DE2454931C2 - Verfahren zur Herstellung von D-Ribose - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von D-RiboseInfo
- Publication number
- DE2454931C2 DE2454931C2 DE2454931A DE2454931A DE2454931C2 DE 2454931 C2 DE2454931 C2 DE 2454931C2 DE 2454931 A DE2454931 A DE 2454931A DE 2454931 A DE2454931 A DE 2454931A DE 2454931 C2 DE2454931 C2 DE 2454931C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- ribose
- ifo
- activity
- μμοι
- bacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/839—Bacillus subtilis
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Als Bestandteil von Nucleinsäuren kommt D-Ribose in allen Organismen vor; Ribit ein Reduktionsprodukt
von D-Ribose, ist in Vitamin B2 und Ribit enthaltender Teichonsäure, einem Bestandteil der Zellwandungen,
vorhanden. Somit ist Ribose eine physiologisch sehr wichtige Substanz. Ferner haben D-Ribose und inre
Derivate bisher als Ausgangsmaterialien für die Synthese von Vitamin B2 und den sogenannten Nucleinsäure-Würzmitteln eine große Beachtung gefunden; demzufolge war die Entwicklung eines technischen Verfahrens
zur Herstellung von D-Ribose sehr erwünscht
der Fermentierung ist außerordentlich gering. Somit sind diese Verfahren für die technische Herstellung von
Im Zusammenhang mit den Verfahren zur Herstellung von D-Ribose unter Verwendung von Organismen aus
der Gattung Bacillus haben Sasajima und Yoneda bereits zwei Verfahren veröffentlicht, bei denen ein D-Ribose
erzeugender Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der für sein Wachstum L-Tyrosin, L-Tryptophan und
L-Phenylalanin benötigt, in einem Nährboden gezüchtet wird, der L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin
in Mengen von je mehr als ca. 100 γΐταλ enthält, bzw. die als Shi 5 und Shi 7 bezeichneten, keine Transketolase
aufweisenden Stämme der Gattung Bacillus oder der mit Glue 34 bezeichnete, keine D-Ribulosephosphat-3-epimerase aufweisende Stamm der Gattung Bacillus verwendet werden.
Das erstgenannte Verfahren ist in der britischen Patentschrift 12 55 254 und das zuletzt genannte Verfahren in
Agricultural and Biological Chemistry, Band 35, Seite 509 (1971), beschrieben.
Die Häufigkeit der Sporenbildung, die Stärke der 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität, der Transketolaseaktivität und der D-Ribulosephosphat-3-epimeraseaktivität der in den vorbekannten Verfahren verwendeten
Stämme wurde aber nicht erwähnt; im folgenden wird D-Ribulosephosphat-3-epimerase einfach als Epimerase
bezeichnet.
Daß diese Stämme Sporen zu bilden vermögen, ist mindestens aus der Tatsache ersichtlich, daß die Sporenbildung eines der hervorstechendsten Merkmale von Mikroorganismen der Gattung Bacillus ist, und folgt auch aus
dem Axiom, daß im allgemeinen das Fehlen eines besonderen Hinweises auf die Sporenbildung in einer Aussage
über einen Mikroorganismus der Gattung Bacillus bedeutet, daß der spezielle Mikroorganismus Sporen zu
bilden vermag (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Aufl., S. 613 [1957]).
Überdies haben diese bekannten Stämme eine sehr geringe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität, bestimmt
mittels des im folgenden beschriebenen Verfahrens zum Testen der 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität;
diese enzymatische Wirkung der genannten Stämme beträgt 0,01 bis 0,02 μΜοΙ pro Minute und pro mg Protein.
Wie in den oben beschriebenen Veröffentlichungen selbst zugegeben wird, werden nach diesen Verfahren
bestenfalls nur ca. 35,3 mg D-Ribose pro ml erhalten.
