DE3687946T2

DE3687946T2 - Verfahren zur herstellung der 2-keto-l-gulonsaeure.

Info

Publication number: DE3687946T2
Application number: DE8686308062T
Authority: DE
Inventors: Ikuo Nogami; Masahide Oka; Hideo Shirafuji; Takamasa Yamaguchi
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1985-10-22
Filing date: 1986-10-17
Publication date: 1993-06-17
Anticipated expiration: 2006-10-18
Also published as: ES2053443T3; US5474924A; IE862776L; JPS62228288A; HU201804B; EP0221707B1; IE59623B1; DK489686D0; DK171869B1; ATE86665T1; CN86107277A; KR870004145A; CA1318871C; DE3687946D1; KR950009199B1; JPH067157A; EP0221707A3; HUT43636A; CN1024022C; JPH0638752B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, die als Zwischenprodukt für die Synthese der L-Ascorbinsäure von Wert ist, und die in dem Herstellungsverfahren einzusetzenden Stämme von Pseudogluconobacter.
2-Keto-L-gulonsäure, die ein wertvolles Zwischenprodukt für die Synthese der L-Ascorbinsäure ist, wird bisher mit Hilfe des technisch eingeführten Verfahrens von Reichstein [Helvetica Chimica Acta 17, 311 (1934)] hergestellt. Dieses Verfahren umfaßt jedoch viele Schritte, erfordert große Mengen an Lösungsmitteln und ist aus diesem Grunde als moderne Technologie unbefriedigend. Als Alternativen zu diesem Reichstein'schen Verfahren hat man mehrere Verfahren, hauptsächlich unter Einsatz von Mikroorganismen, vorgeschlagen. Beispielsweise ist auf das Verfahren zu verweisen, bei dem Glucose mit Hilfe eines Mikroorganismus zu 5-Keto-D-gluconsäure oxidiert wird, diese entweder chemisch oder mikrobiologisch zu L-Idonsäure reduziert wird und diese weiter mikrobiologisch zu 2-Keto-L-gulonsäure oxidiert wird [US- Patent 2 421 611]. Ein anderes bekanntes Verfahren umfaßt die Oxidation von Glucose mit einem Mikroorganismus zu 2,5-Diketo-D-gluconsäure und die mikrobiologische oder chemische Umwandlung derselben in 2-Keto-L-gulonsäure [JP- Patentveröffentlichungen Nr. 39-14493, 53-25033, 56-15877 und 59-35920].
Die Schritte der chemischen Reduktion bei diesen bekannten Verfahren, nämlich der 5-Keto-D-gluconsäure zu L-Idonsäure bei dem erstgenannten Verfahren und der Reduktion der 2,5- Diketo-D-gluconsäure zu 2-Keto-L-gulonsäure in dem letztgenannten Verfahren haben Nachteile hinsichtlich der Stereospezifität, so daß die Bildung des Nebenprodukts D-Gluconsäure bei ersterem und von 2-Keto-D-gluconsäure bei letzterem erniedrigte Ausbeuten der gewünschten Verbindung ergeben. Wenn die oben bezeichnete Reduktion mit Hilfe eines Mikroorganismus durchgeführt wird, sinkt weiterhin die Gesamt-Produkt-Ausbeute, da der Mikroorganismus mit einem Überschuß an Glucose (dem Ausgangsmaterial) als Quelle für die Reduktions-Energie versorgt werden muß. In dieser Hinsicht umfaßt die Erzeugung von 2-Keto-L-Gulonsäure unter Einsatz von L-Sorbose als Ausgangsstoff ausschließlich einen Oxidations-Vorgang. Tatsächlich hat man bereits Versuche in dieser Richtung unternommen, bei denen jeweils ein zu dem Genus Gluconobacter, dem Genus Pseudomonas, dem Genus Serratia, dem Genus Achromobacter und dem Genus Alcaligenes gehörendes Bacterium eingesetzt wurde. So sei hingewiesen auf die Literaturstellen Biotechnology and Bioengineering 14, 799 (1972), Acta Microbiologica Sinica 20, 246 (1980) und 21, 185 (1981), die JP-Patentveröffentlichungen Nr. 41-159 und 41-160, das US-Patent 3 043 749 und die JP- Patentveröffentlichung Nr. 49-39838.
Die soweit mit den in der Literatur benannten Stämmen erzielten Ergebnisse sind jedoch nicht zufriedenstellend, und die Ausbeuten sind zu niedrig, um deren technische Nutzung sicherzustellen.
Unter diesen Umständen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ernsthaft nach einem wirtschaftlich gewinnbringenden Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure gesucht und dabei gefunden, daß ein Bakterienstamm K591s, der aus einer in der Präfektur Wakayama gesammelten Bodenprobe isoliert wurde, und die Bakterienstämme 12-5, 12-15, 12-4 und 22-3, die aus in der Präfektur Shiga gesammelten Bodenproben isoliert wurden, L-Sorbose in 2-Keto-L-gulonsäure in Ausbeuten zu überführen vermögen, die die früheren Ergebnisse bei weitem übersteigen. Darüber hinaus haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung als Ergebnis einer taxonomischen Untersuchung gefunden, daß es sich bei diesen um neue Bakterien handelt, die in der Literatur nicht beschrieben sind. Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage der obigen Befunde entwickelt worden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung
(1) ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, umfassend das In-Berührung-Bringen eines Mikroorganismus von Pseudogluconobacter saccharoketogenes, der befähigt ist, L-Sorbose zu 2-Keto-L-gulonsäure zu oxidieren und der gram-negativ, beweglich und ein Stäbchen-Bacterium mit polaren Geißeln ist,
einen kombinierten DNA-Guanin- und -Cytosin-Gehalt von 67 ± 1 Mol-% und ein Ubichinon mit 10 Isopren-Einheiten als Chinon-System hat;
zur schwachen Erzeugung von Essigsäure aus Ethanol und zur Erzeugung von Dihydroxyaceton aus Glycerin befähigt ist und
Coenzym A als Wachstumsfaktor benötigt, das manchmal durch Pantothensäure ersetzbar ist;
eine positive Reaktion auf den Oxidase-Test ergibt;
bei einem pH-Wert von 4,5 nicht zu wachsen vermag und gutes Wachstum entweder in Hefeextrakt-Medium oder in Pepton-Hefeextrakt-Medium ohne Kohlenhydrat zeigt, entweder so, wie er ist, oder als Zell-Präparat des Mikroorganismus mit L-Sorbose, um 2-Keto-L-Gulonsäure zu erzeugen und anzureichern, und das Ernten derselben;
(2) ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, umfassend das In-Berührung-Bringen eines Mikroorganismus von Pseudogluconobacter saccharoketogenes, der befähigt ist, L-Sorbose zu 2-Keto-L-gulonsäure zu oxidieren und der gram-negativ, beweglich und ein Stäbchen-Bacterium mit polaren Geißeln ist,
einen kombinierten DNA-Guanin- und -Cytosin-Gehalt von 67 ± 1 Mol-% und ein Ubichinon mit 10 Isopren-Einheiten als Chinon-System hat;
zur schwachen Erzeugung von Essigsäure aus Ethanol und zur Erzeugung von Dihydroxyaceton aus Glycerin befähigt ist und
Coenzym A als Wachstumsfaktor benötigt, das manchmal durch Pantothensäure ersetzbar ist;
eine positive Reaktion auf den Oxidase-Test ergibt; bei einem pH-Wert von 4,5 nicht zu wachsen vermag und gutes Wachstum entweder in Hefeextrakt-Medium oder in Pepton-Hefeextrakt-Medium ohne Kohlenhydrat zeigt, mit L-Sorbose in Gegenwart wenigstens eines zu dem Genus Bacillus, dem Genus Pseudomonas, dem Genus Proteus, dem Genus Citrobacter, dem Genus Enterobacter, dem Genus Erwinia, dem Genus Xanthomonas, dem Genus Flavobacterium oder dem Genus Escherichia gehörenden Mikroorganismus.
Von den oben erwähnten 5 Bakterienstämmen haben die Stämme K591s und 12-5 die folgenden taxonomischen Kennwerte.

