HU201804B - Process for producing 2-keto-l-gulon acid in microbiological way - Google Patents

Process for producing 2-keto-l-gulon acid in microbiological way Download PDF

Info

Publication number
HU201804B
HU201804B HU864369A HU436986A HU201804B HU 201804 B HU201804 B HU 201804B HU 864369 A HU864369 A HU 864369A HU 436986 A HU436986 A HU 436986A HU 201804 B HU201804 B HU 201804B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ferm
medium
bacillus
acid
pseudogluconobacter saccharoketogenes
Prior art date
Application number
HU864369A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT43636A (en
Inventor
Ikou Nogami
Masahide Oka
Hideo Shirafuji
Takamasa Yamaguchi
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Publication of HUT43636A publication Critical patent/HUT43636A/hu
Publication of HU201804B publication Critical patent/HU201804B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
    • C12P7/60—2-Ketogulonic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás 2-keto-gulonsav előállítására a Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmus-törzs segítségével. A2-keto-L-gulonsavazL-aszkorbinsavelőállítási eljárásának fontos intermedier je.
A 2-keto-L-gulonsavat korábban Reichstein [Helvetica Chimica Acta 77,311 (1934)] módszerével állították elő. Azonban az eljárás számoslépésből áll, nagymennyiségű oldószert igényel, ezért a modem technológia szempontjából nem megfelelő.
Reichstein módszere helyett számos, mikroorganizmusok felhasználására alapozott módszert javasoltak. Például az egyik szerint glükózt 5-keto-D-gulonsawá oxidálnak egy mikroorganizmus segítségével, kémiai vagy mikrobiológiai úton L-idonsawá redukálják, majd a kapott vegyületet 2-keto-L-gulonsawá oxidálják mikrobiológiai úton (2,421,611 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Egy másik ismert eljárás szerint glükózt 2,5-diketoD-glükonsawá oxidálnak egy mikroorganizmus segítségével, majd a kapott anyagot kémiai vagy mikrobiológiai módszerrel 2-keto-L-gulonsawá alakítják (közzétett japán 39-14493, 53-25033, 5615877 és 59-35920 sz. szabadalmi bejelentések).
Azonban az ismert eljárások hátránya, hogy a kémiai redukciós eljárás, vagyis az 5-keto-D-glükonsav L-idonsawá, illetve a 2,5-diketo-D-glükonsav
2-keto-D-gulonsawá való átalakítása nem sztereospecifikus, így a redukció során melléktermékként képződött D-glükonsav, illetve 2-keto-D-gulonsav miatt a kívánt tennék hozama csökken.
Ezen kívül, ha a fenti reakciót egy mikroorganizmus segítségével hajtjuk végre, az összkitermelés akkor is csökken, mivel a mikrobiológiai eljárásban a kiindulási anyagként alkalmazott glükózt feleslegben kell alkalmaznunk, mivel ez a mikroorganizmus energiaforrása. Ebből a szempontból a kiindulási anyagként L-szorbózt alkalmazó 2-keto-L-gulonsav előállítására szolgáló eljárás csak oxidációs lépést tartalmaz.
Számos, a Gluconobacter, Pseudomonas, Serratia, Achromobacter és Alcaligcnes nemzetséghez tartozó baktériumot vizsgáltak idáig a fenti reakcióban való alkalmasság szempontjából. Az ilyen vizsgálatokat például a Biotechnology and Bioengineering74,799(1972),ActaMicrobiologicaSinica,20, 246 (1980) és 21,185 (1981), 41-159 és 41-160 sz. közzétett japán szabadalmi leírás, 3,043,749 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, valamint a 49-39838 sz. japán közzétett szabadalmi leírás tartalmazza.
Azonban az ismert törzsekkel végzett eredmények nem kielégítőek, és a kitermelés túl alacsony ahhoz, hogy ipari méretekben érdemes legyen megvalósítani.
Találmányunk kidolgozása során célunk az volt, hogy olyan eljárást dolgozzunk ki 2-keto-L-gulonsav előállítására, amely a korábban ismertetett eljárásokhoz képest nagyobb kitermelést eredményez. Vizsgálataink során arra a felismerésre jutottunk, hogy a fenti cél elérhető, ha az eljárásban K591s törzset alkalmazunk. A K591s törzset a Wakayama körzetből vett mintából izoláltuk. Úgy találtuk, hogy az eljárásban a Shiga körzetből vett földmintákból izolált 12-5, 12-15 és 12-4, 22-3 sz. baktéri2 umtörzsek is azonos eredménnyel alkalmazhatók Taxonómiai vizsgálataink szerint ezek a törzsek új baktériumoknak bizonyultak, amelyek az irodalomból nem ismertek.
A találmány tárgya tehát eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására L-szorbózból (1) Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmus segítségével, amely eredeti formájában vagy feldolgozva az L-szorbózt 2-keto-L-gulonsawá oxidálja, vagy (2) oly módon, hogy egy Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmust, amely képes az L-szorbóz 2-keto-L-gulonsavvá való oxidálására, legalább egy, a Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Pseudomonas trifolii, Pseumonoas matophilia, Proteus inconstans, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Erwinia herbicola, Xanthomonas pisi, Flavobacterium meningosepticum fajhoz tartozó mikroorganizmus jelenlétében L-szorbózzal hozunk érintkezésbe.
A találmány szerinti eljárásban használt Pseudogluconobacter saccharoketogenes mikroorganizmus új, aerob mikroorganizmus, amely koenzim-A jelenlétében tenyészik.
Afentiekben említett öt baktérium közölaK591s és 12-5 a következő taxonómiai tulajdonságokkal rendelkezik:
a) Morfológia (1) Pálcika alakúak, méretük(0,3-0,5)x(0,7-1,4) μπι.
(2) Nem mutatnak celluláris polimorfiát.
(3) 2-4 poláris flagella segítségével mozognak.
(4) Nem képeznek spórákat.
(5) Gram-negatív.
(6) Nem saválló.
b) Tenyészetési jellemzők (1) Semleges agar táptalaj: lényegében nincs növekedés. Élesztő-extraktummal dúsított agar táptalaj: kerek, teljes körvonalak, sima felület, opálos.
(2) Élesztő-extraktummal dúsított, ferdére állított agar: a növekedés mérsékelt és fonalszerű, finom, opálos.
(3) Élesztő extraktumból készített folyékony tápközeg: Mérsékelt növekedés, egységes turbiditás az egész közegben.
(4) Semleges zselatin szúrt tenyészet: Csekély felszíni növekedés, a zselatin nem folyósodik el.
(5) Lakmusz tej: Megsavanyodás és koagulálódás.
c) Fiziológiás tulajdonságok (1) Nitrát redukció: gyenge, de pozitív (2) Nitrátmentesítés: negatív (3) Metilvörös (MR) vizsgálat: pozitív (4) Voges-Proskauer vizsgálat: negatív (5) Indol: nem képződik (6) Hidrogén-szulfid: nem képződik (7) Keményítő: nem hidrolizálódik (8) Citromsav: nem hasznosítja (9) Ammónium-sók: hasznosítja (10) Pigmentek: nem képződnek
-2HU 201804Β (11) Ureáz:képzidik (12) Oxidáz: pozitív (13) Kataláz: pozitív (14) Tenyésztéshez szükséges hőmérséklet: 1636’C
Tenyészetéshez szükséges optimális hőmérséklet: 24-34’C
Tenyésztéshez szükséges pH: 5,5-8,7
Tenyésztéshez szükséges optimális pH: 6,0-7,5 (15) Aerób (16) Hugh-Leifson-féle OF teszt: oxidatív (17) Savat igen, de gázt nem fejleszt L-arabínózból, D-xilózból, D-glükózból, D-fruktózból, D-galaktózból, D-mannózból, maltózból, szacharózból, laktózból, trehalózból, D-mannitból és glicerinből.
Sem savat, sem gázt nem fejleszt D-szorbitból, inozitból vagy keményítőből.
d) Egyéb jellemzők (1) Etanolból gyengén ecetsavat képez (2) Növekedéséhez biotin, tiamín, riboflavin és A koenzim (CoA) szükséges.
(3) Glicerinből dihidroxi-acetont képez.
(4) ADNSguanin+citozintartalma:67 ± lmól%.
(5) 10 ízoprén egységből álló ubikinont tartalmaz (CoQio).
(6) Jelentős mennyiségben képez 2-keto-L-gulonsavat L-szorbózból.
(7) Sztreptomicin-rezisztens.
A 12-15 törzs taxonómiai jellemzői a következők:
a) Morfológia (1) Pálcikaalakú,asejtekmérete(0,3-0,5)x(0,71,4) pm.
(2) Nem mutat celluláris polimorfiát.
