CN101979616B - 一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法 - Google Patents

一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法。该方法以埃西托丛梗孢酵母（Moniliella acetoabutans ATCC 18455）作为生产菌株，以碎米糖液作为发酵底物制备高纯度的赤藓糖醇，具体操作包括碎米糖液的制备、赤藓糖醇发酵液的制取和赤藓糖醇产品的精制三个步骤。本发明赤藓糖醇转化率高，发酵周期短，且没有如甘油等副产物，发酵性能稳定；降低了生产成本；操作费用低且设备空间小；产品得率高，杂质少，工序简单，终产物纯度达到98%以上。

Description

一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法
技术领域
本发明属于酶工程和微生物发酵技术领域，具体涉及利用埃西托丛梗孢酵母（Moniliella acetoabutans ATCC 18455）作为出发菌株，以酶解后的碎米糖液作为发酵底物，发酵生产赤藓糖醇的方法。
背景技术
赤藓糖醇是一种甜度约为蔗糖70%的四碳糖醇，化学名为1,2,3,4-丁四醇，分子式为C4H10O4。赤藓糖醇在自然界中分布广泛，在蘑菇、酒类、酱油、奶酪、人和动物的组织液和体液中等都有存在。由于赤藓糖醇在人身体内具有独特的代谢方式，使得赤藓糖醇拥有很多优良的生理功能，如热量值为零、耐受量高，副作用小、适宜糖尿病人食用、非致龋齿特性、清除自由基功能等。因此其在功能性食品、化妆品、医药化工等领域的应用潜力巨大，目前正越来越受到人们的关注。赤藓糖醇的生产方法有两种，化学合成法和微生物发酵法。化学合成法是在葡萄糖酸盐溶液中加入过氧化氢，在有镍、钴等金属盐存在的情况下进行反应生成赤藓糖；再通过加氢得到赤藓糖醇。但是，从原理上来讲都需要大量的过氧化氢，大量的过氧化氢原料来源困难。另外，过氧化氢与葡萄糖或者葡萄糖酸的反应是强放热反应，但是，为了保持正常反应减少副反应，反应液温度须保持在35℃以下，需要消耗大量能量，且反应时间很长。再者，从葡萄糖酸到赤藓糖是氧化过程，而加氢则是一个氢化还原过程，前后形成氧化与氢化的重复，造成对能源的浪费。另外还存在环境污染和食品安全系数低等一系列问题。因此造成了化学合成法成本高，转化率低，产物分离纯化困难而无法工业化生产。发酵法产赤藓糖醇，指利用微生物的生命活动，通过发酵产生赤藓糖醇，再经过提纯精制、浓缩、结晶等步骤获得赤藓糖醇。其条件温和易控制，成本较为低廉，食品安全系数较高，因此发酵法是目前工业上生产赤藓糖醇的主要方法。
国外学者对赤藓糖醇的研究利用较早。最早加拿大的Spencer等人在研究高渗酵母产生甘油时，发现因菌种生长速度、培养条件不同，可产生赤藓糖醇和阿拉伯糖醇等。其后发现产赤藓糖醇的菌株有丝孢酵母属、假丝酵母属、丛梗孢酵母属、短梗霉属等。我国对赤藓糖醇的研究较晚，目前使用的菌株有圆酵母属、球拟酵母属、假丝酵母属等，但产量大都较低，副产物较多，且生产技术相对比较落后，发酵液中赤藓糖醇分离过程复杂，赤藓糖醇晶体纯度低，造成赤藓糖醇生产成本较高。在碳源的利用方面，工业生产中主要利用玉米淀粉发酵产赤藓糖醇，存在成本高，转化率低，生产周期长，发酵液颜色较深，分离复杂等不足。日本学者研究了利用甘油、烷烃作为发酵碳源来发酵生产赤藓糖醇的生产方法，但是尚未工业化生产。因此，筛选发酵效率高的生产菌株，寻找合适、低廉的发酵碳源，开发出高效的生产和提取工艺，以降低赤藓糖醇生产成本，增强我国甜味剂发酵产业的竞争力，是十分有必要的。
发明内容
针对上述发酵法产赤藓糖醇存在的不足，本发明提供一种新的利用碎米生产赤藓糖醇的方法，该方法利用埃西托丛梗孢酵母（Moniliella acetoabutans ATCC 18455）作为生产菌株，以碎米糖液作为发酵底物，发酵液分离纯化精制后得到赤藓糖醇产品。
实现上述目的的具体技术解决方案如下：
一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法包括以下操作步骤：