(a) Morphologie

(1) Stäbchen der Abmessungen 0,3 bis 0,5·0,7 bis 1,4 um.
(2) Kein Zell-Polymorphismus.
(3) Beweglich mit 2 bis 4 polaren Geißeln.
(4) Nicht sporenbildend.
(5) Gram-negativ.
(6) Nicht säurefest.

(b) Kennwerte der Kultur

(1) Nährstoff-Agar-Platte: Im wesentlichen kein Wachstum. Hefeextrakt-Nährstoff-Agar: Rund, vollständiger Rand, glatte Oberfläche, opaleszierend.
(2) Hefeextrakt-Nährstoff-Schrägagar: Wachstum mäßig und fadenförmig, glatt, opaleszierend.
(3) Hefeextrakt-Nährstoff-Flüssigkultur: Mäßiges Wachstum, gleichmäßige Trübung im gesamten Medium.
(4) Nährstoff-Gelatine-Stabkultur: Spärliches Oberflächen-Wachstum; Gelatine nicht verflüssigt.
(5) Lackmus-Milch: Angesäuert und koaguliert.

(c) Physiologische Kennwerte

(1) Nitrat-Reduktion: Schwach, aber positiv.
(2) Denitrifikation: Negativ.
(3) Methylrot (MR)-Test: Positiv.
(4) Voges-Proskauer (VP)-Test: Negativ.
(5) Indol: Nicht gebildet.
(6) Hydrogensulfid: Nicht gebildet.
(7) Stärke: Nicht hydrolysiert.
(8) Citronensäure: Nicht verwertet.
(9) Ammonium-Salze: Verwertet.
(10) Pigmente: Nicht gebildet.
(11) Urease: Gebildet.
(12) Oxidase: Positiv.
(13) Katalase: Positiv.
(14) Temperatur-Bereich für das Wachstum: 16-36ºC; optimaler Temperatur-Bereich für das Wachstum: 24-34ºC. pH-Bereich für das Wachstum: 5,5- 8,7; optimaler pH-Bereich: 6,0-7,5.
(15) Aerob.
(16) Hugh-Leifson's OF-Test: Oxidierend.
(17) Säure wird gebildet, aber Gas wird nicht gebildet aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose, D-Galactose, D-Mannose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose, D-Mannit und Glycerin. Weder Säure noch Gas werden gebildet aus D-Sorbit, Inosit oder Stärke.

(d) Andere Kennwerte

(1) Schwache Bildung von Essigsäure aus Ethanol.
(2) Biotin, Thiamin, Riboflavin und Coenzym A (CoA) werden für das Wachstum benötigt.
(3) Bildung von Dihydroxyaceton aus Glycerin.
(4) Gehalt der DNA an (Guanin + Cytosin): 67 ± 1 Mol-%.
(5) Anwesenheit eines 10 Isopren-Einheiten enthaltenden Ubichinons (CoQ&sub1;&sub0;).
(6) Ausgeprägte Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose.
(7) Streptomycin-resistent.
Die taxonomischen Kennwerte des Stammes 12-15 sind nachstehend angegeben.

(a) Morphologie

(1) Stäbchenförmig; Zellen der Abmessungen 0,3 bis 0,5·0,7 bis 1,4 um.
(2) Kein Zell-Polymorphismus.
(3) Beweglich mit 2 bis 4 polaren Geißeln.
(4) Nicht sporenbildend.
(5) Gram-negativ.
(6) Nicht säurefest.

(b) Kennwerte der Kultur

(1) Nährstoff-Agar-Platte: Im wesentlichen kein Wachstum. Hefeextrakt-Nährstoff-Agar-Platte: Rund, vollständiger Rand, glatt und opaleszierend.
(2) Hefeextrakt-Nährstoff-Schrägagar: Wachstum mäßig und fadenförmig, glatt und opaleszierend.
(3) Hefeextrakt-Nährstoff-Flüssigkultur: Mäßiges Wachstum, gleichmäßige Trübung im gesamten Medium.
(4) Nährstoff-Gelatine-Stabkultur: Spärliches Wachstum nur an der Oberseite; Gelatine nicht verflüssigt.
(5) Lackmus-Milch: Angesäuert, jedoch nicht koaguliert.

(c) Physiologische Kennwerte

(1) Nitrat-Reduktion: Negativ.
(2) Denitrifikation: Negativ.
(3) Methylrot (MR)-Test: Positiv.
(4) Voges-Proskauer (VP)-Test: Negativ.
(5) Indol: Nicht gebildet.
(6) Hydrogensulfid: Nicht gebildet.
(7) Stärke: Nicht hydrolysiert.
(8) Citrat: Nicht verwertet.
(9) Ammonium-Salze: Verwertet.
(10) Keine Pigment-Bildung.
(11) Urease: Gebildet.
(12) Oxidase: Positiv.
(13) Katalase: Positiv.
(14) Wachstum findet bei 23-32ºC, optimal bei 28-32ºC, statt. pH-Bereich für das Wachstum: 6,0-7,5; optimaler pH-Bereich: 6,5-7,1.
(15) Aerob.
(16) Hugh-Leifson's OF-Test: Oxidierend.
(17) Säure wird gebildet, aber Gas wird nicht gebildet aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose und Glycerin. Weder Säure noch Gas werden gebildet aus D-Mannit, D-Sorbit, Inosit und Stärke.

(d) Andere Kennwerte

(1) Schwache Bildung von Essigsäure aus Ethanol.
(2) Biotin, Thiamin, Riboflavin und Coenzym A (CoA) werden für das Wachstum benötigt.
(3) Bildung von Dihydroxyaceton aus Glycerin.
(4) Gehalt der DNA an (Guanin + Cytosin): 67 ± 1 Mol-%.
(5) Anwesenheit eines 10 Isopren-Einheiten enthaltenden Ubichinons (CoQ&sub1;&sub0;).
(6) Ausgeprägte Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose.
(7) Streptomycin-resistent.
Die taxonomischen Kennwerte des Stammes 12-4 sind nachstehend angegeben.

(a) Morphologie

(1) Stäbchen, jede Zelle mit den Abmessungen 0,3 bis 0,5·0,7 bis 1,4 um.
(2) Kein Zell-Polymorphismus.
(3) Beweglich mit 2 bis 4 polaren Geißeln.
(4) Nicht sporenbildend.
(5) Gram-negativ.
(6) Nicht säurefest.

(b) Kennwerte der Kultur

(1) Nährstoff-Agar-Platte: Winzige Kolonien erlauben keine Beobachtungen im einzelnen. Hefeextrakt- Brühe-Agar: Rund, vollständiger Rand, glatt und opaleszierend.
(2) Hefeextrakt-Nährstoff-Schrägagar: Wachstum mäßig und fadenförmig, glatt, opaleszierend.
(3) Hefeextrakt-Nährstoff-Flüssigkultur: Mäßiges Wachstum, gleichmäßige Trübung im gesamten Medium.
(4) Nährstoff-Gelatine-Stabkultur: Schwaches Wachstum nur an der Oberseite; Gelatine nicht verflüssigt.
(5) Lackmus-Milch: Angesäuert, jedoch nicht koaguliert.

(c) Physiologische Kennwerte

(1) Nitrat-Reduktion: Negativ.
(2) Denitrifikation: Negativ.
(3) Methylrot (MR)-Test: Positiv.
(4) Voges-Proskauer (VP)-Test: Negativ.
(5) Indol: Nicht gebildet.
(6) Hydrogensulfid: Gebildet.
(7) Stärke: Nicht hydrolysiert.
(8) Citrat: Nicht verwertet.
(9) Ammonium-Salze: Verwertet.
(10) Keine Pigment-Bildung.
(11) Urease: Gebildet.
(12) Oxidase: Positiv.
(13) Katalase: Positiv.
(14) Wachstum findet bei 16-36ºC, optimal bei 24-34ºC, statt. pH-Bereich für das Wachstum: 5,5-8,2; optimaler pH-Bereich: 6,0-7,5.
(15) Aerob.
(16) Hugh-Leifson's OF-Test: Oxidierend.
(17) Säure wird gebildet, aber Gas wird nicht gebildet aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose, D-Galactose, D-Mannose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose und Glycerin. Weder Säure noch Gas werden gebildet aus D-Mannit, D-Sorbit, Inosit und Stärke.