(3) 2-4 poláris ostorral mozog.
(5) Gram-negatív.
(6) Nem saválló.
b) Tenyésztési jellemzők (1) Semleges agar lemez táptalaj: Lényegében nincs növekedés. Élesztő extraktummal dúsított agar táplemez: Kerek, teljes határvonal, sima és opalizál.
(2) Élesztő extraktummal dúsított, ferdére állított agar táptalaj: A növekedés mérsékelt, fonálszerű, sima és oplizál.
(3) Élesztő extraktumból készített semleges tápfolyadék* Mérsékelt növekedés, egységes turbiditás az egész közegben.
(4) Semleges zselatin szúrt tenyészet: Csekély növekedés, csak a tetején. A zselatin nem folyósodik el.
(5) Lakmusz tej: Megsavanyodás, de koaguláció nincs.
c) Fiziológiás tulajdonságok· (1) Nitrát redukció; negatív (2) Nitrátmentesítés: negatív (3) Metilvörös (MR) teszt: pozitív (4) Voges-Proskauer (VP) teszt: negatív (5) Indok nincs képződés (6) Hidrogén-szulfid: nem képződik (7) Keményítő: nem hidrolizálódik (8) Citrát: nem hasznosítja (9) Ammónium-sók: hasznosítja (10) Nincs pigmentképzés (11) Ureáz: képződik (12) Oxidáz: pozitív (13) Kataláz: pozitív (14) Növekedés 23-32 ’C hőmérsékleten, 2832 ’C az optimális. Növekedés pH tartománya: 6,07,5, optimális pH: 6,5-7,1.
(15) Aerob (16) Hugh-Leifson-féle OF teszt: oxidatív (17) Savat képez, de gázt nem képez a következő vegyületekből: L-arabinóz, D-xilóz, D-glükóz, Dfruktóz, D-mannóz, maltóz, szacharóz, laktóz, trehalóz és glicerin. Sem savat, sem gázt nem képez a kővetkező vegyületekből: D-szorbit, D-mannit, mozit és keményítő.
d) Egyéb jellemzők:
(1) Etanolból gyengén ecetsavat képez.
(2) Növekedéséhez biotin, tiamin, riboflavin és CoA szükséges.
(3) Glicerinből dihidroxi-acetont képez.
(4) ADNS guanin+citozin tartalma: 67 ± 1 mól%.
(5) 10 izoprén egységet tartalmazó ubikinon (CoQio) jelenléte.
(6) Jelentős mennyiségben képez 2-keto-L-gulonsavat L-szorbózból.
(7) Sztreptomicin-rezisztens.
A12-4 törzs taxonómiai tulajdonságai a következők:
a) Morfológia (1) Pálcika formájú sejtek, méretűk (0,3-0,5) x (0,7-1,4) pm (2) Nincs celluláris polimorfia.
(3) 2-4 ostorral mozognak.
(4) Nem spóraképző.
(5) Gram-negatív.
(6) Nem saválló.
b) Tenyésztési jellemzők (1) Semleges agar lemez: A jelentéktelen telepek megfigyelése részletesen nem lehetséges. Élesztő extraktummal dúsított agar tápközeg: Kerek, teljes körvonal, sima, opálos.
(2) Élesztővel dúsított semleges, ferdére állított táptalaj: A növekedés mérsékelt és fonálszerű, sima ésopalizál.
(3) Élesztő extraktum folyékony tápközeg (semleges): Mérsékelt növekedés, egységes turbiditás az egész közegben.
(4) Semleges zselatin szúrt tenyészet: Gyenge növekedés, de csak a tetején. A zselatin nem folyósodik el.
(5) Lakmusz tej: Megsavanyodik, de nem koagulálódik.
c) Fiziológiás tulajdonságok (1) Nitrát redukció: negatív (2) Nitrátmentesítés: negatív (3) Metilvörös (MR) teszt: pozitív (4) Voges-Proskauer (VP) teszt: negatív (5) Indol: nem képződik (6) Hidrogén-szulfid: képződik
-3HU 201804Β (7) Keményítő: nem hidrolizálódik (8) Citrát: nem hasznosítja (9) Ammónium-sók: hasznosítja (10) Nincs pigmentképzés (11) Ureáz: képződik (12) Oxidáz: képződik (13) Kataláz: képződik (14) A növekedés hőmérsékletintervaUuma 1636 ‘C, optimuma 24-34 ’C. A növekedés pH intervalluma 5,5-8,2 optimuma 6,0-7,5.
(15) Aerob (16) Hugh-Leifson-féle OF teszt: oxidatív (17) Savat képez, de gázt nem képez a következő vegyületekból: L-arabinóz, D-xilóz, D-glükóz, Dfruktóz, D-galaktóz, D-mannóz, mai tóz, szacharóz, laktóz, trehalóz és glicerin. Sem savat, sem gázt nem képez D-mannitból, D-szorbitból, inozitból és keményítőből.
d) Egyéb jellemzők:
(1) Etanolból gyengén ecetsavat képez.
(2) Növekedéshez biotin, tiamin, riboflavin és vagy CoA, vagy pantoténsav szükséges.
(3) Glicerinből dihidroxi-acetont képez.
(4) ADNSguanin+citozin tartalma: 67 ± 1 mól% (5) 10 izoprén egységet tartalmazó ubikinon jelenléte (CoQio) (6) L-szorbózból jelentős mennyiségben képez 2keto-L-gulonsavat (7) Sztreptomicin-rezisztens
A 22-3 törzs taxonómiai tulajdonságai a következők:
a) Morfológia (1) Pálcika alakú sejtek, méretük (0,3-0,5) X (0,7-1,4) μτη (2) Nincs celluláris polimorfia (3) 2-4 poláris ostorral mozognak (4) Nem spóraképző (5) Gram-negativ (6) Nem saválló.
b) Tenyésztési jellemzők (1) Semleges agar táptalaj: A jelentéktelen telepek nem tesznek lehetővé részletes megfigyelést. Élesztővel dúsítottsemleges agar: Kerek, egész körvonal, sima, opálos.
(2) Élesztő kivonattal dúsított semleges agar táptalaj ferdére állítva: A növekedés mérsékelt és szálszerű, sima, opálos.
(3) Keményítő extraktumból készült semleges tápközeg: Mérsékelt növekedés, egységes turbiditás az egész közegben.
(4) Semleges zselatin szúrt tenyészet: Gyenge növekedés csak a tetején. Zselatin nem folyósodik el.
(5) Lakmusz tej: Savanyodás, de koaguláció nincs
c) Fiziológiai tulajdonságok (1) Nitrát redukció: pozitív (gyenge) (2) Nitrátmentesítés: negatív (3) Metilvörős (MR) teszt; pozitív (4) Voges-Proskauer (VP) teszt: negatív (5) Indotrnem képződik (6) Hidrogén-szulfid: nem képződik (7) Keményítő: nem hidrolizálódik (8) Citrát: nem hasznosítja (9) Ammónium-sók: hasznosítja (10) Nincs pigmentképzés (11) Ureáz: képződik (12) Oxidáz: pozitív (13) Kataláz: pozitív (14) A növekedés hőmérsékletintervalluma 1638 ’C, optimuma 24-34 ’C. A növekedés pH intervalluma: 5,5-8,7, optimuma 6,0-7,8.
(15) Aerob (16) Hugh-Leifson-féle OF teszt: oxidatív (17) A kővetkező vegyületekból savat igen, de gázt nem képez: L-arabinóz, D-xilóz, D-glükóz, Dfruktóz, D-galaktóz, D-mannóz, maltóz, szacharóz, laktóz, trehalóz és glicerin. A következő vegyül etekből sem savat, sem gázt nem fejleszt: D-mannit, Dszorbit, mozit és keményítő.
d) Egyéb jellemzők:
(1) Etanolból gyengén ecetsavat képez.
(2) Növekedéséhez biotin, tiamin, riboflavin és vagy CoA, vagy pantoténsav szükséges.
(3) Glicerinből dihidroxi-acetont képez.
(4) ADNSguanin+cítozintartalma:67 ± 1 mől%.
(5) 10 izoprén egységet tartalmazó ubikinon egységek jelenléte (6) Jelentős mennyiségben termel 2-kcto-L-gulonsavat L-szorbózból.(7) Sztreptomicin-rezisztens.
A fenti, 5 földből származó baktérium taxonómiai tulajdonságait Bergey Manual of DeterminativeBacteriology, 8. kiadás (1974) és Bergey Manual of Systematic Bacteriology, 1. kötet (1984) alapján határoztuk meg.
