CN104694614B - 一种l-色氨酸的提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种L‑色氨酸的提取工艺，包括：菌液发酵、L‑色氨酸微膜过滤、三柱串联离交柱离交、超滤脱色、反渗透、双效浓缩、结晶、干燥、包装等工艺得到精品L‑色氨酸产品。本发明采用三柱串联离交柱离交、超滤膜脱色和一次结晶得到L‑色氨酸产品，工艺简单且可连续化生产，工艺废料经过综合处理可以生产蛋白饲料，绿色环保。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及L-色氨酸生产技术领域，具体涉及一种L-色氨酸的提取工艺。
背景技术
L-色氨酸的分子式为C11H12O2N2，分子量为204.21，含氮13.72％。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈绢丝光泽、六角片状自色晶体，无臭，有甜味，水中溶解度1.14g/L(25℃)溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。
L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料行业。
近年来，随着国内饲料工业的发展和L-色氨酸及其代谢产物研究的深入，尤其是随着我国老龄化程度不断加重，L-色氨酸在医药行业上的用途也不断扩大。目前，L-色氨酸逐渐成为一种国际市场发展潜力巨大、国内市场需求较大的产品。
目前，L-色氨酸的生产方法主要有4种：(1)蛋白质水解法：主要从含有相对丰富的L-色氨酸的废蚕丝、毛发和血粉等蛋白质原料通过酶水解或碱水解法来提取L-色氨酸。蛋白质水解法工艺复杂，生产周期长，产品成分复杂，现在使用较少。(2)化学合成法：化学合成主要以苯阱为原料或者以吲哚为原料合成，合成之后为DL-色氨酸，在经过拆分得到L-色氨酸。这种方法原料成本高，工艺复杂，工业推广差。(3)酶促转换法：利用微生物产生的L-色氨酸合成酶系转化前体合成L-色氨酸的方法。此法L-色氨酸合成酶受吲哚影响较严重，底物L-丝氨酸价格较高，吲哚水溶性较差，转化率不高。(4)发酵法：是指利用L-色氨酸高产菌种，采用葡萄糖等廉价碳源做原料，控制合适的发酵条件，从而获得L-色氨酸产品的一种方法。发酵法已经成为当前工业生产L-色氨酸的重要方法。
从发酵液中提取L-色氨酸是发酵法生产L-色氨酸的关键工序，现有的提取工艺主要存在以下三个方面的问题。第一方面：传统的提取工艺主要采用粗品制备精品，在制备过程中需要两次结晶，耗费大量的试剂，并需要增加工序去除这些试剂；这不仅增加了工艺的复杂性和工作量，还会造成不必要的生产浪费。第二方面：采用活性炭对L-色氨酸进行脱色，产生大量的废水和活性炭废料。第三方面：菌株产氨基酸效率低。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，克服了现有技术中存在的不足之处，提供了一种L-色氨酸的提取工艺，该工艺操作简单，产率和纯度高，能够实现废物利用，并且合理配伍菌株，大大提高了发酵效率，可大规模推广使用。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
一种L-色氨酸的提取工艺，其包括如下步骤：
步骤1)：将大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌分别培养至浓度为1×108个/mL的菌液，按照2∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照2％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养30小时，得到L-色氨酸发酵液；
步骤2)：将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至60℃，用盐酸调节调pH值为4，经微滤膜过滤得到截留物和滤过液；
步骤3)：步骤2)所得滤过液经过三柱串联离子交换柱，得到L-色氨酸高浓液；然后用盐酸调节L-色氨酸高浓液的pH值为3，最后进行超滤膜过滤得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液；
步骤4)：将步骤3)所得色氨酸超滤液利用反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-色氨酸料液；将上述L-色氨酸料液打入双效低温浓缩锅浓缩得到L-色氨酸浓缩液；
步骤5)：将步骤4)所得L-色氨酸浓缩液打入低温密闭结晶罐中结晶，分别收集上清液和沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品；
步骤6)将步骤2)所得截留物、步骤3)所得含有色素及蛋白的浓缩液以及步骤5)所得上清液合并得到废弃料液，然后往废弃料液中添加豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸，2000rpm搅拌10min，通入蒸汽升温至100℃，蒸馏30分钟；然后将蒸馏物烘干，粉碎机粉碎制得饲料；其中，废弃料液、豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸的质量比为100∶4∶3∶2∶1。
优选地，
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、酵母粉12g/L、硫酸镁2.5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸2.5g/L、磷酸氢二钾9g/L、硫酸亚铁76mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L。
所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar。所述超滤膜器采用聚酰胺管式膜分离系统，截留分子量为600-1000KDa，操作温度50℃，压力为0.25Mpa。
所述反渗透膜为聚酰胺复合膜。
本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：
