DE2458851C3 - Verfahren zur Gewinnung von Einzellerprotein auf Basis von Methanol - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von Einzellerprotein auf Basis von MethanolInfo
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Description
Der zunehmende Bedarf an Protein für die menschliche und tierische Ernährung machen es erforderlich,
neue Verfahren zu Gewinnung hochwertigen Proteins zu entwickeln. So wurde in den letzten Jahren die 4s
Produktion von Protein aus Mikroorganismen untersucht, die als Kohlenstoffquelle gasförmige Kohlenwasserstoffe
wie Methan oder flüssige Kohlenwasserstoffe aus Erdölfraktion verwerten können. Die gasförmigen
Kohlenwasserstoffe haben jedoch die Nachteile, daß sie so eine geringe Wasserlöslichkeit aufweisen und bei den
aeroben Züchtungsbedingungen explosive Gasgemische entstehen. Die flüssigen Kohlenwasserstoffe haben
die Nachteile, daß sie ebenfalls nur eine minimale Wasserlöslichkeit besitzen, was zur Verteilung der zwei ss
flüssigen Phasen einen erhöhten Energiebedarf bedingt. Außerdem muß bei der auf flüssigen Kohlenwasserstoffen
gewachsenen Zellmasse mindestens eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden.
Als besonders günstige Kohlenstoff- und Energiequelle für die Züchtung von Mikroorganismen in
großem Maßstabe wird seit einigen Jahren Methanol diskutiert. Dieses Substrat hat die Vorteile, daß es in
chemisch definierter reiner Form und preiswürdig aus Synthesegas zugänglich ist, welches aus verschiedenen fts
Rohstoffen wie Erdgas, Fraktionen des Erdöls, Steinkohle oder Braunkohle erzeugt werden kann.
Aus der DT-OS 20 40 358 ist ein Verfahren zur Herstellung von Einzellerprotein bekannt, bei dem aus
der Oxidation von flüssigen Alkanen entstandenen Alkoholen, Aldehyden, Ketonen, Carbonsäuren und
deren Derivate als Kohlenstoffquellen verwendet werden.
Aus der DE-AS 21 52 039 ist die Gewinnung von Bakterien-Zellmasse in einem methanolhaltigem Nährmedium
durch die Verwendung der Bakterien-Stämme: Protaminobacter ruber var. machidanus ATCC 21 611,
ATCC21 612.ATCC21 613oder ATCC21 614bekannt.
Aus der DE-OS 23 11 006 ist ein Verfahren zur
Proteinherstellung bekannt, bei welchem der aerobe Mikroorganismus Methylomonas methanolica NRRL-B-5458
auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle gezüchtet wird.
Aus der DE-OS 20 59 277 ist ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Protein bekannt,
welches in geeigneter Nährlösung mit Methanol als einziger Kohlenstoffquelle unter aeroben Bedingungen
die folgenden Bakterien-Stämme verwendet: Pseudomonas methanica, Pseudomonas sp. ATCC 21 438,
Pseudomonas sp. ATCC 21 439, Pseudomonas sp. PRL-W 4, Corynebacterium sp. ATCC 21 232, Corynebacterium
sp. ATCC 21 235 und Corynebacterium sp. ATCC 21 236.
Aus der DE-OS 24 07 740 ist ein Verfahren zur Züchtigung von Mikroorganismen bekannt, bei wel-
ehern eine Mischkultur, bestehend aus einem fakultativ
methanolverwertenden Bakterium, und mehreren nicht methanolverwertenden Bakterien, angewandt wird. Das
methanolverwertende Bakterium ist nicht beweglich und kann neben Methanol auch andere Kohlenstoffsubstrate
wie z. B. Glucose oder Glycerin als Kohlenstoffquelle
verwerten.
Aus der DE-OS 24 18 385 ist ein Verfahren zur Herstellung eines proteinreichen Produktes bekannt,
bei welchem ein nichtrosapigmentierter Stamm, abgeleitet von dem Mikroorganismus Pseudomonas extorquens
(NCIB Nr. 9399), eingesetzt wird.
