DD148465A3 - METHOD FOR CULTURING MICROORGANISMS - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf Methan/Erdgas als einziger Kohlenstoffquelle. Die Erfindung betrifft das Gebiet der mikrobiologischen Eiweiszgewinnung und ist in die IPK C 12 N einzuordnen. Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das eine stabile Prozeszfuehrung unter unsterilen Bedingungen mit hohen Produktivitaeten bei gleichzeitiger Gewaehrleistung eines eiweiszreichen Endproduktes ermoeglicht. Es wurde gefunden, dasz mit dem Bakterienstamm GB 25 - ZIMET B 502 die Zielstellung realisiert wird. Dieser methylotrophe Bakterienstamm bildet keinen Schleim, hat einen ausreichenden, Selektionsvorteil gegenueber anderen schleimbildenden methylotrophen Mikroorganismen und toleriert Ammoniumstickstoffkonzentrationen bis zu 400 mg/I in der Kulturfluessigk.Dieser Stamm wird kontinuierlich unter unsterilen Bedingungen bei einer Temperatur von 38 bis 40 Grad C und einem pH-Wert von 5,4 bis 6,0 unter Normaldruck oder erhoehtem Druck kultiviert. Das mit dem Stamm gewonnene Endprodukt enthaelt bis zu 75% Rohprotein und alle lebenswichtigen Aminosaeuren.The invention relates to a process for the cultivation of microorganisms on methane / natural gas as the sole carbon source. The invention relates to the field of microbiological Eiweiszgewinnung and is classified in the IPK C 12 N. The aim of the invention is to develop a method which enables a stable process under unsterile conditions with high productivity while at the same time guaranteeing an egg-rich end product. It was found that the target position is realized with the bacterial strain GB 25 - ZIMET B 502. This methylotrophic bacterial strain does not produce mucus, has a sufficient selective advantage over other slime-forming methylotrophic microorganisms and tolerates ammonium nitrogen concentrations up to 400 mg / l in the culture fluid. This strain is continuously subjected to unsterile conditions at a temperature of 38 to 40 degrees C and a pH Value of 5.4 to 6.0 cultured under normal pressure or elevated pressure. The end product obtained with the strain contains up to 75% crude protein and all vital amino acids.
Description
2 1 Λ 1 6 42 1 Λ 1 6 4
Titeltitle
Verfahren zur Kultivierung von MikroorganismenProcess for the cultivation of microorganisms
Die Erfindung gehört in das Gebiet der mikrobiologischen Eiweißgewinnung, in die IPK C 12 W.The invention belongs in the field of microbiological protein production, in the IPK C 12 W.
Die Erfindung kann eingesetzt werden in Anlagen, in denen gasförmige Kohlenwasserstoffe mit Hilfe von Bakterien mikrobiologisch umgesetzt v/erden.The invention can be used in plants in which gaseous hydrocarbons are microbiologically reacted with the aid of bacteria.
Es sind bereits Verfahren bekannt zur Kultivierung von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, auf der Grundlage gasförmiger- Kohlenwasserstoffe, z.B. Methan. Dabei v/erden in der überwiegenden Mehrheit nicht (SHEEHAN, B.T. und JOHNSON, M.J. (1971) Production of bacterial cells from methane. Abbl. Microbiol. 2J-, 511 - 515) oder weniger definierte (DE-OS 2375177) Kulturgemische eingesetzt.There are already known methods for culturing microorganisms, in particular bacteria, based on gaseous hydrocarbons, for example methane. However, in the vast majority of cases (SHEEHAN, BT and JOHNSON, MJ (1971) Production of bacterial cells from methane., Bl. Microbiol., 2J - , 511 - 515) or less defined (DE-OS 2375177) culture mixtures are used.
Die bisher eingesetzten definierten Kulturen beinhalten Organismen der- Gattung Methylococcus, die als ammoniumempfindliche Stämme gekennzeichnet sind (DE-OS 2307692 und DE-OS 2241258).The defined cultures used so far include organisms of the genus Methylococcus, which are characterized as ammonium-sensitive strains (DE-OS 2307692 and DE-OS 2241258).