Die 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität der genannten Stämme, erhalten nach dem erwähnten Bestimmungsverfahren, und die in den obenerwähnten Veröffentlichungen angegebenen höchsten in der Flüssigkeit
angereicherten D-Ribosemengen sind in der folgenden Tabelle angegeben.
| 50 | Britisches Patent | Mikroorganismus | 2- Desoxy- D-glucoseoxy- | Angereicherte |
| 55 12 55 254 | dationsaktivität | D-Ribose | ||
| (μ-Mol/min/mg Protein) | (mg/ml) | |||
| Bacillus pumilus Nr. 503 | 0,01 | 28,5 | ||
| Bacillus pumilus Nr. 537 | 0,02 | 30,5 | ||
| 60 Agricultural and | Bacillus pumilus Nr. 558 | 0,01 | 29,3 | |
| Biological Chemistry | Bacillus subtilis Nr. 429 | 0,01 | 26,5 | |
| 35,509(1971) | Bacillus subtilis Nr. 483 | 0,01 | 29,5 | |
| Bacillus-Art Shi 5 | 0,01 | 28,4 | ||
| Bacillus-Art Shi 7 | 0,02 | 35,3 | ||
| Bacillus-Art Glue 34 | 0,01 | 24,8 |
der Gattung Bacillus, denen einerseits wenigstens Transketolase und/oder Epimerase fehlt und die andererseits
keine Sporen zu bilden vermögen und/oder eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität haben, ein unge-
wohnlich hohes Vermögen zur Anreicherung von D-Ribose haben. Daraus ergaben sich weitere Untersuchungen,
die zum Verfahren gemäß vorliegender Erfindung führten, nach dem D-Ribose in einer Menge von ca. 65 bis
70 mg pro ml erzeugt und angereichert werden kann.
Im Zusammenhang mit Verfahren zur Herstellung von D-Ribose unter Verwendung von Mikroorganismen
wurden bisher noch keinerlei Untersuchungen über die Beziehung zwischen dem Sporenbildungsvermögen und
der Ausbeute an D-Ribose ausgeführt; die Erfindung beruht auf der ersten Untersuchung dieser Art Abgesehen
davon, daß somit durch die Ausführung der Erfindung eine erhöhte Ausbeute an D-Ribose erzielt werden kanu,
hat die Erfindung auch den zusätzlichen Vorteil, der die natürliche Folge des Fehlens der Sporenbildung ist, daß
das lästige Verfahren zur Entfernung der Sporen nicht erforderlich ist und das gewünschte Produkt sehr leicht
gewonnen werden kann.
Der Ausdruck »Fehlen der Sporenbildung« wird in der vorliegenden Patentschrift in folgendem Sinne verwendet:
Wenn die gesamte Lebensfähigkeit der Population und die Sporenzahlen nach dem im folgenden
beschriebenen Verfahren bestimmt werden, das analog dem in Journal of General and Applied Microbiology,
Band 16, S. 430, letzte Zeile, bis S. 431, Zeile 5 (1970), beschriebenen Verfahren ist, so beträgt der Quotient aus
der Sporenzahl und der gesamten Lebensfähigkeit der Population, d.h. die »Sporenbildungshäufigkeit«, nicht
mehr als 10~4.
Verfahren zur Bestimmung der Sporenbildungshäufigkeit
Eine öse voll einer Schrägkultur des Stammes, dessen Sporenbildungshäufigkeit bestimmt werden soll, wird in
5 ml eines modifizierten Schaeffer-Nährbodens (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, Band 54, Seite 704 [1965]), der 1,0% D-Glucose, 0,8% Difco-Nährbouillon, 0,01% Shikimisäure,
0,025% MgSO4 · 7 H2O und 0,1% KCl enthielt und 10-6molar an FeCl3 ■ 6 H20,10-3molar an CaCl2 · 2 H2O
und 10-5molar an MnCl2 · 4 H2O war, wobei CaCl2 ■ 2 H2O und MnCI3 · 4 H2O getrennt sterilisiert wurden,
übergeführt Der Nährboden wurde vor der Sterilisierung auf pH = 7,0 eingestellt Nach dreitägiger Bebrütung
bei 37°C wurde die Kultur in 2 Portionen von 2,5 ml geteilt, von denen eine 30 Minuten lang auf 80cC erhitzt
wurde. Sowohl die nicht erhitzte Kultur (gesamte Lebensfähigkeit) als auch die erhitzte Kultur (Sporenzahl)
wurden entsprechend verdünnt und auf einen modifizierten Schaeffer-Agarnährboden gestrichen, der durch
Zusatz von 2% Agar zu dem oben beschriebenen modifizierten Schaeffer-Nährboden hergestellt wurde. Die
lebensfähigen Zellen wurden nach zweitägiger Bebrütung bei 37° C gezählt. Die Sporenbildungshäufigkeit des jo
Teststammes ist der Wert des Quotienten aus der Sporenzahl und der totalen Lebensfähigkeit der Population.
