CN111943836A - 回收2-酮-l-古洛糖酸的改进方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供从发酵液回收2‑酮‑L‑古洛糖酸的改进方法，其减少了废物量并提高了2‑酮‑L‑古洛糖酸晶体的质量和产率。
Description
技术领域
本发明涉及从发酵液回收2-酮-L-古洛糖酸(KGA)的方法，2-酮-L-古洛糖酸(KGA)可用作合成L-抗坏血酸(维生素C)的中间体。
背景技术
2-酮-L-古洛糖酸是制备一种必需营养素L-抗坏血酸的重要中间体。尽管过去已经使用Reichstein方法以工业规模合成了2-酮-L-古洛糖酸(Helvetica Chimica Acta，17：311(1934))，但是发酵方法对于商业化生产2-酮-L-古洛糖酸是优选的。产生2-酮-L-古洛糖酸的发酵途径通常包括两个步骤：a)使用氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)将山梨糖醇转化为山梨糖，以及b)使用酮古洛糖酸菌(Ketogulonogenium vulgarum)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)将山梨糖转化为以钠盐形式的2-酮-L-古洛糖酸(美国专利号3,234,105、3,907,639和3,912,592)。
然而，在转化为抗坏血酸之前，必须首先从发酵液中分离出2-酮-L-古洛糖酸。在当前工业中，通常通过包括以下步骤的方法从发酵液回收2-酮-L-古洛糖酸：a)通过超滤除去微生物细胞材料、细胞营养物和其他有机杂质；b)通过阳离子交换处理将2-酮-L-古洛糖酸的钠盐转化为2-酮-L-古洛糖酸；c)通过纳滤对获得的发酵液进行预浓缩；并且d)浓缩和结晶，以获得2-酮-L-古洛糖酸晶体(美国专利号4,990,441和CN专利号1,754,869A)。
然而，上述方法不能从发酵液中除去一些杂质，这些杂质在浓缩后会迅速积累，从而导致明显的操作问题以及在结晶和离心过程中的困难，并影响了该方法的效率和所获得的2-酮-L-古洛糖酸晶体的质量。另外，该方法产生大量的废物，这些废物是高粘度的、与杂质一起浓缩的并且是非常酸性的，因此不利于环境。
因此，仍然需要一种以高产率、高质量和较少废物从发酵液回收2-酮-L-古洛糖酸的方法。
发明内容
本发明提供一种从发酵液回收2-酮-L-古洛糖酸的改进方法，其减少了废物量并提高了2-酮-L-古洛糖酸晶体的质量和产率。
附图说明
图1示出了根据本发明的方法(“活性炭处理”)和现有方法(“未处理”)获得的第二批晶体的显微照片。与根据没有活性炭处理的现有方法获得的那些相比，根据本发明的方法获得的第二批晶体更大且尺寸更均匀。根据本发明的方法获得的晶体的形状也更加矩形，因此自由流动。
图2示出了在阳离子交换后进行活性炭处理时，纳滤通量显著提高，并接近晶体KGA溶液的通量。
具体实施方式
具体地，本发明提供从发酵液回收2-酮-L-古洛糖酸的改进方法，其包括：
a)将发酵液进行超滤，以获得滤液；
b)采用阳离子交换树脂对滤液进行加工，以获得经加工的滤液；
c)将经加工的滤液进行纳滤和活性炭处理，以获得经处理的滤液；
d)采用浓缩、然后结晶，对经处理的滤液进行加工，以获得2-酮-L-古洛糖酸晶体；并且
e)可选地，采用浓缩、然后结晶，对从步骤d)获得的母液进行进一步加工，以获得第二批2-酮-L-古洛糖酸晶体。
在本发明中，术语“发酵液”是指通过培养一种或多种产生2-酮-L-古洛糖酸或其水溶性盐的微生物而产生的发酵液，参见美国专利Nos.5,834,231和5,705,373。产生2-酮-L-古洛糖酸或其水溶性盐的任何微生物都可以用于制备发酵液。微生物例如包括属于乳杆菌属(Lactobacillus)、假葡糖杆菌属(Pseudogluconobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、醋酸棒状杆菌属(Corynebacterium Acteobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、曲霉属(Aspergillus)、短杆菌属(Brevibacterium)的细菌和属于欧文氏菌属(Erwinia)的细菌。参见例如Atkinson and Mavituna,Biological Engineeringand Biotechnology Handbook,421,1983。除水和不溶性生物质外，发酵液通常还包含营养物质，例如氨基酸，无机和/或有机盐，碳水化合物，各种维生素和生长因子，这些是用于生产2-酮-L-古洛糖酸或其水溶性盐的微生物所必需的。通常，本发明的发酵液含有8重量％至15重量％、优选10重量％至13重量％、例如11重量％和12重量％的2-酮-L-古洛糖酸盐。