Für die Züchtung von Protein aus Methanol wird nach diesem Stand der Technik kein obligat methanolverwertendes
Bakterium, sondern es werden fakultativ methylotrophe Mikroorganismen verwendet Dieser
Stand der Technik wird durch das Verfahren der Erfindung überwunden, welches ein obligat methylotrophes
Bakterium zur Züchtung von Einzellerprotein verwertet 2c
Aus einer Bodenprobe vom Rheinufer bei Ludwigshafen wurde ein obligat Methanol verwertendes Bakterium
isoliert. Es wurden 1 g der Bodenprobe in 100 ml wäßrigem anorganischem Nährmedium = KH2PO4
3.75 g; Na2HPO4 2,50 g; (NH4J2SO4 4,00 g;
MgSO4 · 7H2O 0,5 g; Ca(NO3J2 · 4H2O 0,025 g;
FeSO4 - 7H2O 0,005 g; ZnSO4 · H2O 0,005 g in 1000 ml
dest H2O pH = 7,0 mit 1% (V/V) Methanol als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle suspendiert und bei
300C in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben auf der ^0
Schüttelmaschine (100 U/min) inkubiert. Nach 5 Tagen Inkubation wurden davon je 0,1 ml auf Petrischalen
ausgestrichen, die dasselbe Medium mit 2% Agar zur Verfestigung enthielten. Von diesen Platten wurden
nach weiteren 3 Tagen Inkubation bei 300C Einzelkolonien
abgeimpft und durch Verdünnungsausstriche auf Platten mit demselben Medium wurde nach 5 Flüssig-Passagen
die Reinkultur von dem Bakterienstamm erhalten. Der Bakterien-Stamm wurde als Methylomonas
sp. bezeichnet und erhielt die Nr. DSM 580.
Es wurde nun ein Verfahren zur Gewinnung von Einzellerprotein auf Basis von Methanol gefunden,
welches dadurch gekennzeichnet ist, daß in einem begasten Reaktor mit oder ohne einer mechanischen
Rührung eine wachsende Submerskultur mit dem obligat methanolverwertenden Bakterium Methylomonas
sp. DSM 580 unter aeroben Bedingungen erzeugt wird, in der sich Methanol als einzigste Kohlenstoff- und
Energiequelle sowie die für das Wachstum notwendigen Kationen Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Eisen,
Zink, Mangan und die Anionen Phosphat, Sulfat, Nitrat, Chlorid befinden, daß außerdem in dieses System Luft
oder sauerstoffangereicherte Luft bei einer Reaktionstemperatur von 20—45°C zugeführt wird, wobei eine
Zellmasse mit einem jeweils auf das Zelltrockengewicht bezogenen Rohproteingehalt von mindestens
60—76Gew.-°/o, einem Nucleinsäuregehalt von 2—17
Gew.-%, einem Aschengehalt von 3—6 Gew.-%, einem Fettgehalt von 3—8Gew.-% erzeugt wird, und daß
danach aus dem entstandenen Dreiphasensystem die βο
Zeilmasse abgetrennt und getrocknet wird.
Das Verfahren der Erfindung zur Gewinnung von Einzellerprotein erzeugt das obligat Methanol-verwertende
Bakterium Methylomonas sp. DSM 580 mit folgenden charakteristischen Eigenschaften: r,s
1. Zellmorphologie:
Stäbchen in den Grenzen 0,3—0,6 χ 1,0—1,8μ
beweglich mit einer polaren Geißel.
2. Kolonienmorphologie:
Transparent weiß, rund und glatt etwa 1 —2 mm Durchmesser nach 2—3 Tagen.
3. Stammeigenschaft:
Gramnegativ, Zelltrockenmasse schwachrosa.
4. Physiologie:
Streng aerob, Katalase positiv, Methanol-Dehydrogenase
positiv, Hexose-Phosphat-Synthetase positiv, Hydroxy-Pyruvat-Reductase negativ.
| D. Wachstums | Min. | Opt. | Max. |
| eigenschaften: | 20 | 33-36 | 45 |
| 4,5 | 6,5-7,5 | 9,5 | |
| Temperatur ( C) | 0,5-1,5 | 5,0 | |
| pH | |||
| Methanol-Konz. % | |||
| (V/V) | |||
Das Bakterium Methylomonas sp. wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen,
mit der Nummer DSM 580 hinterlegt.