(d) Andere Kennwerte

(1) Schwache Bildung von Essigsäure aus Ethanol.
(2) Biotin, Thiamin, Riboflavin und entweder Coenzym A (CoA) oder Panthotensäure werden für das Wachstum benötigt.
(3) Bildung von Dihydroxyaceton aus Glycerin.
(4) Gehalt der DNA an (Guanin + Cytosin): 67 ± 1 Mol-%.
(5) Anwesenheit eines 10 Isopren-Einheiten enthaltenden Ubichinons (CoQ&sub1;&sub0;).
(6) Ausgeprägte Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose.
(7) Streptomycin-resistent.
Die taxonomischen Kennwerte des Stammes 22-3 sind nachstehend angegeben.

(a) Morphologie

(b) Kennwerte der Kultur

(c) Physiologische Kennwerte

(1) Nitrat-Reduktion: Positiv (schwach).
(2) Denitrifikation: Negativ.
(3) Methylrot (MR)-Test: Positiv.
(4) Voges-Proskauer (VP)-Test: Negativ.
(5) Indol: Nicht gebildet.
(6) Hydrogensulfid: Nicht gebildet.
(7) Stärke: Nicht hydrolysiert.
(8) Citrat: Nicht verwertet.
(9) Ammonium-Salze: Verwertet.
(10) Keine Pigment-Bildung.
(11) Urease: Gebildet.
(12) Oxidase: Positiv.
(13) Katalase: Positiv.
(14) Wachstum findet bei 16-38ºC, optimal bei 24-34ºC, statt. pH-Bereich für das Wachstum: 5,5-8,7; optimaler pH-Bereich: 6,0-7,8.
(15) Aerob.
(16) Hugh-Leifson's OF-Test: Oxidierend.
(17) Säure wird gebildet, aber Gas wird nicht gebildet aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose, D-Galactose, D-Mannose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose und Glycerin. Weder Säure noch Gas werden gebildet aus D-Mannit, D-Sorbit, Inosit und Stärke.