In der vorliegenden Patentschrift wird der Ausdruck »Fehlen von Transketolase oder Epimerase« im folgenden
Sinne verwendet: Wenn nach dem in Journal of Biological Chemistry 223,1009 (1956), Archives of Biochemistry
and Biophysics 74, 306 (1958) und 74,315 (1958), beschriebenen Verfahren das Ausmaß der Oxydation der
reduzierten Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid (die im folgenden als NADH bezeichnet wird) bestimmt
und die spezielle enzymatische Aktivität für den Zellenextrakt (A), der nach dem im folgenden beschriebenen
Verfahren hergestellt wird, berechnet wird, ist dieser Wert nicht größer als 0,01 μΜοΙ pro Minute und pro mg
Protein.
(I) Verfahren zur Herstellung eines Zellenextraktes (A)
Eine Schrägkultur eines Stammes, dessen Transketolaseaktivität oder Epimeraseaktivität bestimmt werden
soll, wird in einen Nährboden vom pH = 7,0 geimpft, der 2,0% Sorbit, 0,1% Natrium-L-glutamat, 0,1 % KH2SO4,
0,3% K2HPO4,0,5% (NH4J2SO4,0,1% MgSO4 · 7 H20,0,001% FeSO4 · 7 H2O, 0,001% ZnSO4 · 7 H20,0,001%
MnSO4 · 4-6 H20,100-4000 μg/Liter Biotin, 100-3000 μg/Liter Thiamin-hydrochlorid und 100 μg/ml Shikimisäure
enthält, worauf der geimpfte Nährboden unter Schütteln 24 Stunden lang bei 32 bis 37° C bebrütet wird.
Die resultierende Kulturbrühe wird zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, die ihrerseits zweimal mit einer
Pufferlösung vom pH = 7,5 aus 0,01 molarem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und Salzsäure, der 0,001 molar
an Mercaptoäthanol ist, gewaschen und wieder in dem obigen Puffer suspendiert werden, um eine Zellensuspension
herzustellen, deren Adsorptionsvermögen bei 650 nm 10 beträgt. Dann wird Eiweiß-Lysozym zu der
Suspension gegeben, so daß sich eine Konzentration von 50 μg pro ml ergibt; man läßt die Reaktion 30 bis 90
Minuten lang bei 37°C vor sich gehen und zentrifugiert das Gemisch dann. Die resultierende überstehende
Flüssigkeit wird als obiger Zellenextrakt (A) verwendet.
(H)-I Lösungen für die Bestimmung der Transketolaseaktivität
Reaktionslösung A(I1Il ml)
20 μΜοΙ D-Ribose-5-phosphat, 0,5 μΜοΙ NADH, eine genügende Menge D-Ribose-5-phosphatketolisomerase
und Epimerase, 0,66 Einheiten Λ-Glycerophosphatdehydrogenase, die genügend Triosephosphatisomerase
enthält, 0,43 μΜοΙ Thiaminpyrophosphat und 40 μΜοΙ Tris-(hydroxymethyI)-aminomethan-Salzsäure-Pufferlösung
vom pH =7,5.
Reaktionslösung B (0,89 ml)
20 μΜοΙ MgCb, 0,43 μΜοΙ Thiaminpyrophosphat, 40 μΜοΙ Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Pufferlösung
vom pH 7,5 und 10 μΙ der Enzymlösung.
(II)-2 Lösungen für die Bestimmung der Epimeraseaktivität
Reaktionslösung A (0,9 ml)
Reaktionslösung A (0,9 ml)
20 μΜοΙ D-Ribose-5-phosphat, 20 μΜοΙ MgCb, 0,43 μΜοΙ Thiaminpyrophosphat, genügend Transketolase
und 40 μΜοΙ Tris-(hydroxymeth;'l)-aminomethan-Salzsäure-Pufferlösung vom pH 7,5.
Reaktionslösung B (1,09 ml)
0,5 μΜοΙ NADH, 0,66 Einheiten ar-Glycerophosphatdehydrogenase, die genügend Triosephosphatisomerase,
genügend D-Ribose-5-phosphatketolisomerase und Transketolase enthält, und 60 μΜοΙ Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Pufferlösung
vom pH 7,5.
(HI)-I Verfahren zur Bestimmung der Transketolaseaktivität
Jede Reaktionslösung wird 10 Minuten lang bei 30° C bebrütet, worauf die Reaktionslösungen gemischt
werden (das Gesamtvolumen beträgt 2 ml). Die Änderung des Absorptionsvermögens bei 340 nm wurde bei
300C mit einem Gilford Multiple Sample Absorbance Recorder 2000 bestimmt.