本发明在现有技术的基础上，通过大量试验发现，采用两种菌液按照一定比例混合，各菌株之间具备一定的协同作用，比常规的单一菌株发酵方法，能够大大提高色氨酸的发酵产量。本发明采用三柱串联离交柱提取L-色氨酸，其生产工艺简洁，便于操作和维护，占地面积少，可连续工业化生产。
本发明采用超滤脱色技术，脱色过程简单，脱色效果明显；与传统活性炭脱色所产生大量工业废水和活性炭废料相比，减轻废水处理负担，节省了工业成本。
本发明在提取色氨酸过程中，对菌体蛋白、大分子多糖等进行回收利用，几乎无废水外排，避免此类物质的废液对环境造成的污染，绿色环保；而且获得了营养丰富的菌体蛋白饲料，变废为宝，增加经济效益。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种L-色氨酸的提取工艺，其包括如下步骤：
步骤1)：将大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 27325(可参见Appl.Environ.Microbiol.October 1994 vol.60 no.10，3724-3731)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032(Journal of Biotechnology，V104，September 2003，Pages5-25)分别培养至浓度为1×108个/mL的菌液，按照2∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照2％(v/v)接种量接种到发酵培养基(葡萄糖20g/L、酵母粉12g/L、硫酸镁2.5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸2.5g/L、磷酸氢二钾9g/L、硫酸亚铁76mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L)中，温度37℃，溶氧控制20％，罐压0.05MPa，pH7.0，当发酵培养基中葡萄糖耗完后，进入补糖生产L-色氨酸阶段，流加葡萄糖液浓度为600g/L，液氨调节pH控制在7.0，色氨酸浓度可以达到50g/L，葡萄糖转化率为18.8％。待色氨酸生成速率明显下降，残糖浓度上升为1.0g/L时，结束发酵；整个发酵过程时间为30小时；
本发明采用菌株组合，配伍合理，大大提高了色氨酸葡萄糖转化率和缩短发酵时间，有利于工业化；色氨酸含量采用HPLC方法测定，具体参照2007版英国药典(Ph Eurmonograph 1272)；同时在其他条件不变的前提下，检测了单一大肠杆菌发酵色氨酸浓度，仅为33g/L，葡萄糖转化率为17.1％。
步骤2)：将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至60℃，用盐酸调节调pH值为4，经微滤膜过滤得到截留物和滤过液；所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar；
步骤3)：步骤2)滤过液进入三柱串联离交柱，柱中填充阳离子交换树脂柱(001×7)，吸附温度为30℃，得到L-色氨酸高浓液；然后用盐酸调节上述L-色氨酸高浓液的pH值为3，超滤膜过滤得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液；所述超滤膜器采用聚酰胺管式膜分离系统，超滤膜孔径为5nm，截留分子量为600KDa，操作温度50℃，压力为0.25Mpa，滤速控制在60L/m2·h；
步骤4)：将步骤3)得到的超滤液利用反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-色氨酸料液；所述反渗透膜为聚酰胺复合膜，脱水浓缩条件：压力0.55MPa，温度55℃；上述L-色氨酸料液打入双效低温浓缩锅53℃浓缩得到L-色氨酸浓缩液，真空度-0.1MPa；
步骤5)：将L-色氨酸浓缩液打入低温密闭结晶罐中结晶，分别收集上清液和沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品。所述结晶温度为18℃，pH为6.4，结晶时间10小时；干燥时间15s，温度为进入温度120℃，出去温度80℃。经检测产品纯度为99.8％，产品收率为93.5％。
步骤6)将步骤2)所得截留物、步骤3)所得浓缩液以及步骤5)所得上清液合并得到废弃料液，然后往废弃料液中添加豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸，2000rpm搅拌10min，通入蒸汽升温至100℃，蒸馏30分钟；然后将蒸馏物烘干，粉碎机粉碎制得饲料；其中，废弃料液、豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸的质量比为100∶4∶3∶2∶1。
实施例2
一种L-色氨酸的提取工艺，其包括如下步骤：
步骤1)：将大肠杆菌(Escherichia coli)CCTCC M 2011316(参见CN201110400855X)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032分别培养至浓度为1×108个/mL的菌液，按照3∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照2％(v/v)接种量接种到发酵培养基(葡萄糖20g/L、酵母粉12g/L、硫酸镁2.5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸2.5g/L、磷酸氢二钾9g/L、硫酸亚铁76mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L)中，温度37℃，溶氧控制20％，罐压0.05MPa，pH7.0，当发酵培养基中葡萄糖耗完后，进入补糖生产L-色氨酸阶段，流加葡萄糖液浓度为600g/L，液氨调节pH控制在7.0，色氨酸浓度可以达到55g/L，葡萄糖转化率为19.3％；待色氨酸生成速率明显下降，残糖浓度上升为1.0g/L时，结束发酵；整个发酵过程时间为30小时；
本发明采用菌株组合，配伍合理，大大提高了色氨酸葡萄糖转化率和缩短发酵时间，有利于工业化。色氨酸含量检测采用HPLC方法测定，具体参照2007版英国药典(Ph Eurmonograph 1272)；而采用单一大肠杆菌株发酵产色氨酸浓度为43g/L，葡萄糖转化率为18.2％。
步骤2)：将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至60℃，用盐酸调节调pH值为4，经微滤膜过滤得到截留物和滤过液；所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar；
步骤3)：步骤2)滤过液进入三柱串联离交柱，柱中填充阳离子交换树脂柱(001×7)，吸附温度为30℃，得到L-色氨酸高浓液；然后用盐酸调节上述L-色氨酸高浓液的pH值为3，超滤膜过滤得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液；所述超滤膜器采用聚酰胺管式膜分离系统，超滤膜孔径为10nm，截留分子量为800KDa，操作温度50℃，压力为0.25Mpa，滤速控制在60L/m2·h；
步骤4)：将步骤3)得到的超滤液利用反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-色氨酸料液；所述反渗透膜为聚酰胺复合膜，脱水浓缩条件：压力0.55MPa，温度55℃；上述L-色氨酸料液打入双效低温浓缩锅53℃浓缩得到L-色氨酸浓缩液，真空度-0.1MPa；
步骤5)：将L-色氨酸浓缩液打入低温密闭结晶罐中结晶，分别收集上清液和沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品。所述结晶温度为18℃，pH为6.4，结晶时间10小时；干燥时间15s，温度为进入温度120℃，出去温度80℃。经检测产品纯度为99.8％，产品收率为93.7％。
步骤6)将步骤2)所得截留物、步骤3)所得浓缩液以及步骤5)所得上清液合并得到废弃料液，然后往废弃料液中添加豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸，2000rpm搅拌10min，通入蒸汽升温至100℃，蒸馏30分钟；然后将蒸馏物烘干，粉碎机粉碎制得饲料；其中，废弃料液、豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸的质量比为100∶4∶3∶2∶1。
实施例3
本发明制备的饲料养殖试验：
选取60天的仔猪100头，分为两个组别，每组50头，其中实验组用本实施例1制备的饲料饲养，对照组用通威中大猪饲料；其他饲养条件两个组完全相同，具备可比性。饲养10周之后检测各项指标参见表1。
表1
结论：本发明制备的饲料饲养效果较好，日增重以及料重比优于市场常用猪饲料，并且成本较市售饲料低廉，实现了变废为宝。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (4)
1.一种L-色氨酸的提取工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
步骤1)：将大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌分别培养至浓度为1×108个/mL的菌液，按照2∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照2％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养30小时，得到L-色氨酸发酵液；
步骤2)：将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至60℃，用盐酸调节调pH值为4，经微滤膜过滤得到截留物和滤过液；
步骤3)：步骤2)所得滤过液经过三柱串联离子交换柱，得到L-色氨酸高浓液；然后用盐酸调节L-色氨酸高浓液的pH值为3，最后进行超滤膜过滤得到L-色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液；
步骤4)：将步骤3)所得L-色氨酸超滤液利用反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-色氨酸料液；将上述L-色氨酸料液打入双效低温浓缩锅浓缩得到L-色氨酸浓缩液；
步骤5)：将步骤4)所得L-色氨酸浓缩液打入结晶罐中结晶，分别收集上清液和沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品；
步骤6)将步骤2)所得截留物、步骤3)所得含有色素及蛋白的浓缩液以及步骤5)所得上清液合并得到废弃料液，然后往废弃料液中添加豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸，2000rpm搅拌10min，通入蒸汽升温至100℃，蒸馏30分钟；然后将蒸馏物烘干，粉碎机粉碎制得饲料；其中，废弃料液、豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸的质量比为100∶4∶3∶2∶1；
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、酵母粉12g/L、硫酸镁2.5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸2.5g/L、磷酸氢二钾9g/L、硫酸亚铁76mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L；
所述大肠杆菌(Escherichia coli)为ATCC 27325或CCTCC M 2011316，所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为ATCC13032。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述超滤膜器采用聚酰胺管式膜分离系统，截留分子量为600-1000KDa，操作温度50℃，压力为0.25Mpa。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述反渗透膜为聚酰胺复合膜。
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