A fentiek alapján a K591s, 12-5, 12-4 és 22-3 törzs a Pseudomonas nemzetségbe sorolható, tekintve, hogy Gram-negatívak, mozgásra képesek, és pálca formájú baktériumok, melyek poláris ostorokkal rendelkeznek. Azért, mert bizonyos növekedési feltételek szükségesek a tenyésztésükhöz, a DNS guanin + citozin tartalma 67 ± 1 mól%, és kinonrendszerük 10 izoprén egységet tartalmazó ubikinon, hasonlók a Pseudomonas diminuta-hoz és a Pseudomonas vesicularishoz, melyek ennek a nemzetségneklV. szekciójánaklV.RNS csoportjába tartoznak. Azonban az etanolból való gyenge ecetsavképzés és a glicerinből való dihidroxi-aceton képzés azok a jellemzők, amelyek ezeket a törzseket a Pseudomonas nemzetséghez tartozó baktériumoktól megkülönböztetik.
A fenti tulajdonságok a Gluconobacter nemzetséghez tartozó baktériumok tulajdonságaival egyeznek meg. Mivel azonban a fenti 5 törzs az oxidáz vizsgálatban pozitív eredményt mutat, pH - 4,5-nél nem élnek meg, és élesztő extraktum vagy pepton élesztő extraktum tápközegben szénhidrátok jelenléte nélkül is növekszenek, valamint a DNS-ükben a guanin + citozin tartalom 67 ± 1 mól%, ezért a Gluconobacter nemzetségtől különböznek.
így a fenti 5 törzs (K59 Is, 12-5,12-15,12-4,223) nem sorolható be egyetlen ismert nemzetségbe se, ezért egy új nemzetség képviselőinek tekinthetjük őket. így azK591s, 12-5,12-15,12-4 és 22-3 törzset együttesen Pseudogluconobacter saccharoketogenesnek neveztük.
-4HU 201804Β >
A táplálkozási igényeiket tekintve a fenti 5 törzs, a K591s, 12-5 és 12-15 növekedésére aza jellemző, hogy Koenzim-A szükséges növekedésükhöz. A koenzim-Ahárom törzs esetén pantoténsawalnemhelyettesíthető. Másrészt a 1-24, 22-3 pantoténsav 5 vagy koenzim-A jelenlétében egyaránt növekszik
A leírásban a Pseudogluconobacter saccharoketogenes törzseket néha oxídatív törzsekként említjük.
A találmány szerinti eljárásban nemcsak a fenti- 10 ekben leírt 5 törzset, de a fenti törzsből UV besugárzás, röntgen-sugárzás, kémiai mutagénekkel, például N-metil-N’-nitro-N-nitrozoguanidinnel (nitrozoguanidinnel), metil-metán-szulfonáttal, nitrogén mustárral, stb. való kezelés hatására létrejött mu- 15 tánsaikat is alkalmazhatjuk. Példaként az ilyen mutánsokra a TH 14-86 törzset említhetjük, melyet a Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s törzsből nyertünk nitrozoguanidinnel való kezeléssel. A TH 14-86 mutáns törzs ugyanolyan taxonó- 20 miai tulajdonságokkal rendelkezik, mint a K591s törzs, azzal az eltéréssel, hogy L-szorbózból jobban képes 2-keto-L-gulonsavat előállítani.
A fentiekben említett Pseudogluconobacter saccharoketogenes K-591s, 12-5, TH-14-86 törzseket 25 az Osakai Fermentációs Intézetben (IFO) 1985. szeptember 19-én, míg a Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15,12-4 és 22-3 törzseket 1985. december 16-án helyezetük letétbe.
Ezenkívül aPseudogluconobacter saccharoketo- 30 genesK591s, 12-5, TH 14-86 törzseket a Nemzetközi Kereskedelmi és Ipari Minisztérium Ipari Tudomány és Technológiai IrodájánakFermentációsKutatásí Intézetében (FRI) 1985. október 7-én, míg a Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15, 35
12-4 és 22-3 törzseket 1985. december 20-án helyeztük letétbe. A letétbe helyezést a Budapest Egyezmény szerinti letétbehelyezéssé alakítottuk át, és ezeket a mikroogranizmusokat a FRI 1986. augusztus 9. óta nyilvántartja és tárolja. 40
A törzsek IFO és FRI deponálási számai a következők:
Mikroorganizmus neve DFO FRI 45
Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s 14464 P-8481 BP-1130
Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5 14465 P-8480 BP-1129 50
Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH 14-86 14466 P-8479 BP-1128 55
Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15 14482 P-8577 l t 1 BP-1132 !
Mikroorganizmus neve DFO FRI 60
Pseudogluconobacter saccharoketogenes
12-4 14483 P-8576 BP-1131
Pseudogluconobacter ' 65 saccharoketogenes
22-3 14484 P-8578 BP-1133
A találmány szerinti eljárás során a fenti törzseket L-szorbóz tartalmú közegben tenyészthetjük, vagy L-szorbózt adhatunk a fenti törzsekből készített sejtpreparátumhoz.
A „sejtpreparátum” kifejezés alatt a baktérium tápközegéből kimosott, acetonnal szárított, hordozótra felvitt úton (például poliakrilamid gélre, Kkarragénre és hasonlóra felvitt) immobilizált sejteket, vagy egyéb ekvivalens preparátumokat értünk.
A kiindulási anyagként használt L-szorbózt rögtön egyszerre adhatjuk a tápközeghez a tenyésztés kezdetén, vagy több részletben a tenyésztés folyamán, vagy tenyésztés közben folyamatosan.
A rendszerben az L-szorbóz koncentrációja 330, előnyösen 5-25 tömeg/térfogat% a tápközegre számítva.
L-szórbózból úgy állíthatunk elő 2-keto-L-gulonsavat, hogy az adott sejtpreparátumhoz 2-(Nmorfolino)-etánszulfonsav (MES) puffért (pH-6,5; 0,5 M) és kalcium-karbonátot adunk, vízzel hígítjuk, és az elegyet egy kúp alakú lombikba rázzuk.
Az ilyen reakcióelegyben azL-szorbóz és a sejtpreparátum közötti legjobb érintkezést biztosító Lszorbóz koncentráció 0,1-10 tömeg/térfogat%, előnyösen 0,3-3 tömeg/térfogat%. A sejtpreparátum mennyisége száraz sejtre számítva 1-30 mg/ml. A reakcióelegy pH-ját 5,5-7,5 közötti értékenkell tartani, a reakció hőmérséklete kb. 20-40 *C, és a reakcióidő kb. 1-100 óra.
A találmány megvalósítása során úgy találtuk, hogy amikor egy Pseudogluconobacter saccharoketogenes törzset L-szorbóz tartalmú folyékony tápközegben tenyésztve 2-keto-L-gulonsavat állítunk elő, a 2-keto-L-gulonsav nagyobb mennyiségben képződik akkor, ha a Pseudogluconobacter oxidatív törzsön kívül más baktériumot is tartalmaz a tápközeg, mint akkor, ha csak az oxidatív törzset önmagában tenyésztjük.
Második baktériumként például a Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Xanthomonas és Flavobacterium nemzetségből származó törzseket alkalmazhatunk. Specifikus példaként a következőket említhetjük:
Bacillus cereus
Bacillus licheniformis Bacillus megaterium Bacillus pumilus Bacillus amyloliquefaciens Bacillus subtilis Bacillus circulans Pseudomonas trifolii Pseudomonas maltiophilia Proteus inconstans Citrobacter freundii Enterobacter colacae Erwinia herbicola Xanthomonas pisi Xanthomonas citrí Flavobacterium menigosepticum Micrococcus variáns Eshercia coli
ΠΌ3131 IFO 12201 IFO 12108 IFO 12090 IFO 3022 IFO 13719 IFO 3967 DFO12056 IFO 12692 IFO 12930 IFO 13544 IFO 3320 IFO 12686 IFO 13556 IFO 3835 DFO12535 IFO 3765 IFO 3366
-5HU 201804Β
Bármely fenti törzset megfelelő közegben 2040 ’C hőmérsékleten inkubálhatunk 1-4 napig, majd a kapott tenyészetet inokulumként alkalmazhatjuk a találmány szerinti eljárás során. Az inokulum mérete általában 1/10-1/1000 között változik az oxidatív törzshöz viszonyítva. Amennyiben a járulékos törzset ilyen mennyiségben inkubáljuk az oxidatív törzzsel, az oxidatív törzs növekedését oly módon javítja, hogy az oxidatív törzs tiszta kultúrájával összehasonlítva, a kevert tenyészet nagyobb koncentrációban, rövidebb idő alatt képes L-szorbózból 2-keto-L-gulonsavat előállítani.
A járulékos baktériumként használt törzsek előnyösen olyanok, amelyek L-szorbózból 2-keto-Lgulonsavat kevéssé vagy egyáltalán nem tudnak előállítani. Különben ugyanolyan tenyésztési körülményeket alkalmazhatunk, mintha az oxidatív törzset önmagában használnánk.
