DD148465A3

DD148465A3 - Verfahren zur kultivierung von mikroorganismen

Info

Publication number: DD148465A3
Application number: DD21416479A
Authority: DD
Inventors: Karin-Dagmar Wendlandt; Edda Bruehl; Joerg Ambrosius; Erhard Kranz; Klaus Karbaum; Gudrun Lingner
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr; Vsesojusnyj Nii Biosinteza Bel
Priority date: 1979-07-06
Filing date: 1979-07-06
Publication date: 1981-05-27

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf Methan/Erdgas als einziger Kohlenstoffquelle. Die Erfindung betrifft das Gebiet der mikrobiologischen Eiweiszgewinnung und ist in die IPK C 12 N einzuordnen. Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das eine stabile Prozeszfuehrung unter unsterilen Bedingungen mit hohen Produktivitaeten bei gleichzeitiger Gewaehrleistung eines eiweiszreichen Endproduktes ermoeglicht. Es wurde gefunden, dasz mit dem Bakterienstamm GB 25 - ZIMET B 502 die Zielstellung realisiert wird. Dieser methylotrophe Bakterienstamm bildet keinen Schleim, hat einen ausreichenden, Selektionsvorteil gegenueber anderen schleimbildenden methylotrophen Mikroorganismen und toleriert Ammoniumstickstoffkonzentrationen bis zu 400 mg/I in der Kulturfluessigk.Dieser Stamm wird kontinuierlich unter unsterilen Bedingungen bei einer Temperatur von 38 bis 40 Grad C und einem pH-Wert von 5,4 bis 6,0 unter Normaldruck oder erhoehtem Druck kultiviert. Das mit dem Stamm gewonnene Endprodukt enthaelt bis zu 75% Rohprotein und alle lebenswichtigen Aminosaeuren.

Description

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Titel

Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung gehört in das Gebiet der mikrobiologischen Eiweißgewinnung, in die IPK C 12 W.

Die Erfindung kann eingesetzt werden in Anlagen, in denen gasförmige Kohlenwasserstoffe mit Hilfe von Bakterien mikrobiologisch umgesetzt v/erden.

Bekannte technische Lösungen

Es sind bereits Verfahren bekannt zur Kultivierung von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, auf der Grundlage gasförmiger- Kohlenwasserstoffe, z.B. Methan. Dabei v/erden in der überwiegenden Mehrheit nicht (SHEEHAN, B.T. und JOHNSON, M.J. (1971) Production of bacterial cells from methane. Abbl. Microbiol. 2J_-, 511 - 515) oder weniger definierte (DE-OS 2375177) Kulturgemische eingesetzt.

Die bisher eingesetzten definierten Kulturen beinhalten Organismen der- Gattung Methylococcus, die als ammoniumempfindliche Stämme gekennzeichnet sind (DE-OS 2307692 und DE-OS 2241258).

Weiterhin sind definierte Kulturgemische bekannt, in denen nur durch Mikroorganismenassoziation mit symbiontischen Beziehungen (DD-PS 105627) höhere Produktivitäten erzielt werden, oder Vertreter der Gattung Pseudomonas

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(GB-PS 1270006), mit denen nur geringe Biomassekonzen- trationen erzielt werden.

Bekannt sind auch Vertreter der Gattung Methanomonas (DD-PS 113928), die als definierte Kultur unter ungeschützten nicht sterilen) Bedingungen, mit hohen. Produktivitäten, aber bei Temperaturen < 36 ⁰C kultivierbar sind. Dazu wurde ein Verfahren beschrieben (DD-PS 113928), in dem man in einem ungeschützten Prozeß bei einer- Verweilzeit von 6 Stunden und Einhaltung einer Temperatur von 33 ⁰C und einem pH-Wert von 6,2 eine Biomassekonzentration von 23 g/l, das entspricht einer Produktivität von 3,8 g/kg.h, erhält.

In der DD-PS 124194 wird eine Kultur beschrieben, die stabil bei T =38 ⁰C und pH = 5,4 bis 6,2 wächst; als maximale Y/achstumsgeschwindigkeit wird 0,2 h~ angegeben. Die in diesem und anderen Verfahren erwähnten Mikroorganismen haben folgende Nachteile:

- Wachstum in relativ neutralem pH-Bereich und bei Temperaturen um 32 ⁰C

- relativ niedrige Wachstumsgeschwindigkeiten bei Fermentationstemperaturen > 38 C

- niedrige Toleranzgr-enze bezüglich der Ammoniumstickstoffkonzentrationen des Kultivierungsmediums

- - Neigung zur Schleimbildung

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das eine stabile Prozeßführung unter unsterilen Bedingungen mit hohen Produktiv!täten bei gleichzeitiger Gewährleistung eines eiweißreichen Endproduktes ermöglicht.

