JP2023503418A - アンモニアの持続可能な循環のできる分枝鎖アミノ酸の結晶化方法 - Google Patents

Abstract

アンモニアの持続可能な循環のできる分枝鎖アミノ酸の結晶化方法、及び該方法によって生産された分枝鎖アミノ酸の結晶を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、アンモニアの持続可能な循環のできる分枝鎖アミノ酸の結晶化方法に関する。

分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ：branched chain amino acid）とは、分枝がある脂肪族側鎖（aliphatic side-chain）を有するアミノ酸であり、２０種のタンパク質源アミノ酸（proteinogenic amino acid）のうちには、ロイシン（leucine）、イソロイシン（isoleucine）及びバリン（valine）がそれらに該当する。タンパク質源として、分枝鎖アミノ酸は、筋肉形成に非常に重要な役割を担うために、無酸素運動中心のトレーニングを行う人々に必須な物質とされている。実際、該分枝鎖アミノ酸は、グルタミン、クレアチンなどと共に、タンパク質補充剤の次に最も多く利用されるヘルス補助剤のうち一つである。

ところで、分枝鎖アミノ酸は、疎水性脂肪族側鎖により、純水中における溶解度が、他の親水性アミノ酸に比べて低い方である。特に、新たな発酵技術の開発による発酵液内ターゲット物質の濃度上昇は、不可欠であると見られている。すなわち、産業的発酵工程において、分枝鎖アミノ酸の溶解度以上の濃度の分枝鎖アミノ酸が発酵液内に含まれる場合、前述の製造された発酵液には、アミノ酸結晶が形成されてしまい、それは、発酵液の前処理を阻害させたり、分枝鎖アミノ酸結晶の回収率を低下させたりする要因としても作用する。従って、そのような問題点を解決するために、発酵液内または懸濁液内の分枝鎖アミノ酸の溶解度を高めることができる新たな技術が必要な実情となっている。

また、分枝鎖アミノ酸を結晶化させる方法として使用される中和再結晶化方法などにおいては、多量のｐＨ調節物質を必要とし、結晶化効率が低く、持続可能な循環が困難である塩廃棄物を生成し、環境的問題を引き起こすため、結晶化効率が高くありつつも、環境親和的な新たな結晶化工程の開発が必要である。

大韓民国登録特許第１０－１７３６６５４号

本出願の一目的は、アンモニアの持続可能な循環のできる分枝鎖アミノ酸の結晶化方法を提供することである。

本出願の他の目的は、前記方法によって生産された分枝鎖アミノ酸結晶を提供することである。

本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれ、他の説明及び実施形態にも適用されうる。すなわち、本出願で開示された多様な要素の全ての組み合わせが、本出願の範疇に属する。また、以下に述される具体的な敍述により、本出願の範疇が制限されるとするものではない。

本出願は、一態様において、（ａ）分枝鎖アミノ酸結晶を含む反応液と、アンモニアとを混合し、前記分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液を得る段階と、（ｂ）前記得られた溶解液を結晶化させ、分枝鎖アミノ酸結晶を含む濃縮液を得る段階と、（ｃ）前記結晶化過程で生成された、水蒸気及びアンモニアを含む混合気体を得る段階と、（ｄ）前記得られた混合気体に由来するアンモニアを、前記（ａ）段階のアンモニアとして再使用する段階と、を含み、前記（ｂ）段階及び前記（ｃ）段階は、同時または順次に行われる、分枝鎖アミノ酸の結晶化方法を提供する。

本出願の分枝鎖アミノ酸の結晶化方法について、それぞれの段階別に詳細に説明すれば、次の通りである。

まず、本出願の方法は、分枝鎖アミノ酸結晶を含む反応液と、アンモニアとを混合し、分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液を得る段階を含むものでもある。

本出願において用語「分枝鎖アミノ酸」とは、分枝がある脂肪族側鎖を有するアミノ酸を称するものであり、ロイシン、イソロイシン及びバリンからなる群のうちから選択される少なくともいずれか１つのアミノ酸でもあり、例えば、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－バリンからなる群のうちから選択される少なくとも１つのアミノ酸でありうる。

前述の段階において、アンモニアとの混合は、分枝鎖アミノ酸結晶を含む反応液のｐＨを増大させ、反応液内分枝鎖アミノ酸の溶解度を上昇させることができる。前記アンモニアにおいて、最初の工程においては、結晶化フィード（crystallization feed）を生成するために、別途のアンモニア、例えば、アンモニア水を反応液と混合するものでもあり、以後の工程においては、（ｃ）段階から得られた混合気体に由来するアンモニアを混合するものでありうる。

一実施形態において、分枝鎖アミノ酸結晶を含む反応液は、分枝鎖アミノ酸が過飽和された溶液であり、懸濁液形態でもあり、例えば、分枝鎖アミノ酸結晶を含む溶液または発酵液を含むものでもある。