(d) Andere Kennwerte

(1) Schwache Bildung von Essigsäure aus Ethanol.
(2) Biotin, Thiamin, Riboflavin und entweder Coenzym A (CoA) oder Panthotensäure werden für das Wachstum benötigt.
(3) Bildung von Dihydroxyaceton aus Glycerin.
(4) Gehalt der DNA an (Guanin + Cytosin): 67 ± 1 Mol-%.
(5) Anwesenheit eines 10 Isopren-Einheiten enthaltenden Ubichinons (CoQ&sub1;&sub0;).
(6) Ausgeprägte Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose.
(7) Streptomycin-resistent.
Die obigen taxonomischen Kennwerte der fünf aus dem Erdboden stammenden Stämme wurden unter Bezugnahme auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl. (1974), und Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 1 (1984), durchgemustert. Die obige Überprüfung ergab, daß die Stämme K591s, 12-5, 12-15, 12-4 und 22-3 im Hinblick darauf, daß sie gramnegativ, beweglich und Stäbchen-Bakterien mit polaren Geißeln sind, versuchsweise dem Genus Pseudomonas zugeordnet. Und im Lichte der Befunde, daß sie bestimmte Wachstums-Faktoren benötigen, daß der kombinierte Gehalt der DNA an (Guanin + Cytosin) 67 ± 1 Mol-% beträgt und ihr Chinon-System ein Ubichinon mit 10 Isopren-Einheiten ist, ähneln sie Pseudomonas diminuta und Pseudomonas vesicularis, die zu der RNA-Gruppe IV des Abschnitts IV dieses Genus gehören. Die schwache Bildung von Essigsäure aus Ethanol und die Bildung von Dihydroxyaceton aus Glycerin sind jedoch die Kennwerte, die diese Stämme von Bakterien des Genus Pseudomonas unterscheiden.
Die vorstehenden Kennwerte sind solche von Species des Genus Gluconobacter. Im Lichte der Tatsachen, daß diese 5 Stämme positive Antwort-Reaktionen auf den Oxidase-Test geben, nicht bei pH 4,5 zu wachsen vermögen und gutes Wachstum entweder in Hefeextrakt-Nährstoff-Medium oder Pepton-Hefeextrakt-Medium ohne Kohlenhydrate zeigen und einen kombinierten Gehalt der DNA an (Guanin + Cytosin) von 67 ± 1 Mol-% haben, sind sie von den Species des Genus Gluconobacter verschieden.
Somit konnten diese 5 Stämme K591s, 12-5, 12-15, 12-4 und 22-3 nicht irgendwelchen der bekannten Genera zugewiesen werden und mußten als Bakterien einer neuen Species eines neuen Genus angesehen werden. Dementsprechend wurden die K591s, 12-5, 12-15, 12-4 und 22-3 kollektiv als Pseudogluconobacter saccharoketogenes bezeichnet.
Betrachtet man die Nährstoff-Bedürfnisse dieser 5 Stämme, so haben die Stämme K591s, 12-5 und 12-15 die außergewöhnliche Eigenschaft, daß sie CoA für ihr Wachstum benötigen. Der CoA-Bedarf dieser 3 Stämme kann nicht ersatzweise durch Pantothensäure gedeckt werden. Andererseits können 12-4 und 22-3 in Anwesenheit von Panthotensäure ebenso wie in Anwesenheit von CoA wachsen.
In der folgenden Beschreibung werden diese Stämme von Pseudogluconobacter saccharoketogenes gelegentlich als oxidierende Stämme bezeichnet.
Zu den Stämmen, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, gehören nicht nur die oben beschriebenen 5 Stämme, sondern auch andere Stämme, einschließlich von Mutanten, die aus den 5 Stämmen durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht oder Röntgenstrahlung oder durch Behandlung mit chemischen Mutagenen wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (Nitrosoguanidin), Methylmethansulfonat, stickstofflost und so weiter abgeleitet sind. Als Beispiel für solche Mutanten sei der Stamm TH 14-86 erwähnt, der sich von Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s aufgrund der Behandlung mit Nitrosoguanidin ableitet. Dieser Mutanten-Stamm TH 14-18 zeigt die gleichen taxonomischen Kennwerte wie der Parental-Stamm, außer, daß er eine gesteigerte Fähigkeit zur Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose hat.
Die oben genannten Stämme Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s, 12-5 und TH 14-86 wurden beim Institute for Fermentation (IFO), Osaka, am 19. September 1985 hinterlegt, und die Stämme Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15, 12-4 und 22-3 wurden am 16. Dezember 1985 hinterlegt. Weiterhin wurden die Stämme Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s, 12-5 und TH 14-86 wurden beim Fermentation Research Institute (FRI) der Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry, am 7. Oktober 1985 hinterlegt, und die Stämme Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15, 12-4 und 22-3 wurden am 20. Dezember 1985 hinterlegt. Die Hinterlegung wurde in eine Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag umgewandelt, und diese Mikroorganismen werden beim FRI seit dem 9. August 1986 aufbewahrt.
Die Hinterlegungs-Nummern bei IFO und bei FRI sind die folgenden: Mikroorganismus IFO FRI Pseudogluconobacter saccharoketogenes
In der Praxis der vorliegenden Erfindung können die oben genannten Stämme in L-Sorbose enthaltenden Medien kultiviert werden, oder alternativ kann L-Sorbose mit einem aus Zellen dieser Stämme gewonnenen Präparat in Berührung gebracht werden.
Die Begriffe "aus Zellen gewonnenes Präparat" oder "Zell- Präparat", werden hierin so verwendet, daß sie jegliche und sämtliche gewaschenen Zellen aus Kulturbrühen dieser Bakterien, mit Aceton getrocknete Zellen, immobilisierte Zellen auf Trägern wie Polyacrylamid-Gel, K-Carragenin und dergleichen, sowie andere äquivalente Präparate umfassen.
Das Ausgangsmaterial L-Sorbose kann auf einmal zur Auslösung der Kultivierung, in mehreren Anteilen im Laufe der Kultivierung oder kontinuierlich zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden.
Bei der Reaktion aufgrund des Kontakts zwischen L-Sorbose und dem genannten Mikroorganismus beträgt die Konzentration der L-Sorbose in dem Reaktionssystem 3 bis 30 Gew./Vol.-%, vorzugsweise 5 bis 25 Gew./Vol.-%, bezogen auf das Medium.
Als Beispiel für die Arbeitsweise des In-Berührung-Bringens der L-Sorbose mit dem Bakterien-Zell-Präparat sei ein Verfahren erwähnt, das die Zugabe von L-Sorbose, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure(MES)-Puffer (pH 6,5; 0,5 M) und CaCO&sub3; zu dem Zell-Präparat, das Verdünnen mit Wasser und das Schütteln der Mischung in einem konischen Kolben umfaßt.
Die Konzentration der L-Sorbose in einem solchen Reaktionssystem zur Herstellung des Kontakts zwischen L-Sorbose und dem Zell-Präparat beträgt 0,1 bis 10 Gew./Vol.-%, vorzugsweise 0,3 bis 3 Gew./Vol.-%. Die Menge des Zell-Präparats beträgt 1 bis 30 mg/ml, bezogen auf trockene Zellen vor der Reaktion. Der pH-Wert des Reaktionssystems wird auf einen Wert etwa im Bereich von 5,5 bis 7,5 eingestellt, die Reaktionstemperatur beträgt etwa 20ºC bis 40ºC, und die Reaktionszeit beträgt etwa 1 bis 100 h.
Beim Arbeiten mit der vorliegenden Erfindung in der Praxis durch Inkubieren eines Stammes von Pseudogluconobacter in einem L-Sorbose enthaltenden flüssigen Medium zum Erzeugen und Anreichern von 2-Keto-gulonsäure in der Brühe wurde gefunden, daß die Ausbeute der Anreicherung von 2-Keto-L- gulonsäure dann, wenn man andere Bakterien in Kombination mit dem oxidierenden Pseudogluconobacter-Stamm anwesend sein läßt, in bemerkenswertem Maße höher ist als in dem Fall, wenn der oxidierende Stamm für sich allein kultiviert wird.
Die Bakterien, die man gleichzeitig anwesend sein läßt, können beispielsweise Bakterien der folgenden Genera sein: Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Xanthomonas and Flavobacterium. Als spezifische Species, seien die folgenden erwähnt.
Bacillus cereus IFO 3131
Bacillus licheniformis IFO 12201
Bacillus megaterium IFO 12108
Bacillus pumilus IFO 12090
Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022
Bacillus subtilis IFO 13719
Bacillus circulans IFO 3967
Pseudomonas trifolii IFO 12056
Pseudomonas maltophilia IFO 12692
Proteus inconstans IFO 12930
Citrobacter freundii IFO 13544
Enterobacter cloacae IFO 3320
Erwinia herbicola IFO 12686
Xanthomonas pisi IFO 13556
Xanthomonas citri IFO 3835
Flavobacterium menigosepticum IFO 12535
Micrococcus varians IFO 3765
Escherichia coli IFO 3366
Jeder dieser Stämme kann in einem geeigneten Medium bei 20ºC bis 40ºC 1 bis 4 Tage inkubiert werden, und die erhaltene Kultur kann als Impfgut für die Kultivierung in Anwesenheit der gleichzeitig anwesenden Bakterien eingesetzt werden. Die Größe des Impfgutes beträgt im allgemeinen wünschenswerter Weise 1/10 bis 1/1000 derjenigen des oxidierenden Stammes. Wenn der gleichtzeig anwesende Stamm in dieser Menge mit dem oxidierenden Stamm inkubiert wird, wird das Wachstum des oxidierenden Stammes gefördert, so daß im Vergleich zu einer Reinkultur des oxidierenden Stammes die Mischkultur in der Lage ist, L-Sorbose in höheren Konzentrationen in einem kürzeren Zeitraum zu 2-Keto-L-gulonsäure zu oxidieren. Die als diese gleichzeitig anwesenden Bakterien eingesetzten Bakterien sind vorzugsweise solche, die L-Sorbose und 2-Keto-L-gulonsäure nicht oder nur spärlich zu assimilieren vermögen. Ansonsten können die gleichen Bedingungen wie bei der Reinkultur des oxidierenden Stammes angewandt werden. Das zum Kultivieren der oben genannten Mikroorganismen verwendete Medium kann ein flüssiges oder festes, Nährstoffe enthaltendes Medium sein, das von dem betreffenden Stamm verwertet werden kann. Für die Massen- Produktion wird jedoch ein flüssiges Medium bevorzugt. Das Medium enthält die Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, anorganischen Salze, organischen Salze und Spuren-Nährstoffe, die im allgemeinen beim Kultivieren von Mikroorganismen verwendet werden. Während der Ausgangsstoff L-Sorbose als Kohlenstoff-Quelle dient, können auch andere hilfsweise Kohlenstoff-Quellen wie Glucose, Glycerin, Sucrose, Lactose, Maltose, Melasse etc. eingesetzt werden. Die Stickstoff- Quellen werden beispielhaft verkörpert durch verschiedenartige anorganische und organische, Stickstoff enthaltende Verbindungen oder Stickstoff erzeugende Stoffe wie Ammonium- Salze (z. B. Ammonium-Sulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat etc.), Maisquellflüssigkeit (CSL), Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenöl, Harnstoff und so weiter. Als anorganische Salze können Salze von Kalium, Natrium, Calcium, Magnesium, Eisen, Mangan, Cobalt, Zink, Kupfer und/oder Phosphorsäure verwendet werden.
Als Spuren-Nährstoffe können außer CoA, Pantothensäure, Biotin, Thiamin und Riboflavin, die essentielle Wachstumsfaktoren für die genannten Mikroorganismen sind, solche Substanzen zugesetzt werden, die das Wachstum der Mikroorganismen und dadurch die Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure fördern, etwa Flavinmononucleotid (FMN), Flavinadenindinucleotid (FAD), andere Vitamine, L-Cystein, L-Glutaminsäure, Natriumthiosulfat etc., entweder in Form reiner chemischer Verbindungen oder in Form natürlicher Materialien, die sie in geeigneten Mengen enthalten.
Was die Kultur-Methode betrifft, so kann jedes Verfahren der unbewegten Kultur, Schüttelkultur, Submerskultur und so weiter angewandt werden. Für die Massen-Produktion wird die sogenannte Submerskultur bevorzugt.
Die Kultur-Bedingungen hängen naturgemäß von dem Bakterien- Stamm, der Zusammensetzung des Mediums und anderen Faktoren ab und können in jedem Fall so gewählt werden, daß die Ziel- Verbindung mit dem höchsten Wirkungsgrad erhalten werden kann. So kann zum Beispiel die Inkubations-Temperatur vorteilhafterweise im Bereich von 25ºC bis 35ºC liegen, und der pH kann etwa 5 bis 9 betragen.
Wenn die Kultivierung unter den vorstehenden Bedingungen 10 bis 120 h durchgeführt wird, wird die 2-Keto-L-gulonsäure in der höchsten Konzentration angereichert. Da der pH-Wert des Mediums im allgemeinen mit der Bildung der Ziel-Verbindung sinkt, kann es vorteilhaft sein, von Zeit zu Zeit eine geeignete basische Substanz wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniak zuzusetzen, um das Medium auf einem optimalen pH-Wert für die Erzeugung von 2-Keto-L-gulonsäure durch den Bakterienstamm zu halten, oder zum Konstanthalten des pH-Wertes des Mediums dafür zu sorgen, daß ein geeignetes Puffermittel in diesem enthalten ist.
Abgesehen von den obigen Ausführungen können die sterilisierten Kulturbrühen von anderen Bakterien als denen der oxidierenden Stämme mit Vorteil als Komponenten des Mediums eingesetzt werden. Zu den Bakterien, die auf diese Weise ausgenutzt werden können, zählen solche des Genus Bacillus, des Genus Pseudomonas, des Genus Citrobacter, des Genus Escherichia und des Genus Erwinia. Speziell erwähnt seien die folgenden Bakterien.
Bacillus cereus IFO 3131
Bacillus subtilis IFO 3023
Bacillus pumilus IFO 12089
Bacillus megaterium IFO 12108
Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022
Pseudomonas trifolii IFO 12056
Citrobacter freundii IFO 12681
Escherichia coli IFO 3456
Erwinia herbicola IFO 12686
So werden diese Bakterien in Medien inkubiert, die das Wachstum derselben bei 20ºC bis 40ºC für die Dauer von 2 bis 4 Tagen erlauben, und die resultierenden Kulturbrühen werden sterilisiert und dem Medium für den oxidierenden Stamm in einem Anteil von 0,5 bis 5,0 Vol./Vol.-% zugesetzt. Auf diese Weise kann das Wachstum des oxidierenden Stammes begünstigt werden.
Die auf diese Weise entwickelte und in der Kulturbrühe oder der Reaktionsmischung angereicherte 2-Keto-L-gulonsäure kann in an sich bekannter Weise unter Ausnutzung ihrer Eigenschaften geerntet und gereinigt werden. 2-Keto-L-gulonsäure kann in Form der freien Säure geerntet oder in Form ihres Salzes mit, beispielsweise, Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium oder dergleichen abgetrennt werden.
Jedes mit dem Ziel der Erfindung verträgliche Ernte-Verfahren kann zum Einsatz kommen. Beispielsweise wird die Kulturbrühe entsprechend den Erfordernissen durch Filtration, Zentrifugation oder Behandlung mit Aktivkohle von Zellen befreit, und die Lösung wird konzentriert. Die ausgefallenen Kristalle werden durch Filtration gesammelt und zur Gewinnung der Ziel-Verbindung umkristallisiert. Weiterhin können die Lösungsmittel-Extraktion, die Chromatographie, die Fällung oder das Aussalzen und andere Arbeitsweisen in geeigneter Kombination und/oder in Wiederholung angewandt werden.
Wenn 2-Keto-L-gulonsäure in ihrer freien Form erhalten wird, kann sie nach dem herkömmlichen Verfahren in ein Salz, beispielsweise mit Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium oder dergleichen, überführt werden. Wenn die Ziel-Verbindung in Form eines Salzes gewonnen wird, kann dieses mit Hilfe eines bekannten Verfahrens in die freie Säure oder in ein anderes Salz überführt werden.
Die Identität des nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen Produkts mit 2-Keto-L-gulonsäure wurde durch Bestimmung physikalisch-chemischer Konstanten wie der Elementaranalyse, des Schmelzpunktes, der optischen Drehung, des Infrarot-Absorptionsspektrums etc. sichergestellt.
Die quantitative Bestimmung der 2-Keto-L-gulonsäure in der Reaktionsmischung oder der Kulturbrühe erfolgte mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (mobile Phase: verdünnte Schwefelsäure, pH 2,2; Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min; Detektor: Differential-Refraktometer) unter Einsatz einer sulfonierten Polystyrol-Gel-Säule (Shimadzu Seisakusho, Ltd., Japan, SCR-101H-Säule, 7,9 mm·30 cm). Als Standard wurden Kristalle von Natrium-2-keto-L-gulonatmonohydrat eingesetzt. Der Nachweis der 2-Keto-L-gulonsäure erfolgte mittels Dünnschicht-Chromatographie. So gab beim Tüpfeln einer Cellulose-Platte (Merck, USA) mit einer Probe und nach 3 h Entwickeln bei Raumtemperatur mit einem Lösungsmittel-System aus Phenol-Wasser-Ameisensäure (75:25:5), Trocknen und Behandeln mit einem Färbereagens 2-Keto-L-gulonsäure einen Fleck bei einem Rf-Wert von etwa 0,30, wobei der Fleck mit Silbernitrat schwarzbraun, mit o-Phenylendiamin gelb oder mit Anilinphthalsäure rosa war.
2-Keto-L-gulonsäure kann nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Einsatz eines Mikroorganismus, der zum Genus Pseudogluconobacter gehört und befähigt ist, L-Sorbose zu 2-Keto-L-gulonsäure zu oxidieren, in guter Ausbeute produziert werden.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung in weiteren Einzelheiten erläutern. Die im Zusammenhang mit Medien genannten Prozentzahlen stellen Gew./Vol.-% dar.

