DE2311006A1

DE2311006A1 - Verfahren zur proteinherstellung

Info

Publication number: DE2311006A1
Application number: DE19732311006
Authority: DE
Inventors: L K Heggstrom; Thorstendotter Lena Katharina
Original assignee: Astra Protein Products AB
Current assignee: Astra Protein Products AB
Priority date: 1972-03-09
Filing date: 1973-03-06
Publication date: 1973-09-13
Also published as: JPS48103795A; FR2175199B1; DK132290C; FR2175199A1; DD105003A5; DK132290B; SE373154B; NL7303108A; GB1420264A

Description

Dr. Hans-Heinrich Willrath _D__{62 WIESB}aden ι. 3.1973

Dr. Dieter Weber Postfad.1327 ii/ep

Dipl.-Phys. Klaus Seiffert ·%«««»■

TeletnniMdKuo WILLPATENT PATENTANWÄLTE

KN 316-1

Astra Protein Products AB S-431 20 Mölndal l/Schweden

Verfahren zur Proteinherstellung

Priorität: v.9.Märζ 1972 in Schweden Anm.No.: 2969/72

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Mikroorganismus und speziell ein Verfahren zur Herstellung von Protein hoher Qualität und besserer Ausbeute mit Hilfe eines bisher unbekannten Mikroorganismus, der Methanol oxidiert, sowie Protein, das auf diese Weise hergestellt wurde und für tierischen und menschlichen Verbrauch bestimmt ist.

Die folgenden Bakterien sind dafür bekannt, daß sie bei der Züchtung in Nährlösungen, die Methanol enthalten, Protein produzieren, nämlich: Pseudomonas methanica, Ps. sp. ATCC Wr.21 439, Ps. sp. ATCC Nr. 21 438, und Coryne bacterium, sp ATCC Nr.21 232, Co. sp. ATCC Nr. 21 235 und Co. sp. ATCC Mr. 21 236. Diese Bakterien produzieren eine biologische Masse, die etwa 70 Gew.-% Protein, berechnet als Trocken-

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Frankfurt/M₁In «7 U Btnfc Dresdner Bank AG, Wiesbaden. Konto-Nr. 176 KP

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substanz, und etwa 5 Gew.-% Fett, berechnet auf die gleiche Weise, enthält.

Um jedoch die wirtschaftliche Ausbeute des Verfahrens zu erhöhen, wurden an die Proteinproduktion Anforderungen gestellt, die wesentlich höher sind als jene, die man mit bekannten Bakterienstämmen befriedigen kann.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß es möglich ist, diesen Anforderungen nach der vorliegenden Erfindung zu genügen, da ein neuer, bisher unbekannter Mikroorganismus gefunden wurde, der vorläufig als Methylomonas methanolica, NRRL Nr.B-5458 bezeichnet wurde. Dabei handelt es sich um ein zwingend 1-Kohlenstoff ausnützendes, gramnegatives, stabellenförmiges Bakterium, das mit Hilfe eines polaren Flagellum beweglich ist und unpigmentierte Macrokolonien auf festen Substraten bildet, wobei die Stäbchen 0,6 χ 1,6 /U groß sind.

Auf einer Elektronenmikroskopfotografie besitzen die Stäbchen abgerundete Enden und treten allein oder paarweise auf. In einer Standardkultur können auch etwas gebogene Stäbchen auftreten.

Bei Präparaten, die mit Tusche eingefärbt wurden, kann keine sichtbare Kapsel festgestellt werden, doch bei Elektronenmikroskopfotografien von Dünnschnitten kann eine ungewöhnliche Struktur auf der Zellwand unterschieden werden. Mit Sudan-

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schwarz eingefärbte Zellen zeigen keine Affinität gegenüber diesem Farbstoff, weder in logarithmischer Phase noch in stationärer Phase. Außerdem ist der Mikroorganismus katalase- und oxydasepositiv.