前記分枝鎖アミノ酸結晶を含む溶液は、分枝鎖アミノ酸結晶と蒸溜水とを混合した溶液でもあり、前記分枝鎖アミノ酸結晶を含む発酵液は、分枝鎖アミノ酸を生産する微生物を培地で培養して得られるものでもある。

前記分枝鎖アミノ酸を生産する微生物は、分枝鎖アミノ酸生産能がある微生物であるならば、特別に制限がなく、例えば、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属またはエスケリキア（Escherichia）属でもあり、具体的には、コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）菌株、またはその変異株でもあり、一実施形態において、受託番号ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ，ＫＣＣＭ１１２４８ＰまたはＫＣＣＭ１１３３６Ｐを有するコリネバクテリウムグルタミクム変異株でありうる。

本出願において用語「培養」とは、微生物を適切に人工的に調節した環境条件において生育させることを意味する。本出願において、分枝鎖アミノ酸生成能を有する微生物を利用した分枝鎖アミノ酸生産方法は、当業界に周知されている方法を利用して遂行することができる。具体的には、前記培養は、バッチ工程、注入バッチまたは反復注入バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）で連続して培養することができるが、それらに制限されるものではない。

培養に使用される培地は、適切な方式で特定菌株の要件を充足しなければならない。例えば、コリネバクテリウム属菌株に係わる培養培地は、公知されている（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981）。使用されうる糖源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖；炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油のようなオイル及び脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール、エタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸が含まれうる。それら物質は、個別的にまたは混合物として使用されるが、それらに制限されるものではない。使用されうる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、大豆ミール、尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれうる。該窒素源も、個別的にまたは混合物として使用されるが、それらに制限されるものではない。使用されうるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウム、または相応するナトリウム含有塩が含まれうる。

また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むものでもある。さらには、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用されうる。また、該培養培地に適切な前駆体が使用されうる。前述の原料は、培養過程において、培養物に適切な方式により、回分式または連続して添加されうる。しかし、それらに制限されるものではない。

一実施形態において、前記（ａ）段階で得られた分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液のｐＨは、９ないし１２でありうる。前記溶解液のｐＨが９以下である場合には、溶解液内に、分枝鎖アミノ酸結晶が存在し、溶解液の結晶化効率を低減させてしまう。前記分枝鎖アミノ酸溶解液のｐＨは、例えば、９ないし１１．５、９ないし１１、９ないし１０．５、９ないし１０．０、９、ないし９．５、９．５ないし１２．０、９．５ないし１１．５、９．５ないし１１．０；または９．５ないし１０．５、９．５ないし１０、１０ないし１２．０、１０ないし１１．５、１０ないし１１．０；または１０ないし１０．５の範囲を有するものでありうるが、アミノ酸の種類、その他反応条件などにより、適切に調節可能である。

一実施形態において、前記分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液は、分枝鎖アミノ酸結晶が溶解されることにより、懸濁液において、透明な溶液の形態に変化されたものでもある。

以下、本出願の方法は、前述の得られた分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液を結晶化させ、分枝鎖アミノ酸結晶を含む濃縮液を得る段階を含むものでもある。

前述の段階において、分枝鎖アミノ酸溶解液の結晶化は、当業界に知られた通常の技術が適用されうる。例えば、前記結晶化は、溶媒の蒸発を伴うものでもあり、結晶化工程が進められる間、温度は、６０ないし９０℃、６０ないし８５℃、６０ないし８０℃、６０ないし７５℃、６０ないし７０℃、６０ないし６５℃、７０ないし９０℃、７０ないし８５℃、７０ないし８０℃、７０ないし７５℃、７５ないし９０℃、７５ないし８５℃、または７５ないし８０℃でありうる。また、前記結晶化は、本出願の目的を達成するものであるならば、その構成及びその構造に制限がない結晶化装置によっても遂行される。

前記濃縮液は、分枝鎖アミノ酸を高濃度で含んでおり、前記分枝鎖アミノ酸の濃度は、例えば、４０ないし８００ｇ／Ｌ、５５ないし７５０ｇ／Ｌ、７０ないし７００ｇ／Ｌ、８５ないし６５０ｇ／Ｌ、１００ないし６００ｇ／Ｌ、１１５ないし５５０ｇ／Ｌ、１３０ないし５００ｇ／Ｌ、１４５ないし４５０ｇ／Ｌ、１６０ないし４００ｇ／Ｌ、１７５ないし３５０ｇ／Ｌ、または１９０ないし３００ｇ／Ｌでありうるが、それは、産業化工程の規模により、適宜変更可能である。

一実施形態において、前記濃縮液の分枝鎖アミノ酸濃度は（ａ）段階の分枝鎖アミノ酸結晶を含む反応液の分枝鎖アミノ酸濃度対比で、１．０ないし２．０倍、１．０ないし１．８倍、１．０ないし１．７倍、１．０ないし１．６倍、１．２ないし２．０倍、１．２ないし１．８倍、１．２ないし１．７倍、１．２ないし１．６倍、１．３ないし２．０倍、１．３ないし１．８倍、１．３ないし１．７倍、１．３ないし１．６倍、１．４ないし２．０倍、１．４ないし１．８倍、１．４ないし１．７倍、または１．４ないし１．６倍でもあるが、それらに制限されるものではない。

一実施形態において、前記濃縮液は、透明な分枝鎖アミノ酸溶解液の結晶化により、さらに分枝鎖アミノ酸結晶が形成されることにより、溶液の濁度が上昇し、懸濁液の形態に変化されたものでもある。

本出願の方法は、前記結晶化過程で生成された、水蒸気及びアンモニアを含む混合気体を得る段階を含むものでもある。

一実施形態において、前述の段階は、前述の分枝鎖アミノ酸結晶を含む濃縮液を得る段階と、同時または順次に行われるものでもあり、例えば、前述の段階を遂行することができるものであるならば、その構成及びその構造に制限がないアンモニア回収装置によっても遂行される。

一実施形態において、前述の段階は、前記（ｂ）段階の分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液のｐＨが５．５ないし８．０になるまで行うものでもあり、具体的には、前記溶解液のｐＨが５．５ないし７．５、５．５ないし７．０、５．５ないし６．５、６．０ないし８．０、６．０ないし７．５、６．０ないし７．０、６．０ないし６．５、６．５ないし８．０、６．５ないし７．５、６．５ないし７．０、または７．０になるまで行うものでもある。

また、前記混合気体は、水蒸気とアンモニアとが混合されている蒸気状態の気体でもあり、前記混合気体の組成比は、水・アンモニア・分枝鎖アンモニアの気液上の平衡系に支配的な影響を受けるために、結晶化装置の内部温度及び圧力条件により、多様な分布を有することができる。

本出願の方法は、前述の得られた混合気体に由来するアンモニアを、前記（ａ）段階のアンモニアとして再使用する段階を含むものでもある。

一実施形態において、前述の段階は、前記アンモニアを蒸気状態で再使用するか、あるいは前述の蒸気が圧縮または凝縮された液体状態で再使用するものでもある。

前述の段階に先立ち、得られた混合気体を凝縮または圧縮し、混合気体内のアンモニアを液体状態に転換させる段階をさらに含み、例えば、フリーザを使用し、混合気体を凝縮させるか、圧縮器を使用し、混合気体を圧縮するか、あるいは該フリーザと該圧縮器とを同時に使用するものでもある。また、例えば、前述の段階を遂行することができるものであるならば、その構成及びその構造に制限がない圧縮器などによっても遂行される。

一実施形態において、前述の段階は、高濃度の分枝鎖アミノ酸濃縮液を得ることができるまで反復実施されうる。例えば、前述の段階は、２ないし５０回、２ないし４５回、２ないし４０回、２ないし３５回、２ないし３０回、２ないし２５回、２ないし２０回、２ないし１５回、２ないし１０回、または２ないし５回ほど反復実施されうるが、それらに制限されるものではない。

本出願の方法は、（ｃ）段階で得られた混合気体に由来するアンモニアを、前記（ａ）段階のアンモニアとして再使用する段階を含むことにより、多量のｐＨ調節物質を必要とせずに経済的であり、分枝鎖アミノ酸結晶化効率を向上させることができ、持続可能な循環が困難である塩廃棄物生成を減少させ、親環境的な方法としても活用される。

また、本出願の方法は、前記（ａ）段階と前記（ｂ）段階との間に、前記分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液を微細濾過し、溶解液内バイオマスを除去する段階をさらに含んでもよい。

また、本出願の方法は、前記（ａ）段階と前記（ｂ）段階との間に、前記分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液に活性炭を添加し、溶解液内有色物質を除去する段階をさらに含んでもよい。

一実施例によれば、多数回の結晶化過程で生成されるアンモニアを、高レベルの回収率で得ることができ、前述の回収されたアンモニア、例えば、アンモニア水は、、反応液に存在する分枝鎖アミノ酸結晶を溶解させるのに再使用することができた。従って、前記方法は、別途のｐＨ調節剤なしに、結晶化工程に基づき、持続的に、分枝鎖アミノ酸結晶を生成することができ、それにより、分枝鎖アミノ酸結晶の生産効率を向上させることができる。

