CN101979616B - 一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法。该方法以埃西托丛梗孢酵母(Moniliella acetoabutans ATCC 18455)作为生产菌株,以碎米糖液作为发酵底物制备高纯度的赤藓糖醇,具体操作包括碎米糖液的制备、赤藓糖醇发酵液的制取和赤藓糖醇产品的精制三个步骤。本发明赤藓糖醇转化率高,发酵周期短,且没有如甘油等副产物,发酵性能稳定;降低了生产成本;操作费用低且设备空间小;产品得率高,杂质少,工序简单,终产物纯度达到98%以上。
Description
技术领域
本发明属于酶工程和微生物发酵技术领域,具体涉及利用埃西托丛梗孢酵母(Moniliella acetoabutans ATCC 18455)作为出发菌株,以酶解后的碎米糖液作为发酵底物,发酵生产赤藓糖醇的方法。
背景技术
赤藓糖醇是一种甜度约为蔗糖70%的四碳糖醇,化学名为1,2,3,4-丁四醇,分子式为C4H10O4。赤藓糖醇在自然界中分布广泛,在蘑菇、酒类、酱油、奶酪、人和动物的组织液和体液中等都有存在。由于赤藓糖醇在人身体内具有独特的代谢方式,使得赤藓糖醇拥有很多优良的生理功能,如热量值为零、耐受量高,副作用小、适宜糖尿病人食用、非致龋齿特性、清除自由基功能等。因此其在功能性食品、化妆品、医药化工等领域的应用潜力巨大,目前正越来越受到人们的关注。赤藓糖醇的生产方法有两种,化学合成法和微生物发酵法。化学合成法是在葡萄糖酸盐溶液中加入过氧化氢,在有镍、钴等金属盐存在的情况下进行反应生成赤藓糖;再通过加氢得到赤藓糖醇。但是,从原理上来讲都需要大量的过氧化氢,大量的过氧化氢原料来源困难。另外,过氧化氢与葡萄糖或者葡萄糖酸的反应是强放热反应,但是,为了保持正常反应减少副反应,反应液温度须保持在35℃以下,需要消耗大量能量,且反应时间很长。再者,从葡萄糖酸到赤藓糖是氧化过程,而加氢则是一个氢化还原过程,前后形成氧化与氢化的重复,造成对能源的浪费。另外还存在环境污染和食品安全系数低等一系列问题。因此造成了化学合成法成本高,转化率低,产物分离纯化困难而无法工业化生产。发酵法产赤藓糖醇,指利用微生物的生命活动,通过发酵产生赤藓糖醇,再经过提纯精制、浓缩、结晶等步骤获得赤藓糖醇。其条件温和易控制,成本较为低廉,食品安全系数较高,因此发酵法是目前工业上生产赤藓糖醇的主要方法。
国外学者对赤藓糖醇的研究利用较早。最早加拿大的Spencer等人在研究高渗酵母产生甘油时,发现因菌种生长速度、培养条件不同,可产生赤藓糖醇和阿拉伯糖醇等。其后发现产赤藓糖醇的菌株有丝孢酵母属、假丝酵母属、丛梗孢酵母属、短梗霉属等。我国对赤藓糖醇的研究较晚,目前使用的菌株有圆酵母属、球拟酵母属、假丝酵母属等,但产量大都较低,副产物较多,且生产技术相对比较落后,发酵液中赤藓糖醇分离过程复杂,赤藓糖醇晶体纯度低,造成赤藓糖醇生产成本较高。在碳源的利用方面,工业生产中主要利用玉米淀粉发酵产赤藓糖醇,存在成本高,转化率低,生产周期长,发酵液颜色较深,分离复杂等不足。日本学者研究了利用甘油、烷烃作为发酵碳源来发酵生产赤藓糖醇的生产方法,但是尚未工业化生产。因此,筛选发酵效率高的生产菌株,寻找合适、低廉的发酵碳源,开发出高效的生产和提取工艺,以降低赤藓糖醇生产成本,增强我国甜味剂发酵产业的竞争力,是十分有必要的。
发明内容
针对上述发酵法产赤藓糖醇存在的不足,本发明提供一种新的利用碎米生产赤藓糖醇的方法,该方法利用埃西托丛梗孢酵母(Moniliella acetoabutans ATCC 18455)作为生产菌株,以碎米糖液作为发酵底物,发酵液分离纯化精制后得到赤藓糖醇产品。
实现上述目的的具体技术解决方案如下:
一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法包括以下操作步骤:
(1)碎米糖液的生产