Kolonien auf Agarplatten unter Zugabe von Methanol sind weiß bis fahlgelb, an allen Kanten abgerundet, ziemlich flach und ergeben einen teilweise transparenten Eindruck. Nach einem Tag Züchtung sind die Kolonien punktförmig, und nach sechs Tagen besitzen sie einen Durchmesser von 3 bis 4 mm.

Die optimale Wachstumstemperatur liegt bei 3O°C. Die Wachstumsgeschwindigkeit wird bei 15 C und 38 C merklich vermindert. Bei 4O°C wächst die Kultur bei der ersten Umsetzung, wächst aber nicht mehr in Subkulturen hiervon.

Der optimale pH-Wert für das Wachstum in einem flüssigen Medium liegt bei 6,3 bis 6,9, während Wachstum im GesanutpH-Bereich von 5,3 bis 8,5 stattfindet.

Für eine maximale Wachstumsgeschwindigkeit sollte die Methanolkonzentration unter einem Volumen-% gehalten werden. Bei höheren Konzentrationen nimmt die Wachstumsgeschwindigkeit und die Ausbeute schnell ab, und bei einer 6 Volumen-% übersteigenden Konzentration findet kein Wachstum mehr statt.

Unter den angewendeten experimentellen Bedingungen unter Verwendung eines Schüttelbrettes, aber ohne pH-Kontrolle

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oder Kontrolle des Substratverbrauches, liegt die Entwick- lungs- oder Generationszeit ziemlich konstant zwischen 1,5 und 1,8 Stunden.

Ammoniumchlorid wird routinemäßig als Stickstoffquelle in Nährlösungen benützt, doch der Mikroorganismus nützt auch fast gleich gut Nitrate, Aminosäuren (Casaminosäuren) und Hefeextrakte aus. Nitrit und Harnstoff unterstützt das Wachstum ebenfalls, doch weniger stark, und sie hemmen das Wachstum in Konzentrationen oberhalb 0,1 g/l der Währlösung. Bei der Züchtung in einem Medium, das Nitrat und Ammoniumsalze enthält, findet man eine analysierbare Menge an Nitrit.

Methanol ist eine der bisher bekannten zwei Kohlenstoffquellen, die der vorliegende Mikroorganismus, der Methylo- monas methanolica, NRRL B-5458 genannt wird, für das Wachstum ausnützen kann. Wachstumsversuche wurden auf Medien durchgeführt, die als alleinige Kohlenstoffquelle folgende Substanzen enthielten: Methan, n-Alkanole, wie Äthanol, Propanol, Butanol und Pentanol, Aldehyde, wie Formaldehyd, Acetaldehyd, Propionaldehyd, Butyraldehyd und Valeraldehyd, Carbonsäuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure und Valeriansäure, andere organische Säuren, wie Zitronensäure, Milchsäure, Puruvsäure (puruvic acid), Bern steinsäure, Fumarsäure, ^K -Ke tog Iu tar sauce und Oxalsäure, Zucker und entsprechende Verbindungen, wie Glucose Fructose, Lactose, Sucrose, Maltose, Mannose, Xylose, Arabinose, Glyce-

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rin, Sorbit, Mannit und Inosit, komplexe Medien, wie Hefeextrakt, Nährbrühe und Pepton,· Casaminosäuren und Indol, doch mit allen diesen wurde überhaupt kein Wachstum erhalten.

Die zweite Kohlenstoffquelle, die der vorliegende Mikroorganismus auszunützen scheint, ist Methylamin. Der Mikroorganismus ist somit ein solcher, der obligatorisch 1-Kohlenstoff ausnützt.

Kulturmedien, die routinemäßig verwendet wurden, bestanden aus Mineralsalzen folgender Zusammensetzung und Konzentration. Die Kulturmedien bestanden aus wässrigen Lösungen der folgenden Mineralsalze:

mg/1

Na₂HPO₄	7	H₂O	600
KH₂PO₄			400
MgSO₄ ·	6	H₂O	200
NH₄Cl	2	H₂O	800
FeCl₃ ·	7	H₂O	8,35
CaCl₂ ·	5	H₂O	0,33
ZnSO₄ ·	4	H₂O	0,09
CuSO₄ ·	6	H₂O	0,08
MnSO₄ ·		0,08
CoCl₂ ·		0,09

In jenen Fällen, wo Methanol verwendet wurde, d.h. in allen Fällen mit Ausnahme der Kohlenstofftests, wurde dieses in einer Menge von 0,3 Volumen-% verwendet, wobei der pH-Wert

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des Kulturmediums 6,7 betrug.