Beispiel 1

Ein konischer 200 ml-Kolben wurde mit 20 ml eines Impfkultur-Mediums, das 2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% getrocknete Hefe und 2,0% CaCO&sub3; enthielt, beschickt und durch 20 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert. Der Kolben wurde mit einer Ösenfüllung Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s (IFO 14464, FERM BP-1130), der auf einem in der Tabelle 1 angegebenen Schrägmedium 4 d bei 28ºC kultiviert worden war, beimpft und 2 d bei 30ºC unter Schütteln (200 UpM) inkubiert. 2 ml der resultierenden Kulturbrühe wurden in einen Kolben überführt, der das gleiche Impfkulturmedium wie oben enthielt, und unter den gleichen Bedingungen inkubiert, wonach eine Impfkultur erhalten wurde.
Ein konischer 200 ml-Kolben wurde mit 25 ml eines Fermentationskultur-Mediums, das 2,0% CSL, 0,5% getrocknete Hefe, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,05% Na&sub2;S&sub2;O&sub3;·5 H&sub2;O, 0,2% Eisen(II)sulfat, 4,0% CaCO&sub3; und 10,0% L-Sorbose (getrennt sterilisiert) enthielt, beschickt und durch 20 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert. Dieser das obige Fermentations- Medium enthaltende konische Kolben wurde mit 1,25 ml der oben hergestellten Impfkultur inokuliert und durch 3 d Schütteln bei 30ºC inkubiert. Aufgrund der Analyse mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie enthielt die resultierende Fermentationsbrühe 60,5 mg/ml 2-Keto-L-gulonsäure (Umwandlungs-Verhältnis 56,1%). Diese Fermentationsbrühe (1000 ml) wurde zentrifugiert, um zelluläre und andere Sedimente zu entfernen. Der erhaltene überstand (980 ml) wurde durch eine Säule mit Amberlite IR 120 (Rohm & Haas Co., USA, H-Form, 500 ml) geleitet, die dann mit etwa 300 ml entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die ablaufende Flüssigkeit und die Waschmittel-Anteile wurden dann vereinigt und durch eine Säule mit Aktivkohle (500 ml) geleitet, wonach mit etwa 300 ml entionisiertem Wasser gewaschen wurde, um die Kationen und die Farbe zu entfernen. Die ablaufende Flüssigkeit und die Waschmittel-Anteile wurden vereinigt (1600 ml), mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und unter vermindertem Druck bei 50ºC auf etwa 70 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wurde 24 h bei 5ºC stehen gelassen, worauf farblose Prismen erhalten wurden. Die Prismen wurden durch Filtration gesammelt, mit einer kleinen Menge an kaltem Methanol gewaschen und bei Raumtemperatur über Phosphorpentoxid getrocknet, wonach 37,5 g Mononatrium-2-keto-L-gulonatmonohydrat erhalten wurden.
Schmelzpunkt: 147-155ºC (Zers.).
Elementaranalyse (C&sub6;H&sub3;O&sub7;Na·H&sub2;O)
ber.:C: 30,78%; H: 4,74%;
gef.:C: 30,94%; H: 4,85%.
Optische Drehung: [α]D24 -23,3º (c = 1,0, Wasser).
Die HPLC-Retentionszeit, der TLC-Rf-Wert und die Farbe des obigen Produkts stimmten mit denen der authentischen Probe überein.