在本发明中，发酵液首先进行步骤a)中的超滤。
在步骤a)中，超滤可以使用适于除去发酵液中的细胞体、细胞营养物和有机杂质的任何超滤膜。优选地，超滤膜具有3000Da至200000Da、更优选地5000Da至150000Da且进一步优选地10000Da至30000Da的截留分子量。更优选地，超滤膜是醋酸纤维素膜或聚砜膜。
在步骤a)中，使用的压力应取决于使用的超滤膜和经处理的发酵液的条件。优选地，超滤的压力为0.3MPa至1MPa，更优选地0.4MPa至0.8MPa，且进一步优选地0.45MPa至0.5MPa。
超滤可以在任何合适的温度(例如室温)下进行。优选地，超滤是在0℃至50℃、更优选地10℃至40℃且进一步优选地20℃至35℃的温度下进行的。
在步骤a)中的超滤操作之后，获得滤液，其包含2-酮-L-古洛糖酸盐，例如钠盐或钙盐。通常，步骤a)中获得的滤液包含8重量％至12重量％、优选9重量％至11重量％、例如10重量％、11重量％的2-酮-L-古洛糖酸盐。
为了将2-酮-L-古洛糖酸盐转化为2-酮-L-古洛糖酸，根据本发明的步骤b)，采用阳离子交换树脂处理对从步骤a)获得的滤液进行加工。
在步骤b)中，适于将2-酮-L-古洛糖酸盐转化为2-酮-L-古洛糖酸的任何酸性阳离子交换树脂都可以使用。优选地，酸性阳离子交换树脂是强酸性阳离子交换树脂，例如可商购的C-160(Purolite Corporation,USA)。
任何本领域技术人员将理解，在步骤b)的阳离子交换树脂处理中的条件(例如柱子的直径和高度、树脂的填充量、柱子的进料速度和旋转速度等)可以根据实际需求而变化，并且无需创造性劳动即可容易地确定。
在步骤b)的阳离子交换树脂处理之后，获得了包含2-酮-L-古洛糖酸和杂质的经加工的滤液。通常，从步骤b)获得的经加工的滤液包含3重量％至8重量％，优选4重量％至7重量％，例如5重量％和6重量％的2-酮-L-古洛糖酸。
在本发明的方法中，从步骤b)中获得的经加工的滤液进一步进行根据步骤c)的纳滤和活性炭处理，以除去杂质(诸如无机盐、葡萄糖、蔗糖、颜料等)。
在步骤c)中，纳滤可以根据本领域已知的标准程序进行，例如美国专利No.4,990,441和中国专利No.102,391,101中公开的那些。
在步骤c)中，活性炭处理可以使用任何工业级活性炭。优选地，活性炭是粒径小于90μm的活性炭粉末，例如Norit CA1(CABOT Corporation，USA)。在处理中活性炭的使用量取决于待处理的滤液中2-酮-L-古洛糖酸的含量，并且基于所处理的滤液的重量，可以为约0.1重量％至2重量％，优选为0.2重量％至1.5重量％，优选为0.3重量％至1重量％，进一步优选为0.4重量％至0.8重量％，且最优选为0.5重量％。
活性炭处理可以在0℃至50℃、优选地10℃至40℃、更优选地20℃至30℃的温度下进行。
出乎意料的是，本发明的发明人发现，额外的活性炭处理有助于提高由该方法获得的2-酮-L-古洛糖酸晶体的产率和质量(参见图1)，并减少该方法中产生的废物的量、粘度和化学需氧量(COD)。
此外，通过步骤c)中额外的活性炭处理，根据在UV光谱中在400-420nm处的UV吸光度，将获得的滤液中的颜料除去约95％。
在步骤c)中，活性炭处理可以在纳滤之前或之后进行。在一实施方式中，活性炭处理在纳滤之前进行。在另一个实施方式中，活性炭处理在纳滤之后进行。
优选地，在步骤c)中，活性炭处理在纳滤之前进行。在这种情况下，纳滤通量也得到了显著改善(见图2)。
在步骤c)中的纳滤和活性炭处理之后，获得经处理的滤液。通常，经处理的滤液包含8重量％至20重量％，优选10重量％至15重量％，例如11重量％，12重量％，13重量％，14重量％的2-酮-L-古洛糖酸。根据本发明的步骤d)，经处理的滤液进行浓缩、然后结晶，以获得2-酮-L-古洛糖酸晶体。
在步骤d)中，浓缩可以通过本领域已知的任何方法进行，例如通过蒸馏或蒸发等。优选地，步骤c)中获得的经处理的滤液被浓缩至包含65重量％至75重量％、更优选地68重量％至73重量％、例如69重量％、70重量％、71重量％和72重量％的2-酮-L-古洛糖酸的溶液，这对结晶是有利的。结晶在本领域中也是已知的。例如，步骤d)的浓缩和/或结晶是根据CN专利公开1,754,869A进行的，其通过引用并入本说明书中。
可选地，从步骤d)的结晶步骤获得的母液进行如上所操作的进一步浓缩和结晶，以获得第二批2-酮-L-古洛糖酸晶体。
本发明的方法显著改善由该方法获得的2-酮-L-古洛糖酸晶体的产率和质量，尤其是第二批2-酮-L-古洛糖酸晶体的质量(参见图1)，并减少该方法产生的废物的量、粘度和化学需氧量(COD)。
通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例
在本发明的实例中，KGA浓度是通过HPLC测定的，粘度是通过HAAKE Viscotester550(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，中国)测定的，并且颜料是采用紫外可见光谱在420nm下根据供应商的结构测定的。
实施例1：在未经活性炭处理的情况下回收KGA
1.超滤
在板框式膜单元(三达膜科技(厦门)有限公司，中国)中以20000Da的聚合物超滤法中过滤10810g酮古洛糖酸菌和巨大芽孢杆菌的发酵液，该发酵液包含11.8重量％的2-酮-L-古洛糖酸的钠盐(NaKGA)。获得了包含11.7重量％NaKGA的微生物减少的滤液。
2.阳离子交换树脂
根据供应商的指导，将从步骤1)获得的微生物减少的滤液送至阳离子交换树脂C-160(Purolite Corporation,USA)。获得包含5.6重量％质子化的KGA的溶液。
3.纳滤
将从步骤2)获得的KGA溶液经过纳滤单元(三达膜科技(厦门)有限公司，中国)。纳滤后，获得KGA含量为12.3重量％的10614g的微生物减少的浓缩物。
4.浓缩和结晶
将从步骤3)获得的具有KGA的浓缩物在实验室规模的旋转蒸发器中在55℃、50mbar下进一步浓缩成包含49.8重量％KGA的溶液。然后，将溶液转移到间歇式结晶器中，并在50℃、50mbar下进一步浓缩成含有68.3重量％KGA的溶液。将压力恢复至大气压，然后开始冷却程序以进行结晶。冷却顺序如下：在2小时内从50℃冷却至25℃，加入481ml甲醇，然后在2小时内继续冷却至2℃，并在2℃下保持2小时。在该顺序的最后，将悬浮液转移到由真空泵驱动的实验室烧结玻璃过滤器中，从而在滤饼中获得1255g KGA一水合物，其中无水KGA的含量为87.4重量％。
5.母液的处理
将由步骤4)获得的KGA含量16.6％的898g母液浓缩成包含33.4重量％KGA的溶液用于第二次结晶。第二次结晶的冷却顺序如下：将溶液自然冷却至25℃进行成核8小时，然后在5小时内继续冷却至1℃。结晶后将所得悬浮液转移并过滤，从而在滤饼中获得120gKGA一水合物(第二批晶体)，其中无水KGA的含量为75.28％。
两次结晶的总KGA产率为91.0重量％。从第二次结晶获得的第二母液重301g，KGA含量为15.8重量％。第二母液的粘度为47mPa·S。第二母液的COD为0.117g/g(基于产生的KGA)。
实施例2：在纳滤后进行活性炭处理的情况下回收KGA
1.超滤
对11440g包含10.5重量％的2-酮-L-古洛糖酸钠盐(NaKGA)的发酵液进行实施例1的超滤。
2.阳离子交换树脂
根据实施例1运行阳离子交换树脂。
3.纳滤
根据实施例1进行纳滤。
4.活性炭处理
将由步骤3)的纳滤获得的2×5L的微生物减少的浓缩物转移至两个10L搅拌罐中。将0.8重量％的粉末状活性炭(卡尔冈炭素(苏州)有限公司，中国)加入这两个容器中。该处理在30℃下以100rpm的搅拌速度进行120分钟。然后通过实验室规模的布过滤器除去活性炭，以获得KGA含量为12.19重量％的9594g滤液。处理后，在420nm处的UV吸光度的去除率为95.0％。
5.浓缩和结晶