Feste Substrate wurden auf Platten derart benützt, daß Noble Agar (Difco) dem obigen Grundnährmedium in einer Menge von 1/5 % (Gewicht je Volumen) zugesetzt wurde.

Nach der Autoklavenbehandlung und dem Kühlen auf 45 C wurde Methanol in einer Menge von 0,5 Volumen-% zugesetzt.

Bei Wachstumsversuchen unter Verwendung anderer Kohlenstoffquellen als Methanol wurde 0,1 % (Gewicht je Volumen) der Kohlenstoffquelle oder weniger (0,05 % bei den Aldehyden) , wenn eine Hemmwirkung befürchtet wurde, zugesetzt. Wenn nach drei Wochen Inkubation kein Wachstum erfolgte, wurde dies als Anzeichen dafür gewertet, daß eine Ausnutzung der Kohlenstoffquelle und damit des fraglichen Substrates nicht möglich war.

Proben aus verschiedenen Quellen, wie Erdreich von unterschiedlichen Stellen, Wasser, Schlamm aus Teichen, Komposterde und Schlamm kommunaler Abwässer, wurden in den Anreicherungsversuchen verwendet. Etwa 1 g der Probe wurde in 100 ml flüssiges Medium geimpft, das mit 1 Volumen-% Methanol ergänzt worden war, und statisch bei 30°C 4 bis 7 Tage inkubiert. Röihenverdünnungen wurden vorgenommen, bevor die angereichertea Medien auf Methanol-Agarplatten verteilt wurden. Nach Inkubation während 6 bis 7 Tagen wurden einzelne Kolonien herausgenommen, serienmäßig verdünnt und auf neue

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Platten ausgebreitet. Dieses Verfahren mußte gewöhnlich fünfmal wiederholt werden, bevor man eine reine Kultur eines Organismus erhielt. Die Reinheit der Kulturen wurde durch mikroskopische Prüfung der Agarplatten mit lebenden Zellsuspensionen unter einem Phasenkontrastmikroskop und von angefärbten Präparaten sichergestellt.

Reine Kulturen wurden routinemäßig hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, Methanol als Kohlenstoffquelle und Energiequelle bei einer Inkubation in flüssigen Kulturmedien auszunützen. Um als wirklicher methanoloxydierender Organismus angesehen zu werden, mußte eine Kultur gleich gut in wenigstens fünf Reihensubkulturen mit einer Gesamtverdünnung von 1O~ wachsen.

Der gefundene Mikroorganismus, der hier vorläufig als Methylomonas methanolica, NRRL B-5458 nach dem System von Whittenbury und nach J.W.Foster und R.H.Davis, Journal of Bacteriology, 91, 1924 (196&) bezeichnet wird, wurde zur Herstellung von biologischer Masse in einem ansatzweise durchgeführten Verfahren verwendet. In diesem Verfahren wurde das oben erwähnte flüssige Ausgangsmedium benützt. Vorratskulturen des Stammes wurden auf festen Kulturmedien nach den obigen Angaben aufbewahrt.

Bei der Herstellung einer Impfkultur für die Experimente unter Gewinnung der biologischen Masse wurden drei aufeinanderfolgende Umsetzungen oder Übertragungen in Schüttel-

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brettkolben vorgenommen. Die Zellen wurden am Ende der logarithmischen Phase geerntet, Zentrifugiert und erneut in einem kleinen Volumen frischen Nährmediums suspendiert, bevor sie in einem Experiment verwendet wurden.