（1）碎米糖液的生产
Figure 961178DEST_PATH_IMAGE001
将碎米淘洗，挑除杂质，加温度40℃的水浸泡2-6h，磨浆机磨浆，细度为30-60目，加水将浓浆调至浓度为18-20°Bé，制得碎米米浆；
Figure 940635DEST_PATH_IMAGE002
在碎米米浆中加入液体的耐高温α-淀粉酶，每吨碎米加耐高温α-淀粉酶160mL；使用高温喷射液化器液化，第一次喷射温度105℃，带压维持时间15min；第二次喷射温度130℃，带压维持时间2min；降温至100℃泵入层流罐，再次加入液体的耐高温α-淀粉酶反应，每吨碎米加耐高温α-淀粉酶240mL，反应时间为90-100min，反应温度为95-100℃，当固形物含量为20%时到达反应终点，制得碎米液化液，冷却；
Figure 343541DEST_PATH_IMAGE003
用稀盐酸调节碎米液化液的pH值至pH4，加入糖化酶进行糖化，每吨碎米加糖化酶1000g，糖化时间55-60h，糖化温度60℃，制得碎米糖化液；
Figure 801068DEST_PATH_IMAGE004
用压滤机压滤碎米糖化液，压滤温度为55-60℃，压力0.25MPa，制得碎米糖液；将碎米糖液分别泵入两个储罐，一个储罐作为二级种子培养基底物，另一个储罐作为发酵培养基底物待用；
（2）赤藓糖醇发酵液的制取
Figure 677757DEST_PATH_IMAGE001
在摇瓶培养基上接入一环埃西托丛梗孢酵母（Moniliella acetoabutans ATCC 18455）菌种，30℃摇床培养24h，获得一级种子；
摇瓶培养基配方为：葡萄糖200g/L，玉米浆干粉3g/L，尿素5g/L；
在一个储罐的二级种子培养基底物中添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L后，120℃灭菌15min，泵入二级种子罐，降温至30℃，接入一级种子，接种量5%；无菌空气经过滤除菌后通入发酵罐，罐压0.5MPa，通气量为0.5vvm，培养条件为罐温30℃，转速200r/min，培养时间24h，获得二级种子液；
在另一个储罐的发酵培养基底物中添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L、硫酸锰5g/L、泡敌0.05%，120℃灭菌15min，泵入发酵罐，降温至30℃，接入二级种子液，接种量10%；发酵条件为罐温28℃；无菌空气经过滤灭菌后通入发酵罐，罐压0.05MPa，通气量为1vvm，转速400r/min，发酵时间为95-100h；葡萄糖浓度下降到0.5%时达到发酵终点，得到含赤藓糖醇的发酵液，其中赤藓糖醇含量为130-135g/L，赤藓糖醇转化率为42-45%；
（3）赤藓糖醇产品的精制
Figure 654568DEST_PATH_IMAGE001
将含赤藓糖醇的发酵液用板框压滤机进行粗滤以除去发酵液中菌体、蛋白质，以减轻超滤压力，压滤温度为55-60℃，压力0.25MPa，制得粗滤液；
Figure 385764DEST_PATH_IMAGE002
将粗滤液进行超滤操作，膜截留分子量为1000D，以除去发酵液中残存的菌体、蛋白、核酸、胶体颗粒的大分子物质，操作温度常温，超滤压力0.2MPa，制得超滤液；
Figure 441445DEST_PATH_IMAGE003
将超滤液进一步纳滤，膜截留分子量200D，以脱除发酵液中的色素、核苷酸、氨基酸、短肽、部分盐离子，操作温度40℃，纳滤压力2MPa，浓缩倍数为15倍，制得纳滤液；
Figure 586704DEST_PATH_IMAGE004
将纳滤液通过多效降膜蒸发器浓缩至原体积液的20%后送入结晶罐，结晶罐留种10%；结晶总时间60h，其中养晶12h，冷却结晶48h；常规离心分离，干燥，制得赤藓糖醇；制得的赤藓糖醇为白色结晶粉末，有蔗糖甜味，无异味，水分含量0.05%，赤藓糖醇纯度为98-99%。
所述碎米为籼米副产物，即籼米的碎米，或粳米副产物，即粳米的碎米。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