Weiterhin sind definierte Kulturgemische bekannt, in denen nur durch Mikroorganismenassoziation mit symbiontischen Beziehungen (DD-PS 105627) höhere Produktivitäten erzielt werden, oder Vertreter der Gattung PseudomonasFurthermore, defined culture mixtures are known in which only by microorganism association with symbiotic relationships (DD-PS 105627) higher productivity can be achieved, or representatives of the genus Pseudomonas
_ 2_ ^1Λ 164_ 2 _ ^ 1Λ 164
(GB-PS 1270006), mit denen nur geringe Biomassekonzen- trationen erzielt werden.(GB-PS 1270006), with which only low biomass concentrations are achieved.
Bekannt sind auch Vertreter der Gattung Methanomonas (DD-PS 113928), die als definierte Kultur unter ungeschützten nicht sterilen) Bedingungen, mit hohen. Produktivitäten, aber bei Temperaturen < 36 0C kultivierbar sind. Dazu wurde ein Verfahren beschrieben (DD-PS 113928), in dem man in einem ungeschützten Prozeß bei einer- Verweilzeit von 6 Stunden und Einhaltung einer Temperatur von 33 0C und einem pH-Wert von 6,2 eine Biomassekonzentration von 23 g/l, das entspricht einer Produktivität von 3,8 g/kg.h, erhält.Also known are representatives of the genus Methanomonas (DD-PS 113928), as a defined culture under unprotected non-sterile) conditions, with high. Productivities, but culturable at temperatures <36 0 C. For this purpose, a method has been described (DD-PS 113928), in which one in an unprotected process at a residence time of 6 hours and maintaining a temperature of 33 0 C and a pH of 6.2, a biomass concentration of 23 g / l , which corresponds to a productivity of 3.8 g / kg.h.
In der DD-PS 124194 wird eine Kultur beschrieben, die stabil bei T =38 0C und pH = 5,4 bis 6,2 wächst; als maximale Y/achstumsgeschwindigkeit wird 0,2 h~ angegeben. Die in diesem und anderen Verfahren erwähnten Mikroorganismen haben folgende Nachteile:In DD-PS 124194 a culture is described which grows stably at T = 38 0 C and pH = 5.4 to 6.2; the maximum velocity is 0.2 h ~. The microorganisms mentioned in this and other methods have the following disadvantages:
- Wachstum in relativ neutralem pH-Bereich und bei Temperaturen um 32 0C- Growth in relatively neutral pH range and at temperatures around 32 0 C.
- relativ niedrige Wachstumsgeschwindigkeiten bei Fermentationstemperaturen > 38 C- relatively low growth rates at fermentation temperatures> 38 C
- niedrige Toleranzgr-enze bezüglich der Ammoniumstickstoffkonzentrationen des Kultivierungsmediumslow tolerance levels with respect to the ammonium nitrogen concentrations of the culture medium
- - Neigung zur Schleimbildung- - tendency to slime
Ziel der ErfindungObject of the invention
Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das eine stabile Prozeßführung unter unsterilen Bedingungen mit hohen Produktiv!täten bei gleichzeitiger Gewährleistung eines eiweißreichen Endproduktes ermöglicht.The aim of the invention is to develop a process which enables stable process management under unsterile conditions with high productivity while ensuring a protein-rich end product.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Produktionskultur zu selektieren und einzusetzen, die mit hohen Biomassekonzentrationen im unsterilen Prozeß bei einer Temperatur T ^ 38 0C sowie einem pH-Wert ^ 5,7 einen ausreichenden Selektionsvorteil gegenüber den bisher bekannten schleimbildenden methylotrophen Mikroorganismen besitzt und selbst keinen Schleim bildet. Außerdem sollen niedrigere spezifische Verbrauchswerte für Methan und Sauerstoff, eine größere Wachstumsgeschwindigkeit und höhere Toleranzgrenzen für die Ammoniumstickstoffkonzentration des Kulturmediums erreicht werden, als für die genannten Stämme bekannt ist.The invention is therefore an object of the invention to select and use a production culture that has high biomass concentrations in the unsterile process at a temperature T ^ 38 0 C and a pH value of 5.7 sufficient selection advantage over the previously known slime-forming methylotrophic microorganisms and does not even form a mucus. In addition, lower specific consumption levels for methane and oxygen, a greater growth rate and higher tolerance limits for the ammonium nitrogen concentration of the culture medium are to be achieved than is known for the strains mentioned.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein besonders selektierter, obligat methylotropher, methanassi-» milierender Stamm (Assimilation von CH. über Serinweg) kontinuierlich auf einem Methan-Luft-Gemisch unter Normaldruck oder erhöhtem Druck in einer streng bilanzierten Uahrsalzlösung unter unsterilen Bedingungen kultiviert wird. Der Stamm wurde aus mit Industrieabwässern angereichertem Flußwasser des Stadtgebietes Leipzig über eine Anreicherungskultur isoliert, die unter kontinuierlichen Bedingungen nach einem besonderen Selektionsprogramm, in dem Temperatur- und pH-Wert variiert, die anderen Prozeßparameter jedoch konstant gehalten wurden, erhalten worden war. Der Stamm wurde in der Stammsammlung des Zentralinstitutes für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegt und trägt die Bezeichnung GB 25 ZIMET B 502.According to the invention, the object is achieved by cultivating a particularly selected, obligately methylotrophic, methanassicizing strain (assimilation of CH via serine route) continuously on a methane-air mixture under atmospheric pressure or elevated pressure in a strictly balanced crude solution under unsterile conditions becomes. The strain was isolated from river water enriched with industrial effluents of the urban area of Leipzig via an enrichment culture which had been obtained under continuous conditions according to a special selection program in which temperature and pH varied but the other process parameters were kept constant. The strain was deposited in the strain collection of the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the Academy of Sciences of the GDR and bears the designation GB 25 ZIMET B 502.
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Das Anreicherungsmedium enthielt pro Liter Aqua dest:The enrichment medium contained per liter of distilled water:
0,028 ml 35 mg 25,0 mg0.028 ml 35 mg 25.0 mg
0,785 mg 1,825 mg 1,20 mg 0,322 mg0.785 mg 1.825 mg 1.20 mg 0.322 mg
0,036 mg KiSO71 . 7Ho0 0,109 mg0.036 mg KiSO 71 . 7H o 0 0.109 mg
0,186 mg0.186 mg
0,883 mg 0,041 mg0.883 mg 0.041 mg
1,286 mg CrCl3 . 6H2O 0,077 mg1.286 mg CrCl 3 . 6H 2 O 0.077 mg
Diese Salze sind ausreichend für 1 g Biomassetrockensubstanz, wenn Stickstoff in Form von M4 +-Ionen über die pH-Regulierung dem Kulturmedium zugeführt wird. Die Salzkonzentration im Anreicherungsmedium ist so gewählt, daß den Organismen alle notwendigen Elemente angeboten werden. Dadurch werden Leistungsminderungen der Mikroorganismen durch. Limitationen vermieden. Einer Hemmung durch Überdosierung wird vorgebeugt, indem der Anreicherungsprozeß bei relativ niedrigen Zelldichten.von 3 bis 4 g/l BTS geführt wird. Der mittels konventioneller Selektionsmethoden aus der Anreicherungskultur selektierte Haupttyp, Stamm GB 25 ZIFlET B 502, der ca. 95% der Zellmasse entsprach, wird charakterisiert durch:These salts are sufficient for 1 g of biomass dry substance when nitrogen in the form of M 4 + ions is supplied via the pH regulation to the culture medium. The salt concentration in the enrichment medium is chosen so that the organisms are offered all the necessary elements. As a result, performance reductions of the microorganisms by. Limitations avoided. Inhibition by overdose is prevented by carrying out the enrichment process at relatively low cell densities of 3 to 4 g / L BTS. The main type selected by conventional selection methods from the enrichment culture, strain GB 25 ZIFLET B 502, which corresponded to about 95% of the cell mass, is characterized by:
Zellmor-phologie:Zellmor-morphology:
mehr oder weniger stark gekrümmte Zellen mit einer Größe von 0,8 bis 1,0 χ 2 bis 3 /ummore or less strongly curved cells with a size of 0.8 to 1.0 χ 2 to 3 / um
Der Krümmungsgrad der Zellen ist von der Konzentration an gelöstem Sauerstoff des Kultivierungsmediums abhängig. Die Zellen sind gramnegativ, nicht säurefest und unbeweglich. In Abhängigkeit von den Fermentationsparametern können sudanophile Granula in den Zellen eingelagert werden. Schleimbildung ist nicht zu beobachten.The degree of curvature of the cells depends on the dissolved oxygen concentration of the culture medium. The cells are gram-negative, non-acidic and immobile. Depending on the fermentation parameters, sudanophilic granules can be stored in the cells. Slime formation is not observed.