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Aufgabe der Erfindung

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Produktionskultur zu selektieren und einzusetzen, die mit hohen Biomassekonzentrationen im unsterilen Prozeß bei einer Temperatur T ^ 38 ⁰C sowie einem pH-Wert ^ 5,7 einen ausreichenden Selektionsvorteil gegenüber den bisher bekannten schleimbildenden methylotrophen Mikroorganismen besitzt und selbst keinen Schleim bildet. Außerdem sollen niedrigere spezifische Verbrauchswerte für Methan und Sauerstoff, eine größere Wachstumsgeschwindigkeit und höhere Toleranzgrenzen für die Ammoniumstickstoffkonzentration des Kulturmediums erreicht werden, als für die genannten Stämme bekannt ist.

Merkmale der Erfindung

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein besonders selektierter, obligat methylotropher, methanassi-» milierender Stamm (Assimilation von CH. über Serinweg) kontinuierlich auf einem Methan-Luft-Gemisch unter Normaldruck oder erhöhtem Druck in einer streng bilanzierten Uahrsalzlösung unter unsterilen Bedingungen kultiviert wird. Der Stamm wurde aus mit Industrieabwässern angereichertem Flußwasser des Stadtgebietes Leipzig über eine Anreicherungskultur isoliert, die unter kontinuierlichen Bedingungen nach einem besonderen Selektionsprogramm, in dem Temperatur- und pH-Wert variiert, die anderen Prozeßparameter jedoch konstant gehalten wurden, erhalten worden war. Der Stamm wurde in der Stammsammlung des Zentralinstitutes für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegt und trägt die Bezeichnung GB 25 ZIMET B 502.

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Das Anreicherungsmedium enthielt pro Liter Aqua dest:

0,028 ml 35 mg 25,0 mg

0,785 mg 1,825 mg 1,20 mg 0,322 mg

0,036 mg KiSO₇₁ . 7H_o0 0,109 mg

0,186 mg

0,883 mg 0,041 mg

1,286 mg CrCl₃ . 6H₂O 0,077 mg

Diese Salze sind ausreichend für 1 g Biomassetrockensubstanz, wenn Stickstoff in Form von M₄ ⁺-Ionen über die pH-Regulierung dem Kulturmedium zugeführt wird. Die Salzkonzentration im Anreicherungsmedium ist so gewählt, daß den Organismen alle notwendigen Elemente angeboten werden. Dadurch werden Leistungsminderungen der Mikroorganismen durch. Limitationen vermieden. Einer Hemmung durch Überdosierung wird vorgebeugt, indem der Anreicherungsprozeß bei relativ niedrigen Zelldichten.von 3 bis 4 g/l BTS geführt wird. Der mittels konventioneller Selektionsmethoden aus der Anreicherungskultur selektierte Haupttyp, Stamm GB 25 ZIFlET B 502, der ca. 95% der Zellmasse entsprach, wird charakterisiert durch:

H₃PO₄	(80%~ig)	0	18H
KH₂PO₄		0	4H₂O
MgSO₄	. 7Hg	0	H₂O
CUSO₄	* 5Hg	0	0
MnSO₄	. 4H₂
PeCl₂	. 4H₂	0
ZnCIg		0
CoSO₄	. 7H₂
KiSO₄	. 7H₂
AIg(SO	4^}3 '
Ca(IO₃	)₂ .
Na₂MoO	4 ^{# 2}
H₃BO₃ CrCl₃	. 6H₂

Zellmor-phologie:

mehr oder weniger stark gekrümmte Zellen mit einer Größe von 0,8 bis 1,0 χ 2 bis 3 /um

Der Krümmungsgrad der Zellen ist von der Konzentration an gelöstem Sauerstoff des Kultivierungsmediums abhängig. Die Zellen sind gramnegativ, nicht säurefest und unbeweglich. In Abhängigkeit von den Fermentationsparametern können sudanophile Granula in den Zellen eingelagert werden. Schleimbildung ist nicht zu beobachten.

Koloniemorphologie:

Auf Mineralagarplatten werden elfenbein- bis cremefarbene Kolonien mit einem Durchmesser von 0,5 mm, glattem Rand und mattglänzender Oberfläche entwickelt, wenn eine anorganische Stickstoffquelle und Methan als C-Quelle angeboten v/erden.

V/eitere Merlanale:

Kein Wachstum auf peptonhaltigen Nährböden Temperaturbereich: 28 bis 42 ⁰C pH-Bereich: 4,7 bis 6,8 Toleranzgrenze für Ammoniumstickstoff: 400 mg/1

Der Stamm GB 25 ist serologisch vom Stamm GB 21 - IMET B 385 unterscheidbar- (Absorptionsmethode).