在碎米米浆中加入液体的耐高温α-淀粉酶,每吨碎米加耐高温α-淀粉酶160mL;使用高温喷射液化器液化,第一次喷射温度105℃,带压维持时间15min;第二次喷射温度130℃,带压维持时间2min;降温至100℃泵入层流罐,再次加入液体的耐高温α-淀粉酶反应,每吨碎米加耐高温α-淀粉酶240mL,反应时间为90-100min,反应温度为95-100℃,当固形物含量为20%时到达反应终点,制得碎米液化液,冷却;
(2)赤藓糖醇发酵液的制取
摇瓶培养基配方为:葡萄糖200g/L,玉米浆干粉3g/L,尿素5g/L;
在一个储罐的二级种子培养基底物中添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L后,120℃灭菌15min,泵入二级种子罐,降温至30℃,接入一级种子,接种量5%;无菌空气经过滤除菌后通入发酵罐,罐压0.5MPa,通气量为0.5vvm,培养条件为罐温30℃,转速200r/min,培养时间24h,获得二级种子液;
在另一个储罐的发酵培养基底物中添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L、硫酸锰5g/L、泡敌0.05%,120℃灭菌15min,泵入发酵罐,降温至30℃,接入二级种子液,接种量10%;发酵条件为罐温28℃;无菌空气经过滤灭菌后通入发酵罐,罐压0.05MPa,通气量为1vvm,转速400r/min,发酵时间为95-100h;葡萄糖浓度下降到0.5%时达到发酵终点,得到含赤藓糖醇的发酵液,其中赤藓糖醇含量为130-135g/L,赤藓糖醇转化率为42-45%;
(3)赤藓糖醇产品的精制
将纳滤液通过多效降膜蒸发器浓缩至原体积液的20%后送入结晶罐,结晶罐留种10%;结晶总时间60h,其中养晶12h,冷却结晶48h;常规离心分离,干燥,制得赤藓糖醇;制得的赤藓糖醇为白色结晶粉末,有蔗糖甜味,无异味,水分含量0.05%,赤藓糖醇纯度为98-99%。
所述碎米为籼米副产物,即籼米的碎米,或粳米副产物,即粳米的碎米。
本发明的有益技术效果体现在以下方面:
①利用埃西托丛梗孢酵母(Moniliella acetoabutans ATCC 18455)作为生产菌株,其赤藓糖醇转化率高,发酵周期短,较其他菌株发酵生产周期节省时间约40h,且没有如甘油等副产物,发酵性能稳定。
②利用碎米糖液作为发酵底物,与其他碳源底物如烷烃、甘油、玉米淀粉等相比,菌株利用率高,不需添加额外氮源且碎米本身较为廉价,因此有效的降低了生产成本。发酵液颜色更浅,发酵液中的赤藓糖醇更容易分离。过滤分离得到的碎米蛋白可以作其他用途,达到了碎米的全利用,提高了碎米的利用深度。
③发酵液通过板框过滤分离得到的酵母可以用作单细胞蛋白、饲料等用途。采用超滤、纳滤等新分离工艺,较传统工艺中使用活性炭脱色效果更好以及色谱柱分离效率更高,回收率达到90%以上,有效的降低了分离成本。且避免了色谱柱分离中大量洗脱溶剂的使用,减少了环境污染。
④利用多效降膜蒸发器进行浓缩,传热快,受热时间短(2min),较其他浓缩方式处理量大,操作费用低且设备空间小。冷却结晶法进行结晶操作,产品得率高,杂质少,工序简单,终产物纯度达到98%以上。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明作进一步地描述。
实施例1:
(1)碎米糖液的生产
在碎米米浆中加入液体的耐高温α-淀粉酶,每吨碎米加耐高温α-淀粉酶160mL。使用高温喷射液化器液化,第一次喷射温度105℃,带压维持时间15min。第二次喷射温度130℃,带压维持时间2min。降温至100℃后泵入层流罐,再次加入同样的耐高温α-淀粉酶反应,每吨碎米加耐高温α-淀粉酶240mL,反应时间90min,反应温度100℃,当固形物含量为20%时到达反应终点,制得碎米液化液;
(2)赤藓糖醇发酵液的制取