A fenti mikroorganizmusok tenyésztésére használt közeg szilárd vagy folyékony lehet, s olyan tápanyagokat tartalmaz, amelyet az adott törzs hasznosít. Azonban ipari méretű eljárás esetén a folyékony tápközeg előnyös. A közeg tartalmaz szénforrásokat, nitrogén forrásokat, szervetlen sókat, szerves sav sókat, és nyomnyi mennyiségben olyan anyagokat, melyeket általában használnak mikroorganizmusok tenyésztéséhez.
Míg a kiindulási anyagként használt L-szorbóz szénforráskéntszolgál.egyébsegéd-szénforrásokat, például glükózt, glicerint, szacharózt, laktózt, maltózt, melaszt stb. szintén alkalmazhatunk
Nitrogénforrásként például különböző szervetlen és szerves nitrogéntartalmú vegyületet vagy nitrogénvegyületet, például ammónium-sókat (például ammónium-szulfátot, ammónium-nitrátot, ammónium-kloridot, ammónium-foszfátot stb.) kukoricalekvárt (CSL), peptont, húsextraktumot, élesztő extraktumot, szárított élesztőt, szójalisztet, gyapotmag lisztet, karbamidot stb. használhatunk Szervetlen sóként kálium-, nátrium-, kalcium-, magnézium-, vas-,mangén-,kobalt-, cink-,réz-és/vagyfoszforsav sóit alkalmazhatjuk
Nyomnyi mennyiségű tápanyagként a koenzimA-n kívül pantoténsavat, biotint, tiamint és riboflavint alkalmazhatunk, melyek a fenti mikroorganizmusok növekedéséhez feltétlenül szükségesek, de használhatunk olyan anyagokat is, melyek meggyorsít ják a mikroorganizmus növekedését ill. ily módon az 2-keto-L-gulonsav képződést, például flavin mononukleotidot (FMN), flavin-adenin dinukleotidot (FAD), egyéb vitaminokat, L-ciszteint, L-glutaminsavat, nátrium-tioszulfátot stb. vagy tiszta vegyületek, vagy ezeket tartalmazó természetes anyagok formájában, megfelelő mennyiségben.
A tenyésztési módszert illetően bármely stacionárius, rázó, alámerítéses stb. eljárás alkalmazható. Ipari méretű eljárásra azún. alámerítéses tenyésztési eljárás az előnyös.
Természetesen a tenyésztési körülmények a baktérium törzstől, a tápközeg összetételétől és egyéb faktoroktól függnek, és minden esetben úgy kell megválasztanunk őket, hogy a kívánt vegyületet a lehető legnagyobb hatékonysággal kapjuk.
így például az inkubációs hőmérséklet előnyösen
25-35 ’C lehet, és a közeg pH-ja kb. 5-9.
Ha a tenyésztést a fenti körülmények között 1 ΟΠΟ órán keresztül folytatjuk, a 2-keto-L-gulonsav a legnagyobb koncetrációban képződik Mivel a közeg pH értéke általában a kívánt vegyület képződésével csökken, előnyös, ha egy bázikus anyagot, például nátrium-hidroxidot, kálium-hidroxidot vagy ammóniát adunk időről időre a tápközeghez, hogy a közeg pH-ját optimális értéken tartsuk a 2-keto-L-gulonsav termelés szempontjából, vagy a tápközeghez egy megfelelő puffért adunk, hogy a közeg pH-ját állandó értéken tartsuk.
A fentiektől függetlenül, a közeg további komponenseiként az oxidatív törzseken kívül a tápközeg előnyösen egyéb sterilezett baktériumot is tartalmazhat. Ilyen baktériumokra példaként a Bacillus, Pseudomonas, Citrobacter, Escherichia, Erwinia nemzetségekbe tartozó törzseket említhetjük. Konkrét példaként a következő törzseket sorolhatjuk fel:
Bacillus cereus BFO3131
Bacillus subtilis IFO 3023
Bacillus pumilus IFO12089
Bacillus megaterium ΠΌ12108
Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022
Pseudomonas trifolii IFO 12056
Citrobacter freundii HO 12681
Escherichia coli ΠΌ3546
Erquinia herbicola IFO 12686
így ezeket a baktériumokat egy olyan közegben inkubáljuk, mely lehetővé teszi növekedésüket 2040 ’C hőmérsékleten, 2-4 napon keresztül, és a kapott tenyészközeget sterilezzük, majd az oxidatív törzs közegéhez adjuk 0,5-5,0 térfogat/térfogat% arányban. így az oxidatív törzs növekedését meggyorsíthatjuk.
A reakcióelegyben vagy tápközegben így képződött és felhalmozódott 2-keto-L-gulonsavat önmagában ismert módon, a vegyület tulajdonságait felhasználva különíthetjük el és tisztíthatjuk. A 2keto-L-gulonsavat a szabad sav vagy például nátrium-, kálium-, kalcium-, ammónium- vagy hasonló sója formájában különíthetjük el.
Bármely eljárás, amely a kívánt vegyület kinyerésére alkalmas, megfelelő. Például a tápközegből el- ί választhatjuk a sejteket, például szűréssel, centrifu- j gálással vagy aktív szénnel való kezeléssel, és az oldatot bepárol juk. A kicsapódott kristályokat kiszűr- i jük, és átkristályositva a kívánt vegyületet kapjuk.
Ezen kívül oldószeres extrakciót, kromatográfiát, í kicsapást vagy kisózást, és egyéb módszereket is használhatunk megfelelő kombinációban és/vagy ismétléssel.
Amikor a 2-keto-L-gulonsavat szabad savformájában kapjuk, sóvá alakíthatjuk például nátrium-, kálium-, kalcium-, ammónium-vagy hasonló sójává ismert módon. Amikor a kívánt vegyületet sója fór- I májában nyerjük ki, a szabad savat képezhetjük vagy más sót képezhetünk belőle ismert módon.
A találmány szerinti tennék 2-keto-L-gulonsavval való azonosságát a kapott termék fizikai-kémiai konstansainak, például elemanalízis, olvadáspont, optikai forgatóképesség, IR abszorpciós spektrum,
-6HU 201804Β stb. meghatározásával állapítottuk meg.
A 2-keto-L-gulonsav mennyiségét a reakcióelegyben vagy tápközegben nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (mobil fázis: híg kénsav, pH-2,2; folyási sebesség: 0,5 ml/perc; detektor: differenciál refraktométer) határoztukmeg egy szulfonált polisztirol-gél oszlopot (Shimadzu Seisakusho, Ltd. Japán, SCR-101H oszlop, 7,9 mm x 30 cm) alkalmazva. Standardként 2-keto-L-gulonát-monohidrát nátriumsójának kristályait használtuk A 2keto-L-gulonsavat vékonyréteg kromatográfiásan detektáltuk Ekkor egy cellulóz lapra (Merck, USA) mintát vittünk fel, és miután fenol(víz) hangyasav 75:25:5 térfogatarányú elegyével 3 órán keresztül szobahőmérsékleten kifejlesztettük a kromatogramot,alapotmegszárítottukésegyszínreagensselkezeltük A 2-keto-L-gulonsav Rf értéke kb. 0,30 volt, mely ezüst-nitráttal bamásfekete, o-fenilén-diaminnal sárga ill. anilin-ftálsavval rózsaszín foltot adott.
A 2-keto-L-gulonsav jó kitermelsésel állítható elő a találmány szerinti eljárással egy Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhhoz tartozó mikroorganizmust alkalmazva, mely az L-szorbózt 2keto-L-gulonsawá képes oxidálni.
A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk
A példákban a %-ok tömeg/térfogat%-ot jelentenek
1. példa
Egy200 ml-es Erlenmeyer-lombikba 20 ml olyan törzstenyészet-közeget mérünk be, amely 2,0% glükózt, 1,0% peptont, 1,0% szárított élesztőt és 2,0% kalcium-karbonátot tartalmaz, s melyet 120 ’C-on 20 percig sterileztünk autoklávban.