Methylomonas sp. DSM 580 kann nur auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen, nicht
dagegen auf Methan, Methylamin, Äthanol oder Glucose, wie aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich
ist.
| Substrate | Wachstum ') |
| Methan | |
| Methanol | + |
| Methylamin | - |
| Formaldehyd | - |
| Formiat | - |
| Äthanol | - |
| Propanol-(l) | - |
| Propanol-(2) | - |
| Acetat | - |
| Lactat | - |
| Pyruvat | - |
| Succinat | - |
| Ci trat | - |
| Glucose | - |
| Fructose | - |
| Serin | - |
| ') + Wachstum | |
| - kein Wachstum |
Ferner wurde gefunden, daß die von der Zellmasse befreite flüssige Phase ganz oder teilweise in den
Prozeß recyclisiert wird und daß Methylomonas sp. DSM 580 bei chargenweiser Prozeßführung bei einer
Anfangskonzentration von 0,5—5,0 Vol.-%, insbesondere bei 2—3 Vol.-%, Methanol gezüchtet wird und daß
Methylomonas sp. DSM 580 bei chargenweiser Prozeßführung bei gesteuerter Aufrechterhaltung einer
konstanten Methanolkonzentration von 0,01 — 2,0 Vol.-%, bis zu einem Gesamtumsatz von 25 Vol.-%
Methanol gezüchtet wird.
Weiter wurde gefunden, daß Methylomonas sp. DSM 580 bei kontinuierlicher Prozeßführung mit einer
Durchflußrate von 0,1 —0,5 Vol./Vol./Std. unter chemostatischen
oder turbidostatischen Bedingungen gezüchtet wird.
Außerdem wurde gefunden, daß wahrend des Wachstums durch Zusatz von Alkalien bzw. Säuren ein
praktisch konstanter pH-Wert von 4,5-9,0 eingestellt
wird.
Ferner wurde gefunden, daß während der Züchtung in den Reaktor Luft oder sauerstoffangereicherte Luft mit
einer Belüftungsrate von 0,5—1,5 VoL/VoL/Min. zugeführt
wird und das eingeleitete Gasgemisch einen Sauerstoffgehalt von 20—60 Vol.-% aufweist.
Weiter wurde gefunden, daß während der Züchtung in den Reaktor Luft oder sa ^erstoffangereicherte Luft
mit einer Belüftungsrate von 0,1— 0,2 VoL/VoL/Min. zugeführt wird und das eingeleitete Gasgemisch einen
Sauerstoffgehalt von 20—60 Vol.-% aufweist.
Außerdem wurde gefunden, daß die wäßrige Nährlösung als stickstoffquelle Ammonium und/oder Nitrat-Salze
und/oder Harnstoff und Wuchsstoffe enthält.
Das Verfahren der Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläutert:
Ein 801 Bioreaktor, gefüllt mit 501 Nährlösung (Zusammensetzung: 200 g (NH4J2SO4, 150 g KH2PO4,
125 g Na2HPO4, 25 g MgSO4 · 7H2O, 1,25 g
Ca(NO3)2 · 4 H2O, H2O, 0,25 g FeSO4 · H2O, 0,25 g
ZnSO4 · H2O, 0,25 g KCl in 50 1 Wasser) wird 10 Min.
bei 121°C sterilisiert, auf 35°C abgekühlt, aseptisch mit
1000ml Methanol versetzt, mit 500 ml Inoculum von Methylomonas sp. DSM 580 beimpft, 28 Std. bei 35° C
mit einem Turborührer (300 Upm) suspendiert und bei einer Belüftungsrate von 0,7 VoL/VoL/Min. gezüchtet.
Während der Züchtung wird in der Submerskultur durch
atomatische Zugabe von 6 Vol.-% Ammoniaklösung ein konstanter pH-Wert von 7.0 aufrechterhalten. Nach 22
Std. wird der Reaktor auf 15" C gekühlt, der pH-Wert
durch Zusatz von Schwefelsäure auf pH 3.0 eingestellt und die ausgefällte Zellmasse abfiltriert, mit Wasser
gewaschen und getrocknet (324 g Zelltrockenmasse). Die Zellzusammensetzung beträgt: 71% Rohprotein
und 9% Nukleinsäuren, 4% Asche und 7% Fett, bezogen auf die Zelltrockenmasse.