Beispiel 2

Ein Proberöhrchen (16 mm·160 mm), das 5 ml des in der Tabelle 2 angegebenen vollständigen Mediums enthielt, wurde mit einer Ösenfüllung Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s, der auf einem in der Tabelle 1 angegebenen Schrägmedium kultiviert worden war, beimpft und 2 d bei 30ºC unter Schütteln inkubiert. Diese Kultur (1 ml) wurde in ein 5 ml des gleichen Mediums enthaltendes Proberöhrchen überführt, das dann 4 h unter Schütteln inkubiert wurde. Die resultierende Brühe (5 ml) wurde 15 min bei 5ºC aseptisch zentrifugiert (12 000 UpM), um die Zellen zu ernten. Die Zellen wurden in 10 ml Tris-Maleinsäure-Puffer (pH 6,5; 0,05 M) suspendiert und erneut zentrifugiert. Die obige Arbeitsweise wurde zweimal wiederholt, und die gewaschenen Zellen wurden in 5 ml des oben erwähnten, 1 mg/ml Nitrosoguanidin enthaltenden Puffers suspendiert und zur mutagenen Behandlung 2 h bei 30ºC geschüttelt. Die Suspension wurde 15 min bei 5ºC zentrifugiert (12 000 UpM), um die Zellen zu ernten, die dann zweimal mit Anteilen von 10 ml Tris-Maleinsäure-Puffer gewaschen wurden, um eine Fraktion zu isolieren, die mit Nitrosoguanidin behandelte Zellen enthielt. Diese wurde mit 0,85-proz. Kochsalz-Lösung auf eine geeignete Konzentration verdünnt und auf einer Platte (Durchmesser 9 cm) ausgebreitet, die 15 ml des vollständigen Mediums (fest) enthielt. Das beimpfte Medium auf der Platte wurde 5 d bei 28ºC inkubiert, um Kolonien wachsen zu lassen. Die Kolonien wurden gezählt und mit der unbehandelten Kontrolle verglichen. Die Mortalität der Mikroorganismen aufgrund der Nitrosoguanidin-Behandlung betrug 90,4%. Die Kolonien auf der Platte mit dem vollständigen Medium wurden auf Platten mit dem minimalen essentiellen Medium der Tabelle 3 repliziert, und nach 3 d Inkubation bei 28ºC wurde die Häufigkeit von Auxotrophen (nahrungsbedingten Mutanten) untersucht; diese Häufigkeit betrug etwa 6,6%.
Die mit dem Mutagen auf der Platte mit dem vollständigen Medium behandelten Kolonien wurden auf eine frische Platte mit dem vollständigen Medium über eine Länge von etwa 2 cm mit der Rate von 12 Stämmen pro Platte aufgestrichen. Nach 2 d Inkubation bei 28ºC wurde eine Ösenfüllung der gewachsenen Zellen in ein Proberöhrchen überführt, das 3 ml eines aus 7,0% L-Sorbose (getrennt sterilisiert), 1,0% getrockneter Hefe, 1,0% Pepton, 0,1% Eisen(II)-chlorid und 3,0% CaCO&sub3; zusammengesetzten Mediums (pH 6,5) enthielt, und 4 d unter Schütteln bei 30ºC inkubiert. Unter den Stämmen der Test-Mutanten wurde gefunden, daß der Stamm TH14-86 unter den obigen Bedingungen doppelt soviel 2-Keto-L-gulonsäure erzeugt wie der Parenteral-Stamm K591s. Dieser Stamm TH14-86 (IFO 14466; FERM BP-1128) wurde als oxidierender Stamm mit einer gesteigerten Fähigkeit, L-Sorbose zu oxidieren, ausgewählt. Tabelle 1: Schräg-Medium (g/l) D-Sorbit Pepton Hefeextrakt CaCO&sub3; Agar pH 7,0 Tabelle 2: Vollständiges Medium (g/l) D-Sorbit Pepton Hefeextrakt pH 6,5 (Im Falle eines festen Mediums wurden 20 g Agar zugesetzt) Tabelle 3: Minimal-essentielles Medium (g/l) Sucrose K&sub2;HPO&sub4; KH&sub2;PO&sub4; (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; NaCl MGSO&sub4; · 7 H&sub2;O MnCl&sub2; · n H&sub2;O Natrium-L-glutamat L-Cystein CoA FMN Thiamin Biotin pH 7,0 (Im Falle eines festen Mediums wurden 20 g Agar zugesetzt)

Beispiel 3

Der in Beispiel 2 von Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s abgeleitete Mutanten-Stamm TH14-86 wurde 4 d bei 28ºC auf einem Schrägmedium kultiviert. Eine Ösenfüllung der Zellen wurde der Schrägkultur entnommen, und mit ihr wurden 20 ml des in Beispiel 1 beschriebenen Impfkultur-Mediums in einem konischen 200 ml-Kolben beimpft, das danach 2 d unter schütteln bei 30ºC inkubiert wurde.
Ein konischer Kolben von 1 Liter Fassungsvermögen wurde mit 200 ml eines aus 3,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% getrockneter Hefe und 2,0% CaCO&sub3; bestehenden Mediums beschickt und durch 20 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert. Der konische Kolben wurde mit 20 ml der obigen Kultur beimpft und 2 d bei 28ºC unter Schütteln inkubiert, um eine Impfkultur zu erhalten. Getrennt wurde eine Ösenfüllung Bacillus megaterium IFO 12108, der 2 d bei 28ºC auf einem Schrägmedium wachsen gelassen worden war, in einen konischen 200 ml-Kolben eingeimpft, der 20 ml eines aus 4,0% Sucrose, 4,0 Baumwollsamenmehl, 0,65% K&sub2;HPO&sub4;, 0,55% KH&sub2;PO&sub4;&sub1; 0,05% Ammoniumsulfat, 0,05% NaCl, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,05% Calciumpantothenat (pH 7,0) (sterilisiert durch 20 min Autoklavieren bei 120ºC) bestehenden Mediums enthielt und 3 d bei 30ºC inkubiert. Die resultierende Kulturbrühe wurde durch 20 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert, in der Kälte aufbewahrt und als Komponente des hierunter erwähnten Fermentationsmedium eingesetzt. So wurde ein 5-Liter-Kessel-Fermenter mit 3 l eines Hefe-Mediums beschickt, das aus 12,5% L-Sorbose (15 min bei 120ºC getrennt sterilisiert), 0,5% Ammoniumsulfat, 0,03% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% Na&sub2;S&sub2;O&sub3;·5 H&sub2;O, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,1% FeSO&sub4;·7 H&sub2;O, 5 ug/ml MnSO&sub4;·4 H&sub2;O, 5 ug/ml Thiamin, 0,1 ug/ml Biotin, 0,1 ug/ml FMN, 5,0% CaCO&sub3; und 4,0 Vol./Vol.-% der obigen sterilisierten Brühe von Bacillus megaterium bestand, und durch 30 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert. Dieses Fermentations-Medium wurde mit 300 ml der obigen Impfkultur beimpft und 3 d bei 32ºC unter Belüftung mit 2,4 l/min und Rühren mit 800 UpM kultiviert. Die resultierende Fermentationsbrühe enthielt 102,0 mg/ml 2-Keto-L- gulonsäure (Umwandlungs-Verhältnis 75,7%). Diese Brühe (1 Liter) wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, wonach 73,2 g Mononatrium-2-keto-L-gulonat-monohydrat-Kristalle erhalten wurden.

Beispiel 4

Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5 (IFO 14465, FERM BP-1129) wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 inkubiert, um eine Impfkultur zu erhalten. Ein konischer 200 ml-Kolben wurde mit 20 ml eines 9,0% L-Sorbose enthaltenden, in Beispiel 3 beschriebenen Fermentations-Mediums beschickt und durch 20 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert. Der Kolben wurde mit 1,5 ml der obigen Impfkultur beimpft und 2 d bei 32ºC inkubiert. Die resultierende Fermentationsbrühe enthielt 73,2 mg/ml 2-Keto-L-gulonsäure (Umwandlungs-Verhältnis 75,4%).

Beispiel 5

Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4 (FERM BP-1131, IFO 14483) , 12-15 (FERM BP-1132, IFO 14482) und 22-3 (FERM BP-1133, IFO 14484) wurden jeweils 3 d unter Schütteln in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 inkubiert. Die Ausbeuten an 2-Keto-L-gulonsäure in der Brühe betrugen 52,1 mg/ml für den Stamm 12-4 (Umwandlungs-Verhältnis 53,7%), 48,7 mg/ml für den Stamm 12-15 (Umwandlungs-Verhältnis 50,2%) und 69,3 mg/ml für den Stamm 22-3 (Umwandlungs-Verhältnis 71,4%).