Für die Züchtung wurde eine Biotec LP 600-Züchtungsanlage verwendet, die eine automatische Temperaturkontrolle und eine pH-Wertkontrolle sowie eine stufenlose Antriebsvorrichtung mit magnetischer Kupplung des Flügelrades enthielt. Die Fermentiereinrichtung (BiotecEL 103) hatte folgende Abmessungen:

Durchmesser 160 mm, Höhe 200 mm und vier Prallwände. Das achtflügelige Flügelrad besaß einen Durchmesser von 70 mm und befand sich 70 mm vom Boden entfernt. Das Volumen des Nährmediums betrug 2500 ml, und die Geschwindigkeit des Rührers betrug 900 U/min. Bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,75 WM betrug die SauerstoffÜberführungsgeschwindigkeit 150 mMol Sauerstoff je Liter und Stunde. Der pH-Viert wurde durch Zugabe von 1 m NH.OH eingestellt. Die Methanolkonzentration wurde mit Hilfe von Messungen der Methanolmenge der austretenden Luft nach dem katalytischen Verbrennungsprinzip kontrolliert.

Gelöster Sauerstoff (pO2> wurde mit Hilfe einer Sonde nach M.J.Johnson, J.Brokowski und C.Engblom, Biotechn.Bioeng. 6, Seite 457 (1964) analysiert. Die Werte für p0₂, die zugesetzte Menge an NH^OH und die zugesetzte Menge an Methanol wurden

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kontinuierlich aufgezeichnet. Die Züchtungstemperatur betrug 3O°C.

Das Wachstum wurde durch Messungen des Trockengewichtes und der optischen Dichte der erhaltenen biologischen Masse verfolgt. Millipore-Membranfilter HAWP. 04700 (HA 0,45 ,u, Durchmesser 47 mm) wurden zur Bestimmung des Trockengewichts der biologischen Masse verwendet. Die Filter wurden bei 105°C drei Stunden getrocknet. Die optische Dichte wurde in einem Linson-3-Colorimeter mit einer Wellenlänge von 620 nm gemessen.

Gaschromatografische Analysen wurden in einem Perkin-Elmer-Gaschromatografen unter Verwendung einer Säulentemperatur von 40°C und unter Verwendung von Helium als Trägergas durchgeführt. Die Sauerstoff- und Stickstoffkonzentrationen wurden direkt gemessen, während Kohlendioxid als Rest berechnet wurde. Die Methanolbestimmung in dem Medium wurde in einem Pye-Gaschromatografen Modell 64 unter Verwendung eines Flammenionisierungsdetektors durchgeführt, wobei die Säulentemperatur 135°C betrug und die Säule mit Poropak Q gepackt war.

Für den oben erwähnten Mikroorganismus begann die Beschleunigungsphase während der zweiten Züchtungsstunde und dauerte sechs Stunden. Die logarithmfeche Phase dauerte fünf Stunden und repräsentierte eine Zunahme der biologischen Masse von 0,3 auf 3,0 g/l. Die Abnahmephase setzte sich bis zur 24.Stunde der Züchtung fort. Die stationäre Phase begann bei einer Kon-

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zentratlon der biologischen Masse von 7,2 g/l. Die Werte der Ausbeute der biologischen Masse, der Wachsturasgeschwindigkeit und der Produktivität der logarithmischen Phase sowie des gesamten Verfahrens mit dem Ansatz sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengestellt. Der Methanolverbrauch ist in der Tabelle II gezeigt.

In der logarithmischen Phase ist der Methanolverbrauch je Einheit der biologischen Masse stabil. In dieser Phase ist der Ausbeutekoeffizient der höchste. In der Abnahmephase ist der Ausbeutekoeffizient folglich geringer.