A lombikba levő közeget 1 kacsnyi Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s-selinokuláljuk, melyet az 1. táblázat szerinti ferde tápközegben tenyésztettünk 28 ’C-on 4 napig és 30 ’C hőmérséleten 2 napon keresztül rázással (200 fordulat/perc) inkubáltunk
Akapott tápelegy2 ml-ét a fentivel azonos összetételű tápközegbe oltjuk, és ugyanilyen körülmények között inkubálva törzstenyészetet kapunk
Egy 200 ml-es kúp alakú lombikot 25 ml olyan fermentációs közeggel töltünk meg, amely 2,0% CSL-t, 0,5% szárított élesztőt, 0,5% ammóniumszulfátot, 0,05% Na2S2O3.5H2O-t, 0,2% vas-szulfátot, 4,0% kalcium-karbonátot és 10,0% L-szorbózt (elkülönítve sterilezve) tartalmaz, s melyet 120 ’Con 20 percig autoklávban sterileztünk
A fenti tápközeget tartalmazó kúpos lombikba 1,25 ml fentiekben előállított törzskultúrát inokulálunk, és 30 ’C hőmérsékleten 3 napon keresztül való keveréssel inkubáljuk
A nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint a kapott fermentlé 60,5 mg/ml 2-keto-gulonsavat (átalakítási arány: 56,1 %) tartalmaz. A fenti fermentlé 1000 ml-ét centrifugálva a sejtből származó és egyéb kiülepedett részeket eltávolítjuk. A felülúszót (980 ml) Amberlite IR 120 (Rohm and Haas Co., USA, H-forma, 500 ml) oszlopon vezetjük keresztül, melyet 300 ml ionmentesített vízzel mo12 sunk Az átfolyt anyagot és a mosófolyadékot egyesítjük és egy 500 ml-es aktív szenet tartalmazó oszlopon vezetjükkeresztül, majd kb. 300ml ionmentesített vízzel mossuk a kationok és a szín eltávolítása céljából. Az átfolyt anyagot és a mosófolyadékot egyesítjük (1600 ml), a pH-ját nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be, és csökkentett nyomáson 50 ’C-on kb. 70 ml-re pároljuk be.
Ezt a koncentrátumot 5 ’C-on 24 órán keresztül állni hagyjuk így színtelen prizmákat kapunk A prizmákat leszűrjük, kis mennyiségű hideg metanollal mossuk és foszfor-pentoxidon szárítjuk szobahőmérsékleten, csökkentett nyomáson. így 37,5 g mononátrium-2-keto-L-gulonát-monohidrátot kapunk
Olvadáspont: 147-155’C (bomlik)
Elemanalízis a CóHgOyNaJHfeO képlet alapján: Számított: C: 30,78%; H; 4,74%;
Talált: C: 30,94%; II: 4,85%.
Optikai forgatóképesség [a]Z4D - -23,3’ (c-1,0, víz)
A nagynyomású folyadékkromatográfiás retenciós időt, a vékonyrétegkromatográf iásRf értéket és színt tekintve a termék azonos volt az autentikus mintával.
2. példa
Egy 16 mm x 160 mm-es vizsgálati csövet 5 ml 2. táblázat szerinti teljes tápközeggel töltünk meg, majd egy kacsnyi Pscudogluconobacter saccharoketogenes K59 ls-sel inokuláljuk, melyet az 1. táblázat szerinti ferde tápközegben tenyésztettünk és 30 ’C hőmérsékleten 2 napon át rázva inkubáltunk
A kapott tenyészetből 1 ml-et 5 ml ugyanilyen tápközeget tartalmazó vizsgálati csőbe viszünk, melyet 4 órán keresztül rázva inkubáltunk A kapott 5 ml-nyi közeget aszeptikus körülmények között centrifugáljuk (12.000 fordulat/perc) 5 ’C-on 15 percig, hogy begyűjtsük a sejteket. A sejteket 10 ml triszmaleinsav pufferben (pH - 6,5; 0,05 M) szuszpendáljuk, majd ismét centrifugáljuk
A fenti eljárást kétszer megismételjük, és a mosott sejteket 5 ml fenti pufferben, mely 1 mg/ml nitrozoguanidint tartalmaz, szuszpendáljuk, és 30 ’C hőmérsékleten 2 órán keresztül rázzuk, hogy mutánst képezzünk.
A szuszpenziót centrifugáljuk (12.000 fordulat/perc) 5 ’C hőmérsékleten 15 percig, hogy elválasszuk a sejteket, melyeket kétszer 10 ml trisz- maleinsav pufferrel mosunk, és így nitrozoguanidinnel kezelt sejtfrakciót különítünk el. Ezt 0,85%-os sóoldattal megfelelő koncentrációra hígítjuk és egy 9 cm átmérőjű lemezen, mely 15 ml teljes szilárd táptalajt tartalmaz, kenjük el.
Az inokulált lemezt 28 ’C-on 5 napig tartjuk A telepeket megszámoljuk, és összehasonlítjuk a kezeletlen kontrollal. A nitrozoguanidin kezelés következtében a mikroorganizmusok mortalitása 90,4%. A teljes táptalajon levő tenyészeteket a 3. táblázat szerinti minimális lényeges tápanyagokat tartalmazó táptalajokra oltjuk át, és miután 3 napon keresztül 28 ’C-on inkubáltuk, az auxotrofok (táplálkozási mutánsok) gyakoriságát vizsgáljuk. Ez a gyakoriság kb. 6,6% volt.
A mutagénnel kezelt tenyészeteket a teljes táp7
-7HU 201804Β anyagot tartalmazó lemezről egy friss teljes tápanyagot tartalmazó lemezre oltjuk át, úgy hogy 12 törzslegyen2cmhosszúságbanegylemezen.Miután 28 ’C hőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáltuk, a tenyésztett sejtekből egy kacsnyit visszaviszünk 3 ml tápkőzeget tartalmazó vizsgálati csőbe. A közeg pH-ja 6,5, összetétele akővetkező: 7,0% szorbóz(kűlön s terilezet t), 1,0% szárított élesztő, 1,0% pép tón, 0,1% vas-klorid és 3,0% kalcium-karbonát, melyet 30 ’C hőmérsékleten 4 napig rázva inkubáltunk.
A vizsgált mutáns törzsek közül a TH 14-86 kétszer annyi 2-keto-L-gulonsavat termelt, mint azeredeti K591S törzs azonos körülmények között. A TH 14-86 törzs oxidatív törzs, mely megnövekedett aktivitással oxidálja azL-szorbózt.
1. táblázat
Ferde tápközeg g/i
D-szorbit 25
Pepton 10
Élesztő extraktum 10
Agár 20
Kalcium-karbonát 2
pH »7,0
2. táblázat
Teljes tápközeg g/1
D-szorbit 25
Pepton 10
Élesztő extraktum 10 pH - 6,5 (Szilárd tápközeg esetén 20 g agart adunk hozzá.)
3. táblázat
Minimális lényeges elemeket tartalmazó tápközég/1)
Szacharóz 5
Kálium-hidrogénfoszfát 3 kálium-dihidrogénfoszfát 1 nátrium-szulfát 1 nátrium-klorid 1 magnézium-szulfát.7H2O 0,1 mangán-kloridjiH2O 0,002 nátrium-L-glu tárnát 0,1
L-cisztein 0,1
CoA 0,002
PMN 0,002 tiamin 0,002 biotin 0,001 pH-7,0
Szilárd közeg esetén 20 g agart adunk hozzá.
3. példa
A TH 14-86 mutáns törzset, melyet a Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s-ből állítottunk elő a 2. példa szerinti módon, 28 *C hőmérsékleten 4 napon keresztül tenyésztjük. Ezután egy kacsnyi sejttel 20 ml, 1. példában leírt tápközeget oltunk be200ml-es kúpos formájú lombikban, és ezt 30 'C-on 2 napig rázással inkubáljuk.
liter kúpos lombikba 200 ml olyan tápközeget töltünk, mely 3,0%glükózt, l,0%peptont, 1,0% szárított élesztőt, 2% kalcium-karbonátot tartalmaz, s melyet 120 ’C hőmérsékleten 20 percig autoklávban sterileztünk. Ezt a közeget 20 ml fenti tenyészettel oltjuk be, és 28 °C-ou inkubáljuk 2 napig rázás közben. Ettől elkülönítve egy kacsnyi Bacillus megaterium-ot (IFO 12108) - amelyet ferde tápközegen tenyésztettünk 28 °C hőmérsékleten 2 napig - oltunk egy 200 ml-es kúpos formájú lombikba, mely 20 ml, 4,0% szacharózt, 4,0% gyapotmag lisztet, 0,65% kálium-hidrogén-foszfátot, 0,55% kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,05% magnézium-szulfátot, 0,05% ammónium-szulfátot, 0,05% nátrium-kloridot és 0,05%kalcium-pantotenátot (pH-7,0) (melyet 120 ’C-on 20 percig autoklávban sterileztünk) tartalmaz, és 30 ’C-on 3 napig inkubáljuk.
A kapott fermentlevet 120 ’C-on 20 percig sterilezzük, hidegben tároljuk, és az alábbiakban említett fermentációs közeg komponenseként használjuk.
