werden 50% des Fer­ mentorinhaltes geerntet und die Kultur mit einer Nähr­ lösung aufgefüllt, die für eine Zuwachs von 2 g/l Biomasse berechnet ist. Gleichzeitig wird die pH-Regelung wieder mit einer 2%igen Ammoniaklösung vor­ genommen und eine Verdünnungsrate von 0,12 h^-1 ein­ gestellt. Das Nährsalzangebot wird sukzessive an die Zunahme der Biomassekonzentration angepaßt. Die Kultur schaltet sofort wieder auf Wachstum und nach 15 h kontinuierlicher Fahrweise wird eine Biomasse­ konzentration von 19,1 g/l sowie ein PHB-Gehalt von 5,6% ermittelt. Anschließend wird wieder der Produkt­ bildungsprozeß initiiert, indem wiederum die Stick­ stoffquelle bis auf 10% des Bedarfs reduziert und die Durchflußrate auf 0,04 h^-1 gesenkt wird. Während einer Versuchsphase von 8 h vergrößert sich die Biomasse­ konzentration auf 24,3 g/l mit einem PHB-Gehalt von 42,3%. Es werden wiederum 50% des Fermentorinhaltes ge­ erntet und die gleiche Prozedur wie beim 1. Zyklus durchgeführt. Während des Wachstumprozesses wird die Gelöstsauerstoffkonzentration bei 0,5-15%, während des PHB-Bildungsprozesses bei 0,5-5% gehalten.

Die Zyklen können beliebig lange wiederholt werden, wenn eingehalten wird, daß beispielsweise bei einer Verdünnung um 50% bei der gegebenen Durchflußrate die Wachstumsphase die doppelte Zeit der Produktbildungsphase beträgt.

Claims (10)

1. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly-β-Hydroxybuttersäure (PHB) oder Copolymeren, dadurch gekennzeichnet, daß ein methanotropher Bakterienstamm mit einem methanenthaltenden Gas als einziger Kohlenstoff­ quelle in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases unter unsterilen Bedingungen kultiviert wird, wobei der Wachstumsprozeß kontinuierlich und der Produkt­ bildungsprozeß kontinuierlich oder diskontinuier­ lich geführt werden, und aus der erhaltenen Biomasse die PHB oder die Copolymere auf an sich übliche Weise durch Extraktion gewonnen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als methanotropher Bakterienstamm der Stamm Methylocystis spec. ZIMET B 502 eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung im Temperaturbereich von 20 bis 42°C, bei pH-Werten von 5,2 bis 6,8, bei Drücken bis zu 0,6 MPa und einem Gelöstsauerstoffgehalt von 0,5 bis 90% des Sättigungswertes der Luft durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhöhung der Biomassekonzentration im Wachstumsprozeß ein Teil der Biomasse nach Mikrofiltration in den Fermentor zurückgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Wachstums- und Produktbildungsprozeß alternierend durchgeführt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium und/oder das Begasungsgemisch aus methanenthaltendem und sauerstoffenthaltendem Gas wieder in das Verfahren zurückgeführt werden.

7. Verfahren zur Herstellung von PHB nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als methanenthaltendes Gas reines Methan, gereinigtes Biogas oder gereinigtes Deponiegas eingesetzt werden.

8. Verfahren zur Herstellung von Copolymeren aus Poly­ hydroxybuttersäure und Polyhydroxyvaleriansäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als methanenthaltendes Gas Erdgas mit einem Gehalt an Methanhomologen unter 15% eingesetzt wird.

9. Verwendung von Erdgas mit einem Gehalt an Methanhomologen unter 15% zur biotechnologischen Herstellung von Copolymeren enthaltend β-Hydroxybuttersäure- und β-Hydroxyvaleriansäure- Einheiten.

10. Verwendung des Bakterienstammes Methylocystis spec. ZIMET B 502 zur biotechnologischen Herstellung von Poly-β-hydroxybuttersäure und Copolymeren.