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Tabelle I

logarithmisch^ Phase

Gesamtverfahren mit einem Ansatz

Ausbeute an biologischer Masse, g/l

3,0

benötigte maximale Sauerstoffüberführungsgeschwindigkeit , mMol Sauerstoff/Liter, Stunde 138,90

7,2

maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit je Stunde	0,510	0,30
Entwicklungs- oder Generationszeit (Stunden)	1,36	1,55
Produktivität, g/l, Stunde	0,84	4,17
maximale Produktivität, g/l, Stunde	2,6	0,240
Methanolverbrauch, g je 1 g der biologischen Masse	2,99	30,70
Methanol-Ausbeutekoeffizient, g/g	0,344	4,33
Methanolkohlenstoffumwandlung, % (Gewicht/Gewicht)	42,77	0,231
Sauerstoffverbrauch, g je 1 g der biologischen Masse	2,87
Sauerstoff-Ausbeutekoeffizient g/g	0,348

138,90

In einer kontinuierlichen Züchtung wird die maximale Produktion mit 2,2 g biologische Masse je liter und Stunde oder höher bestimmt.

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- 12 Tabelle II

Menge der biologischen Masse, g/l

Methanolverbrauch

g/i

Ausbeutekoeffizient/ g CH₃OiVg der bioloschen Masse

0,5 I/O 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 6,5

3,7

6,3

9,0

12,2

15,2

19,0

22,5

0,25 0,33 0,33 0,33 0,33 0,28 0,18 0,125

Die Gesamtzusammensetzung der biologischen Masse in der logarithmischen Phase ist in Tabelle III aufgeführt. Der Rohproteingehalt betrug 87,7 Gew.-%. Die Methan©lumwandlung betrug 42,76 %. Die Kohlenstoffgewinnung in der logarithmischen Phase betrug 98,5 - 1,5 %.

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- 13 Tabelle III

Die Elementenzusaminensetzung der biologischen Masse, die man unter Verwendung von 0,3 Volumen-% Methanol erhielt. Die biologische Masse wurde mit 1,3 g biologischer Masse je Liter des Nährmediums geerntet.

Element	g/100 g der biologischen Masse, Trocken gewicht	Element	mg/100 g der biologischen Masse, Trocken gewicht
C	47,90	Fe	115
O	23,75	Cu	33
N	13,95	K	30
H	7,20	Na	20
P	2,60	Zn	10
S	2,40	Ca	2
Cl	0,50	Co	0,50
Mg	0,28	Mn	0,28
Asche	4,80	MO	0,20

Bei Verwendung eines methanoloxydierenden Bakterium, wie des oben erwähnten Methylomonas methanolica, NRRL B-5458, kommt mn zum Ergebnis, daß der stamm eine höhere Wacnsturnsgeschwindigkeit als andere Bakterienstämme besitzt, die nicht obligatorisch Methanol oxydieren, daß der Stamm für die Entgiftung methanolhaltiger Substrate ohne gleichzeitige Oxydation anderer Kohlenstoffquellen in dem Substrat verwendet werden kann und daß der Stamm für sein Wachstum

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nicht tote oder lysierte Zellen ausnützen kann. Diese letztere Tatsache ergibt Vorteile in einem ansatzweisen Ver fahren in der stationären Phase. Es ist auch wahrscheinlich, daß in diesem letzteren Fall weniger Sekundärprodukte er halten werden, wodurch ein reineres und besser definiertes Protein erhalten werden sollte.

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Claims

Patentansprüche

1.) Verfahren zur Proteinherstellung, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer geeigneten Nährlösung unter Verwendung von Methanol als einzige Kohlenstoffquelle aerob den Mikroorganismus Methylomonas methanolica NRRL B-5458 züchtet, der ein obligatorisch 1-Kohlenstoff ausnützendes gramnegatives, stäbchenförmiges Bakterium ist, welches mit Hilfe eines polaren Flagellum beweglich ist, auf festen Substraten unpigmentierte Macrokolonien bildet und dessen Stäbchen 0,6 χ 1,6 ,u groß sind.

2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Nährstofflösung eine Methanolmenge von nicht mehr als 6 Volumen-%, vorzugsweise von nicht mehr als 1 Volumen-%, verwendet.

3.) Verfahren nadi Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nährlösung mit einem pH-Wert von 5,3 bis 8,5, vorzugsweise von 6,3 bis 6,9, verwendet.

4.) Verfahren nah Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Beendigung der Züchtung die dabei erhaltene biologische Masse von der Nährlösung abfiltriert.

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