CN114599634B - 允许氨的循环能够持续的支链氨基酸的结晶化方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种允许氨的循环能够持续的支链氨基酸的结晶化方法以及由该方法生产的支链氨基酸结晶。
Description
技术领域
本申请涉及一种允许氨的循环能够持续的支链氨基酸的结晶化方法。
背景技术
支链氨基酸(Branched chain amino acid；BCAA)是具有支链的脂肪族侧链(Aliphatic side-chain)的氨基酸，并在二十种蛋白原氨基酸(Proteinogenic aminoacid)中，对应于亮氨酸(leucine)、异亮氨酸(isoleucine)和缬氨酸(valine)。作为一种蛋白原，支链氨基酸在形成肌肉方面发挥着非常重要的作用，因此对于主要进行无氧运动训练的人来说，被视为必需的物质。事实上，支链氨基酸与谷氨酰胺和肌酸等是继蛋白质补充剂之后最常用的健身补充剂之一。
一方面，由于疏水性脂肪族侧链，支链氨基酸在纯水中的溶解度低于其他亲水性氨基酸。特别地，由于新发酵技术的发展的发酵液中目标物质浓度的增加被认为是不可避免的。换言之，在工业发酵工艺中，当发酵液中包括浓度等于或高于支链氨基酸溶解度的支链氨基酸时，在所制备的发酵液中会形成氨基酸结晶，这可能成用为抑制发酵液预处理或降低支链氨基酸结晶的回收率的因素。因此，为了解决这个问题，需要一种能够提高支链氨基酸在发酵液或悬浮液中溶解度的新技术。
此外，在使用为结晶化支链氨基酸的方法的中和重结晶方法等中，需要大量的pH调节物质而使结晶化效率低，并且产生难以可持续循环的盐废物而造成环境问题，因此有必要开发一种结晶化效率高且环保的新结晶化工艺。
[先前技术文献]
[专利文献]
(专利文献1)韩国注册专利第10-1736654号
发明内容
技术问题
本申请的一目的为提供一种允许氨的循环能够持续的支链氨基酸的结晶化方法。
本申请的另一目的为提供一种由上述方法生产的支链氨基酸结晶。
技术方案
本申请中所公开的每一个描述和实施例也适用于每一个其他描述和实施例。换言之，本申请所公开的各种要素的所有组合均属于本申请的范围内。此外，不能视本申请的范围受到以下详细描述的限制。
根据本申请的一方面，提供一种一种支链氨基酸的结晶化方法，包括：(a)将包括支链氨基酸结晶的反应液与氨混合来获得溶解有所述支链氨基酸结晶的溶解液的步骤；(b)将所获得的溶解液结晶化来获得包括支链氨基酸结晶的浓缩液的步骤；(c)获得包括在所述结晶化过程中产生的水蒸气和氨的混合气体的步骤；以及(d)将来自所获得的混合气体的氨再使用为所述(a)步骤的氨的步骤，其中，所述(b)步骤和所述(c)步骤同时或依次进行。
本申请的支链氨基酸的结晶化方法将针对每个步骤进行详细描述如下。
首先，本申请的方法可以包括将包括支链氨基酸结晶的反应液与氨混合来获得溶解有支链氨基酸结晶的溶解液的步骤。
在本申请中，术语“支链氨基酸”是指具有分枝的脂肪族侧链的氨基酸，并可以为选自亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸中的至少一种氨基酸，例如，可以是选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的至少一种氨基酸。
在上述步骤中，与氨混合可以提高包括支链氨基酸结晶的反应液的pH，并可以增加支链氨基酸在反应液中的溶解度。对于所述氨，可以是在最初工艺中用于生成结晶化进料(Crystallization Feed)而将单独的氨如氨水与反应液混合的，也可以是混合在随后的工艺中将来自从(c)步骤中获得的混合气体的氨。