Beispiel 6

Ein konischer 200 ml-Kolben wurde mit 25 ml eines aus 1,0% L-Sorbose (getrennt sterilisiert), 0,5% Pepton und 0,5% Hefeextrakt bestehenden Mediums (pH 7,0) beschickt und durch 15 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert. Der Kolben wurde mit einer Ösenfüllung Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86, der 4 d bei 28ºC auf einem Schrägmedium der Tabelle 1 kultiviert worden war, beimpft und 2 d bei 30ºC unter Schütteln inkubiert, um eine Impfkultur zu erhalten.
Ein konischer 200 ml-Kolben wurde mit 25 ml eines aus 5,0% L-Sorbose (getrennt sterilisiert), 1,0% Pepton, 0,5% Hefeextrakt und 2,0% Calciumcarbonat bestehenden Mediums (pH 7,0) beschickt und durch 15 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert. Der Kolben wurde mit 1,0 ml der obigen Impfkultur beimpft und 2 d bei 30ºC inkubiert.
Die resultierende Kultur (500 ml) wurde 20 min bei Raumtemperatur stehen gelassen, und das Sediment wurde durch Dekantation entfernt. Die verbleibende Flüssigkeit wurde bei einer langsamen Geschwindigkeit von 1 000 UpM bei Raumtemperatur zentrifugiert, um das überwiegend aus CaCO&sub3; bestehende Sediment zu entfernen. Die auf diese Weise erhaltene Zellsuspension wurde 10 min bei 5ºC weiter zentrifugiert (6 000 UpM), und die gesammelten Zellen wurden zweimal mit Anteilen von etwa 100 ml kalter Kochsalz-Lösung (0,85%) gewaschen und erneut bei 5ºC zentrifugiert (6 000 UpM), um gewaschene Zellen zu erhalten. Die Zellen wurden weiter in 35 ml kalter Kochsalz-Lösung (0,85%) suspendiert, wonach eine Suspension gewaschener Zellen erhalten wurde. Zu 4 ml dieser Suspension gewaschener Zellen wurden 300 mg L- Sorbose, 0,5 ml 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure(MES)-Puffer (pH 6,5; 0,5 M) und 180 mg CaCO&sub3; hinzugefügt, und danach wurde mit Wasser auf 10 ml verdünnt. Die Mischung wurde in einem konischen 100 ml-Kolben 24 h bei 30ºC unter Schütteln reagieren gelassen. Es wurde gefunden, daß die auf diese Weise erhaltene Reaktionsmischung 24,6 mg/ml 2-Keto-L-gulonsäure enthielt (Umwandlungs-Verhältnis 76,0%).

Beispiel 7

Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s, 12-5 und TH14-86 wurden jeweils 4 d bei 28ºC auf einem Schrägmedium wachsen gelassen. Getrennt wurden die in Tabelle 4 angegebenen mitzuverwendenden Bakterien auf dem gleichen Schrägmedium 2 d bei 28ºC wachsen gelassen. Jeweils ein 20 ml einer Impfkultur-Mediums aus Beispiel 1 enthaltender konischer 200 ml-Kolben wurde mit einer Ösenfüllung eines der Stämme beimpft und 2 d bei 30ºC unter Schütteln (200 UpM) inkubiert. Auf diese Weise wurden verschiedene Kultur-Brühen erhalten.
Ein konischer 200 ml-Kolben wurde mit 25 ml eines aus 2,0% CSL, 0,3% getrockneter Hefe, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,05% Na&sub2;S&sub2;O&sub3;·5 H&sub2;O, 0,2% Eisen(II)-sulfat, 5,0% CaCO&sub3; und 15,0% L-Sorbose (getrennt sterilisiert) beschickt und durch 20 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert. Der das vorstehende Medium enthaltende konische Kolben wurde mit der obigen Impfkultur (1,5 ml) eines der genannten (oxidierenden) Stämme von Pseudogluconobacter saccharoketogenes 5 d bei 30ºC unter Schütteln inkubiert, um eine reine Kultur zu erhalten.
Im Falle einer Mischkultur wurden 0,1 ml einer Impfkultur eines der mitverwendeten Bakterien gleichzeitig mit der Beimpfung mit dem oxidierenden Stamm eingeimpft, und das beimpfte Medium wurde 5 d bei 30ºC inkubiert.
Die Menge der in jeder Brühe produzierten 2-Keto-L-gulonsäure wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 aufgeführt. Die Anwesenheit der gleichzeitig mitverwendeten Bakterien ergab gesteigerte Ausbeuten an 2-Keto-L-gulonsäure. Tabelle 4 Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Kultivieren des Stammes Pseudoglucohobacter saccharoketogenes mit und ohne Anwesenheit der gleichzeitig mitverwendeten Bakterien Mitverwendetes Bacterium Pseudogluconobacter saccharoketogenes Ohne Zusatz Bacillus cereus IFO 3131 Bacillus licheniformis IFO 12201 Bacillus megaterium IFO 12108 Bacillus pumilus IFO 12090 Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 Bacillus subtilis IFO 13719 Pseudomonas trifolii IFO 12056 Pseudomonas maltophilia IFO 12692 Proteus inconstans IFO 12930 Citrobacter freundii IFO 13544 Enterobacter cloacae IFO 3320 Erwinia herbicola IFO 12686 Xanthomonas pisi IFO 13556 Flavobacterium meningosepticum IFO 12535 Die Zahlen in Klammern geben das Umwandlungs-Verhältnis an.

Beispiel 8

In einen 2 l-Sakaguchi-Kolben wurden 500 ml eines Vorkultur- Mediums aus 2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% getrockneter Hefe, 2,0% CaCO&sub3; und 0,01% Actcol (Entschäumungsmittel, Takeda Chemical Industries, Ltd.) eingefüllt, und der Inhalt wurde durch 20 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert. Die auf einem Schrägmedium aus Tabelle 1 kultivierten Zellen von Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86 wurden in 10 ml sterilem Wasser suspendiert, und die Gesamt-Menge wurde zum Beimpfen in den Sakaguchi-Kolben gegeben, und dieser wurde auf einem Hin-und-Her-Schüttelgerät (85 Cyclen pro Minute) 3 d bei 28ºC inkubiert, um eine Vorkultur zu erhalten. Ein 200 l-Fermenter wurde mit 120 1 (pH 6,5) einer aus 3,0% Glucose, 1,0% CSL, 0,5% getrockneter Hefe, 0,05% Natriumthiosulfat, 0,1% Eisen(II)-sulfat, 2,0% Calciumcarbonat und 0,03% Actcol bestehenden Impfkultur beschickt und 30 min bei 125ºC sterilisiert. In diesen Fermenter wurden 1,8 l der oben erwähnten Vorkultur überführt, und anschließend wurde 3 d bei 30ºC mit 120 UpM (Rühren), 100 1/min (Belüftung), 1,0 kg/cm²G (Druck) kultiviert, wonach eine Impfkultur erhalten wurde.
Andererseits wurde eine Ösenfüllung des mitverwendeten Stammes Bacillus megaterium IFO 12108, der 2 d bei 28ºC auf einem Schrägmedium aus Tabelle 1 wachsen gelassen worden war, in einen 2 l-Sakaguchi-Kolben inokuliert, der 500 ml des oben erwähnten Vorkultur-Mediums enthielt, und auf einem Hin-und-Her-Schüttelgerät (85 Cyclen pro Minute) 2 d bei 28ºC inkubiert, um eine Vorkultur zu erhalten. Ein 50 l- Fermenter wurde mit 30 l des gleichen Mediums wie dem obigen Vorkultur-Medium beschickt und 20 min bei 120ºC sterilisiert. Dieser Fermenter wurde mit 500 ml der Vorkultur des mitverwendeten Stammes inokuliert und 2 d bei 30ºC mit 120 UpM (Rühren), 30 l/min (Belüftung), 1,0 kg/cm²G (Druck) kultiviert, wonach eine Impfkultur des mitverwendeten Stammes erhalten wurde.
Ein 2 m³-Fermenter wurde mit l 000 1 eines aus 15,0% L- Sorbose (getrennt sterilisiert), 5,0% Calciumcarbonat, 2,0% CSL, 0,2% getrockneter Hefe, 0,3% Ammoniumsulfat, 0,05% Natriumthiosulfat, 0,1% Eisen(II)-sulfat und 0,03 0/0 Actcol bestehenden Fermentations-Mediums beschickt und 30 min bei 125ºC sterilisiert. In diesen Fermenter wurden 110 l der obigen Impfkultur des Stammes Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86 und 10 1 der Impfkultur des mitverwendeten Stammes Bacillus megaterium IFO 12108 überführt, und die Kultivierung wurde bei 110 UpM (Rühren), 900 l/min (Belüftung), 0,5 kg/cm²G (Druck) und 30ºC durchgeführt. Nach 4 d Inkubation enthielt die Kulturbrühe 123,1 mg/ml 2-Keto-L-gulonsäure (Umwandlungs-Verhältnis: 76,1%).