Koloniemorphologie:Colony morphology:
Auf Mineralagarplatten werden elfenbein- bis cremefarbene Kolonien mit einem Durchmesser von 0,5 mm, glattem Rand und mattglänzender Oberfläche entwickelt, wenn eine anorganische Stickstoffquelle und Methan als C-Quelle angeboten v/erden.On mineral agar plates, ivory-to-cream-colored colonies with a diameter of 0.5 mm, a smooth edge and a matt surface are developed when an inorganic nitrogen source and methane are offered as C sources.
V/eitere Merlanale:Further Merlanale:
Kein Wachstum auf peptonhaltigen Nährböden Temperaturbereich: 28 bis 42 0C pH-Bereich: 4,7 bis 6,8 Toleranzgrenze für Ammoniumstickstoff: 400 mg/1No growth on peptone containing culture media Temperature range: 28 to 42 0 C pH range: 4.7 to 6.8 Tolerance limit for ammonium nitrogen: 400 mg / 1
Der Stamm GB 25 ist serologisch vom Stamm GB 21 - IMET B 385 unterscheidbar- (Absorptionsmethode).Strain GB 25 is serologically distinguishable from strain GB 21 - IMET B 385- (absorption method).
Zwischen beiden Kulturen kommen Kreuzreaktionen vor, d.h., das Kaninchen-Antiaerum der einen Kultur gibt auch mit der anderen eine positive Reaktion (sov/ohl bei der Objektträger-Agglutination als auch in der Immunofluoreszenz). Durch Absorption wurde ein spezifisches Serum hergestellt, das mit der GB 21 positiv und mit der GB 25 negativ reagiert, beide Kulturen also serologisch zu unterscheiden gestattet. Dieses Serum wurde erhalten, indem in das unspezifische GB 21-Serum eine ausreichende Menge GB 25-Zellen eingebracht und mehrere Stunden stehen gelassen wurde.Cross reactions occur between the two cultures, i.e., the rabbit antiserum of one culture also gives a positive response with the other (as in slide agglutination as well as in immunofluorescence). By absorption, a specific serum was produced which reacts positively with the GB 21 and negatively with the GB 25, thus allowing to differentiate both cultures serologically. This serum was obtained by introducing into the nonspecific GB 21 serum a sufficient amount of GB 25 cells and allowing them to stand for several hours.
- 6 - . 2 1 4 1 6 4- 6 -. 2 1 4 1 6 4
Danach wurden die Zellen abzentrifugiert, das zellfreie Serum erbrachte die gewünschte Reaktion« Aufgrund seiner morphologischen und physiologischen Merkmale stellt der Stamm GB 25 - ZIMET B 502 einen obligat methylotrophen Mikroorganismus dar. Seine maximale spezifische Wachstumsrate ist mit der der ursprünglichen Anreicherungskultur identisch und beträgt/U = 0,22 h" ·Cell-free serum gave the desired response. "Due to its morphological and physiological features, strain GB 25 - ZIMET B 502 is an obligate methylotrophic microorganism. Its maximum specific growth rate is identical to that of the original enrichment culture and is / U = 0.22 h "·
/ Jüci.X./ Jüci.X.
Unter unsterilen Prozeßbedingungen ist der Organismus GB 25 im Temperaturbereich von 28 bis 42 0C, bevorzugt bei 38 bis 40 0C, bei einem pH-Wert im Bereich von 4,7 bis 6,8, bevorzugt 5,4 bis 6,0 und einem Druck von 1 bis 15 atm kontinuierlich bei Verweilzeiten bis minimal 4,6 h kultivierbar-. Er besitzt damit ausreichende Selektionsvorteile, insbesondere gegenüber Substratkonkurrenten mit fermentationstechnisch ungünstigen Eigenschaften, und eine schleimfreie Fermentation im ungeschützten (unsterilen) Prozeß ist möglich.Under unsterile process conditions, the organism GB 25 is in the temperature range of 28 to 42 0 C, preferably at 38 to 40 0 C, at a pH in the range of 4.7 to 6.8, preferably 5.4 to 6.0 and a pressure of 1 to 15 atm continuously culturable at residence times to a minimum of 4.6 h. He thus has sufficient selection advantages, especially against substrate competitors with fermentation unfavorable properties, and a non-slime fermentation in the unprotected (unsterile) process is possible.