Zwischen beiden Kulturen kommen Kreuzreaktionen vor, d.h., das Kaninchen-Antiaerum der einen Kultur gibt auch mit der anderen eine positive Reaktion (sov/ohl bei der Objektträger-Agglutination als auch in der Immunofluoreszenz). Durch Absorption wurde ein spezifisches Serum hergestellt, das mit der GB 21 positiv und mit der GB 25 negativ reagiert, beide Kulturen also serologisch zu unterscheiden gestattet. Dieses Serum wurde erhalten, indem in das unspezifische GB 21-Serum eine ausreichende Menge GB 25-Zellen eingebracht und mehrere Stunden stehen gelassen wurde.

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Danach wurden die Zellen abzentrifugiert, das zellfreie Serum erbrachte die gewünschte Reaktion« Aufgrund seiner morphologischen und physiologischen Merkmale stellt der Stamm GB 25 - ZIMET B 502 einen obligat methylotrophen Mikroorganismus dar. Seine maximale spezifische Wachstumsrate ist mit der der ursprünglichen Anreicherungskultur identisch und beträgt/U = 0,22 h" ·

/ Jüci.X.

Unter unsterilen Prozeßbedingungen ist der Organismus GB 25 im Temperaturbereich von 28 bis 42 ⁰C, bevorzugt bei 38 bis 40 ⁰C, bei einem pH-Wert im Bereich von 4,7 bis 6,8, bevorzugt 5,4 bis 6,0 und einem Druck von 1 bis 15 atm kontinuierlich bei Verweilzeiten bis minimal 4,6 h kultivierbar-. Er besitzt damit ausreichende Selektionsvorteile, insbesondere gegenüber Substratkonkurrenten mit fermentationstechnisch ungünstigen Eigenschaften, und eine schleimfreie Fermentation im ungeschützten (unsterilen) Prozeß ist möglich.

Die Begasung erfolgt mit Methan-luft-Gemischen von 1 : 3 bis 1 : 6, Die Regulierung des pH-Wertes wird bevorzugt mit Ammoniak oder einem Ammoniak-Natronlauge-Gemisch vorgenommen. Eine Regulierung mit Natronlauge bei Vorgabe von z.B. Ammoniumchlorid ist ebenfalls möglich. Die Währlösung wird mit Leitungswasser angesetzt und mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von ^ 3 eingestellt. Dabei v/erden die Konzentrationen der- Bestandteile der Nährlösung so gewählt, daß das Iföhrsalzangebot stets der aktuellen Biomassekonzentration entspricht bzw« nur unwesentlich davon abweicht. Das Endpordukt des Prozesses ist eine Trockensubstanz, die bis zu 75% Rohprotein enthält und alle lebenswichtigen Aminosäuren aufweist.

Am nachfolgenden Beispiel wird die Erfindung näher erläutert.

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Beispiel

In einen Rührfermentor werden 5 kg vorgezüchtetes Impfmaterial der Kultur GB 25 - ZBiET B 502 mit einer Konzentration von 3 bis 4 g/l eingesetzt. Die Temperatur wird auf 40 C, der pH-Wert auf 5₅7 und die Verweilzeit auf 8 h eingestellt. Das Medium wird mit 26 l/h«kg Methan und 104 1/kg.h Luft begast. Die Regelung des pH-Wertes erfolgt mit einer 2%-igen Ammoniaklösung; damit wird gleichzeitig die StickstoffVersorgung der Organismen gewährleistet. Die Nährlösung (Zusammensetzung s. Merlanale der Erfindung) wird zunächst für eine Bakterienkonzentration von 10 g/l bilanziert. Nachdem die Biomasse auf eine Konzentration von 10 g/l angewachsen ist, wird die Verweilzeit auf 6 h herabgesetzt und die !Jährlösung für eine Bakterienkonzentration von 15 g/l bilanziert. Die Ammoniumstickstoffkonzentration des Kulturmediums wird zwischen 50 und 300 mg/1 gehalten. Unter diesen Bedingungen werden im stabilen kontinuierlichen Prozeß Bakterienkonzentrationen von 14,7 g/l> entsprechend einer Produktivität von 2,45 g/kj.h, erzielt. Der Rohproteingehalt der Biomasse beträgt 75%,

Claims

-*- 2 14 164 Patentanspruch

1. Verfahren zur Kultivierung von Bakterien auf Methan/ Erdgas als einziger Kohlenstoffquelle in Gegenwart einer wäßrigen Mineralsalzlösung und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienstamm GB 25 - ZIMET B 502 kontinuierlich mit einer Durchflußrate von maximal 0,25. h unter vorzugsweise unsterilen Bedingungen bei einer Temperatur von 28 bis 42 ⁰C, vorzugsweise 38 bis 40 ⁰C, und einem pH-Wert von 4,7 bis 6,8, vorzugsweise 5,4 bis 6,0, unter normalem oder erhöhtem Druck kultiviert wird.

2« Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei Ammoniumstickstoffkonzentrationen in der Kulturflüssigkeit bis zu 400 mg/1 durchgeführt wird.