Ein 3401 Bioreaktor, ausgerüstet mit einem »Intensor«,
wird mit 2001 Nährsalzlösung (Zusammensetzung: 500 g (NH4J2SO4, 500 g NH4NO3, 600 g KH2PO4, 500 g
Na2HPO4,140 g MgSO4 · 7H20,15 g Ca(NOj)2 ■ 4H2O,
6 g FeSO4 · 7H2O1 2 g KCl in 200 1 Leitungswasser)
beschickt, der pH-Wert auf 6,8 eingestellt, 15 Min. bei
121°C sterilisiert, auf 33°C abgekühlt, aseptisch mit 2000 ml Methanol versetzt, mit 4000 ml einer 18
Std.-Vorkultur von Methylomonas sp. DSM 580 beimpft und bei 33°C, einer Belüftungsrate von 0,5 VoL/VoL/
Min. und einer Umdrehungszahl von 1800 Upm gezüchtet. Während des Wachstums wird in der
Submerskultur automatisch die Methanolkonzentration auf 0,5 Vol.-% konstant gehalten, indem man die der
Flüssigkeitskonzentration entsprechende Dampfkonzentration an Methanol im Abgas mittels eines
Flammenionisationsdetektors kontinuierlich erfaßt und über einen Grenzwertgeber die notwendige Methanolzugabe
steuert, außerdem wird automatisch mit einer pH-Regulierstation durch Zusatz einer 12vol.-%igen
Ammoniaklösung ein pH-Wert von 6,8 aufrechterhal-
> ten. Nachdem nach 25 Std. bereits ein Zellkonzentration
von 14 g Zelltrockenmasse pro Liter erreicht ist, wird
unter Konstanthaltung der Belüftungsrate mit sauerstoff angereicherter Luft mit einem Sauerstoffgehalt von
40 Vol.% begasL Der Prozeß wird nach 60 Std. auf
ίο 15°C abgekühlt, in einer Durchlaufzentrifuge bei
10 000 g die entstandene Zellmasse abgetrennt und getrocknet. Unter diesen Prozeßbedingungen beträgt
die Zellausbeute 0,44 g Zelltrockenmasse/g Methanol, mit einem Gehalt an 76% Rohprotein, 6,5% Nukleinsäuren,
5% Asche und 4,5% Fett, bezogen auf die Zelltrockenmasse.
Ein 80 1 Bioreaktor, ausgerüstet mit einem »Intensor« wie in Beispiel 2, wird mit 50 I Nährsalzlösung mit einer
Zusammensetzung wie in Beispiel 1 beschrieben, mit 1000 ml einer Kultur von Methylomonas sp. DSM 580
beimpft, die zuvor 15 Std. bei 35° C kultiviert wurde, bei
35CC, einer Belüftungsrate von 0,5 VoiyVoL/Min. und
einer Umdrehungszahl von 1200 Upm bei einem konstanten pH-Wert von 7,0 unter statischen Bedingungen
gezüchtet. Die kontinuierliche Kultur wird nach 18 Std. gestartet bei einer Durchflußrate von 0,05, nach
weiteren 48 Std. wird die Durchflußrate auf 0,1 erhöht und dann innerhalb von 120 Std. stufenweise auf 0,35
gesteigert. Unter diesen Bedingungen wird der Gleichgewichtszustand aufrechterhalten, bei Zellausbeutekoeffizienten
von 0,46 (g Zelltrockenmasse/g Methanol)
is und einer Produktivität von 10,8 g/l/h. Das anfallende
Kulturfiltrat wird nach Erreichung des Gleichgewichtszustandes in einer Menge von 50 Vol.-% in den Reaktor
zurückgeführt unter entsprechender Verringerung der eingeführten Nährlösung.
Die Zellzusammenseizung beträgt: 72% Rohprotein, 4,5% Nukleinsäuren, 3,5% Asche und 5,5% Fett,
bezogen auf die Zelltrockenmasse.
Das Verfahren der Erfindung bietet den Vorteil, daß erstmalig ein obligat methylotrophes Bakterium verwendet
wird, das eine wesentlich höhere Produktivität aufweist gegenüber bekannten fakultativ methylotrophen
Mikroorganismen. Bei dem Verfahren der Erfindung können sich keine Mutanten entwickeln, die
die Fähigkeit auf Methanol zu wachsen verloren haben.