így egy 51-es üveg fermentorba 31 élesztő tápközeget töltünk, amely 12,5% L-szorbózt (120 ’C-on külön sterilezve 15 percig), 0,5% ammónium-szulfátot, 0,03% kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,05% Na2S2O3.5H2O-t, 0,05% magnézium-szulfátot, 0,1% FeSO4.7H2O-t, 5 pg/ml MnSO4.4H2O-t, 5 μg/ml tiamin t, 0,1 μβ/ηϋόίοΙΐηΙ,Ο,Ι μg/mlFMN-t, 5,0% kalcium-karbonátot, és 4,0 t/t% fenti sterilezett tápközeget - mely Bacillus megateriumot tartalmaz, és 120 ’C-on 30 percig autoklávban sterilezünk - tartalmaz.
Ebbe a fermentációs közegbe 300 ml fenti tenyészetet oltunk, és 32 ’C hőmérsékleten 2,4 liter/perces levegőztetéssel és 800 f ordulat/perccel 3 napig keverjük. A kapott fermentlé 102,0 mg/ml 2-keto-Lgulonsavat tartalmaz. Átalakítási arány: 75,7%. A fermentlé 1 literét az l.pclda szerint tisztítva 73,2g mononátrium-2-keto-L-gulonát-monohidrát sót kapunk.
4. példa
Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5 törzset az 1. példa szerint inkubálunk, így egy törzstenyészetet állítunk elő. Ezt a törzstenyészetet egy 200 ml kúpos lombikban levő, 20 ml, 9,0% L-szorbózt tartalmazó 3. példában leírt fermentációs közegbe, melyet 120 ’C-on 20 percig sterileztünk, oltjuk. A tenyészetet 32 ’C-on 2 napig inkubáljuk. A kapott fermentlé 73,2 mg/ml 2-keto-L-gulonsavat (átalakítási arány: 75,4%) tartalmaz.
5. példa
Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4, 12-15 és 22-3 törzseket külön-külön a 4. példa szerint rázás közben inkubálunk a 4. példa szerinti módon. A 2-keto-L-gulonsav mennyisége a fermentlében a 12-4 esetén 52,1 mg/ml (konverziós arány: 53,7%), a 12-15 törzs esetén 48,7 mg/ml (átalakítási arány: 50,2%), míg a 22-3 törzs esetén 69,3 mg/ml (átalakítási arány: 71,4%).
6. példa
Egy 200 ml-es kúpos lombikba 25 ml olyan közeget mérünk, mely 1,0% L-szorbózt (külön sterilezett), 0,5% peptont, 0,5% élesztő extraktumot tartalmaz, s melyet 120 ’C hőmérsékleten 15 percig sterilezőink.
A lombikba egy kacsnyi Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH 14-86-ot adunk, melyet az 1.
-8HU 201804Β táblázat szerinti ferde közegen tenyésztettünk 28 *C-on 4 napig, és 30 ’C-on inkubáltunk 2 napig rázás közben.
Egy 200 ml-es kúpos lombikba 25 ml 5,0% szorbózt, melyet külön sterileztünk, 1,0% peptont, 0,5% 5 élesztő extraktumot és 2,0% kalcium-karbonátot tartalmazó tápközeget (pH-7,0) mérünk, melyet 120*Chőmérsékleten 15percígsterileztünkAfenti törzstenyészet 1,0 ml-ével beoltjuk a közeget, és 30 ’C-on 2 napig inkubáljuk. 10
A kapott tenyészetet (500 ml) szobahőmérsékleten 20 percig állni hagyjuk, majd aleülepedett részeket dekantálással eltávolítjuk. A maradék folyadékot 1000 fordulat/perccel centrifugáljuk szobahőmérsékleten, hogy eltávolítsuk a főként kalcium- 15 karbonátot tartalmazó üledéket. Az így kapott sejtszuszpenziót tovább centrifugáljuk 6000 fordulat/perccel 5 ’C hőmérsékleten 10 percig, és a kapott sejteket kétszer, körülbelül 100 ml hideg sóoldattal (0,85%) mossuk, majd ismét centrifugáljuk 6000 20 fordulat/perccel 5 ‘C-on. Asejteket ismét szuszpendáljuk 35 ml hideg sóoldatban (0,85%), és így mosott sejtszuszpenziót állítunk elő.
A fenti mosott sejtszuszpenzió 4 ml-éhez 300 mg L-szorbózt, 0,5 ml 2-(M-morfolino)-etánszulfonsav 25 (MES) puffért (pH-6,5; 0,5 M) és 180 mg kalciumkarbonátot adunk, majd az elegyet 10 ml-re hígítjuk vízzel. Az elegyet egy 100 ml-es kúpos lombikban 30 percig reagáltatjuk 30 *C hőmérsékleten úgy, hogy 24 órán keresztül rázat juk Az így kapott elegy 24,6 30 mg/ml 2-keto-L-gulonsavat tartalmaz (átalakítási arány: 76,0%).
7. példa
Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s, 12-5ésTH 14-86 törzseket 28 ’Chőmérsék- 35 létén 4 napig ferde tápközegen tenyésztünk Ezektől elkülönítve a 4. táblázat szerinti kísérő baktériumokat ugyanilyen ferde tápközegen tenyésztjük 28 ’C-on két napig. Mindegyik törzsből egy kacsnyi mennyiséggel oltjuk be egy 200 ml-es kúp formájú lombikban levő 20 ml törzs tenyészet közeget (1. példa szerinti összetételű), és rázás közben (200 fordulat/perc) inkubáljuk 30 *Chőmérséldeten2napig.Hy módon különböző tenyészeteket állítunk elő.
Egy200ml-es kúp formájú lombikba 25 ml olyan fermentációs közeget töltünk, mely 2,0% CSL-t, 0,3% szárított élesztőt, 0,5% ammónium-szulfátot, 0,05% Na2S2O3.5H2O-t, 0,2% vas-szulfátot, 5,0% kalcium-karbonátot, 15,0% L-szorbózt (melyet külön sterileztünk), tartalmaz, s ezt 120 ’C-on 20 percig sterilezzük.
A fenti tápközeget tartalmazó lombikba 1,5 ml az egyik Pseudogluconobacter saccharoketogenes (oxidatív) tenyészetből származó törzstenyészetet viszünk, és rázás közben 30 ’C hőmérsékleten 5 napig inkubálva tiszta tenyészetet állítunk elő.
Kevert tenyészet esetén a kísérő baktériumot az oxidatív törzzsel egyidejűleg ol tjük a tápközegbe oly módon, hogy 0,1 ml törzstenyészetet inokulálunk, és a beoltott közeget 30 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 5 napig rázás közben.
A fermentlevekben keletkező 2-keto-L-gulonsav mennyiségét nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálattal mértük. Az eredményeket a 4. táblázat tartalmazza. A kísérő baktérium jelenléte következtében a 2-keto-L-gulonsav kitermelése megnőtt.
A4. táblázat a 2-keto-L-gulonsav termelését mutatja a Pseudogluconobacter saccharoketogenes törzs által a kísérő baktérium jelenlétében ill. jelenléte nélkül. A zárójelben levő számok az átalakítási arányt jelentik
4. táblázat
Kísérő baktérium K591s Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5 TH14-86
Kísérő baktérium nélkül (mg/ml) 55.3 (34.2%) (mg/ml) 74.1 (45.8%) mg/ml) 87.6 (54.1%)
Bacillus cereus 87.3 101.5 125.9
IFO3131 (54.0%) (62.7%) (77.8%)
Bacillus licheniformis IFO12201 - - 125.0 (77.3%)
Bacillus megaterium 69.3 90.2 135.4
IFO 12108 (42.8%) (55.8%) (83.7%)
Bacillus pumilus 93.1 129.0 134.7
IFO 12090 (57.5%) (79.8%) (83.3%)
Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 - - 126,9 (78.5%)
Bacillus subtüis 81,7 94,4 135.3
IFO 13719 (50.5%) (58,4%) (83,7%)
-9HU 201804Β
4. táblázat folytatása
Kísérő baktérium K591s Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5 TH14-86
Pseudomonas trifolü 67.2 98.8 2122.6
IFO12056 (41.5%) (61.1%) (75.8%)
Pseudomonas maltophilia 71.9 79.8 135.3
IFO 12692 (44.4%) (49,3%) (83,7%)
Proteus inconstans — 124,5
IFO 12930 (77.0%)
Citrobacter freundii - 132.3
IFO 13544 (81.8%)
Enterobacter cloacae — - 132.0
IFO 3320 (81.6%)
Erwinia herbicola 71,8 111,6 129,1
EFO12686 (44.4%) (69.0%) (79.8%)
Xanthomonaspisi - 121.5
IFO 13556 (75.1%)
Flavobacterium meningosepticum - - 122.8
IFO 12535 (75.9%)
4. példa
Egy 2 literes Sakaguchi-lombikba 500 ml előtenyészközeget mértünk, mely 2,0% glükózt, 1,0% peptont, 1,0% szárított élesztőt, 2,0% kalcium-karbonátot és 0,01% Actocolt (habzásgátló, Takeda Chemical IndustriesLtd., Japán) tartalmaz, s melyet 120 *C hőmérsékleten 20 percig sterileztünk.