在一实施例中，包括支链氨基酸结晶的反应液可以是支链氨基酸过饱和的溶液中的悬浮液形式，例如，可以包括含有支链氨基酸结晶的溶液或发酵液。
包括所述支链氨基酸结晶的溶液可以是支链氨基酸结晶和蒸馏水混合的溶液，并且包括所述支链氨基酸结晶的发酵液可以是通过在培养基中培养生产支链氨基酸的微生物而获得的。
只要是具有支链氨基酸生产能力的微生物，生产所述支链氨基酸的微生物没有特别限制，例如，可以是棒状杆菌(Corynebacterium)属或埃希菌(Escherichia)属，具体地，可以是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株或其变异株，在一实施例中，可以是具有保藏号KCCM11662P、KCCM11248P或KCCM11336P的谷氨酸棒状杆菌变异株。
在本申请中，术语“培养”是指在适度人工调节的环境中培养微生物。在本申请中，使用具有支链氨基酸生产能力的微生物生产支链氨基酸的方法可以通过使用本领域公知的方法进行。具体地，所述培养可以连续在分批培养工艺、分批补料式培养或反复培养分批补料式培养工艺(fed batch or repeated fed batch process)中进行，但不限于此。
用于培养的培养基必须以适当的方式满足特定菌株的要求。例如，棒状杆菌属菌株的培养基是已知的(例如，通用细菌学方法手册(Manual of Methods for GeneralBacteriology).)美国微生物学会(American Society for Bacteriology.)华盛顿特区，美国，1981)可以使用的糖源包括诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素的糖和碳水化合物；诸如大豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油等的油和脂肪；诸如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸的脂肪酸；诸如甘油和乙醇等的醇；以及诸如乙酸的有机酸。这些物质可以单独使用或作为混合物使用，但不限于此。可以使用的氮源包括蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、大豆小麦和尿素或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可以单独使用或作为混合物使用，但不限于此。可以使用的磷源可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
此外，培养基可以含有生长所必需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。另外，可以使用必需的生长物质，例如氨基酸和维生素。此外，可以使用适合培养基的前驱体。上述原料可以在培养过程中通过适合培养的方法分批或连续添加。然而，本申请不限于此。
在一实施例中，在所述(a)步骤中获得的溶解有支链氨基酸结晶的溶解液的pH可以为9至12。当所述溶解液的pH为等于或低于9时，溶解液中存在支链氨基酸结晶，因此降低了溶解液的结晶化效率。所述支链氨基酸溶解液的pH可以具有例如9至11.5、9至11、9至10.5、9至10.0、9至9.5、9.5至12.0、9.5至11.5、9.5至11.0、9.5至10.5、9.5至10、10至12.0、10至11.5、10至11.0、或10至10.5的范围，并可根据氨基酸种类及其他反应条件等适当调整。
在一实施例中，随着支链氨基酸结晶溶解，溶解有所述支链氨基酸结晶的溶解液可以从悬浮液变为透明溶液的状态。
此后，本申请的方法可以包括将所获得的溶解有支链氨基酸结晶的溶解液结晶化来获得包括支链氨基酸结晶的浓缩液的步骤。
在所述步骤中，支链氨基酸溶解液的结晶化可以应用本领域已知的常规技术。例如，所述结晶化可以伴随着溶剂的蒸发，并且进行结晶化工艺期间的温度可以是60℃至90℃、60℃至85℃、60℃至80℃、60℃至75℃、60℃至70℃、60℃至65℃、70℃至90℃、70℃至85℃、70℃至80℃、70℃至75℃、75℃至90℃、75℃至85℃、或75℃至80℃。此外，只要能够达成本申请的目的，所述结晶化可以由其构成和结构不受限制的结晶化装置进行。
所述浓缩液含有高浓度的支链氨基酸，并且所述支链氨基酸的浓度可以为例如40g/L至800g/L、55g/L至750g/L、70g/L至700g/L、85g/L至650g/L、100g/L至600g/L、115g/L至550g/L、130g/L至500g/L、145g/L至450g/L、160g/L至400g/L、175g/L至350g/L、或190g/L至300g/L，但其可根据工业化工艺的规模而变化。
在一实施例中，与(a)步骤中的包括支链氨基酸结晶的反应液的支链氨基酸浓度相比，所述浓缩液的支链氨基酸浓度可以为1.0倍至2.0倍、1.0倍至1.8倍、1.0倍至1.7倍、1.0倍至1.6倍、1.2倍至2.0倍、1.2倍至1.8倍、1.2倍至1.7倍、1.2倍至1.6倍、1.3倍至2.0倍、1.3倍至1.8倍、1.3倍至1.7倍、1.3倍至1.6倍、1.4倍至2.0倍、1.4倍至1.8倍、1.4倍至1.7倍、或1.4倍至1.6倍，但不限于此。
在一实施例中，随着通过透明的支链氨基酸溶解液的结晶化而再次形成支链氨基酸结晶，溶液的浊度增加，因此所述浓缩液可变成悬浮液状态。
本申请的方法可以包括获得包括在所述结晶化过程中产生的水蒸气和氨的混合气体的步骤。
在一实施例中，所述步骤可以与上述的获得包括支链氨基酸结晶的浓缩液的步骤同时或依次进行，并且，例如，只要所述步骤可以进行，则可以由其构成和结构不受限制的氨回收装置进行。
在一实施例中，所述步骤可进行直至所述(b)步骤的溶解有支链氨基酸结晶的溶解液的pH变为5.5至8.0，具体地，可进行直至所述溶解液的pH变为5.5至7.5、5.5至7.0、5.5至6.5、6.0至8.0、6.0至7.5、6.0至7.0、6.0至6.5、6.5至8.0、6.5至7.5、6.5至7.0，或7.0。
另外，所述混合气体可以是水蒸气和氨混合而成的蒸气状态的气体，由于所述混合气体的组成比主要受水-氨-支链氨的气液相平衡系统的影响，其可具有取决于结晶化装置的内部温度和压力条件的各种分布。
本申请的方法可以包括将来自所获得的混合气体的氨再使用为所述(a)步骤的氨的步骤。
在一实施例中，在所述步骤中，所述氨可以以蒸气状态再使用或者以压缩或凝缩了所述蒸气的液体状态再使用。
在所述步骤之前，可进一步包括通过对所获得的混合气体进行凝缩或压缩来将混合气体中的氨转化为液体状态的步骤，例如，可以使用冷却器凝缩混合气体、使用压缩器压缩混合气体或同时使用冷却器和压缩器。此外，例如，只要所述步骤可以进行，则可以由其构成和结构不受限制的压缩器等进行。
在一实施例中，可以重覆进行所述步骤直至能够获得高浓度的支链氨基酸浓缩液。例如，所述步骤可以重覆进行2次至50次、2次至45次、2次至40次、2次至35次、2次至30次、2次至25次、2次至20次、2次至15次、2次至10次或2次至5次，但不限于此。
由于本申请的方法包括将来自从(c)步骤中获得的混合气体的氨再使用为所述(a)步骤的的氨的步骤，因此不需要大量的pH调节物质而经济实惠的，可以提高支链氨基酸结晶化效率，并且可以通过减少难以可持续循环的盐废物的产生，从而使用为环保的方法。
此外，本申请的方法可在所述(a)步骤与所述(b)步骤之间进一步包括通过对溶解有所述支链氨基酸结晶的溶解液进行微细过滤来去除溶解液中的生物量的步骤。
另外，本申请的方法可在所述(a)步骤与所述(b)步骤之间进一步包括在溶解有所述支链氨基酸结晶的溶解液中添加活性炭来去除溶解液中的有色物质的步骤。
根据一实施例，可以以高水平的回收率获得在复数次的结晶化过程中产生的氨，并且所回收的氨，例如氨水，可以再使用来溶解存在于反应液中的支链氨基酸结晶。因此，所述方法可以基于结晶化过程持续生产支链氨基酸结晶而无需单独的pH调节剂，因此，可以提高支链氨基酸结晶的生产效率。
本申请的方法可在所述(b)步骤之后进一步包括从所述(b)步骤的包括支链氨基酸结晶的浓缩液中分离支链氨基酸结晶的步骤。
例如，所述分离支链氨基酸结晶的步骤可以在所述步骤(b)步骤和所述(c)步骤之间、所述步骤(c)步骤和所述(d)步骤之间或在所述(d)步骤之后进行，并可以与所述步骤(c)步骤或所述(d)步骤同时进行，但只要是在所述(b)步骤之后进行，则可以在任何步骤中进行，而与所述步骤(c)步骤和所述(d)步骤的顺序无关。
在所述步骤中，从浓缩液中分离支链氨基酸结晶可以包括，例如，通过对包括所述支链氨基酸结晶的浓缩液进行固液分离来获得支链氨基酸湿晶(Wet crystal)的步骤；以及通过对所获得的湿晶进行干燥来获得支链氨基酸结晶的步骤，但本领域已知的与氨基酸结晶的分离和纯化相关的常规技术可以不受限制地应用。
另外，根据本申请的另一方面，提供一种由支链氨基酸的结晶化方法生产的支链氨基酸结晶，其中，所述方法包括：a)将包括支链氨基酸结晶的反应液与氨混合来获得溶解有所述支链氨基酸结晶的溶解液的步骤；(b)将所获得的溶解液结晶化来获得包括支链氨基酸结晶的浓缩液的步骤；(c)获得包括在所述结晶化过程中产生的水蒸气和氨的混合气体的步骤；以及(d)将来自所获得的混合气体的氨再使用为所述(a)的氨的步骤，其中，所述(b)步骤和所述(c)步骤同时或依次进行。
所述支链氨基酸的结晶化方法如上所述。
有益效果
根据本申请的支链氨基酸的结晶化方法通过以蒸气状态获得在结晶化过程中首先加入的氨并将其再使用以增加支链氨基酸的溶解度，因此可以提高支链氨基酸结晶的生产效率，并且由于不需要大量的pH调节物质和额外的中和工艺，可以降低生产成本。
此外，根据本申请的支链氨基酸的结晶化方法可以通过进一步减少难以可持续循环的盐废物的产生，从而可用作环保的方法。
附图说明
图1为确认支链氨基酸的溶解度随溶液pH而变化的结果。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例是用于例示说明本发明，本发明的范围不限于这些实施例。此外，由于本说明书中未记载的内容能够被本申请的技术领域或类似领域的技术人员充分认识和推断，因此省略其说明。
实施例1.试验材料和试验方法
(1)试验材料
支链氨基酸使用了纯度为等于或高于98％的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸产品，并且所述支链氨基酸产品均使用CJ第一制糖产品。水使用了直接制备的三次蒸馏水，并且26％(v/v)氨水和98％(v/v)的硫酸购自大井化金株式会社并使用。用于高效液相色谱(high-performance liquid chromatograph；HPLC)分析的0.1M的硝酸水溶液和0.02M的吡啶二羧酸水溶液购自Sigma-Aldrich(美国)并使用。
(2)支链氨基酸溶解液的浓度和支链氨基酸结晶的纯度分析
使用HPLC(型号DIONEX Ultimate 3000系统，赛默飞世尔科技(ThermoScientific)，美国)进行支链氨基酸溶解液的浓度和支链氨基酸的纯度分析，并且分析条件如下：
-柱：Hypersil gold HPLC柱(默飞世尔科技，美国)
-柱温：40℃
-流动相：0.1wt％硫酸水溶液
-流动相速度：1.0ml/分钟
-感测器：荧光检测器。
(3)支链氨基酸溶解液中的氨浓度的分析
使用离子色谱法(型号930compact IC Flex，万通(Metrohm)，瑞士)进行支链氨基酸溶解液中的氨浓度的分析，并且分析条件如下：
-柱：Metrosep C4-150(Metrohm万通，瑞士)
-柱温：25℃
-流动相：0.7mM的硝酸水溶液+1.7mM的吡啶二羧酸水溶液
-流动相速度：1.0ml/分钟。
(4)支链氨基酸的溶解度分析
在玻璃材质的1L夹套反应器中测量支链氨基酸的溶解度。在1L夹套反应器中将蒸馏水和氨水以各种比例混合后，加入过量的支链氨基酸结晶并将其搅拌，从而制备包括支链氨基酸结晶的反应液。在使用冷冻/加热循环装置(型号F35，优莱博(Julabo)，德国)将反应器的内部温度恒定保持在30℃的同时，这些条件在搅拌下维持等于或多于12小时。之后，停止搅拌，并在支链氨基酸结晶全部沉降时，将澄明状态的上清液的一部分转移到安装有0.45μm注射器过滤器的注射器取样器中。此时，使用pH测量计(型号S220，梅特勒托利多(Mettler Toledo)，美国)测量该溶液的pH值。使用定量烧瓶用三次蒸馏水稀释后，使用HPLC测量该样品的浓度。将所述上清液样品的浓度假定为溶解度，并确认了支链氨基酸的溶解度随溶液的pH变化(图1)。结果，确认了支链氨基酸的溶解度从溶液的pH变为9或更高的时间点开始增加。
实施例2.包括支链氨基酸结晶的溶液中的分离和纯化
(1)支链氨基酸的结晶化和氨的回收
对于每种条件，在相同的工艺条件下总共进行5次结晶化。然而，在第一次的结晶化工艺中，为了制备结晶化进料，将氨水添加到通过混合BCAA结晶和蒸馏水而制备的包括BCAA结晶的溶液中来溶解整个BCAA结晶。在随后的次数中，将回收的氨水添加到包括BCAA结晶的反应液中来溶解BCAA结晶(试验组)。一方面，作为对照组，使用了其中通过将26％(v/v)的氨水添加到包括BCAA结晶的反应液中然后用98％(v/v)的硫酸将pH重新调节至7的组。
对于结晶化和氨回收，使用一种装置，其具有一种结构，该结构包括结晶化器，其包括结晶化进料注入其中的注入单元、pH调节单元、加热循环器和排出口；蒸气回收装置，其包括回收的氨水注入其中的注入单元、冷却循环器和排出口；以及压缩器，其位于结晶化器和蒸气回收装置之间。具体地，所述结晶化进料是指在第一次的结晶化过程中所获得的包括支链氨基酸结晶的浓缩液，在玻璃材质的20L夹套反应器中进行结晶化，并且为了防止热交换单元结垢，夹套仅安装到内部液体体积为10L的位置。夹套部位充满其温度由冷冻/加热循环装置(型号F35，优莱博，德国)控制的三次蒸馏水，并且进行结晶化工艺期间的温度保持在80℃。内部反应液等的搅拌使用以特氟隆(Teflon)材质的四叶片螺旋桨(4-bladeimpeller)可调节转速的搅拌器(型号RW-20，伊卡(IKA)，德国)进行的，并且进行结晶化期间的搅拌速度保持在200rpm。反应器内部的减压是使用通过管道连接的压缩器(Compressor)进行的，在压缩器和结晶化器之间安装有电子真空控制器(型号NVC 2300-A，理化(Eyela)，日本)来调节其压力。结晶化器内的压力保持在100mbar。氨回收装置由可储存高达20bar的压力的不锈钢材质的20L夹套压力容器构成，并且用供给自有设备的4℃的冷却水进行冷却。此时，进行氨的回收直至结晶化器内的pH变为5.5至8.0。将最终浓缩液的浓度调整为与添加氨前的包括BCAA结晶的反应液浓度相比的1.5倍。
(2)支链氨基酸结晶的分离和干燥
当达到所述最终浓度时，结晶化工艺终止，并且反应器中的浓缩液通过设置在下方的排出管回收。此后，使用安装有棉过滤器的离心篮式分离器(型号H-122，科库森(Kokusan)，日本)以2000rpm的速度对所回收的浓缩液进行固液分离5分钟。根据需要，在分离初始时使用蒸馏水进行洗涤工艺。之后，将获得的湿晶(wet crystal)在烘箱干燥器中在80℃下干燥至重量没有变化，从而获得BCAA结晶。
(3)试验结果
(3.1)L-亮氨酸的结晶化和氨的回收
使用由纯度等于或高于98％的L-亮氨酸结晶制备的20L的悬浮液进行L-亮氨酸的结晶化和氨回收试验。试验共进行5次，实验结果中第2次至第5次的结晶化工艺的平均值见表1。对于具有L-亮氨酸浓度范围为30g/L至200g/L的反应液，通过加入回收的氨水并将所述反应液的pH调节至9至12的范围来进行结晶的溶解，之后，在进行结晶化的同时再次回收氨水。
如下表1所示，对照组没有回收氨水，但在根据一实施例的结晶化工艺中，以等于或高于97％的回收率确保了浓度为9％至23％的氨水，并且所回收的氨水可再使用于溶解反应液中的L-亮氨酸结晶。
【表1】
(3.1)L-异亮氨酸的结晶化和氨的回收
使用由纯度等于或高于98％的L-异亮氨酸结晶制备的20L的悬浮液进行L-异亮氨酸的结晶化和氨回收试验。试验共进行5次，实验结果中第2次至第5次的结晶化工艺的平均值见表2。对于具有L-异亮氨酸浓度范围为50g/L至250g/L的反应液，通过加入回收的氨水并将所述反应液的pH调节至9至12的范围来进行结晶的溶解，之后，在进行结晶化的同时再次回收氨水。
如下表2所示，对照组没有回收氨水，但在根据一实施例的结晶化工艺中，以等于或高于97％的回收率确保了浓度为9％至22％的氨水，并且所回收的氨水可再使用于溶解反应液中的L-异亮氨酸结晶。
【表2】
(3.3)L-缬氨酸的结晶化和氨的回收
使用由纯度等于或高于98％的L-缬氨酸结晶制备的20L的悬浮液进行L-缬氨酸的结晶化和氨回收试验。试验共进行5次，实验结果中第2次至第5次的结晶化工艺的平均值见表3。对于具有L-缬氨酸浓度范围为120g/L至350g/L的反应液，通过加入回收的氨水并将所述反应液的pH调节至9至12的范围来进行结晶的溶解，之后，在进行结晶化的同时再次回收氨水。
如下表3示，对照组没有回收氨水，但在根据一实施例的结晶化工艺中，以等于或高于98％的回收率确保了浓度为13％至23％的氨水，并且所回收的氨水可再使用于溶解反应液中的L-缬氨酸结晶。
【表3】
实施例3.包括支链氨基酸结晶的发酵液中的分离和纯化
(1)包括支链氨基酸的发酵液的制备
使用作为生产L-亮氨酸的菌株的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)变异株(保藏号：KCCM11662P)、作为生产L-异亮氨酸的菌株的谷氨酸棒杆菌变异株(保藏号：KCCM11248P)，以及作为生产L-缬氨酸的菌株的谷氨酸棒杆菌变异株(保藏号：KCCM11336P)来制备分别包括L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的发酵液。
具体地，将40mL的预培养基分株到500mL的振荡用锥形烧瓶中，并在121℃下加压灭菌15分钟后，将各菌株接种并在33℃下以200rpm搅拌的同时，在旋转搅拌孵化器中培养24小时。之后，将3L的种子培养基填充到5L的发酵罐中，并在121℃下加压灭菌30分钟后，将pH调节至7.0，并将所述4％的预培养物接种来在33℃下以800rpm和0.5vvm的通气率条件培养直到OD值达到20来进行种子培养。然后，将2.1L的主培养基填充到5L的发酵罐中，并在121℃下加压灭菌30分钟后，每次添加0.6L葡萄糖，并用氨气将pH调至7.0。将所述种子培养液在准备好的主培养罐中接种至20％，并在培养温度33℃和1.0vvm的通气率条件下培养42小时，同时调节至400rpm至800rpm以使溶解氧保持在等于或高于30％，从而制备了分别包括L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸。所述培养过程中使用的预培养、种子培养和主培养基的组成如下表4所示。
【表4】
| 组成 | 预培养基 | 种子培养基 | 主培养基 |
| 葡萄糖(g/l) | 5.0 | 10.1 | 40.2 |
| MgSO4(g/l) | 0.5 | 0.5 | 4.2 |
| 酵母提取物(g/l) | 5 | 10 | 3.2 |
| KH2PO4 | 2 | 3 | 3 |
| 硫酸铵(g/l) | 6.3 | ||
| NH4Cl(g/l) | 0.5 | 1 | |
| NaCl(g/l) | 0.5 | 0.5 | |
| Na2HPO4(g/l) | 4.07 | 5.07 |
(2)支链氨基酸结晶的分离和干燥
使用上述制备的包括BCAA结晶的发酵液代替包括BCAA结晶的溶液，并以与实施例2的(1)和(2)中所述相同的方式进行氨添加、结晶化、BCAA结晶的分离和干燥，同时，在添加氨的步骤和结晶化步骤之间，额外进行如下所述的微细过滤步骤和添加粉末活性炭步骤。
具体地，使用安装有0.1μm微细过滤膜的微细过滤装置(型号Pellicon 2，默克(Merck)，美国)从溶解有BCAA结晶的溶解液中去除如菌体的生物量，并且为了去除有色物质，将与BCAA相比的10wt％的粉末活性炭(型号YL303，元力，中国)添加到所述透过液，然后在60℃下搅拌30分钟。之后，通过使用7μm的过滤膜的第一次真空过滤从所述BCAA溶解液中去除活性炭，并且通过使用0.45μm的过滤膜的第二次真空过滤进一步去除残留的活性炭。
(3)试验结果
(3.1)L-亮氨酸的纯化
从所述实施例3的(1)中制备的包括L-亮氨酸结晶且L-亮氨酸浓度为60g/L的发酵液中重复进行L-亮氨酸纯化5次。向20L的包括L-亮氨酸结晶的发酵液中添加回收的氨水(但最初是氨水试剂)来调节pH至10，并在溶解全部量的L-亮氨酸后，通过微细过滤除去生物量。此后，对经微细过滤的透过液进行粉末状活性炭处理以分离有色物质。然后，对滤液进行浓缩结晶化至90g/L的浓度，并且使用篮式过滤器对包括L-亮氨酸结晶的浓缩液进行固液分离。此时，使用基于包括L-亮氨酸结晶的浓缩液的20vol％的三次蒸馏水进行洗涤。
之后，5次平均的通过干燥的最终回收的结晶的重量为1.1kg，并且5次平均的结晶纯度的为98.4％。在根据一实施例的结晶化工艺中，可以以等于或高于98％的回收率确保浓度为13％的氨水，并且所回收的氨水可以再使用于溶解发酵液中的L-亮氨酸结晶。
(3.2)L-异亮氨酸的纯化
从所述实施例3的(1)中制备的包括L-异亮氨酸结晶且L-异亮氨酸浓度为90g/L的发酵液中重复进行L-异亮氨酸纯化5次。向20L的包括L-异亮氨酸结晶的发酵液中添加回收的氨水(但最初是氨水试剂)来调节pH至10，并在溶解全部量的L-异亮氨酸后，通过微细过滤除去生物量。此后，对经微细过滤的透过液进行粉末状活性炭处理以分离有色物质。然后，对滤液进行浓缩结晶化至135g/L的浓度，并且使用篮式过滤器对包括L-异亮氨酸结晶的浓缩液进行固液分离。此时，使用基于包括L-异亮氨酸结晶的浓缩液的20vol％的三次蒸馏水进行洗涤。
之后，5次平均的通过干燥的最终回收的结晶的重量为1.7kg，并且5次平均的结晶纯度的为98.6％。在根据一实施例的结晶化工艺中，可以以等于或高于98％的回收率确保浓度为13％的氨水，并且所回收的氨水可以再使用于溶解发酵液中的L-异亮氨酸结晶。
(3.3)L-缬氨酸的纯化
从所述实施例3的(1)中制备的包括L-缬氨酸结晶且L-缬氨酸浓度为150g/L的发酵液中重复进行L-缬氨酸纯化5次。向20L的包括L-缬氨酸结晶的发酵液中添加回收的氨水(但最初是氨水试剂)来调节pH至10，并在溶解全部量的L-缬氨酸后，通过微细过滤除去生物量。此后，对微细过滤的透过液进行粉末状活性炭处理经以分离有色物质。然后，对滤液进行浓缩结晶化至225g/L的浓度，并且使用篮式过滤器对包括L-缬氨酸结晶的浓缩液进行固液分离。此时，使用基于包括L-缬氨酸结晶的浓缩液的20vol％的三次蒸馏水进行洗涤。
之后，5次平均的通过干燥的最终回收的结晶的重量为3.0kg，并且5次平均的结晶纯度的为98.4％。在根据一实施例的结晶化工艺中，可以以等于或高于98％的回收率确保浓度为13％的氨水，并且所回收的氨水可以再使用于溶解发酵液中的L-缬氨酸结晶。
上述的本发明的描述是用于举例，并且本发明所属领域的普通技术人员可以理解，在不改变本发明的技术思想或必要的特征的情况下，可以很容易地转换成其他具体的形式。因此，应当理解，上述实施例在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。
Claims (7)
1.一种支链氨基酸的结晶化方法，包括：
(a)将包括支链氨基酸结晶的反应液与氨混合来获得溶解有所述支链氨基酸结晶的溶解液的步骤；
(b)将所获得的溶解液结晶化来获得包括支链氨基酸结晶的浓缩液的步骤；
(c)获得包括在所述结晶化过程中产生的水蒸气和氨的混合气体的步骤；以及
(d)将来自所获得的混合气体的氨再使用为所述(a)步骤的氨的步骤，
其中，所述(b)步骤和所述(c)步骤同时或依次进行，
其中所述支链氨基酸为选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸中的至少一种氨基酸，以及
其中在所述(a)步骤中，溶解有所述支链氨基酸结晶的溶解液的pH为9至12，以及
其中与所述(a)步骤中的包括支链氨基酸结晶的反应液的支链氨基酸浓度相比，所述(b)步骤中的包括支链氨基酸结晶的浓缩液的支链氨基酸浓度为1.3倍至1.7倍，以及
其中，进行所述(c)步骤直至所述(b)步骤的包括支链氨基酸结晶的浓缩液的pH变为5.5至8.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，包括所述支链氨基酸结晶的反应液含有包括支链氨基酸结晶的溶液或发酵液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，包括所述支链氨基酸结晶的发酵液为通过在培养基中培养生产支链氨基酸的微生物而获得的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述(d)步骤中，所述氨以蒸气状态再使用或者以压缩或凝缩了所述蒸气的液体状态再使用。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述(a)步骤与所述(b)步骤之间进一步包括(a-1)通过对溶解有所述支链氨基酸结晶的溶解液进行微细过滤来去除溶解液中的生物量的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述(a)步骤与所述(b)步骤之间进一步包括(a-2)在溶解有所述支链氨基酸结晶的溶解液中添加活性炭来去除溶解液中的有色物质的步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述(b)步骤之后进一步包括(e)从所述(b)步骤的包括支链氨基酸结晶的浓缩液中分离支链氨基酸结晶的步骤。
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