CN107083407B - 一种l-苹果酸的制备、分离以及除杂纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵技术领域，公开了一种L‑苹果酸的制备、分离以及除杂纯化方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）通透化处理，步骤3）分离、除杂，步骤4）纯化。本发明方法制得苹果酸产量大，除杂纯化后产品收率和纯度高。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种L-苹果酸的制备、分离以及除杂纯化方法。
背景技术
苹果酸,又名羟基丁二酸、羟基琥珀酸或1-羟基乙烷二羧酸,分子式为C4H6O5，分子量134.09，结构式为HOOCCHOHCH2COOH。苹果酸具有右旋（D-型）和左旋（L-型）两种旋光异构体及DL-型外消旋体三种型式产品。L—苹果酸用途广泛。
L-苹果酸为天然果汁之重要成份，味道柔和，具特殊香味，不损害口腔与牙齿，代谢上有利于氨基酸吸收，不积累脂肪，是新一代的食品酸味剂，被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂” 。目前在老年及儿童食品中正取代柠檬酸。L—苹果酸是人体必需的一种有机酸，也是一种低热量的理想食品添加剂。L-苹果酸是生物体三羧酸的循环中间体，口感接近天然果汁并具有天然香味，与柠檬酸相比，产生的热量更低，口味更好，因此广泛应用于酒类、饮料、果酱、口香糖等多种食品中，并有逐渐替代柠檬酸的势头。是目前世界食品工业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。L－苹果酸中含有天然的润肤成分，能够很容易地溶解粘结在干燥鳞片状的死细胞之间的“胶粘物”，从而可以清除皮肤表面皱纹，使皮肤变得嫩白、光洁而有弹性，因此在化妆品配方中备受青睐。L－苹果酸可用于药物制剂、片剂、糖浆中，还可以配入氨基酸溶液中，能明显提高氨基酸的吸收率；L－苹果酸可以用于治疗肝病、贫血、免疫力低下、尿毒症、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用；还可用于制备和合成驱虫剂、抗牙垢剂等。另外L－苹果酸还可以作为工业清洗剂、树脂固化剂、合成材料增塑剂、饲料添加剂等。
随着氨基酸行业逐步发展，发酵法生产技术L-苹果酸也有了长足的进步，但是L-苹果酸的发酵产量较低，转化率不彻底。申请人之前的发明专利“一种直接发酵法生产L-苹果酸的方法”以及“一种L-苹果酸提取新工艺”通过优化工艺以及菌株合理配伍，大幅度提高了苹果酸的产量以及糖酸转化率，但是黄曲霉会产生一定量的黄曲霉素，产品中会残留黄曲霉毒素，后续分离步骤繁琐，增加了企业成本。鉴于上述缺陷，申请人之前的专利技术“一种制备L-苹果酸的方法”采用米曲霉发酵来制备苹果酸，其采用混合发酵的方式，取得了较好的苹果酸产率；申请人之前的专利技术“一种L-苹果酸提取新工艺”采用中和与酸解以及离子交换与低温浓缩结晶等步骤对苹果酸进行分离纯化，苹果酸纯度可达到99%，但是步骤较为繁琐，而且操作成本高。本发明在该专利技术的基础上对发酵培养进行了改进，旨在于进一步提高苹果酸的产率，并且对苹果酸进行除杂纯化，提高工业附加值。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种L-苹果酸的制备、分离以及除杂纯化方法，该方法制得苹果酸产量大，除杂纯化后产品收率和纯度高。
本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：
一种L-苹果酸的制备、分离以及除杂纯化方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）通透化处理，步骤3）分离、除杂，步骤4）纯化。
具体地，所述方法包括如下步骤：
步骤1）发酵：按照米曲霉种子液∶发酵罐培养基为1∶8的体积比例转入发酵罐中培养，温度32℃，培养40h；
步骤2）通透化处理：往步骤1）所得发酵液中添加碳酸钙和CTAB，继续发酵40h，然后控制温度为39℃，压强为2个大气压，保温保压发酵6h，停止发酵，得到L-苹果酸发酵液；发酵过程中，控制pH在6.2；并通过流加葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0wt％；
步骤3）分离、除杂：将L-苹果酸发酵液2000rpm离心10min，去除沉淀，收集上清液，微滤膜过滤，截留分子量为10000Da，微滤温度为32℃；滤过液再进行超滤，截留分子量为1000Da，超滤温度为32℃，收集透过液；
步骤4）纯化：步骤3）所得将透过液通过装填有强碱弱酸型两性离子交换树脂的色谱柱，然后洗脱吸附于树脂上的苹果酸，将得到的洗脱液减压蒸馏，真空干燥，得到L-苹果酸。
优选地，米曲霉种子液的浓度为1×1010CFU/mL；
优选地，所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/L，葡萄糖60g/L，木糖50 g/L，玉米浆12g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，pH值6.2。
优选地，所述碳酸钙的添加量为80g/L，所述CTAB的添加量为40mg/L。
本发明的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：
本发明对现有苹果酸发酵菌株进行通透化处理，提高了苹果酸的产率；本发明在发酵末期通过提高培养温度，可增加分子扩散的速度；
发酵末期通过增加压力对细胞的挤压作用增强,细胞表面发生轻微变形,细胞膜的通透性增加；
培养过程后期加入合适剂量的CTAB，干扰细胞壁的合成，改善菌体细胞壁和细胞膜对催化反应中底物和产物的传质限制，同时调整合适的浓度，避免终浓度过低，达不到透性化改造的目的，终浓度过高则可能导致细胞死亡或生长停滞；
本发明通过添加CTAB结合温度压强的改变，实现菌株培养与透性化处理的耦合，可以在不需要对培养好的细胞进行后续透性化处理的情况下减小菌体细胞壁和细胞膜对底物和产物的传质限制，避免后续透性化处理细胞的步骤及相关设备运转的投入，为提高苹果酸产量提供了一个简便方法；
本发明发酵工艺中添加碳酸钙来维持培养液中碳酸钙的浓度，提高了米曲霉的发酵效率；本发明发酵液中L-苹果酸产品的分离、除杂纯化工艺简单可行，收率和纯度高，生产成本低，可规模化生产；
本发明纯化得到的L-苹果酸产品为白色结晶粉末，收率和纯度高，提高了工业附加值。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种L-苹果酸的制备、分离以及除杂纯化方法，其包括如下步骤：
按照米曲霉种子液（浓度为1×1010CFU/mL)∶发酵罐培养基为1∶8的体积比例转入发酵罐中培养，温度32℃，培养40h，然后添加碳酸钙和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，碳酸钙的添加量为80g/L，CTAB的添加量为40mg/L，继续发酵4h，然后控制温度为39℃，压强为2个大气压，保温保压发酵6h，停止发酵，得到L-苹果酸发酵液；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.2；并通过流加浓度为200g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％；所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/L，葡萄糖60g/L，木糖50 g/L，玉米浆12g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，pH值6.2；所述米曲霉为米曲霉(Aspergillus oryzae) ACCC 30584。
将L-苹果酸发酵液2000rpm离心10min，去除沉淀，收集上清液，微滤膜过滤，截留分子量为10000Da，微滤温度为32℃；滤过液再进行超滤，截留分子量为1000Da，超滤温度为32℃，收集透过液，将透过液通过装填有强碱弱酸型两性离子交换树脂的色谱柱，然后洗脱吸附于树脂上的苹果酸，将得到的洗脱液减压蒸馏，真空干燥，得到L-苹果酸。上述L-苹果酸经检测，产品纯度为99%以上，硫酸盐、氯化物、透光率、重金属含量等相关指标均符合相关标准要求。
实施例2
各因素对米曲霉发酵液中苹果酸产量的影响：
L-苹果酸的测定：采用2,7—萘二酚显色法，取样品溶液1.0 mL，加入6.0 mL分析纯的浓硫酸，再加入0.1 mL 2,7—萘二酚溶液，接着在100℃水浴中加热20 min，取出待冷却至室温后，于385 nm下进行比色测定，以蒸馏水作对照校正仪器零点。用标准样品先作标准曲线，以苹果酸含量为横坐标，385 nm处吸收值即OD385为纵坐标，通过未知样品在385nm处的OD值，则可在标准曲线上查得相应的苹果酸含量。
设置对照组，其中，对照组1：不提高温度和压强，其余同实施例1；对照组2：不添加CTAB，其余同实施例1；试验组为实施例1。各组别发酵液中苹果酸的产量见表1：
表1
| 组别 | 对照组1 | 对照组2 | 实施例1 |
| 苹果酸产量（g/L） | 82.1 | 93.7 | 128.9 |
实施例3
1、CTAB梯度试验：
以实施例1为例，检测了CTAB的添加时间对产酸量的影响，具体见表2：
表2
| 时间h | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 |
| 苹果酸产量（g/L） | 104.5 | 113.6 | 117.4 | 128.9 | 124.9 | 118.3 |
2、压强梯度试验：针对发酵末期6小时，选择1-5大气压进行测试，其余实验流程同实施例1，具体发酵结果见表3：
表3
| 大气压强度 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 苹果酸产量（g/L） | 113.5 | 128.9 | 124.3 | 109.6 | 98.7 |
3、温度梯度试验：针对发酵末期6小时内，选择33-43℃进行测试，其余实验流程同实施例1，具体发酵结果见表4：
表4
| 温度℃ | 32 | 36 | 39 | 41 | 43 |
| 酸产量（g/L） | 101.3 | 112.4 | 128.9 | 113.5 | 98.6 |
结论：适当提高温度和压强可以增加米曲霉细胞壁的透过性，从而提高苹果酸产量，但是压强或温度过高时，可能会导致菌株活力降低或者死亡，从而导致苹果酸量下降；CTAB的添加时间对苹果酸产量影响也较大，最终选择在第50小时添加。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种L-苹果酸的制备、分离以及除杂纯化方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1）发酵：按照米曲霉种子液∶发酵罐培养基为1∶8的体积比例转入发酵罐中培养，温度32℃，培养40h；
步骤2）通透化处理：往步骤1）所得发酵液中添加碳酸钙和CTAB，继续发酵4h，然后控制温度为39℃，压强为2个大气压，保温保压发酵6h，停止发酵，得到L-苹果酸发酵液；发酵过程中，控制pH在6.2；并通过流加葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0wt％；
所述碳酸钙的添加量为80g/L，所述CTAB的添加量为40mg/L;
步骤3）分离、除杂：将步骤2）所得L-苹果酸发酵液2000rpm离心10min，去除沉淀，收集上清液，微滤膜过滤，截留分子量为10000Da，微滤温度为32℃；滤过液再进行超滤，截留分子量为1000Da，超滤温度为32℃，收集透过液；
步骤4）纯化：步将骤3）所得透过液通过装填有强碱弱酸型两性离子交换树脂的色谱柱，然后洗脱吸附于树脂上的苹果酸，将得到的洗脱液减压蒸馏，真空干燥，得到L-苹果酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述米曲霉种子液的浓度为1×1010CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/L，葡萄糖60g/L，木糖50 g/L，玉米浆12g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，pH值6.2。
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| L-苹果酸一步发酵法的工艺研究及浅析;田三德等;《食品科技》;20081231(第6期);第106-108页 * |
| L-苹果酸发酵工艺条件的研究;刘建军等;《山东微生物学会第六次会员代表大会暨2014年学术年会》;20141231;第263-271页 * |
| Micellar effect on the kinetics of oxidation of malic acid by N-bromophthalimide;Sangeeta Patil等;《Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects》;20070516(第308期);第6-13页 * |
| 细胞通透性的改变及其应用;罗杰等;《微生物学报》;20010630;第41卷(第3期);第386-389页 * |
| 黄曲霉SFW-7产L-苹果酸的研究;郝夕祥;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20110915(第09期);全文 * |
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