Die Begasung erfolgt mit Methan-luft-Gemischen von 1 : 3 bis 1 : 6, Die Regulierung des pH-Wertes wird bevorzugt mit Ammoniak oder einem Ammoniak-Natronlauge-Gemisch vorgenommen. Eine Regulierung mit Natronlauge bei Vorgabe von z.B. Ammoniumchlorid ist ebenfalls möglich. Die Währlösung wird mit Leitungswasser angesetzt und mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von ^ 3 eingestellt. Dabei v/erden die Konzentrationen der- Bestandteile der Nährlösung so gewählt, daß das Iföhrsalzangebot stets der aktuellen Biomassekonzentration entspricht bzw« nur unwesentlich davon abweicht. Das Endpordukt des Prozesses ist eine Trockensubstanz, die bis zu 75% Rohprotein enthält und alle lebenswichtigen Aminosäuren aufweist.Fumigation is carried out with methane-air mixtures of 1: 3 to 1: 6, The regulation of the pH is preferably carried out with ammonia or an ammonia-sodium hydroxide mixture. A regulation with caustic soda with specification of eg ammonium chloride is also possible. The currency solution is prepared with tap water and adjusted with phosphoric acid to a pH of ^ 3. The concentrations of the constituents of the nutrient solution are chosen so that the Iföhrs salt supply always corresponds to the current biomass concentration or deviates only insignificantly from it. The end effector of the process is a dry substance that contains up to 75% crude protein and has all the essential amino acids.
Am nachfolgenden Beispiel wird die Erfindung näher erläutert.In the following example, the invention will be explained in more detail.
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In einen Rührfermentor werden 5 kg vorgezüchtetes Impfmaterial der Kultur GB 25 - ZBiET B 502 mit einer Konzentration von 3 bis 4 g/l eingesetzt. Die Temperatur wird auf 40 C, der pH-Wert auf 557 und die Verweilzeit auf 8 h eingestellt. Das Medium wird mit 26 l/h«kg Methan und 104 1/kg.h Luft begast. Die Regelung des pH-Wertes erfolgt mit einer 2%-igen Ammoniaklösung; damit wird gleichzeitig die StickstoffVersorgung der Organismen gewährleistet. Die Nährlösung (Zusammensetzung s. Merlanale der Erfindung) wird zunächst für eine Bakterienkonzentration von 10 g/l bilanziert. Nachdem die Biomasse auf eine Konzentration von 10 g/l angewachsen ist, wird die Verweilzeit auf 6 h herabgesetzt und die !Jährlösung für eine Bakterienkonzentration von 15 g/l bilanziert. Die Ammoniumstickstoffkonzentration des Kulturmediums wird zwischen 50 und 300 mg/1 gehalten. Unter diesen Bedingungen werden im stabilen kontinuierlichen Prozeß Bakterienkonzentrationen von 14,7 g/l> entsprechend einer Produktivität von 2,45 g/kj.h, erzielt. Der Rohproteingehalt der Biomasse beträgt 75%, In a stirred fermentor, 5 kg of culture broth GB 25 - ZBiET B 502 bred at a concentration of 3 to 4 g / l are used. The temperature is adjusted to 40 C, the pH to 5 5 7 and the residence time to 8 h. The medium is gassed with 26 l / h <kg of methane and 104 l / kg.h of air. The regulation of the pH is carried out with a 2% ammonia solution; This ensures at the same time the nitrogen supply of the organisms. The nutrient solution (composition see Merlanale of the invention) is first balanced for a bacterial concentration of 10 g / l. After the biomass has grown to a concentration of 10 g / l, the residence time is reduced to 6 h and the annual solution is balanced for a bacterial concentration of 15 g / l. The ammonium nitrogen concentration of the culture medium is maintained between 50 and 300 mg / l. Under these conditions, bacterial concentrations of 14.7 g / l> corresponding to a productivity of 2.45 g / kj.h are achieved in the stable continuous process. The crude protein content of the biomass is 75%,
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| DD148465A3 true DD148465A3 (en) | 1981-05-27 |
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| DD (1) | DD148465A3 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19619084A1 (en) * | 1996-04-30 | 1997-11-06 | Ufz Leipzighalle Gmbh | Bio:technical production of poly-beta-hydroxy-butyric acid |
| DE19721243A1 (en) * | 1997-05-14 | 1998-11-19 | Ufz Leipzighalle Gmbh | Plant and process for poly-beta-hydroxy-butyric acid production from methane in biogas |
-
1979
- 1979-07-06 DD DD21416479A patent/DD148465A3/en not_active IP Right Cessation
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