Az 1. táblázat szerinti közegen tenyésztett Pseudogluconobacter saccharoketogenes ΤΗ 14-86 törzs sejtjeit 10 ml steril vízben szuszpendáljuk, és az egészet a Sakaguchi-lombikban levő közegbe oltjuk, és 85 rázás/perc sebességgel rázzuk 28 ’C hőmérsékleten 3 napig, így egy előtenyészetet állítunk elő.
Egy 2001-es fermentorba 1201 (pH-6,5) törzstenyészetet mérünk, mely 3,0% glükózt, 1,0% CSL-t, 0,5% szárított élesztőt, 0,05% nátrium-tioszulfátot, 0,1% vas-szulfátot, 2,0% kalcium-karbonátot és 0,03% Actcolt tartalmaz, s 125 ’C hőmérsékleten 30 percig sterilezzük. Ebbe a fermentorba bevezetjük az előbbi előtenyészet 1,8 literét, majd a tenyésztést 120 fordulat/perces keveréssel, 1001/perc levegőztetéssel, 98.104 Pa túlnyomáson és 30 ’C hőmérsékleten 3 napig folytatjuk, és így egy tőrzstenyészetet állítunk elő.
Az 1. táblázat szerinti közegen 28 ’C hőmérsékleten 2 napig tenyésztett Bacillus megaterium kísérő baktériumból egy kacsnyival beoltunk egy 2 literes Sakaguchi-lombikban levő 500 ml fenti összetételű előtenyészeti közeget, és 85 rázás/perc sebességgel rázzuk 28 ‘C hőmérsékleten 2 napig, így egy előtenyészetet állítunk elő.
Egy 50 literes fermentorba 30 liter közeget töltünk, melynek összetétele a fenti előtenyészeti közeggel megegyezik, és 120 'C hőmérsékleten 20 percig sterilezzük. A közegbe 500 ml kísérő baktérium törzset oltunk, és 120fordulat/Mrc keveréssel, 30Hter/perc levegőztetéssel, 9,8.104 Pa túlnyomáson és 30 ’C hőmérsékleten 2 napig tenyésztvea kísérő baktérium töratenyészetét állítjuk elő.
Egy 2 m3-es fermentorba 10001fermentációs kö40 zeget töltünk, mely 15,0% L-szorbózt (külön sterilezve), 5,0% kalcium-karbonátot, 2,0% CSL-t, 0,2% szárított élesztőt, 0,3% vas-szulfátot és 0,03% Actcolt tartalmaz, s 125 *Chőmérsékleten30percígsterilezzük.
A fenti fermentorba a Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH 14-86 törzs törzstenyészetének 110 literét, és a kísérő Bacillus megaterium törzs törzstenyészetének 10 literét vezetjük, és a tenyésztést 110 fordulat/perc keveréssel, 900 liter/perc le50 vegőztetéssel, 4,9.104 Pa túlnyomáson és 30 ’C hőmérsékleten f olytat juk. 4 napig való tenyésztés után a fermentlé 123,1 mg/ml 2-keto-L-gulonsavat tartalmaz. Átalakulási arány: 76,1 %.
9. példa
Egy 200 ml-es kúp alakú 20 ml, 8. példa szerinti előtenyészeti közeget mérünk, és autoklávban 120 ’C hőmérsékleten 30 percig sterilezzük.
Az 1. táblázat szerinti közegen tenyésztett (28 ’C, 60 4 nap) Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH
14-86 törzs egy kacsnyi mennyiségével a fenti tápközeget beoltjuk, majd 30 *C hőmérsékleten rázás közben inkubáljuk2 napig. Akapott tenyészetet (20 ml) egy 1 literes kúpformájúlombikba visszük,mely
200 ml ugyanüyen tápközeget tartalmaz, és 30 ’C
-10HU 201804Β hőmérsékleten inkubálva rázás közben 2 napig a TH 14-86 törzstenyészetét állítjuk elő.
Az 1. táblázat szerinti közegen 28 ’C hőmérsékleten 2 napig tenyésztett Bacillus megaterium tenyészetből egy kacsnyival beoltjuk egy 200 ml-es lombikban levő, 20 ml előtenyészeti közeget, s ezt 28 ’C hőmérsékleten 2 napig rázás közben inkubálva a kísérő baktérium törzstenyészetét állítjuk elő.
liter fermentációs közegből, mely 3,0% külön sterilezett L-szorbózt, 2,0% CSL-t, 02% szárított élesztőt, 0,3% ammónium-szulfátot, 0,05% nátrium-tioszulfátot, 0,1% vas-szulfátot, 0,02% Actcolt és 9,0% kalcium-karbonátot tartalmaz, 2,1 litert 120 ’C hőmérsékleten 30 percig sterilezőnk. A sterilezett közeget egy 5 literes fermentorba töltjük.
Ehhez a közeghez 300 ml fenti TH 14-86 törzstenyészetet és 4 ml kísérő baktérium törzstenyészetet adunk, és a tenyésztést 30 ’C hőmérsékleten 2,4 liter/perc levegőztetéssel és 800 fordulat/perc keveréssel hajtjuk végre.
Ettől elkülönítve, 510 g L-szorbózt oldunk vízben, így 800 ml szorbóz oldatot készítünk, és 120 ’C hőmérsékleten 20 percig sterilezzűL Ezt a sterilezett oldatot folyamatosan adjuk a fermentorhoz a tenyésztés 6. órájától a 24. órájáig.
Az L-szorbóz hozzáadása után a tenyésztést , ugyanolyan körülmények között folytatjuk további 28 órán keresztül. (Teljes tenyésztési idő: 70 óra.) A kapott fermentlé 163,5 mg/ml 2-keto-L-gulonsavat tartalmaz. Átalakítási arány: 75,8%.

Claims (8)

  1. SZABADALMIIGÉNYPONTOK
    1. Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmust vagy annak mutánsát, adott esetben más mikroorganizmussal együtt, L-szorbóz jelenlétében tenyésztünk, majd a 2-keto-L-gulonsavat a közegből kinyerjük (Elsőbbsége: 1985.10.22.)
  2. 2. Áz 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s-t (FERM BP1130), 12-5-öt (FERM BP-1129) vagy TH 14-86-ot (FERM BP-1128) tenyésztünk. (Elsőbbsége:
    1985.10.22.)
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15-öt (FERM BP1132), 12-4-et (FERM BP-1131) vagy 22-3-at (FERM BP-1133) tenyésztünk. (Elsőbbsége:
    1985.12.24.)
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmust legalább egy, a Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Pseudomonas trifolii, Proteus inconstans, Citrobacter freundii, Enterobacter colacae, Erwinia herbicola, Xanthomonas pisi vagy Flavobacterium meningosepticum fajhoz tartozó baktérium és L-szorbóz jelenlétében tenyésztjük (Elsőbbsége: 1985.10.22.)
  5. 5. A4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmusként Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s-t (FERM BP1130), 12-5-öt (FERMBP-1129), vagy TH 14-86-ot (FERM BP-1128) tenyésztünk. (Elsőbbsége:
    1985.10.22.)
  6. 6. A4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmusként Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15-őt (FERM BP1132), 12-4-et (FERM BP-1131) vagy 22-3-at (FERM BP-1133) tenyésztünk. (Elsőbbsége:
    1985.12.24.)
  7. 7. A4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmusként Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH 14-86 ot (FERM BP-1128), második mikroorganizmusként Bacillus cereust,Bacilluslicheniformist,BaciIlusmegateriumot, Bacillus pumilust, Bacillus amyloliquefacienst, Bacillus subtilist, Pseudomonas trifoliit, Pseudomonas matophiliát, Proteus inconstanst, Citrobacter freundiit, Enterobacter cloacae-t, Erwinia herbicolat,Xanthomonas pisit vagy Flavobacterium meningosepticumot tenyésztünk. (Elsőbbsége:
    1985.10.22.)
  8. 8. A4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmusként Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s-t (FERM BP1130) vagy 12-5-öt (FERMBP-1129), míg második mikroorganizmusként Bacillus ccreust, Bacillus megateriumot, Bacillus pumilist, Bacillus subtilist, Pseudomonas trifoliit, Pseudomonas maltophiliát, Citrobacter freundiit, Enterobacter colacaet vagy Erwinia herbicolát tenyésztünk. (Elsőbbsége:
    1985.10.22.)