Das Bakterium nach dem Verfahren der Erfindung ist somit sehr stabil, sein Stoffwechsel ist auf ein Minimum
reduziert, weitere genetischen Veränderungen würden zum Absterben der Zellen führen. Ein weiterer Vorteil
des Verfahrens der Erfindung liegt darin, daß die methanol-dissimilatorischen und -assimilatorischen Enzyme
konsitutiv sind. Wenn das Verfahren der Erfindung unter Methanollimitierenden Bedingungen
kontinuierlich durchgeführt wird, ist der Nucleinsäuregehalt der Zellmasse sehr niedrig und der Verlust an
do Methanol durch Verdampfung praktisch gleich Null.
Claims (9)
1. Verfahren zur Gewinnung von Einzellerprotein auf Basis von Methanol, dadurch gekennzeichnet,
daß in einem begasten Reaktor mit oder ohne einer mechanischen Rührung eine
wachsende Submerskultur mit dem obligat methanolverwertenden Bakterium Methylomonas sp.
DSM 580 unter aeroben Bedingungen erzeugt wird, in der sich Methanol als einzigste Kohlenstoff- und
Energiequelle sowie die für das Wachstum notwendigen Kationen Natrium, Kalium, Magnesium,
Calcium, Eisen, Zink, Mangan und die Anionen Phosphat, Sulfat, Nitrat, Chlorid befinden, daß
außerdem in dieses System Luft oder sauerstoffangereicherte Luft bei einer Reaktionstemperatur
von 20—45°C zugeführt wird, wobei eine Zellmasse
mit einem jeweils auf das Zelltrockengewicht bezogenen Rohproteingehalt von mindestens
60—76Gew.-%, einem Nucleinsäuregehalt von
2—17Gew.-%, einem Aschegehalt von 3—6 Gew.-°/o, einem Fettgehalt von 3—8Gew.-% erzeugt
wird, und daß danach aus dem entstandenen Dreiphasensystem die Zellmasse abgetrennt und
getrocknet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die von der Zellmasse befreite flüssige
Phase ganz oder teilweise in den Prozeß recyclisiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Methylomonas sp. DSM 580 bei
chargenweiser Prozeßführung bei einer Anfangskonzentration von 0,5—5,0 Vol.-%, insbesondere bei
2—3 Vol.-%, Methanol gezüchtet wird. .
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß Methylomonas sp. DSM 580 bei chargenweiser Prozeßführung bei gesteuerter
Aufrechterhaltung einer konstanten Methanolkonzentration von 0,01 —2,0 VoL-%, bis zu einem
Gesamtumsatz von 25 VoL-% Methanol gezüchtet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Methylomonas sp. DSM 580 bei
kontinuierlicher Prozeßführung mit einer Durchflußrate von 0,1 —0,5 VoL/VoIVStd. unter chemo tatischen
oder turbidostatischen Bedingungen gezüchtet wird.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß während des Wachstums durch
Zusatz von Alkalien bzw. Säuren ein praktisch konstanter pH-Wert von 4,9—9,0 eingestellt wird.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß während der Züchtung in den
Reaktor Luft oder sauerstoffangereicherte Luft mit einer Belüftungsrate von 0,5—1,5 VolVVolVMin.
zugeführt wird und das eingeleitete Gasgemisch einen Sauerstoffgehalt von 20—60 Vol.-% aufweist.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß während der Züchtung in den
Reaktor Luft oder sauerstoffangereicherte Luft mit einer Belüftungsrate von 0,1—0,2 Vol7Vol7Min.
zugeführt wird und das eingeleitete Gasgemisch einen Sauerstoffgehalt von 20—60 Vol.-% aufweist.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Nährlösung als
Stickstoffquelle Ammonium und/oder Nitrat-Salze und/oder Harnstoff und Wuchsstoffe enthält.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19742458851 DE2458851C3 (de) | 1974-12-12 | Verfahren zur Gewinnung von Einzellerprotein auf Basis von Methanol |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19742458851 DE2458851C3 (de) | 1974-12-12 | Verfahren zur Gewinnung von Einzellerprotein auf Basis von Methanol |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2458851A1 DE2458851A1 (de) | 1976-06-16 |
| DE2458851B2 DE2458851B2 (de) | 1977-06-30 |
| DE2458851C3 true DE2458851C3 (de) | 1978-02-16 |
Family
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