(III)-2 Verfahren zur Bestimmung der Epimeraseaktivität
Die Reaktionslösung A wird bei 3O0C 30 Minuten lang bebrütet, und die Reaktionslösung B wird bei 300C
10 Minuten lang bebrütet. Die Reaktionslösungen werden gemischt Dann werden 10 μΐ der Enzymlösung zu
dem Gemisch gegeben (das Gesamtvolumen beträgt 2 ml). Die Veränderung des Absorptionsvermögens bei
340 nm wurde in gleicher Weise wie bei der Bestimmung der Transketolaseaktivität gemessen.
(IV) Berechnung der Enzymaktivität
Die Enzymaktivität (μΜοΙ pro Minute und pro mg Protein) in der Enzymlösung entspricht der folgenden
Formel:
-ΛE340 /min x
worin — JEWmin die Geschwindigkeit der Abnahme des Nettoabsorptionsvermögens der gemischten Reaktionslösung
bei 340 nm innerhalb 1 Minute bedeutet, V das Gesamtvolumen der gemischten Reaktionslösung
(2 ml) darstellt, Σ der molekulare Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm (6,22 αη2/μΜο1) ist, d den
Lichtweg (1 cm) bedeutet, E das Volumen der Enzymlösung (0,01 ml) darstellt und ρ die Konzentration des
Proteins in der Enzymlösung (mg pro ml) ist.
In dieser Patentschrift wird der Ausdruck »hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität« im folgenden Sinne
verstanden: Wenn bei einem Zellenextrakt (B), der nach den im folgenden zu beschreibenden Verfahren zur
Herstellung von Zellenextrakt (B) hergestellt ist, das Ausmaß der Reduktion von Nicotinamid-adenindinucleotid
(NAD+) unter Verwendung der Reaktionslösung für die Bestimmung der 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität,
die ebenfalls im folgenden beschrieben werden soll, bestimmt wird und auf Grund dieses Ausmaßes die
enzymatische Aktivität des Extraktes nach der Formel berechnet wird, die vorstehend als Ausdruck für die
Transketolase- oder Epimeraseaktivität angegeben ist, wird ein Wert gefunden, der nicht kleiner als 0,05 μΜοΙ
pro Minute und pro mg Protein, aber nicht größer als 1,00 μΜοΙ pro Minute pro mg Protein ist.
(I) Verfahren zur Herstellung von Zellenextrakt (B)
Ein Nährboden, der 0,5% Sorbit, 0,65% Natrium-L-glutamat, 0,1% KH2PO4, 0,3% K2HPO4, 0,1% Na2SO4,
0,01% MgSO4 ■ 7 H20,0,004% Biotin. 0,0003% Thiaminhydrochlorid und 0,01% Shikimsäure enthält, wird aus
einer Schrägkultur mit einem Stamm, dessen 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität bestimmt werden soll,
geimpft und unter Schütteln 20 Stunden lang bei 37° C bebrütet. Aus der Brühe werden die Zellen durch
Zentrifugieren geerntet, zweimal mit einer Pufferlösung vom pH = 7,5 aus 0,01 molarem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
und Salzsäure, die an Mercaptoäthanol 0,001 molar ist, gewaschen und wieder in dem obigen
Puffer suspendiert, um eine Zellensuspension herzustellen, deren Absorptionsvermögen bei 650 nm 100 beträgt.
Die Suspension wird bei 160W 10 Minuten lang mit einem Ultraschallzerkleinerer behandelt, wodurch die
Zellen zerrissen werden. Das Sediment wird durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Fraktion ist der
Zellenextrakt (B).
(II) Reaktionslösung für die Bestimmung der 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität
1,2 ml einer Pufferlösung vom pH =8,0 aus 1 molarem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und Salzsäure,
0,2 ml einer O.lmillimolaren Lösung von MnSO4 · 4—6 H2O, 0,2 ml einer 20millimolaren N AD + -Lösung, 0,2 ml
einer 1 molaren 2-Desoxy-D-glucos<;lösung und 0,2 ml des Zellenextrakts (B)(Reaktionstemperatur 300C).