HU864369A 1985-10-22 1986-10-21 Process for producing 2-keto-l-gulon acid in microbiological way HU201804B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP23685785 1985-10-22
JP29147285 1985-12-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT43636A HUT43636A (en) 1987-11-30
HU201804B true HU201804B (en) 1990-12-28

Family

ID=26532898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU864369A HU201804B (en) 1985-10-22 1986-10-21 Process for producing 2-keto-l-gulon acid in microbiological way

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5474924A (hu)
EP (1) EP0221707B1 (hu)
JP (2) JPH0638752B2 (hu)
KR (1) KR950009199B1 (hu)
CN (1) CN1024022C (hu)
AT (1) ATE86665T1 (hu)
CA (1) CA1318871C (hu)
DE (1) DE3687946T2 (hu)
DK (1) DK171869B1 (hu)
ES (1) ES2053443T3 (hu)
HU (1) HU201804B (hu)
IE (1) IE59623B1 (hu)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0795957B2 (ja) * 1986-06-05 1995-10-18 武田薬品工業株式会社 ２−ケト−ｌ−グロン酸の製造法
US4933289A (en) * 1986-06-05 1990-06-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Biologically pure cultures of Pseudomonas sorbosoxidans useful for producing 2-keto-L-gulonic acid
US4935359A (en) * 1987-02-07 1990-06-19 Institute Of Microbiology Fermentation process
US4877735A (en) * 1987-06-19 1989-10-31 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for producing 2-keto-L-gulonic acid
DK174267B1 (da) * 1988-04-29 2002-10-28 Basf Ag Fremgangsmåde til oprensning af 2-keto-L-gulonsyre
FR2636343B1 (hu) * 1988-09-13 1994-11-25 Rhone Poulenc Sante
DK173507B1 (da) * 1988-09-30 2001-01-15 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre
RU2102481C1 (ru) * 1991-06-13 1998-01-20 Ф.Хоффманн-Ля Рош, Аг Способ получения 2-кето-l-гулоновой кислоты или ее соли
TW293036B (hu) * 1992-11-27 1996-12-11 Takeda Pharm Industry Co Ltd
CN1048282C (zh) * 1993-07-09 2000-01-12 武田药品工业株式会社 生产2－酮－l－古洛糖酸的方法
CN1080761C (zh) * 1993-12-24 2002-03-13 Basf公司 2－酮基－l－古洛糖酸的改良性生产方法
ATE391180T1 (de) 1996-09-19 2008-04-15 Dsm Ip Assets Bv Alkohol-aldehyd-dehydrogenasen
US6730503B1 (en) 1996-09-19 2004-05-04 Roche Vitamins Inc. Alcohol/aldehyde dehydrogenase
US5834231A (en) * 1996-10-24 1998-11-10 Archer Daniels Midland Co. Bacterial strains and use thereof in fermentation process for 2-keto-L-gulonic acid production
EP1112344A2 (en) 1998-09-11 2001-07-04 Archer-Daniels-Midland Company Bacterial strains for the production of 2-keto-l-gulonic acid
AU2001253162A1 (en) 2000-04-05 2001-10-23 Archer-Daniels-Midland Company Ketogulonigenium shuttle vectors
US20020006665A1 (en) 2000-04-05 2002-01-17 D'elia John Ketogulonigenium endogenous plasmids
AU2001251324A1 (en) 2000-04-05 2001-10-23 Archer-Daniels-Midland Company An endogenous ketogulonigenium plasmid
US6387654B1 (en) 2000-05-04 2002-05-14 Archer-Daniels-Midland Company Bacterial strains and fermentation processes for the production of 2-keto-l-gulonic acid
AU4695700A (en) * 2000-05-04 2001-11-12 Archer Daniels Midland Co Bacterial strains and fermentation processes for the production of 2-keto-l-gulonic acid
JP3657538B2 (ja) 2001-06-12 2005-06-08 住友電気工業株式会社 レドックスフロー電池用セルスタック
JP3682244B2 (ja) 2001-06-12 2005-08-10 住友電気工業株式会社 レドックスフロー電池用セルフレーム及びレドックスフロー電池
AU2003283253A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-19 Dsm Ip Assets B.V. Production of 2-kga
AP2724A (en) 2006-07-21 2013-08-31 Xyleco Inc Conversion systems for biomass
AU2008249370B2 (en) 2007-05-08 2013-09-05 Ensuiko Sugar Refining Co., Ltd. Method for producing glucuronic acid by glucuronic acid fermentation
AU2013272645B2 (en) 2012-06-04 2019-03-28 Ensuiko Sugar Refining Co., Ltd. D-glucaric acid-producing bacterium, and method for manufacturing D-glucaric acid
JP6133561B2 (ja) * 2012-08-29 2017-05-24 国立大学法人九州大学 砒素の処理方法
CN105594745A (zh) * 2016-02-03 2016-05-25 广西大学 一种源于山梨糖的稻曲病菌抑制物
CN107179370B (zh) * 2017-07-27 2020-01-14 石药集团维生药业（石家庄）有限公司 一种采用高效液相色谱法检测维生素c二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法
CN111943836A (zh) * 2019-05-16 2020-11-17 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 回收2-酮-l-古洛糖酸的改进方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3043749A (en) * 1960-07-28 1962-07-10 Pfizer & Co C Preparation of 2-keto-l-gulonic acid
US3234105A (en) * 1962-09-20 1966-02-08 Takeda Chemical Industries Ltd Method for producing 2-keto-lgulonic acid
SU526660A1 (ru) * 1975-01-24 1976-08-30 Институт Микробиологии И Вирусологии Ан Казахской Сср Штамм N 806-продуцент 2 кето- гулоной кислоты
US4876195A (en) * 1985-12-26 1989-10-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for producing 2-keto-D-glucaric acid

Also Published As

Publication number Publication date
KR870004145A (ko) 1987-05-07
JPH067157A (ja) 1994-01-18
CN1024022C (zh) 1994-03-16
EP0221707A2 (en) 1987-05-13
IE862776L (en) 1987-04-22
DK489686D0 (da) 1986-10-14
DK489686A (da) 1987-04-23
HUT43636A (en) 1987-11-30
KR950009199B1 (ko) 1995-08-16
US5474924A (en) 1995-12-12
ES2053443T3 (es) 1994-08-01
CA1318871C (en) 1993-06-08
EP0221707B1 (en) 1993-03-10
ATE86665T1 (de) 1993-03-15
CN86107277A (zh) 1987-07-15
DK171869B1 (da) 1997-07-21
JPH0638752B2 (ja) 1994-05-25
IE59623B1 (en) 1994-03-09
JPS62228288A (ja) 1987-10-07
DE3687946T2 (de) 1993-06-17
EP0221707A3 (en) 1988-10-05
DE3687946D1 (de) 1993-04-15
JPH078235B2 (ja) 1995-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU201804B (en) Process for producing 2-keto-l-gulon acid in microbiological way
US4529697A (en) Process for producing L-glutamic acid by fermentation
US3922194A (en) Process for producing 2-keto-L-gulonic acid
EP0046284B1 (en) Method for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid and microorganisms for carrying out the method
US3998697A (en) Process for preparing 2-keto-L-gulonic acid
US4876195A (en) Process for producing 2-keto-D-glucaric acid
US3959076A (en) Process for producing 2-keto-L-gulonic acid
US4738924A (en) Method for the production of 6-hydroxynicotinic acid
EP0152948A2 (de) Verfahren zur Herstellung von 6-Hydroxynikotinsäure
FI70924B (fi) Foerfarande foer framstaellning av enzymen kolesteras
US4933289A (en) Biologically pure cultures of Pseudomonas sorbosoxidans useful for producing 2-keto-L-gulonic acid
US4892823A (en) Method for producing 2-keto-L-gulonic acid
US3970522A (en) Method for the production of D-ribose
JP2574661B2 (ja) ２−ケト−ｌ−グロン酸生成菌
JP2570313B2 (ja) 新規微生物
US5496715A (en) Process for preparing indigo
US4430429A (en) Production of vitamin B12 -activity substances
US5234819A (en) Method for preparing 2,5-diketo-D-gluconic acid
JP2676741B2 (ja) 新規微生物
JPH06165683A (ja) アスタキサンチンの製造法
Zeikus et al. Production of vitamin B 12-activity substances
JPS5914787A (ja) 新規微生物
JPH04325096A (ja) （Ｒ）−２−ハロプロピオン酸および（Ｒ）−２−ハロ−ｎ−酪酸の製造法
JPS63105690A (ja) トレハロ−ズジミコ−ル酸の製造法
MXPA99003710A (en) Novel bacterial strains and use thereof in fermentation processes for 2-keto-l-gulonic acid production

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee