CN108707083B - 一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明的方法利用四阶段变温结晶代替常规结晶技术，将支链氨酸盐酸盐清液先第二次降温至60～80℃进行初步结晶，然后于60～65℃恒温条件下进行恒温养晶，再第三次降温至50～55℃进行二次结晶，最后第四次降温至10～30℃进行终结晶，得到支链氨基酸及其盐酸盐成品；利用本发明的方法制备得到的支链氨基酸及其盐酸盐成品回收率可高达90.1％、支链氨基酸纯度可高达99.9％。
Description
技术领域
本发明涉及一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
支链氨基酸是指蛋白质中的三种常见氨基酸，由亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸组成。这类氨基酸可以促进胰岛素释放以及促进生长激素释放这两种特殊方式促进人体合成代谢、加快人体肌肉增长。因此，支链氨基酸在运动补剂以及保健品中有巨大的市场。
现在，支链氨基酸的生产主要依靠微生物发酵，但是，微生物发酵过程中还会产生其他氨基酸，这些氨基酸尤其是中性氨基酸(例如亮氨基酸)的分子量和化学等电点跟支链氨基酸非常接近，造成了微生物发酵生产支链氨基酸过程中的产酸水平低、杂酸含量高等问题。
目前，常采用离子交换法来提取微生物那发酵液中的支链氨基酸，但是，离子交换工艺并不能分离杂酸且存在许多缺陷，例如，离子交换工艺步骤复杂，需要再生和洗脱；离子交换工艺的再生过程中会用到大量的酸和碱，使得产品纯度低且得率低；离子交换工艺在洗脱和再生后会有大量铵氮废液产生，不仅会因消耗大量的酸碱而花费大量的资金，而且会对环境造成很大的污染，同时，洗脱过程又会消耗大量的水。
因此，分离技术的落后限制了支链氨基酸的规模生产，且由于支链氨基酸产品中的其他氨基酸难以去除，国内原料药高端产品不能满足欧盟标准，所以无法进入国际市场参与原料药的竞争。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法。此方法利用四阶段变温结晶代替常规结晶技术，将支链氨酸盐酸盐清液先第二次降温至60～80℃进行初步结晶，然后于60～65℃恒温条件下进行恒温养晶，再第三次降温至50～55℃进行二次结晶，最后第四次降温至10～30℃进行终结晶，得到支链氨基酸及其盐酸盐成品；此方法制备得到的支链氨基酸及其盐酸盐成品回收率可高达90.1％、支链氨基酸纯度可高达99.9％。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法，所述方法为将支链氨基酸发酵液进行除菌、浓缩、干燥，得到支链氨基酸粗品；将支链氨基酸粗品按照一定的比例加入盐酸中，于80～90℃进行第一次溶解，得到支链氨基酸粗溶液；将支链氨基酸粗溶液第一次降温至10～30℃后进行过滤，得到支链氨基酸盐酸盐；将支链氨基酸盐酸盐按照一定的比例加入水中，于80～90℃进行第二次溶解，得到支链氨基酸盐酸盐溶液；将支链氨基酸盐酸盐溶液经纳滤膜、离子交换膜、电渗析膜进行过滤脱盐，得到支链氨酸盐酸盐清液；将支链氨酸盐酸盐清液先第二次降温至60～80℃进行初步结晶，然后于60～65℃恒温条件下进行恒温养晶，再第三次降温至50～55℃进行二次结晶，最后第四次降温至10～30℃进行终结晶，得到支链氨基酸及其盐酸盐成品。
在本发明的一种实施方式中，所述除菌为过滤除菌。
在本发明的一种实施方式中，所述浓缩为将支链氨酸发酵液浓缩至5～10倍。
在本发明的一种实施方式中，所述浓缩为将支链氨酸发酵液浓缩至5倍。
在本发明的一种实施方式中，所述干燥为喷雾干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述支链氨基酸粗品与盐酸的质量比为1:2～5。
在本发明的一种实施方式中，所述支链氨基酸粗品与盐酸的质量比为1:3。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次溶解、第二次溶解的温度均为80℃。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次降温的温度为25℃。
在本发明的一种实施方式中，所述支链氨基酸盐酸盐溶液的浓度为3～7％。
在本发明的一种实施方式中，所述支链氨基酸盐酸盐溶液的浓度为4％、5％或7％。
在本发明的一种实施方式中，其特征在于，所述第二次降温的温度为60℃。
在本发明的一种实施方式中，所述第二次降温的时间为15～30min。
在本发明的一种实施方式中，所述第二次降温的时间为20min。
在本发明的一种实施方式中，所述恒温养晶的温度为60℃。
在本发明的一种实施方式中，所述恒温养晶的时间为1～2h。
在本发明的一种实施方式中，所述恒温养晶的时间为2h。
在本发明的一种实施方式中，所述第三次降温的温度为50℃。
在本发明的一种实施方式中，所述第三次降温的时间为4～5h。
在本发明的一种实施方式中，所述第三次降温的时间为4h。
在本发明的一种实施方式中，所述第四次降温的温度为20℃。
在本发明的一种实施方式中，所述第四次降温的时间为15～30min。
在本发明的一种实施方式中，所述第四次降温的时间为20min。
本发明提供了应用上述一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法生产得到的支链氨基酸及其盐酸盐。
本发明提供了上述一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法在生产支链氨基酸及其盐酸盐方面的应用。
有益效果：
(1)本发明利用四阶段变温结晶代替常规结晶技术，将支链氨酸盐酸盐清液先第二次降温至60～80℃进行初步结晶，然后于60～65℃恒温条件下进行恒温养晶，再第三次降温至50～55℃进行二次结晶，最后第四次降温至10～30℃进行终结晶，使得得到的支链氨基酸及其盐酸盐成品回收率可高达90.1％、支链氨基酸纯度可高达99.9％；
(2)本发明利用多膜组合技术脱盐取代传统离子交换技术，减少酸碱消耗，减少废水排放，实现了清洁生产和节能减排，有效的解决离子交换树脂再生酸碱的用量及盐污染的问题，并降低水耗。
具体实施方式
下面结合实施例与对比例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
支链氨基酸收率检测方法：
收率＝产品质量/(发酵液中的氨基酸浓度*体积)
支链氨基酸纯度检测方法：
取本品约0.1g，精密称定，加无水甲酸1ml溶解后，加冰醋酸25ml，照点位滴定法，用高氯酸滴定液滴定，将滴定的结果用空白试验校正，每1ml高氯酸滴定液相当于13.12mg。
实施例1：缬氨酸的分离纯化
具体步骤如下：
(1)将缬氨酸发酵液进行过滤除菌并浓缩至5倍，然后将浓缩后的发酵液进行喷雾干燥，得到缬氨酸粗品；
(2)将缬氨酸粗品与盐酸按照1:3的质量比进行混合，于80℃进行第一次溶解，得到缬氨酸粗溶液；
(3)将缬氨酸粗溶液第一次降温至25℃后进行过滤，得到缬氨酸盐酸盐；
(4)将缬氨酸盐酸盐按照一定的比例加入水中，于80℃进行第二次溶解，得到浓度为5％的缬氨酸盐酸盐溶液；
(5)将缬氨酸盐酸盐溶液经纳滤膜、离子交换膜、电渗析膜进行过滤脱盐，得到缬氨酸盐酸盐清液；
(6)将缬氨酸盐酸盐清液先第二次降温至60℃进行初步结晶(降温时间20min)，然后于60℃恒温条件下进行恒温养晶(恒温时间2h)，再第三次降温至50℃进行二次结晶(降温时间4h)，最后第四次降温至20℃进行终结晶(降温时间20min)，得到缬氨酸及其盐酸盐成品。
将得到的缬氨酸及其盐酸盐成品进行回收率及纯度检测。
检测结果为：回收率90.1％、纯度99.9％。
实施例2：异亮氨酸的分离纯化
具体步骤如下：
(1)将异亮氨酸发酵液进行过滤除菌并浓缩至5倍，然后将浓缩后的发酵液进行喷雾干燥，得到异亮氨酸粗品；
(2)将异亮氨酸粗品与盐酸按照1:3的质量比进行混合，于80℃进行第一次溶解，得到异亮氨酸粗溶液；
(3)将异亮氨酸粗溶液第一次降温至25℃后进行过滤，得到异亮氨酸盐酸盐；
(4)将异亮氨酸盐酸盐按照一定的比例加入水中，于80℃进行第二次溶解，得到浓度为7％的异亮氨酸盐酸盐溶液；
(5)将异亮氨酸盐酸盐溶液经纳滤膜、离子交换膜、电渗析膜进行过滤脱盐，得到异亮氨酸盐酸盐清液；
(6)将异亮氨酸盐酸盐清液先第二次降温至60℃进行初步结晶(降温时间20min)，然后于60℃恒温条件下进行恒温养晶(恒温时间2h)，再第三次降温至50℃进行二次结晶(降温时间4h)，最后第四次降温至20℃进行终结晶(降温时间20min)，得到异亮氨酸及其盐酸盐成品。
将得到的异亮氨酸及其盐酸盐成品进行回收率及纯度检测。
检测结果为：回收率89.6％、纯度99.8％。
实施例3：异亮氨酸的分离纯化
具体步骤如下：
(1)将亮氨酸发酵液进行过滤除菌并浓缩至5倍，然后将浓缩后的发酵液进行喷雾干燥，得到亮氨酸粗品；
(2)将亮氨酸粗品与盐酸按照1:3的质量比进行混合，于80℃进行第一次溶解，得到亮氨酸粗溶液；
(3)将亮氨酸粗溶液第一次降温至25℃后进行过滤，得到亮氨酸盐酸盐；
(4)将亮氨酸盐酸盐按照一定的比例加入水中，于80℃进行第二次溶解，得到浓度为4％的亮氨酸盐酸盐溶液；
(5)将亮氨酸盐酸盐溶液经纳滤膜、离子交换膜、电渗析膜进行过滤脱盐，得到亮氨酸盐酸盐清液；
(6)将亮氨酸盐酸盐清液先第二次降温至60℃进行初步结晶(降温时间20min)，然后于60℃恒温条件下进行恒温养晶(恒温时间2h)，再第三次降温至50℃进行二次结晶(降温时间4h)，最后第四次降温至20℃进行终结晶(降温时间20min)，得到亮氨酸及其盐酸盐成品。
将得到的亮氨酸及其盐酸盐成品进行回收率及纯度检测。
检测结果为：回收率89.7％、纯度99.9％。
对比例1：缬氨酸的分离纯化
具体步骤如下：
(1)将缬氨酸发酵液进行过滤除菌并浓缩至5倍，然后将浓缩后的发酵液进行喷雾干燥，得到缬氨酸粗品；
(2)将缬氨酸粗品与盐酸按照1:3的质量比进行混合，于80℃进行第一次溶解，得到缬氨酸粗溶液；
(3)将缬氨酸粗溶液第一次降温至25℃后进行过滤，得到缬氨酸盐酸盐；
(4)将缬氨酸盐酸盐按照一定的比例加入水中，于80℃进行第二次溶解，得到浓度为5％的缬氨酸盐酸盐溶液；
(5)将缬氨酸盐酸盐溶液经纳滤膜、离子交换膜、电渗析膜进行过滤脱盐，得到缬氨酸盐酸盐清液；
(6)将缬氨酸盐酸盐清液降温至50℃后于50℃进行恒温结晶(降温时间2h、结晶时间4h)，得到缬氨酸及其盐酸盐成品。
将得到的缬氨酸及其盐酸盐成品进行回收率及纯度检测。
检测结果为：回收率74.2％、纯度99.6％。
对比例2：缬氨酸的分离纯化
具体步骤如下：
(1)将缬氨酸发酵液进行过滤除菌并浓缩至5倍，然后将浓缩后的发酵液进行喷雾干燥，得到缬氨酸粗品；
(2)将缬氨酸粗品与盐酸按照1:3的质量比进行混合，于80℃进行第一次溶解，得到缬氨酸粗溶液；
(3)将缬氨酸粗溶液第一次降温至25℃后进行过滤，得到缬氨酸盐酸盐；
(4)将缬氨酸盐酸盐按照一定的比例加入水中，于80℃进行第二次溶解，得到浓度为5％的缬氨酸盐酸盐溶液；
(5)将缬氨酸盐酸盐溶液经纳滤膜、离子交换膜、电渗析膜进行过滤脱盐，得到缬氨酸盐酸盐清液；
(6)将缬氨酸盐酸盐清液先第二次降温至60℃进行初步结晶(降温时间20min)，然后于60℃恒温条件下进行恒温养晶(恒温时间2h)，再第三次降温至50℃进行终结晶(降温时间4h)，得到缬氨酸及其盐酸盐成品。
将得到的缬氨酸及其盐酸盐成品进行回收率及纯度检测。
检测结果为：回收率83.6％、纯度99.6％。
对比例3：缬氨酸的分离纯化
具体步骤如下：
(1)将缬氨酸发酵液进行过滤除菌并浓缩至5倍，然后将浓缩后的发酵液进行喷雾干燥，得到缬氨酸粗品；
(2)将缬氨酸粗品与盐酸按照1:3的质量比进行混合，于80℃进行第一次溶解，得到缬氨酸粗溶液；
(3)将缬氨酸粗溶液第一次降温至25℃后进行过滤，得到缬氨酸盐酸盐；
(4)将缬氨酸盐酸盐按照一定的比例加入水中，于80℃进行第二次溶解，得到浓度为5％的缬氨酸盐酸盐溶液；
(5)将缬氨酸盐酸盐溶液经纳滤膜、离子交换膜、电渗析膜进行过滤脱盐，得到缬氨酸盐酸盐清液；
(6)将缬氨酸盐酸盐清液先第二次降温至60℃进行初步结晶(降温时间1h)，然后于60℃恒温条件下进行恒温养晶(恒温时间2h)，再第三次降温至50℃进行二次结晶(降温时间4h)，最后第四次降温至20℃进行终结晶(降温时间20min)，得到缬氨酸及其盐酸盐成品。
将得到的缬氨酸及其盐酸盐成品进行回收率及纯度检测。
检测结果为：回收率84.3％、纯度99.9％。
对比例4：缬氨酸的分离纯化
具体步骤如下：
(1)将缬氨酸发酵液进行过滤除菌并浓缩至5倍，然后将浓缩后的发酵液进行喷雾干燥，得到缬氨酸粗品；
(2)将缬氨酸粗品与盐酸按照1:3的质量比进行混合，于80℃进行第一次溶解，得到缬氨酸粗溶液；
(3)将缬氨酸粗溶液第一次降温至25℃后进行过滤，得到缬氨酸盐酸盐；
(4)将缬氨酸盐酸盐按照一定的比例加入水中，于80℃进行第二次溶解，得到浓度为5％的缬氨酸盐酸盐溶液；
(5)将缬氨酸盐酸盐溶液经纳滤膜、离子交换膜、电渗析膜进行过滤脱盐，得到缬氨酸盐酸盐清液；
(6)将缬氨酸盐酸盐清液于60℃恒温条件下进行恒温养晶(恒温时间2h)，再第二次降温至50℃进行初步结晶(降温时间4h)，最后第三次降温至20℃进行终结晶(降温时间20min)，得到缬氨酸及其盐酸盐成品。
将得到的缬氨酸及其盐酸盐成品进行回收率及纯度检测。
检测结果为：回收率80.2％、纯度99.9％。
对比例5：缬氨酸的分离纯化
具体步骤如下：
(1)将缬氨酸发酵液进行过滤除菌并浓缩至5倍，然后将浓缩后的发酵液进行喷雾干燥，得到缬氨酸粗品；
(2)将缬氨酸粗品与盐酸按照1:3的质量比进行混合，于80℃进行第一次溶解，得到缬氨酸粗溶液；
(3)将缬氨酸粗溶液第一次降温至25℃后进行过滤，得到缬氨酸盐酸盐；
(4)将缬氨酸盐酸盐按照一定的比例加入水中，于80℃进行第二次溶解，得到浓度为5％的缬氨酸盐酸盐溶液；
(5)将缬氨酸盐酸盐溶液经纳滤膜、离子交换膜、电渗析膜进行过滤脱盐，得到缬氨酸盐酸盐清液；
(6)将缬氨酸盐酸盐清液先第二次降温至60℃进行初步结晶(降温时间20min)，然后第三次降温至50℃进行二次结晶(降温时间4h)，最后第四次降温至20℃进行终结晶(降温时间20min)，得到缬氨酸及其盐酸盐成品。
将得到的缬氨酸及其盐酸盐成品进行回收率及纯度检测。
检测结果为：回收率79.9％、纯度99.9％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法，其特征在于，所述方法为将支链氨基酸发酵液进行除菌、浓缩、干燥，得到支链氨基酸粗品；将支链氨基酸粗品按照一定的比例加入盐酸中，于80～90℃进行第一次溶解，得到支链氨基酸粗溶液；将支链氨基酸粗溶液第一次降温至10～30℃后进行过滤，得到支链氨基酸盐酸盐；将支链氨基酸盐酸盐按照一定的比例加入水中，于80～90℃进行第二次溶解，得到支链氨基酸盐酸盐溶液；将支链氨基酸盐酸盐溶液经纳滤膜、离子交换膜、电渗析膜进行过滤脱盐，得到支链氨酸盐酸盐清液；将支链氨酸盐酸盐清液先第二次降温至60～80℃进行初步结晶，然后于60～65℃恒温条件下进行恒温养晶，再第三次降温至50～55℃进行二次结晶，最后第四次降温至10～30℃进行终结晶，得到支链氨基酸及其盐酸盐成品；
其中，所述第二次降温的时间为15～30min；所述恒温养晶的时间为1～2h；所述第三次降温的时间为4～5h。
2.如权利要求1所述的一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法，其特征在于，所述支链氨基酸粗品与盐酸的质量比为1:2～5。
3.如权利要求1或2所述的一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法，其特征在于，所述支链氨基酸盐酸盐溶液的浓度为3～7％。
4.如权利要求1或2所述的一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法，其特征在于，所述第二次降温的温度为60℃。
5.如权利要求3所述的一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法，其特征在于，所述第二次降温的温度为60℃。
6.如权利要求1、2、5任一项所述的一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法，其特征在于，所述恒温养晶的温度为60℃。
7.如权利要求3所述的一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法，其特征在于，所述恒温养晶的温度为60℃。
8.如权利要求4所述的一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法，其特征在于，所述恒温养晶的温度为60℃。
9.权利要求1-8任一项所述的一种从发酵液中分离纯化支链氨基酸的方法在生产支链氨基酸及其盐酸盐方面的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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