摇瓶培养基灭菌后接入一环埃西托丛梗孢酵母(Moniliella acetoabutans ATCC 18455)菌种,30℃摇床培养24h。 摇瓶培养基配方为:葡萄糖200g/L,玉米浆干粉3g/L,尿素5g/L。经菌种镜检及OD值等各项指标达标后获得一级种子;
将其中一个储罐中的碎米糖液添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L后,120℃灭菌15min泵入二级种子罐,降温至30℃后接入一级种子,接种量5%。无菌空气经过滤除菌后通入发酵罐,罐压0.5MPa,通气量为0.5vvm,培养条件为罐温30℃,转速200r/min,培养时间24h。经菌种镜检及OD值等各项指标达标后获得二级种子液;
将另外一个储罐中的碎米糖液添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L、硫酸锰5g/L、泡敌0.05%后,120℃灭菌15min泵入发酵罐,降温至30℃后接入二级种子液,接种量10%。发酵条件为罐温28℃。无菌空气经过滤灭菌后通入发酵罐,罐压0.05MPa,通气量为1vvm,转速400r/min,发酵时间100h。葡萄糖浓度下降到0.5%时达到发酵终点,得到含赤藓糖醇的发酵液,其中赤藓糖醇含量为135g/L,赤藓糖醇转化率为43.3%。
(3)赤藓糖醇产品的精制
将粗滤液进行超滤操作,膜截留分子量1000D,以除去发酵液中的残存的菌体、蛋白、核酸、胶体颗粒等大分子物质,操作温度常温,超滤压力0.2MPa,制得超滤液;
将得到的纳滤液通过多效降膜蒸发器浓缩至原体积液的20%后送入结晶罐,结晶罐留种10%。结晶总时间60h,其中养晶12h,冷却结晶48h。常规离心分离,干燥包装后制得产品,制得的赤藓糖醇晶体为白色结晶粉末,有蔗糖甜味,无异味,水分含量0.05%,赤藓糖醇纯度为99%。
实施例2
(1)碎米糖液的生产
在碎米米浆中加入液体的耐高温α-淀粉酶,每吨碎米加耐高温α-淀粉酶160mL。使用高温喷射液化器液化,第一次喷射温度105℃,带压维持时间15min。第二次喷射温度130℃,带压维持时间2min。降温至100℃后泵入层流罐,再次加入同样的耐高温α-淀粉酶反应,每吨碎米加耐高温α-淀粉酶240mL,反应时间100min,反应温度95℃,当固形物含量为20%时到达反应终点,制得碎米液化液;
(2)赤藓糖醇发酵液的制取
摇瓶培养基灭菌后接入一环埃西托丛梗孢酵母(Moniliella acetoabutans ATCC 18455)菌种,30℃摇床培养24h。 摇瓶培养基配方为:葡萄糖200g/L,玉米浆干粉3g/L,尿素5g/L。经菌种镜检及OD值等各项指标达标后获得一级种子;
将其中一个储罐中的碎米糖液添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L后,120℃灭菌15min泵入二级种子罐,降温至30℃后接入一级种子,接种量5%。无菌空气经过滤除菌后通入发酵罐,罐压0.5MPa,通气量为0.5vvm,培养条件为罐温30℃,转速200r/min,培养时间24h。经菌种镜检及OD值等各项指标达标后获得二级种子液。
将另外一个储罐中的碎米糖液添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L、硫酸锰5g/L、泡敌0.05%后,120℃灭菌15min泵入发酵罐,降温至30℃后接入二级种子液,接种量10%。发酵条件为罐温28℃。无菌空气经过滤灭菌后通入发酵罐,罐压0.05MPa,通气量为1vvm,转速400r/min,发酵时间95h。葡萄糖浓度下降到0.5%时达到发酵终点,得到含赤藓糖醇的发酵液,其中赤藓糖醇含量为131g/L,赤藓糖醇转化率为42.7%。
(3)赤藓糖醇产品的精制
精制步骤同实施例1,制得的赤藓糖醇晶体水分含量为0.05%,赤藓糖醇纯度为98%。