Die erfindungsgemäß eingesetzten Stämme der Gattung Bacillus haben einerseits wenigstens keine Transketolase
und/oder Epimerase und andererseits eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität und/oder kein
Sporenbildungsvermögen. Diese Stämme wurden aus Bacillus pumilus und Bacillus subtilis nach verschiedenen
Verfahren erhalten, beispielsweise durch Bestrahlen der Ausgangsstämme mit ultraviolettem Licht, Röntgenstrahlen,
Gammastrahlen od. dgl., oder durch Einwirkenlassen von chemischen Mutagenen, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin,
Stickstofflost, Dimethylsulfoxyd, Äthylmethansulfonat usw., auf die Ausgangsstämme. Es
ist natürlich möglich, zuerst einen Stamm zu erhalten, der keine Transketolase und/oder Epimerase aufweist, und
den Stamm einer weiteren Mutation zu unterwerfen, um einen Stamm herzustellen, der kein Sporenbildungsvermögen
und/oder eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität hat, oder diese beiden Stufen des Verfahrens
zur Herstellung der gewünschten Mutante zu vertauschen. Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme sind
Bacillus pumilus IFO 13566, IFO 13585 und IFO 13620 sowie Bacillus subtilis IFO 13565, IFO 13573, IFO 13586,
IFO 13588 und IFO 13621.
Die Zahlen nach dem Wort IFO bedeuten die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka,
Japan.
Was die Nährstoffe angeht, die als Bestandteile eines Nährbodens für die Züchtung von Mikroorganismen
verwendet werden, so gehören zu den Kohlenstoffquellen u. a. D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Sorbit,
D-Mannit, Saccharose, Melasse, Stärkehydrolysate, Stärke, Essigsäure und Äthanol. Zu den Stickstoffquellen
gehören organische Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Baumwollsamenabfälle, Hefeextrakt, Trockenhefe,
Fischmehl, Fleischextrakt, Pepton, das als »casamino acid« bezeichnete Caseinhydrolysat usw., anorganische
Stickstoffverbindungen, wie wäßriges Ammoniak, Ammoniakgas, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat usw., und organische Stickstoffverbindungen,
wie Harnstoff, Aminosäuren usw. Abgesehen von den genannten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können
dem Nährboden verschiedene Metalle, Vitamine, Aminosäuren und andere Substanzen zugesetzt werden, die für
das Wachstum des speziellen Mikroorganismus unbedingt erforderlich sein mögen und deren Mengen beliebig
sind.
Die Züchtung wird aerob ausgeführt, z. B. durch Schütelkultur oder submerse Kultur unter Durchblasen von
Luft und Rühren. Die Bebrütungstemperatur wird gewöhnlich je nach der Temperatur, die sich für das Wachsturn
des speziellen Organismus und die Anreicherung von D-Ribose eignet, im Bereich von 20 bis 45°C gewählt.
Der pH-Wert des Nährbodens liegt vorzugsweise irgendwo zwischen ca. 5 und c?. 9.
Um den pH-Wert während der ganzen Züchtungsdauer in dem optimalen bereich zu halten, kann man von
Zeit zu Zeit eine neutralisierend wirkende Substanz, wie Salzsäure, Schwefelsäure, wäßriges Ammoniak, Ammoniakgas,
eine wäßrige Natriumhydroxydlösung, Calciumcarbonat, Calciumhydroxyd usw, zusetzen. Gewöhnlich
reichert sich in dem Nährboden in ca. 2 bis 5 Tagen eine wesentliche Menge D-Ribose an.
Die so angereicherte D-Ribose kann beispielsweise nach dem folgenden Verfahren leicht gewonnen werden.
Die Kulturbrühe kann nämlich zuerst filtriert oder zentrifugiert werden, wodurch die Zellen mit großer Leichtigkeit
entfernt werden können. Dann kann das Filtrat durch Behandlung mit Aktivkohle und Ionenaustauscherharz
entsalzt und entfärbt und danach eingeengt werden.
Das Konzentrat kann mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthanol, versetzt werden, worauf sich
D-Ribosekristalle abscheiden. Die D-Ribose kann leicht gewonnen werden, gleichgültig, ob das obige Verfahren
oder ein anderes Verfahren angewandt wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Prozente beziehen sich auf das Verhältnis GewVVoU wenn
nichts anderes angegeben ist.