①利用埃西托丛梗孢酵母（Moniliella acetoabutans ATCC 18455）作为生产菌株，其赤藓糖醇转化率高，发酵周期短，较其他菌株发酵生产周期节省时间约40h，且没有如甘油等副产物，发酵性能稳定。
②利用碎米糖液作为发酵底物，与其他碳源底物如烷烃、甘油、玉米淀粉等相比，菌株利用率高，不需添加额外氮源且碎米本身较为廉价，因此有效的降低了生产成本。发酵液颜色更浅，发酵液中的赤藓糖醇更容易分离。过滤分离得到的碎米蛋白可以作其他用途，达到了碎米的全利用，提高了碎米的利用深度。
③发酵液通过板框过滤分离得到的酵母可以用作单细胞蛋白、饲料等用途。采用超滤、纳滤等新分离工艺，较传统工艺中使用活性炭脱色效果更好以及色谱柱分离效率更高，回收率达到90%以上，有效的降低了分离成本。且避免了色谱柱分离中大量洗脱溶剂的使用，减少了环境污染。
④利用多效降膜蒸发器进行浓缩，传热快，受热时间短（2min），较其他浓缩方式处理量大，操作费用低且设备空间小。冷却结晶法进行结晶操作，产品得率高，杂质少，工序简单，终产物纯度达到98%以上。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
实施例1：
（1）碎米糖液的生产
Figure 448350DEST_PATH_IMAGE001
将籼米副产物碎米淘洗，挑除碎米中的杂质后，加40℃水浸泡2h后用磨浆机磨浆，细度为40目，加水将浓浆调至浓度20°Bé，制得碎米米浆；
Figure 34052DEST_PATH_IMAGE002
在碎米米浆中加入液体的耐高温α-淀粉酶，每吨碎米加耐高温α-淀粉酶160mL。使用高温喷射液化器液化，第一次喷射温度105℃，带压维持时间15min。第二次喷射温度130℃，带压维持时间2min。降温至100℃后泵入层流罐，再次加入同样的耐高温α-淀粉酶反应，每吨碎米加耐高温α-淀粉酶240mL，反应时间90min，反应温度100℃，当固形物含量为20%时到达反应终点，制得碎米液化液；
Figure 27678DEST_PATH_IMAGE003
待碎米液化液冷却后，用稀盐酸将pH值调节至pH4，加入糖化酶，每吨碎米加糖化酶1000g，糖化时间为60h，糖化温度60℃，制得碎米糖化液；
Figure 331620DEST_PATH_IMAGE004
用压滤机压滤碎米糖化液，压滤温度为60℃，压力0.25MPa。制得碎米糖液，将碎米糖液分别泵入两个储罐，一个储罐作为二级种子培养基底物，另一个储罐作为发酵培养基底物待用。
（2）赤藓糖醇发酵液的制取
Figure 731378DEST_PATH_IMAGE001
选择埃西托丛梗孢酵母（Moniliella acetoabutans ATCC 18455）作为出发菌株；
Figure 935701DEST_PATH_IMAGE002
摇瓶培养基灭菌后接入一环埃西托丛梗孢酵母（Moniliella acetoabutans ATCC 18455）菌种，30℃摇床培养24h。 摇瓶培养基配方为：葡萄糖200g/L，玉米浆干粉3g/L，尿素5g/L。经菌种镜检及OD值等各项指标达标后获得一级种子；
Figure 333184DEST_PATH_IMAGE003
将其中一个储罐中的碎米糖液添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L后，120℃灭菌15min泵入二级种子罐，降温至30℃后接入一级种子，接种量5%。无菌空气经过滤除菌后通入发酵罐，罐压0.5MPa，通气量为0.5vvm，培养条件为罐温30℃，转速200r/min，培养时间24h。经菌种镜检及OD值等各项指标达标后获得二级种子液；
Figure 124422DEST_PATH_IMAGE004
将另外一个储罐中的碎米糖液添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L、硫酸锰5g/L、泡敌0.05%后，120℃灭菌15min泵入发酵罐，降温至30℃后接入二级种子液，接种量10%。发酵条件为罐温28℃。无菌空气经过滤灭菌后通入发酵罐，罐压0.05MPa，通气量为1vvm，转速400r/min，发酵时间100h。葡萄糖浓度下降到0.5%时达到发酵终点，得到含赤藓糖醇的发酵液，其中赤藓糖醇含量为135g/L，赤藓糖醇转化率为43.3%。
（3）赤藓糖醇产品的精制
Figure 265554DEST_PATH_IMAGE001
将发酵液泵入至储料罐后用板框压滤机进行粗滤以除去发酵液中菌体、蛋白质等物质，以减轻超滤压力，压滤温度60℃，压力0.25MPa，制得粗滤液；
将粗滤液进行超滤操作，膜截留分子量1000D，以除去发酵液中的残存的菌体、蛋白、核酸、胶体颗粒等大分子物质，操作温度常温，超滤压力0.2MPa，制得超滤液；
Figure 161277DEST_PATH_IMAGE003
将超滤液进一步纳滤，膜截留分子量200D，以脱除发酵液中的色素、核苷酸、氨基酸、短肽、部分盐离子等，操作温度40℃，纳滤压力2MPa，浓缩倍数为15倍，制得纳滤液；
将得到的纳滤液通过多效降膜蒸发器浓缩至原体积液的20%后送入结晶罐，结晶罐留种10%。结晶总时间60h，其中养晶12h，冷却结晶48h。常规离心分离，干燥包装后制得产品，制得的赤藓糖醇晶体为白色结晶粉末，有蔗糖甜味，无异味，水分含量0.05%，赤藓糖醇纯度为99%。
实施例2
（1）碎米糖液的生产
Figure 119054DEST_PATH_IMAGE001
将粳米副产物碎米淘洗，挑除碎米中的杂质后，加40℃水浸泡6h后用磨浆机磨浆，细度为40目，加水将浓浆调至浓度18°Bé，制得碎米米浆；
Figure 38250DEST_PATH_IMAGE002
在碎米米浆中加入液体的耐高温α-淀粉酶，每吨碎米加耐高温α-淀粉酶160mL。使用高温喷射液化器液化，第一次喷射温度105℃，带压维持时间15min。第二次喷射温度130℃，带压维持时间2min。降温至100℃后泵入层流罐，再次加入同样的耐高温α-淀粉酶反应，每吨碎米加耐高温α-淀粉酶240mL，反应时间100min，反应温度95℃，当固形物含量为20%时到达反应终点，制得碎米液化液；
Figure 43115DEST_PATH_IMAGE003
待碎米液化液冷却后，用稀盐酸将pH调节至pH4，加入糖化酶，每吨碎米加糖化酶1000g，糖化时间为55h，糖化温度60℃，制得碎米糖化液；
Figure 543366DEST_PATH_IMAGE004
用压滤机压滤碎米糖化液，压滤温度为60℃，压力0.25 MPa。制得碎米糖液，将碎米糖液分别泵入两个储罐，一个储罐作为二级种子培养基底物，另一个储罐作为发酵培养基底物待用。
（2）赤藓糖醇发酵液的制取
Figure 26300DEST_PATH_IMAGE001
选择埃西托丛梗孢酵母（Moniliella acetoabutans ATCC 18455）作为出发菌株；
Figure 62652DEST_PATH_IMAGE002
摇瓶培养基灭菌后接入一环埃西托丛梗孢酵母（Moniliella acetoabutans ATCC 18455）菌种，30℃摇床培养24h。 摇瓶培养基配方为：葡萄糖200g/L，玉米浆干粉3g/L，尿素5g/L。经菌种镜检及OD值等各项指标达标后获得一级种子；
Figure 238418DEST_PATH_IMAGE003
将其中一个储罐中的碎米糖液添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L后，120℃灭菌15min泵入二级种子罐，降温至30℃后接入一级种子，接种量5%。无菌空气经过滤除菌后通入发酵罐，罐压0.5MPa，通气量为0.5vvm，培养条件为罐温30℃，转速200r/min，培养时间24h。经菌种镜检及OD值等各项指标达标后获得二级种子液。
Figure 225966DEST_PATH_IMAGE004
将另外一个储罐中的碎米糖液添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L、硫酸锰5g/L、泡敌0.05%后，120℃灭菌15min泵入发酵罐，降温至30℃后接入二级种子液，接种量10%。发酵条件为罐温28℃。无菌空气经过滤灭菌后通入发酵罐，罐压0.05MPa，通气量为1vvm，转速400r/min，发酵时间95h。葡萄糖浓度下降到0.5%时达到发酵终点，得到含赤藓糖醇的发酵液，其中赤藓糖醇含量为131g/L，赤藓糖醇转化率为42.7%。
（3）赤藓糖醇产品的精制
精制步骤同实施例1，制得的赤藓糖醇晶体水分含量为0.05%，赤藓糖醇纯度为98%。

Claims (2)

1.一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)碎米糖液的生产
①将碎米淘洗，挑除杂质，加温度40℃的水浸泡2-6h，磨浆机磨浆，细度为30-60目，加水将浓浆调至浓度为18-20°Bé，制得碎米米浆；
②在碎米米浆中加入液体的耐高温α-淀粉酶，每吨碎米加耐高温α-淀粉酶160mL；使用高温喷射液化器液化，第一次喷射温度105℃，带压维持时间15min；第二次喷射温度130℃，带压维持时间2min；降温至100℃泵入层流罐，再次加入液体的耐高温α-淀粉酶反应，每吨碎米加耐高温α-淀粉酶240mL，反应时间为90-100min，反应温度为95-100℃，当固形物含量为20％时到达反应终点，制得碎米液化液，冷却；
③用稀盐酸调节碎米液化液的pH值至pH4，加入糖化酶进行糖化，每吨碎米加糖化酶1000g，糖化时间55-60h，糖化温度60℃，制得碎米糖化液；
④用压滤机压滤碎米糖化液，压滤温度为55-60℃，压力0.25MPa，制得碎米糖液；将碎米糖液分别泵入两个储罐，一个储罐作为二级种子培养基底物，另一个储罐作为发酵培养基底物待用；
(2)赤藓糖醇发酵液的制取
①在摇瓶培养基上接入一环埃西托丛梗孢酵母(Moniliella acetoabutans)ATCC 18455菌种，30℃摇床培养24h，获得一级种子；
摇瓶培养基配方为：葡萄糖200g/L，玉米浆干粉3g/L，尿素5g/L；
②在一个储罐的二级种子培养基底物中添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L后，120℃灭菌15min，泵入二级种子罐，降温至30℃，接入一级种子，接种量5％；无菌空气经过滤除菌后通入发酵罐，罐压0.5MPa，通气量为0.5vvm，培养条件为罐温30℃，转速200r/min，培养时间24h，获得二级种子液；
③在另一个储罐的发酵培养基底物中添加磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁5g/L、硫酸锰5g/L、泡敌0.05％，120℃灭菌15min，泵入发酵罐，降温至30℃，接入二级种子液，接种量10％；发酵条件为罐温28℃；无菌空气经过滤灭菌后通入发酵罐，罐压0.05MPa，通气量为1vvm，转速400r/min，发酵时间为95-100h；葡萄糖浓度下降到0.5％时达到发酵终点，得到含赤藓糖醇的发酵液，其中赤藓糖醇含量为130-135g/L，赤藓糖醇转化率为42-45％；
(3)赤藓糖醇产品的精制
①将含赤藓糖醇的发酵液用板框压滤机进行粗滤以除去发酵液中菌体、蛋白质，以减轻超滤压力，压滤温度为55-60℃，压力0.25MPa，制得粗滤液；
②将粗滤液进行超滤操作，膜截留分子量为1000D，以除去发酵液中残存的菌体、蛋白、核酸、胶体颗粒的大分子物质，操作温度常温，超滤压力0.2MPa，制得超滤液；
③将超滤液进一步纳滤，膜截留分子量200D，以脱除发酵液中的色素、核苷酸、氨基酸、短肽、部分盐离子，操作温度40℃，纳滤压力2MPa，浓缩倍数为15倍，制得纳滤液；
④将纳滤液通过多效降膜蒸发器浓缩至原体积液的20％后送入结晶罐，结晶罐留种10％；结晶总时间60h，其中养晶12h，冷却结晶48h；常规离心分离，干燥，制得赤藓糖醇；制得的赤藓糖醇为白色结晶粉末，有蔗糖甜味，无异味，水分含量0.05％，赤藓糖醇纯度为98-99％。
2.根据权利要求1所述的一种利用碎米生产赤藓糖醇的方法，其特征在于：所述碎米为籼米副产物，即籼米的碎米，或粳米副产物，即粳米的碎米。
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