Beispiel 9

Ein konischer 200 ml-Kolben wurde mit 20 ml des Vorkultur- Mediums aus Beispiel 8 beschickt und durch 30 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert. Eine Ösenfüllung des 4 d bei 28ºC auf einem Schrägmedium aus Tabelle 1 kultivierten Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86 wurde in den obigen Kolben inokuliert und unter Schütteln 2 d bei 30ºC inkubiert. Die resultierende Kultur (20 ml) wurde in einen konischen 1 l-Kolben, der 200 ml des gleichen Mediums enthielt, überführt und unter Schütteln 2 d bei 30ºC inkubiert, wodurch eine Impfkultur von TH14-86 erhalten wurde.
Eine Ösenfüllung des Bacillus megaterium IFO 12108, der 2 d bei 28ºC auf einem Schrägmedium aus Tabelle 1 wachsen gelassen worden war, wurde in einen konischen 200 ml-Kolben, der 20 ml des Vorkultur-Mediums enthielt, inokuliert und 2 d bei 28ºC unter Schütteln inkubiert, um eine Impfkultur des mitverwendeten Bacteriums zu erhalten. Ein aus 3,0% L- Sorbose (getrennt sterilisiert), 2,0% CSL, 0,2% getrockneter Hefe, 0,3% Ammoniumsulfat, 0,05% Natriumthiosulfat, 0,1% Eisen(II)-sulfat, 0,02% Actcol und 9,0% Calciumcarbonat bestehendes Fermentations-Medium (3 l) wurde auf 2,1 l eingestellt und durch 30 min Autoklavieren bei 120ºC sterilisiert. Das sterilisierte Medium wurde in einen 5 l-Kessel-Fermenter gefüllt.
Dieser Kessel-Fermenter wurde mit 300 ml der obigen Impfkultur des Stammes TH14-86 und 4 ml der Impfkultur des mitverwendeten Stammes beimpft, und die Kultivierung wurde bei 30ºC, 2,4 l/min (Belüftung) und 800 UpM durchgeführt.
Getrennt wurden 510 g L-Sorbose in Wasser gelöst, um 800 ml einer Sorbose-Lösung herzustellen, und 20 min bei 120ºC sterilisiert. Diese sterilisierte Lösung wurde kontinuierlich von der 6. bis zur 42. Stunde in den Kessel-Fermenter eingeleitet. Nach der Zugabe der L-Sorbose wurde die Kultivierung unter denselben Bedingungen wie oben weitere 28 h fortgesetzt (insgesamt 70 h). Die resultierende Brühe enthielt 163,5 mg/ml 2-Keto-L-gulonsäure (Umwandlungs- Verhältnis: 75,8 %).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, umfassend das In-Berührung-Bringen eines Mikroorganismus von Pseudogluconobacter saccharoketogenes, der befähigt ist, L-Sorbose zu 2-Keto-L-gulonsäure zu oxidieren und der gram-negativ, beweglich und ein Stäbchen-Bacterium mit polaren Geißeln ist,

einen kombinierten DNA-Guanin- und -Cytosin-Gehalt von 67 ± 1 Mol-% und ein Ubichinon mit 10 Isopren- Einheiten als Chinon-System hat;

zur schwachen Erzeugung von Essigsäure aus Ethanol und zur Erzeugung von Dihydroxyaceton aus Glycerin befähigt ist und

Coenzym A als Wachstumsfaktor benötigt, das manchmal durch Pantothensäure ersetzbar ist; eine positive Reaktion auf den Oxidase-Test ergibt; bei einem pH-Wert von 4,5 nicht zu wachsen vermag und gutes Wachstum entweder in Hefeextrakt-Medium oder in Pepton-Hefeextrakt-Medium ohne Kohlenhydrat zeigt,

entweder so, wie er ist, oder als Zell-Präparat des Mikroorganismus mit L-Sorbose, um 2-Keto-L-Gulonsäure zu erzeugen und anzureichern, und das Ernten derselben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Mikroorganismus Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s (FERM BP-1130), 12-5 (FERM BP-1129), TH 14-86 (FERM BP-1128) 12-15 (FERM BP-1132) 12-4 (FERM BP-1131) oder 22-3 (FERM BP-1133) ist.

3. Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, umfassend das In-Berührung-Bringen eines Mikroorganismus von Pseudogluconobacter saccharoketogenes, der befähigt ist, L-Sorbose zu 2-Keto-L-gulonsäure zu oxidieren und der gram-negativ, beweglich und ein Stäbchen-Bacterium mit polaren Geißeln ist,

mit L-Sorbose in Gegenwart wenigstens eines zu dem Genus Bacillus, dem Genus Pseudomonas, dem Genus Proteus, dem Genus Citrobacter, dem Genus Enterobacter, dem Genus Erwinia, dem Genus Xanthomonas, dem Genus Flavobacterium oder dem Genus Escherichia gehörenden Mikroorganismus.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Mikroorganismus von Pseudogluconobacter saccharoketogenes Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s (FERM BP-1130), 12-5 (FERM BP-1129), TH 14-86 (FERM BP-1128), 12-15 (FERM BP-1132), 12-4 (FERM BP-1131) oder 22-3 (FERM BP-1133) ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Mikroorganismus von Pseudogluconobacter saccharoketogenes Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH 14-86 (FERM BP-1128) ist, der Mikroorganismus des Genus Bacillus Bacillus cereus (IFO 3131), Bacillus licheniformis (IFO 12201), Bacillus megaterium (IFO 12108), Bacillus pumilus (IFO 12090), Bacillus anyloliguefaciens (IFO 3022) oder Bacillus subtilis (IFO 13719) ist, der Mikroorganismus des Genus Pseudomonas Pseudomonas trifolii (IFO 12056) oder Pseudomonas maltophilia (IFO 12692) ist, der Mikroorganismus des Genus Proteus Proteus inconstans (IFO 12930) ist, der Mikroorganismus des Genus Citrobacter Citrobacter freundii (IFO 13544) ist, der Mikroorganismus des Genus Enterobacter Enterobacter cloacae (IFO 3320) ist, der Mikroorganismus des Genus Erwinia Erwinia herbicola (IFO 12686) ist, der Mikroorganismus des Genus Xanthomonas Xanthomonas pisi (IFO 13556) ist und der Mikroorganismus des Genus Flavobacterium Flavobacterium meningosepticum (IFO 12535) ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Mikroorganismus von Pseudogluconobacter saccharoketogenes Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s (FERM BP-1130) oder 12-5 (FERM BP-1129) ist, der Mikroorganismus des Genus Bacillus Bacillus cereus (IFO 3131), Bacillus megaterium (IFO 12108), Bacillus pumilus (IFO 12090) oder Bacillus subtilis (IFO 13719) ist, der Mikroorganismus des Genus Pseudomonas Pseudomonas trifolii (IFO 12056) oder Pseudomonas moltophilia (IFO 12692) ist, der Mikroorganismus des Genus Citrobacter Citrobacter freundii (IFO 13544) ist, der Mikroorganismus des Genus Enterobacter Enterobacter cloacae (IFO 3320) ist und der Mikroorganismus des Genus Erwinia Erwinia herbicola (IFO 12686) ist.

7. Biologisch reine Kultur des zu Pseudogluconobacter saccharoketogenes gehörenden Mikroorganismus, die aerob in Gegenwart von Coenzym A wächst, worin der Mikroorganismus Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s (FERM BP-1130), 12-5 (FERM BP1129), TH 14-86 (FERM BP-1128), 12-15 (FERM BP-1132) 12-4 (FERM BP-1131) oder 22-3 (FERM BP-1133) ist.