Claims (2)
1.一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法,其特征在于包括以下操作步骤:
(1)碎米糖液的生产
①将碎米淘洗,挑除杂质,加温度40℃的水浸泡2-6h,磨浆机磨浆,细度为30-60目,加水将浓浆调至浓度为18-20°Bé,制得碎米米浆;
②在碎米米浆中加入液体的耐高温α-淀粉酶,每吨碎米加耐高温α-淀粉酶160mL;使用高温喷射液化器液化,第一次喷射温度105℃,带压维持时间15min;第二次喷射温度130℃,带压维持时间2min;降温至100℃泵入层流罐,再次加入液体的耐高温α-淀粉酶反应,每吨碎米加耐高温α-淀粉酶240mL,反应时间为90-100min,反应温度为95-100℃,当固形物含量为20%时到达反应终点,制得碎米液化液,冷却;
③用稀盐酸调节碎米液化液的pH值至pH4,加入糖化酶进行糖化,每吨碎米加糖化酶1000g,糖化时间55-60h,糖化温度60℃,制得碎米糖化液;
④用压滤机压滤碎米糖化液,压滤温度为55-60℃,压力0.25MPa,制得碎米糖液;将碎米糖液分别泵入两个储罐,一个储罐作为二级种子培养基底物,另一个储罐作为发酵培养基底物待用;
(2)赤藓糖醇发酵液的制取
①在摇瓶培养基上接入一环埃西托丛梗孢酵母(Moniliella acetoabutans)ATCC 18455菌种,30℃摇床培养24h,获得一级种子;
摇瓶培养基配方为:葡萄糖200g/L,玉米浆干粉3g/L,尿素5g/L;
②在一个储罐的二级种子培养基底物中添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L后,120℃灭菌15min,泵入二级种子罐,降温至30℃,接入一级种子,接种量5%;无菌空气经过滤除菌后通入发酵罐,罐压0.5MPa,通气量为0.5vvm,培养条件为罐温30℃,转速200r/min,培养时间24h,获得二级种子液;
③在另一个储罐的发酵培养基底物中添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L、硫酸锰5g/L、泡敌0.05%,120℃灭菌15min,泵入发酵罐,降温至30℃,接入二级种子液,接种量10%;发酵条件为罐温28℃;无菌空气经过滤灭菌后通入发酵罐,罐压0.05MPa,通气量为1vvm,转速400r/min,发酵时间为95-100h;葡萄糖浓度下降到0.5%时达到发酵终点,得到含赤藓糖醇的发酵液,其中赤藓糖醇含量为130-135g/L,赤藓糖醇转化率为42-45%;
(3)赤藓糖醇产品的精制
①将含赤藓糖醇的发酵液用板框压滤机进行粗滤以除去发酵液中菌体、蛋白质,以减轻超滤压力,压滤温度为55-60℃,压力0.25MPa,制得粗滤液;
②将粗滤液进行超滤操作,膜截留分子量为1000D,以除去发酵液中残存的菌体、蛋白、核酸、胶体颗粒的大分子物质,操作温度常温,超滤压力0.2MPa,制得超滤液;
③将超滤液进一步纳滤,膜截留分子量200D,以脱除发酵液中的色素、核苷酸、氨基酸、短肽、部分盐离子,操作温度40℃,纳滤压力2MPa,浓缩倍数为15倍,制得纳滤液;
④将纳滤液通过多效降膜蒸发器浓缩至原体积液的20%后送入结晶罐,结晶罐留种10%;结晶总时间60h,其中养晶12h,冷却结晶48h;常规离心分离,干燥,制得赤藓糖醇;制得的赤藓糖醇为白色结晶粉末,有蔗糖甜味,无异味,水分含量0.05%,赤藓糖醇纯度为98-99%。
2.根据权利要求1所述的一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法,其特征在于:所述碎米为籼米副产物,即籼米的碎米,或粳米副产物,即粳米的碎米。
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