将在步骤4)中获得的滤液在实验室规模的旋转蒸发器中在55℃、50mbar下浓缩成包含45.9重量％KGA的浓缩物。将浓缩物快速转移至间歇式结晶器中，并在50℃、50mbar下浓缩成含有71.59重量％KGA的溶液。然后，按照与实施例1相同的冷却程序进行结晶，但是在温度降至25℃后加入333.24g甲醇。在该顺序的最后，将悬浮液过滤，从而在滤饼中获得1162g的KGA一水合物，其中无水KGA含量为86.5重量％。
6.母液的进一步处理
将由步骤5)获得的KGA含量17.9重量％的683g母液浓缩成包含40.2重量％KGA的溶液用于第二次结晶。第二次结晶的冷却顺序如下：在15分钟内从50℃冷却至25℃，然后在5小时内继续冷却至1℃。温度降到50℃以下后，晶体立即成核并生长。将所得悬浮液转移并过滤，从而在滤饼中获得第二批118.8g KGA一水合物，其中无水KGA的含量为73.0重量％。与实施例1相比，第二次结晶总共只需要4小时或更短的时间，并且获得的第二批晶体比实施例1中获得的第二批晶体更大，如图1所示。
从两次结晶得到的总KGA产率为93.7％。从第二次结晶获得的第二母液重量为169g，KGA含量为18.1重量％。第二母液的粘度为42mPa·S。第二母液的COD为0.079g/g(产生的KGA)。与实施例1相比，母液中累积的废物总量大大减少。
实施例3：在纳滤之前用活性炭处理回收KGA。
在实施例1的超滤和阳离子交换后，将1L的微生物减少的溶液(含8重量％的KGA)用1重量％的粉末状活性炭(Norit CA 1，Cabot Corporation，USA)采用实施例2的方式进行处理。使KGA含量为7.8-8重量％的滤液穿过实验室纳滤膜单元(Trisep Corporation，USA)。当在浓缩液侧各浓度处与未进行活性炭处理的的溶液进行比较时，经处理的溶液的渗透通量得到了显著改善，如图2所示。
Claims (9)
1.从发酵液回收2-酮-L-古洛糖酸的方法，其包括：
a)将所述发酵液进行超滤，以获得滤液；
b)采用阳离子交换树脂对所述滤液进行加工，以获得经加工的滤液；
c)将所述经加工的滤液进行纳滤和活性炭处理，以获得经处理的滤液；
d)采用浓缩、然后结晶，对所述经处理的滤液进行加工，以获得2-酮-L-古洛糖酸晶体；并且
e)可选地，采用浓缩、然后结晶，对从步骤d)获得的母液进行进一步加工，以获得第二批2-酮-L-古洛糖酸晶体。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤a)的所述超滤使用截留分子量为3000Da至200000Da、优选地5000Da至150000Da且更优选地10000Da至30000Da的超滤膜。
3.权利要求1或2所述的方法，其中用于步骤a)的所述超滤的压力为0.3MPa至1MPa、更优选地0.4MPa至0.8MPa且进一步优选地0.45MPa至0.5MPa。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤a)的所述超滤是在0℃至50℃、更优选地10℃至40℃且进一步优选地20℃至35℃的温度下进行的。
5.前面权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)中的酸性阳离子交换树脂是强酸性阳离子交换树脂。
6.前面权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)中用于活性炭处理的活性炭是活性炭粉末。
7.前面权利要求中任一项所述的方法，其中相对于滤液的重量，步骤c)中用于活性炭处理的活性炭的用量为约0.1重量％至2重量％，优选地0.2重量％至1.5重量％，更优选地0.3重量％至1重量％，进一步优选地0.4重量％至0.8重量％，最优选为0.5重量％。
8.前面权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)中的活性炭处理是在0℃至50℃、优选地10℃至40℃、更优选地20℃至30℃的温度下进行的。
9.前面权利要求中任一项所述的方法，其中活性炭处理是在步骤c)中的纳滤之前进行的。
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