本出願の方法は、前記（ｂ）段階後、前記（ｂ）段階の分枝鎖アミノ酸結晶を含む濃縮液から、分枝鎖アミノ酸結晶を分離する段階をさらに含んでもよい。

前記分枝鎖アミノ酸結晶を分離する段階は、例えば、前記（ｂ）段階と前記（ｃ）段階との間、前記（ｃ）段階と前記（ｄ）段階との間、または前記（ｄ）段階後にもなされ、前記（ｃ）段階または前記（ｄ）段階と同時にもなされるが、前記（ｂ）段階後であるならば、前記（ｃ）段階及び前記（ｄ）段階との順序とは係わりなく、いずれも段階においても、行うことができる。

前述の段階において、濃縮液からの分枝鎖アミノ酸結晶の分離は、例えば、前記分枝鎖アミノ酸結晶を含む濃縮液を個液分離し、分枝鎖アミノ酸湿晶（wet crystal）を得る段階と、前記得られた湿晶を乾燥させ、分枝鎖アミノ酸結晶を得る段階を含んでもよいが、アミノ酸結晶の分離及び精製と係わる、当業界に知られた通常の技術が非制限的にも適用されえる。

また、本出願は、他の態様として、（ａ）分枝鎖アミノ酸結晶を含む反応液と、アンモニアとを混合し、前記分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液を得る段階と、（ｂ）前記得られた溶解液を結晶化させ、分枝鎖アミノ酸結晶を含む濃縮液を得る段階と、（ｃ）前記結晶化過程で生成された、水蒸気及びアンモニアを含む混合気体を得る段階と、（ｄ）前記得られた混合気体に由来するアンモニアを、前記（ａ）段階のアンモニアとして再使用する段階と、を含み、前記（ｂ）段階及び前記（ｃ）段階は、同時または順次に行われる、分枝鎖アミノ酸の結晶化方法によって生産された分枝鎖アミノ酸結晶を提供する。

前記分枝鎖アミノ酸の結晶化方法は、前述の通りである。

本出願による分枝鎖アミノ酸の結晶化方法は、分枝鎖アミノ酸の溶解度上昇のために最初に添加されたアンモニアを結晶化過程から蒸気状態で得て、それを再使用することにより、分枝鎖アミノ酸結晶の生産効率を向上させることができ、多量のｐＨ調節物質、及びさらなる中和工程が必要ではないので、生産コストが節減されうる。

また、本出願による分枝鎖アミノ酸の結晶化方法は、さらに持続可能な循環が困難である塩廃棄物の生成を低減させ、親環境的な方法としても活用される。

溶液のｐＨによる分枝鎖アミノ酸の溶解度変化を確認した結果である。

以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかしながら、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。また、本明細書に記載されていない内容は、本出願の技術分野または類似分野における熟練者であるならば、十分に認識して類推することができるものであるので、その説明を省略する。

実施例１．実験材料及び実験方法
（１）実験材料
分枝鎖アミノ酸は、純度９８％以上のＬ－バリン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－ロイシン製品を使用し、前記分枝鎖アミノ酸製品としては、いずれもＣＪ第一製糖製品を使用した。水は、、直接製造された三次蒸溜水を使用し、２６％（ｖ／ｖ）アンモニア水と、９８％（ｖ／ｖ）の硫酸は、大井化金社から購入して使用した。高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ：high-performance liquid chromatograph）分析のための０．１Ｍ硝酸水溶液、０．０２Ｍジピコリン酸水溶液は、Sigma-Aldrich（米国）から購入して使用した。

（２）分枝鎖アミノ酸溶解液の濃度、及び分枝鎖アミノ酸結晶の純度の分析
分枝鎖アミノ酸溶解液濃度、及び分枝鎖アミノ酸結晶純度の分析は、高性能液体クロマトグラフィ（model ＤＩＯＮＥＸ Ultimate ３０００ system、Thermo Scientific、米国）を利用して進め、分析条件は、次の通りである：
－カラム：Hypersil gold ＨＰＬＣ column（Thermo Scientific、米国）
－カラム温度：４０℃
－移動相：０．１ｗｔ％硫酸水溶液
－移動相速度：１．０ｍｌ／分
－感知器：蛍光検出器（fluorescence detector）

（３）分枝鎖アミノ酸溶解液内のアンモニア濃度の分析
分枝鎖アミノ酸溶解液内アンモニア濃度分析は、イオンクロマトグラフィ（model ９３０ compact ＩＣ Flex、Metrohm、スイス）を利用して進行め、分析条件は、次の通りである：
－カラム：Metrosep Ｃ４－１５０（Metrohm、スイス）
－カラム温度：２５℃
－移動相：０．７ｍＭ硝酸水溶液＋１．７ｍＭジピコリン酸水溶液
－移動相速度：１．０ｍｌ／分

（４）分枝鎖アミノ酸の溶解度の分析
分枝鎖アミノ酸の溶解度測定は、ガラス材質の１Ｌジャケット反応器において進めた。１Ｌジャケット反応器に、蒸溜水とアンモニア水ろを多様な比率で混ぜた後、過量の分枝鎖アミノ酸結晶を添加し、それらを撹拌することにより、分枝鎖アミノ酸結晶を含む反応液を製造した。その後、反応器の内部温度を冷凍／加熱循環装置（model Ｆ３５、Julabo、ドイツ）を使用し、３０℃に一定に維持しながら、そのような条件を、撹拌と共に１２時間以上維持した。その後、撹拌を止め、分枝鎖アミノ酸結晶がいずれも沈めば、透き通った状態の上澄み液一部を、０．４５μｍシリンジフィルタが装着されたシリンジサンプラに移し入れた。そのとき、当該溶液のｐＨを、ｐＨ測定器（model Ｓ２２０、Mettler Toledo、米国）を利用して測定した。当該サンプルの濃度は、定量フラスコを使用し、三次蒸溜水に希釈した後、ＨＰＬＣを利用して測定した。前記上澄み液サンプルの濃度を、溶解度で想定し、溶液のｐＨによる分枝鎖アミノ酸の溶解度変化を確認した（図１）。その結果、溶液のｐＨが９以上になる時点から、分枝鎖アミノ酸の溶解度が上昇するということを確認することができた。

実施例２．分枝鎖アミノ酸結晶を含む溶液での分離及び精製
（１）分枝鎖アミノ酸の結晶化、及びアンモニアの回収
結晶化は、各条件当たり同一工程条件で、総５回進めた。ただし、最初の結晶化工程においては、結晶化フィードを製造するために、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）結晶と蒸溜水とを混合し、製造されたＢＣＡＡ結晶を含む溶液にアンモニア水を添加し、ＢＣＡＡ結晶を全量溶解させた。その後の回数目においては、ＢＣＡＡ結晶を含む反応液に、回収されたアンモニア水を添加し、ＢＣＡＡ結晶を溶解させた（実験群）。なお、対照群としては、アンモニア水の回収過程なしに、ＢＣＡＡ結晶を含む反応液に、２６％（ｖ／ｖ）のアンモニア水を添加し、続けて９８％（ｖ／ｖ）の硫酸でｐＨを７に再調整した群を使用した。

結晶化及びアンモニアの回収は、結晶化フィードが注入される注入部、ｐＨ調節部、加熱循環器及び排出口を含む結晶化器；回収されたアンモニア水が注入される注入部、冷却循環器及び排出口を含む蒸気回収装置；及び結晶化器と蒸気回収装置との間に圧縮器を含む構造によってなる装置を使用した。具体的には、前記結晶化フィードは、最初の結晶化過程で得られた、分枝鎖アミノ酸結晶を含む濃縮液を意味し、該結晶化は、ガラス材質の２０Ｌジャケット反応器で進め、熱交換部におけるスケーリング防止のために、ジャケットは、内部液体の体積が１０Ｌになる地点の高さにまで設けた。該ジャケット部位は、冷凍／加熱循環装置（model Ｆ３５、Julabo、ドイツ）で温度が制御される三次蒸溜水で充填され、結晶化工程が進められる間、温度は８０℃に維持した。内部反応液などの撹拌は、テフロン（登録商標）材質の４－ブレードインペラ（blade impeller）でもって、回転速度調節が可能な撹拌器（model ＲＷ－２０、ＩＫＡ、ドイツ）を利用して進め、結晶化が進められる間、撹拌速度は、２００ｒｐｍを維持した。反応器内部の圧力低下は、配管に連結された圧縮器（compressor）を利用して進め、圧縮器と結晶化器との間には、圧力調節のための電子式真空制御器（model ＮＶＣ ２３００－Ａ、Eyela東京理化器械、日本）が設けられ、それらの圧力を調節した。結晶化器内部の圧力は、１００ｍｂａｒに維持した。アンモニア回収部は、２０ｂａｒまで保存可能なステンレス鋼材質の２０Ｌジャケット圧力容器によって構成し、自体設備に供給される４℃の冷却水で冷却を進めた。このとき、アンモニアの回収は、結晶化器内部のｐＨが５．５ないし８．０になるまで進めた。最終濃縮液の濃度は、アンモニアが投入される前のＢＣＡＡ結晶を含む反応液の濃度対比で、１．５倍になるように調節した。

（２）分枝鎖アミノ酸の結晶の分離及び乾燥
前記最終濃縮濃度に至れば、結晶化工程を終了させ、反応器内濃縮液を、下部に配された排出配管を介して回収した。その後、前述の回収された濃縮液をコットンフィルタが装着された遠心バスケット分離器（model Ｈ－１２２、コクサン、日本）を使用し、２，０００ｒｐｍの速度で５分間個液分離した。必要により、蒸溜水を利用し、分離初期に洗浄工程を進めた。その後、得られた湿晶（wet crystal）を、８０℃のオーブン乾燥器において、重さ変化がなくなるで乾燥させ、ＢＣＡＡ結晶を得た。

（３）実験結果
（３．１）Ｌ－ロイシンの結晶化及びアンモニアの回収
９８％以上純度のＬ－ロイシン結晶でもって製造された２０Ｌ懸濁液を利用し、Ｌ－ロイシンの結晶化及びアンモニア回収の実験を進めた。該実験は、総５回進め、当該実験結果において、２回目から５回目までの結晶化工程に係わる平均値を、表１に示した。３０ないし２００ｇ／ＬのＬ－ロイシン濃度範囲を有する反応液を対象に、回収されたアンモニア水を添加し、前記反応液のｐＨを９から１２の範囲に調整し、結晶の溶解を進め、その後、結晶化を進めながら、さらにアンモニア水を回収した。

下記表１に示されているように、対照群においては、回収されたアンモニア水がなかったが、一実施例による結晶化工程においては、９ないし２３％濃度のアンモニア水を、９７％以上の回収率でもって確保することができ、前述の回収されたアンモニア水は、反応液内Ｌ－ロイシン結晶を溶解するのに再使用することができた。

（３．２）Ｌ－イソロイシンの結晶化、及びアンモニアの回収
９８％以上純度のＬ－イソロイシン結晶で製造された２０Ｌ懸濁液を利用し、Ｌ－イソロイシンの結晶化及びアンモニア回収の実験を進めた。該実験は総５回進め、当該実験結果において、２回目から５回目までの結晶化工程に係わる平均値を表２に示した。５０ないし２５０ｇ／ＬのＬ－イソロイシン濃度範囲を有する反応液を対象に、回収されたアンモニア水を添加し、前記反応液のｐＨを９から１２の範囲に調整し、結晶の溶解を進め、その後、結晶化を進めながら、さらにアンモニア水を回収した。

下記表２に示されているように、対照群においては、回収されたアンモニア水がなかったが、一実施例による結晶化工程においては、９ないし２２％濃度のアンモニア水を、９７％以上の回収率でもって確保することができ、前述の回収されたアンモニア水は、反応液内Ｌ－イソロイシン結晶を溶解するのに再使用することができた。

（３．３）Ｌ－バリンの結晶化、及びアンモニアの回収
９８％以上純度のＬ－バリン結晶でもって製造された２０Ｌ懸濁液を利用し、Ｌ－バリンの結晶化及びアンモニア回収の実験を進めた。該実験は、総５回進め、当該実験結果において、２回目から５回目までの結晶化工程に係わる平均値を表３に示した。１２０ないし３５０ｇ／ＬのＬ－バリン濃度範囲を有する反応液を対象に、回収されたアンモニア水を添加し、前記反応液のｐＨを９から１２の範囲に調整し、結晶の溶解を進め、その後、結晶化を進めながら、さらにアンモニア水を回収した。

下記表３に示されているように、対照群においては、回収されたアンモニア水がなかったが、一実施例による結晶化工程においては、１３ないし２３％濃度のアンモニア水を、９８％以上の回収率でもって確保することができ、前述の回収されたアンモニア水は、反応液内Ｌ－バリン結晶を溶解するのに再使用することができた。

実施例３．分枝鎖アミノ酸の結晶を含む発酵液からの分離及び精製
（１）分枝鎖アミノ酸を含む発酵液の製造
Ｌ－ロイシンを生産する菌株であるコリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）変異株（受託番号：ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ）、Ｌ－イソロイシンを生産する菌株であるコリネバクテリウムグルタミクム変異株（受託番号：ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ）及びＬ－バリンを生産する菌株であるコリネバクテリウムグルタミクム変異株（受託番号：ＫＣＣＭ１１３３６Ｐ）を利用し、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－バリンをそれぞれ含む発酵液を製造した。

具体的には、前培養培地４０ｍＬを、５００ｍＬ振盪用三角フラスコに分注し、１２１℃で１５分間加圧殺菌した後、各菌株を植菌し、３３℃で２００ｒｐｍで撹拌させながら、回転撹拌培養器で２４時間培養した。その後、５Ｌ発酵槽に種培養培地３Ｌを充填し、１２１℃で３０分間加圧殺菌した後、ｐＨを７．０に調節し、前記前培養物４％を植菌し、３３℃で、８００ｒｐｍ及び通気量０．５ｖｖｍの条件で、ＯＤ値が２０になるまで培養し、種培養を行った。その後、５Ｌ発酵槽に、本培養培地２．１Ｌを充填し、１２１℃で３０分間加圧殺菌した後、ブドウ糖を０．６Ｌずつ添加し、アンモニアガスを利用し、ｐＨを７．０に調節した。前記種培養液を準備した本培養槽に２０％に植菌し、培養温度３３℃及び通気量１．０ｖｖｍの条件で溶存酸素が最小３０％以上維持されるように、４００ないし８００ｒｐｍまで調節しながら、４２時間培養し、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－バリンを含む各発酵液を製造した。前記培養過程に使用された前培養、種培養及び本培養の培地組成は、下記表４の通りである。

（２）分枝鎖アミノ酸の結晶の分離及び乾燥
ＢＣＡＡ結晶を含む溶液の代わりに、前述の製造されたＢＣＡＡ結晶を含む発酵液を利用し、実施例２の（１）及び（２）に記載したところと同一方法により、アンモニア添加、結晶化、ＢＣＡＡ結晶の分離及び乾燥を行い、それと共に、アンモニア添加段階と結晶化段階との間に、下記のように微細濾過段階と粉末活性炭添加段階とをさらに進めた。

具体的には、ＢＣＡＡ結晶が溶解された溶解液から、．１μｍ微細濾過膜が装着された微細濾過装置（model Pellicon ２、Merck、米国）を利用し、菌体のようなバイオマスを除去し、有色物質除去のために、前記透過液に、ＢＣＡＡ対比で、１０ｗｔ％の粉末活性炭（model ＹＬ３０３、Yuanli、中国）を添加した後、６０℃で３０分間撹拌した。その後、７μｍ濾過膜を利用した一次真空濾過を介し、前記ＢＣＡＡ溶解液から活性炭を除去し、０．４５μｍ濾過膜を利用した二次真空濾過を介し、残留活性炭をさらに除去した。

（３）実験結果
（３．１）Ｌ－ロイシンの精製
前述の実施例３の（１）で製造された、Ｌ－ロイシン結晶を含むＬ－ロイシン濃度６０ｇ／Ｌの発酵液から、Ｌ－ロイシン精製を５回反復して行った。Ｌ－ロイシン結晶を含む発酵液２０Ｌに、回収されたアンモニア水（ただし、最初には、アンモニア水試薬）を添加し、ｐＨを１０まで調整し、Ｌ－ロイシンを全量溶解させた後、微細濾過を介し、バイオマスを除去した。その後、微細濾過透過液に、粉末活性炭処理を進め、有色物質を分離した。その後、濾過液を対象に、濃縮結晶化を９０ｇ／Ｌの濃度まで進め、Ｌ－ロイシン結晶を含む濃縮液は、バスケット濾過器を利用し、個液分離した。このとき、洗浄は、Ｌ－ロイシン結晶を含む濃縮液基準で、２０ｖｏｌ％の三次蒸溜水を利用して行った。

その後、乾燥を介して最終回収された結晶の重さは、５回平均１．１ｋｇであり、結晶の純度は、５回平均９８．４％であった。一実施例による結晶化工程においては、１３％濃度のアンモニア水を、９８％以上の回収率でもって確保することができ、前述の回収されたアンモニア水は、発酵液内Ｌ－ロイシン結晶を溶解するのに再使用することができた。

（３．２）Ｌ－イソロイシンの精製
前述の実施例３の（１）から製造された、Ｌ－イソロイシン結晶を含むＬ－イソロイシン濃度９０ｇ／Ｌの発酵液から、Ｌ－イソロイシン精製を５回反復して行った。Ｌ－イソロイシン結晶を含む発酵液２０Ｌに、回収されたアンモニア水（ただし、最初には、アンモニア水試薬）を添加し、ｐＨを１０まで調整し、Ｌ－イソロイシンを全量溶解させた後、微細濾過を介し、バイオマスを除去した。その後、微細濾過透過液に、粉末活性炭処理を進め、有色物質を分離した。その後、濾過液を対象に、濃縮結晶化を１３５ｇ／Ｌの濃度まで進め、Ｌ－イソロイシン結晶を含む濃縮液は、バスケット濾過器を利用し、個液分離した。このとき、洗浄は、Ｌ－イソロイシン結晶を含む濃縮液基準で、２０ｖｏｌ％の三次蒸溜水を利用して行った。

その後、乾燥を介して最終回収された結晶の重さは、５回平均１．７ｋｇであり、結晶の純度は、５回平均９８．６％であった。一実施例による結晶化工程においては、１３％濃度のアンモニア水を、９８％以上の回収率でもって確保することができ、前述の回収されたアンモニア水は、発酵液内Ｌ－イソロイシン結晶を溶解するのに再使用することができた。

（３．３）Ｌ－バリンの精製
前述の実施例３の（１）から製造された、Ｌ－バリン結晶を含むＬ－バリン濃度１５０ｇ／Ｌの発酵液から、Ｌ－バリン精製を５回反復して行った。Ｌ－バリン結晶を含む発酵液２０Ｌに、回収されたアンモニア水（ただし、最初には、アンモニア水試薬）を添加し、ｐＨを１０まで調整し、Ｌ－バリンを全量溶解させた後、微細濾過を介し、バイオマスを除去した。その後、微細濾過透過液に、粉末活性炭処理を進め、有色物質を分離した。その後、濾過液を対象に、濃縮結晶化を２２５ｇ／Ｌの濃度まで進め、Ｌ－バリン結晶を含む濃縮液は、バスケット濾過器を利用し、個液分離した。このとき、洗浄は、Ｌ－バリン結晶を含む濃縮液基準に、２０ｖｏｌ％の三次蒸溜水を利用して行った。

その後、乾燥を介して最終回収された結晶の重さは、５回平均３．０ｋｇであり、結晶の純度は、５回平均９８．４％であった。一実施例による結晶化工程においては、１３％濃度のアンモニア水を、９８％以上の回収率でもって確保することができ、前述の回収されたアンモニア水は、発酵液内Ｌ－バリン結晶を溶解するのに再使用することができた。

前述の本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の当業者であるならば、本発明の技術的思想や必須な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易に変形が可能であるということを理解することができるであろう。従って、以上で記述された実施例は、全ての面において例示的なものであり、限定的ではないと理解されなければならない。

Claims (12)

1. （ａ）分枝鎖アミノ酸結晶を含む反応液と、アンモニアとを混合し、前記分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液を得る段階と、
   （ｂ）前記得られた溶解液を結晶化させ、分枝鎖アミノ酸結晶を含む濃縮液を得る段階と、
   （ｃ）前記結晶化過程で生成された、水蒸気及びアンモニアを含む混合気体を得る段階と、
   （ｄ）前記得られた混合気体に由来するアンモニアを、前記（ａ）段階のアンモニアとして再使用する段階と、を含み、
   前記（ｂ）段階及び前記（ｃ）段階は、同時または順次に行われる、分枝鎖アミノ酸の結晶化方法。
2. 前記分枝鎖アミノ酸は、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－バリンからなる群のうちから選択される少なくとも１つのアミノ酸である、請求項１に記載の分枝鎖アミノ酸の結晶化方法。
3. 前記分枝鎖アミノ酸結晶を含む反応液は、分枝鎖アミノ酸結晶を含む溶液または発酵液を含む、請求項１に記載の分枝鎖アミノ酸の結晶化方法。
4. 前記分枝鎖アミノ酸結晶を含む発酵液は、分枝鎖アミノ酸を生産する微生物を培地で培養して得られる、請求項３に記載の分枝鎖アミノ酸の結晶化方法。
5. 前記（ａ）段階において、前記分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液のｐＨは、９ないし１２である、請求項１に記載の分枝鎖アミノ酸の結晶化方法。
6. 前記（ｂ）段階の分枝鎖アミノ酸結晶を含む濃縮液の分枝鎖アミノ酸濃度は、（ａ）段階の分枝鎖アミノ酸結晶を含む反応液の分枝鎖アミノ酸濃度対比で、１．３ないし１．７倍である、請求項１に記載の分枝鎖アミノ酸の結晶化方法。
7. 前記（ｃ）段階は、前記（ｂ）段階の分枝鎖アミノ酸溶解液のｐＨが５．５ないし８．０になるまで行う、請求項１に記載の分枝鎖アミノ酸の結晶化方法。
8. 前記（ｄ）段階は、前記アンモニアを蒸気状態で再使用するか、あるいは前記蒸気が圧縮または凝縮された液体状態で再使用する、請求項１に記載の分枝鎖アミノ酸の結晶化方法。
9. 前記（ａ）段階と前記（ｂ）段階との間に、
   （ａ－１）前記分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液を微細濾過し、溶解液内バイオマスを除去する段階をさらに含む、請求項１に記載の分枝鎖アミノ酸の結晶化方法。
10. 前記（ａ）段階と前記（ｂ）段階との間に、
    （ａ－２）前記分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液に活性炭を添加し、溶解液内の有色物質を除去する段階をさらに含む、請求項１に記載の分枝鎖アミノ酸の結晶化方法。
11. 前記（ｂ）段階後、
    （ｅ）前記（ｂ）段階の分枝鎖アミノ酸結晶を含む濃縮液から、分枝鎖アミノ酸結晶を分離する段階をさらに含む、請求項１に記載の分枝鎖アミノ酸の結晶化方法。
12. （ａ）分枝鎖アミノ酸結晶を含む反応液と、アンモニアとを混合し、前記分枝鎖アミノ酸結晶が溶解された溶解液を得る段階と、
    （ｂ）前記得られた溶解液を結晶化させ、分枝鎖アミノ酸結晶を含む濃縮液を得る段階と、
    （ｃ）前記結晶化過程で生成された、水蒸気及びアンモニアを含む混合気体を得る段階と、
    （ｄ）前記得られた混合気体に由来するアンモニアを、前記（ａ）段階のアンモニアとして再使用する段階と、を含み、
    前記（ｂ）段階及び前記（ｃ）段階は、同時または順次に実施される、分枝鎖アミノ酸の結晶化方法によって生産された分枝鎖アミノ酸の結晶。

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