Die keine Transketolase aufweisende, keine Sporen bildende Mutante Bacillus pumilus IFO 13566. die durch
Bestrahlung mit ultraviolettem Licht aus Bacillus pumilus IFO 12113 erhalten worden war und eine Transketolascaktivität
von nicht mehr als 0,01 μΜοΙ pro Minute und mg Protein und eine Sporenbildungshäufigkeit von
2 χ 10-8 hatte, wurde verwendet, um 10 Liter eines Nährbodens zu impfen, der 2,0% Sorbit, 2,0% Maisquellwasser,
03% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 100 μg pro ml Tyrosin und 100 μg pro
ml Phenylalanin enthielt, worauf der geimpfte Nährboden 24 Stunden lang bei 36° C bebrütet wurde. Die
Gesamtmenge der resultierenden Kultur wurde in 100 Liter eines Nährbodens übergeführt, der 15,0% D-Glucose,
1,0% Trockcnhefe, 0,5% Aminoniumsulfat, 2,0% Calciumcarbonat, 50 »g pro ml Tryptophan. 50 ug pro ml
Tyrosin und 50 μg pro ml Phenylalanin enthielt; darin wurde die Kultur 60 Stunden lang bei 36° C gezüchtet,
wobei sich die D-Ribose in einer Menge von 64 mg pro ml anreicherte. Aus dieser D-Ribosefermentierungsbrühe
wurden die Zellen durch Filtration entfernt, worauf das Filtrat auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens
eingeengt wurde. Dann wurde das Konzentrat mit ca. 1/4 seines Volumens an Äthanol versetzt und der
Niederschlag verworfen. Der Rückstand wurde mit Kationen- und Anionenaustauscherharzen entsalzt und dann
auf einer Säule mit Aktivkohle entfärbt _
Die entfärbte Lösung wurde eingeengt und mit ca. dem vierfachen Volumen Äthanol versetzt, wodurch 5,0 kg
kristalline D-Ribose erhalten wurden.
Die keine Transketolase aufweisende, keine Sporen bildende Mutante Bacillus subtilis IFO 13565, die durch
Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) aus Bacillus subtilis IFO 3026 erhalten worden
war und eine Transketolaseaktivität von nicht mehr als 0,01 μΜο] pro Minute und pro mg Protein sowie eine
Sporenbildungshäufigkeit von 8 χ 10~5 hatte, wurde nach einem ähnlichen Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben,
gezüchtet, wodurch sich die D-Ribose in einer Menge von 62 mg pro ml in der Brühe anreicherte. Aus dieser
Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 14,6 kg kristalline D-Ribose erhalten.
Die keine Epimerase aufweisende, keine Sporen bildende Mutante Bacillus subtilis IFO 13573, die durch
Bestrahlung mit ultraviolettem Licht aus Bacillus subtilis IFO 3026 erhalten worden war und eine Epimeraseaktivität
von nicht mehr als 0,01 μΜοΙ pro Minute und mg Protein sowie eine Sporenbildungshäufigkeit von 7 χ \0~h
hatte, wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet, wobei sich die D-Ribose in einer Menge von
65 mg pro ml anreicherte. Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 4,3 kg D-Ribosekristalle
erhalten.
ίο Beispiel 4
Die Mutante Bacillus pumilus IFO 13585, die durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht aus Bacillus pumilus
IFO 12092 erhalten worden war und die keine Transketolase aufwies und eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität
hatte (Transketolaseaktivität nicht mehr als 0,01 μΜοΙ pro Minute und mg Protein; 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität
0,28 μΜοΙ pro Minute und mg Protein), wurde nach einem ähnlichen Verfahren, wie
in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, wobei sich die D-Ribose in der Brühe in einer Menge von 63,2 mg pro ml
anreicherte. Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 4,8 kg D-Ribosekristalle erhalten.
Die Mutante Bacillus subtilis IFO 13586, die durch Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin aus
Bacillus subtilis IFO 3026 erhalten worden war und keine Epimerase aufwies und eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität
hatte (Epimeraseaktivität nicht mehr als 0,01 μΜοΙ pro Minute und mg Protein; 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität
031 μΜοΙ pro Minute und mg Protein), wurde nach einem ähnlichen Verfahren,
wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, wobei sich die D-Ribose in der Brühe in einer Menge von 65,7 mg pro
ml anreicherte. Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 5,1 kg D-Ribosekristalle
erhalten.
Die Mutante Bacillus subtilis IFO 13588, die durch Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin aus
Bacillus subtilis IFO 3026 erhalten worden war und keine Transketolase aufwies und eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydaiionsaktivität
hatte (Transketolaseaktivität nicht mehr als 0,01 μΜοΙ pro Minute und mg Protein;
2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität 0,33 μΜοΙ pro Minute und mg Protein), wurde nach einem ähnlichen
Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, wobei die D-Ribose sich in der Brühe in einer Menge von
66,5 mg pro ml anreicherte. Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 5,3 kg D-Ribosekristalle
erhalten.
Die keine Transketolase aufweisende, keine Sporen bildende und eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität
besitzende Mutante Bacillus pumilus IFO 13620 mit einer Transketolaseaktivität von nicht mehr als 0,01
μΜοΙ pro Minute und mg Protein, einer Sporenbildungshäufigkeit von 4 χ 10~6 und einer 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität
von 034 μΜοΙ pro Minute und mg Protein, die durch Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen
aus Bacillus pumilus S-I, der aus der Erde isoliert und gemäß der Beschreibung in Bargeys Manual of Determinative
Bacteriology, Seiten 620—622 (1957), als Bacillus pumilus identifiziert worden war, erhalten worden war,
wurde nach einem ähnlichen Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, wobei sich die D-Ribose in der
Brühe in einer Menge von 723 mg pro ml anreicherte. Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in
Beispiel 1 5,6 kg kristalline D-Ribose erhalten.
Die keine Transketolase aufweisende, keine Sporen bildende, eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität
aufweisende Mutante Bacillus subtilis IFO 13621 mit einer Transketolaseaktivität von nicht mehr als 0,01
μΜοΙ pro Minute und mg Protein, einer Sporenbildungshäufigkeit von 3 χ 10~7 und einer 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität
von 0,29 μΜοΙ pro Minute und mg Protein, die durch Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen
aus Bacillus subtilis IFO 3026 erhalten worden war, wurde nach einem ähnlichen Verfahren, wie in Beispiel 1
beschrieben, gezüchtet, wobei sich die D-Ribose in der Brühe in einer Menge von 70,5 mg pro ml anreicherte.
Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 5,4 kg kristalline D-Ribose erhalten.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von D-Ribose durch Züchten eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus und Gewinnen der angereicherten D-Ribose aus der resultierenden Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Bacillus puinilus IFO 13566, Bacillus pumilus IFO 13585, Bacillus pumilus IFO 13620, Bacillus subtilis IFO 13565, Bacillus subtilis IFO 13573, Bacillus subtilis IFO 13586, Bacillus subtilis IFO 13588 oder Bacillus subtilis IFO13621 züchtet
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP48131955A JPS517753B2 (de) | 1973-11-23 | 1973-11-23 | |
| JP3135774A JPS521993B2 (de) | 1974-03-18 | 1974-03-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2454931A1 DE2454931A1 (de) | 1975-05-28 |
| DE2454931C2 true DE2454931C2 (de) | 1984-12-13 |
Family
ID=26369806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2454931A Expired DE2454931C2 (de) | 1973-11-23 | 1974-11-20 | Verfahren zur Herstellung von D-Ribose |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3970522A (de) |
| CA (1) | CA1040565A (de) |
| CH (1) | CH616706A5 (de) |
| DE (1) | DE2454931C2 (de) |
| DK (1) | DK138759B (de) |
| FR (1) | FR2252404B1 (de) |
| GB (1) | GB1474129A (de) |
| HU (1) | HU170227B (de) |
| IT (1) | IT1024897B (de) |
| NL (1) | NL180233C (de) |
| PL (2) | PL91801B1 (de) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4904587A (en) * | 1987-09-10 | 1990-02-27 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production of D-ribose |
| US5168056A (en) * | 1991-02-08 | 1992-12-01 | Purdue Research Foundation | Enhanced production of common aromatic pathway compounds |
| EP0501765A1 (de) * | 1991-03-01 | 1992-09-02 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Verfahren zur Herstellung von D-Ribose |
| US7226761B2 (en) | 1992-11-05 | 2007-06-05 | Danisco Sweeteners Oy | Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols |
| US20080038779A1 (en) * | 1992-11-05 | 2008-02-14 | Danisco Sweeteners Oy | Manufacture of Five-Carbon Sugars and Sugar Alcohols |
| US5776736A (en) * | 1992-12-21 | 1998-07-07 | Purdue Research Foundation | Deblocking the common pathway of aromatic amino acid synthesis |
| US5629181A (en) * | 1993-09-16 | 1997-05-13 | Purdue Research Foundation | Synthesis of catechol from biomass-derived carbon sources |
| US5487987A (en) * | 1993-09-16 | 1996-01-30 | Purdue Research Foundation | Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources |
| CN102241706B (zh) * | 2010-12-31 | 2014-04-09 | 三达膜科技（厦门）有限公司 | 一种d-核糖的提纯分离方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3607648A (en) * | 1968-02-01 | 1971-09-21 | Takeda Chemical Industries Ltd | Method for the production of d-ribose |
| US3919046A (en) * | 1972-06-17 | 1975-11-11 | Takeda Chemical Industries Ltd | Method of producing d-ribose |
-
1974
- 1974-11-19 CH CH1539474A patent/CH616706A5/de not_active IP Right Cessation
- 1974-11-20 DE DE2454931A patent/DE2454931C2/de not_active Expired
- 1974-11-22 GB GB5066674A patent/GB1474129A/en not_active Expired
- 1974-11-22 IT IT70422/74A patent/IT1024897B/it active
- 1974-11-22 HU HUTA1331A patent/HU170227B/hu unknown
- 1974-11-22 PL PL1974175862A patent/PL91801B1/pl unknown
- 1974-11-22 CA CA214,424A patent/CA1040565A/en not_active Expired
- 1974-11-22 DK DK608474AA patent/DK138759B/da not_active IP Right Cessation
- 1974-11-22 NL NLAANVRAGE7415277,A patent/NL180233C/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-11-22 FR FR7438436A patent/FR2252404B1/fr not_active Expired
- 1974-11-22 PL PL1974191682A patent/PL95026B1/pl unknown
- 1974-11-25 US US05/527,145 patent/US3970522A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NICHTS-ERMITTELT |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2252404B1 (de) | 1979-05-04 |
| PL95026B1 (de) | 1977-09-30 |
| GB1474129A (en) | 1977-05-18 |
| HU170227B (de) | 1977-04-28 |
| IT1024897B (it) | 1978-07-20 |
| DE2454931A1 (de) | 1975-05-28 |
| CA1040565A (en) | 1978-10-17 |
| NL180233B (nl) | 1986-08-18 |
| DK138759C (de) | 1979-03-26 |
| US3970522A (en) | 1976-07-20 |
| DK608474A (de) | 1975-07-21 |
| FR2252404A1 (de) | 1975-06-20 |
| PL91801B1 (de) | 1977-03-31 |
| NL7415277A (nl) | 1975-05-27 |
| CH616706A5 (de) | 1980-04-15 |
| DK138759B (da) | 1978-10-23 |
| NL180233C (nl) | 1987-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3882242T2 (de) | Fermentationsverfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-Gulonsäuren. | |
| DE3687946T2 (de) | Verfahren zur herstellung der 2-keto-l-gulonsaeure. | |
| EP0008031B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von 6-Amino-6-desoxy-L-sorbose | |
| DE4000942A1 (de) | Mikroorganismus der species bacillus coagulans sowie ein verfahren zur herstellung von optisch reiner l(+)-milchsaeure | |
| DE2161164A1 (de) | Verfahren zur mikrobiologischen Her stellung von Protein sowie Verwendung des Verfahrensproduktes | |
| DE2413963A1 (de) | Verfahren zur herstellung von 2-ketol-gulonsaeure und deren salzen auf mikrobiologischem wege | |
| DE2343587A1 (de) | Verfahren zur herstellung von 2-ketol-gulonsaeure | |
| DE2633076A1 (de) | Verfahren zur durchfuehrung von enzymatischen reaktionen unter verwendung von in einer polymerisatmatrix eingeschlossenen mikroorganismen | |
| DE2530861B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure und deren Salzen | |
| DE2454931C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von D-Ribose | |
| DE2400323C2 (de) | Neue Glucose-Isomerase und ihre Herstellung | |
| DD232310A5 (de) | Verfahren zur herstellung von l-carnitin | |
| DE2939269A1 (de) | Verfahren zur optischen trennung von d,l-2-amino-4-methylphosphinobuttersaeure | |
| DE3027380C2 (de) | ||
| DE2402217C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Proteinmaterial | |
| DE3604874A1 (de) | Verfahren zur herstellung von coniferylaldehyd und mikroorganismus dafuer | |
| DE2417642C3 (de) | Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose | |
| DE2445581C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von D-Gluconsäure-dlactam | |
| DE3781699T2 (de) | Verfahren zur herstellung von l-sorbose. | |
| DE1922843C (de) | ||
| DE2002048B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Citronensäure | |
| DE1922843A1 (de) | Mikrobiologisches Oxydationsverfahren | |
| DE2330426C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von D-Ribose | |
| DE2108760B2 (de) | Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von jodinin | |
| DE69126213T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Alanin durch Fermentation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8126 | Change of the secondary classification | ||
| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
| 8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: SCHOENWALD, K., DR.-ING. FUES, J., DIPL.-CHEM. DR. |
|
| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition |