CN111876446B - 利用米曲霉发酵制备l-苹果酸的工艺 - Google Patents

利用米曲霉发酵制备l-苹果酸的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用米曲霉发酵制备L‑苹果酸的工艺，属于发酵工程技术领域。该利用米曲霉发酵制备L‑苹果酸的工艺，包括以下步骤：向装液量20％的发酵培养基中接入10％的孢子悬液，加入40～50g/L的CaCO3，30～32℃条件下通风培养140～160h；所述发酵培养基以g/L计，含有：100碳源、3氮源、0.1K2HPO4、0.2KH2PO4；在发酵至24～28h时，以g/L计加入FeSO4·7H2O 0.05、MnSO4 0.01；在发酵至80～90h时，以g/L计补加入40碳源。该利用米曲霉发酵制备L‑苹果酸的工艺，提高了L‑苹果酸的得率。

Description

利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺。
背景技术
L-苹果酸是生物体代谢过程TCA循环中产生的一种重要有机酸，作为优良的酸味剂和保鲜剂，在食品、医药、化工、日化和保健等领域具有广泛用途。
L-苹果酸的生产方法主要有化学合成法、发酵法、转化法。目前发酵法生产L-苹果酸，主要采用米曲霉进行发酵。申请公布号为CN105861574A的发明专利公开了一种利用米曲霉发酵产L-苹果酸的方法，该方法以米曲霉为生产菌株，是向装液量20％的发酵培养基中，接入10％的孢子悬液，加入60～80g/LCaCO3，30～34℃通风培养120h；所述发酵培养基以g/L计，含有：120葡萄糖、3胰蛋白胨、0.15KH2PO4、0.15K2HPO4、0.10MgSO4·7H2O、0.10CaCl2·H2O、0.05NaCl、0.01柠檬酸、0.05FeSO4·7H2O，pH自然，该方法未对发酵过程中的pH实时调控，且发酵培养基中的各组分在发酵前一次性加入，发酵得到的L-苹果酸量少。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，该发酵工艺采用补料发酵的方式，提高了L-苹果酸发酵得率。
为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，包括以下步骤：向装液量20％的发酵培养基中接入10％的孢子悬液，加入40～50g/L的CaCO3，30～32℃条件下通风培养140～160h；所述发酵培养基以g/L计，含有：100碳源、3氮源、0.1K2HPO4、0.2KH2PO4；在发酵至24～28h时，以g/L计加入FeSO4·7H2O 0.05、MnSO4 0.01；在发酵至80～90h时，以g/L计补加入40碳源。
进一步地，在发酵至60～70h时用质量分数为15～20％的碳酸钠调节发酵培养基的pH至5～5.5。
进一步地，所述碳源为葡萄糖或淀粉。
进一步地，所述氮源为胰蛋白胨或鱼粉蛋白胨。
进一步地，所述孢子悬液的浓度为1×106个/mL。
进一步地，所述孢子悬液的制备过程为：将米曲霉菌株从斜面接入种子培养基，种子培养温度为30℃，转速为200rpm，培养16h。
进一步地，所述种子培养基以g/L计，含有：30的葡萄糖、3的胰蛋白胨、0.32的KH2PO4、0.45的K2HPO4、0.82的NaH2PO4、0.75的Na2HPO4、0.06的MgSO4.7H2O。
本发明的有益效果：
本发明的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，在开始产酸阶段，加入FeSO4·7H2O、MnSO4等，加入的金属离子改变了米曲霉的代谢过程，提高了L-苹果酸的积累水平。
本发明的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，在发酵后期，碳源消耗较多时，补充碳源，消除了发酵前期因葡萄糖浓度高产生的底物阻遏效应，使得发酵得以继续进行，提高了L-苹果酸的得率。
本发明的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，在发酵后期，改变了发酵的pH，使得L-苹果酸较多的释放出来，提高了L-苹果酸的得率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明作进一步说明。
本发明所用的米曲霉菌株，购买自江南大学，菌种编号为：米曲霉PGRSN-3。
L-苹果酸测定方法：采用HPLC法测定。流动相：0.1mol/L KH2PO4，pH2.8；流速：0.6mL/min；柱温：25℃；检测器：紫外检测器；波长：215nm；柱子：C18。加入1倍体积的2mol/LHCL将发酵液中的碳酸钙溶解完全后，8000r/min离心10min，吸取上清稀释一定倍数过膜处理用液相测定。
实施例1
本实施例的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，包括以下步骤：
1)种子培养：将米曲霉菌液接入种子罐中进行培养，在温度30℃，转速200rpm条件下培养16h，种子培养的培养基以g/L计，含有：30的葡萄糖、3的胰蛋白胨、0.32的KH2PO4、0.45的K2HPO4、0.82的NaH2PO4、0.75的Na2HPO4、0.06的MgSO4.7H2O，培养得到孢子悬液，孢子悬液的浓度为1×106个/mL。
2)发酵：向装液量的体积比为20％的发酵培养基中接入体积比为10％的孢子悬液，加入50g/L的CaCO3，30℃条件下通风培养160h。发酵培养基以g/L计，含有：100葡萄糖、3胰蛋白胨、0.1K2HPO4、0.2KH2PO4。在发酵至28h时，以g/L计加入FeSO4·7H2O 0.05、MnSO40.01。在发酵至90h时，以g/L计补加入40葡萄糖。在发酵至70h时用质量分数为15～20％的碳酸钠调节发酵培养基的pH至5。发酵结束，测得的L-苹果酸产量为125.5g/L。
实施例2
本实施例的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，包括以下步骤：
1)种子培养：将米曲霉菌液接入种子罐中进行培养，在温度30℃，转速200rpm条件下培养16h，种子培养的培养基以g/L计，含有：30的葡萄糖、3的胰蛋白胨、0.32的KH2PO4、0.45的K2HPO4、0.82的NaH2PO4、0.75的Na2HPO4、0.06的MgSO4.7H2O，培养得到孢子悬液，孢子悬液的浓度为1×106个/mL。
2)发酵：向装液量的体积比为20％的发酵培养基中接入体积比为10％的孢子悬液，加入40g/L的CaCO3，32℃条件下通风培养140h。发酵培养基以g/L计，含有：100淀粉、3胰蛋白胨、0.1K2HPO4、0.2KH2PO4。在发酵至24h时，以g/L计加入FeSO4·7H2O 0.05、MnSO40.01。在发酵至80h时，以g/L计补加入40葡萄糖。在发酵至60h时用质量分数为15～20％的碳酸钠调节发酵培养基的pH至5。发酵结束，测得的L-苹果酸产量为121.6g/L。
实施例3
本实施例的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，包括以下步骤：
1)种子培养：将米曲霉菌液入种子罐中进行培养，在温度30℃，转速200rpm条件下培养16h，种子培养的培养基以g/L计，含有：30的葡萄糖、3的胰蛋白胨、0.32的KH2PO4、0.45的K2HPO4、0.82的NaH2PO4、0.75的Na2HPO4、0.06的MgSO4.7H2O，培养得到孢子悬液，孢子悬液的浓度为1×106个/mL。
2)发酵：向装液量的体积比为20％的发酵培养基中接入体积比为10％的孢子悬液，加入45g/L的CaCO3，32℃条件下通风培养150h。发酵培养基以g/L计，含有：100葡萄糖、3蛋白胨鱼粉、0.1K2HPO4、0.2KH2PO4。在发酵至26h时，以g/L计加入FeSO4·7H2O 0.05、MnSO40.01。在发酵至85h时，以g/L计补加入40葡萄糖。在发酵至65h时用质量分数为15～20％的碳酸钠调节发酵培养基的pH至5.3。发酵结束，测得的L-苹果酸产量为122.8g/L。
实施例4
本实施例的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，包括以下步骤：
1)种子培养：将米曲霉菌液接入种子罐中进行培养，在温度30℃，转速200rpm条件下培养16h，种子培养的培养基以g/L计，含有：30的葡萄糖、3的胰蛋白胨、0.32的KH2PO4、0.45的K2HPO4、0.82的NaH2PO4、0.75的Na2HPO4、0.06的MgSO4.7H2O，培养得到孢子悬液，孢子悬液的浓度为1×106个/mL。
2)发酵：向装液量的体积比为20％的发酵培养基中接入体积比为10％的孢子悬液，加入50g/L的CaCO3，32℃条件下通风培养140h。发酵培养基以g/L计，含有：100葡萄糖、3蛋白胨鱼粉、0.1K2HPO4、0.2KH2PO4。在发酵至24h时，以g/L计加入FeSO4·7H2O 0.05、MnSO40.01。在发酵至80h时，以g/L计补加入40葡萄糖。在发酵至70h时用质量分数为15～20％的碳酸钠调节发酵培养基的pH至5.5。发酵结束，测得的L-苹果酸产量为121.8g/L。
实施例5
本实施例的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，包括以下步骤：
1)种子培养：将米曲霉菌液接入种子罐中进行培养，在温度30℃，转速200rpm条件下培养16h，种子培养的培养基以g/L计，含有：30的葡萄糖、3的胰蛋白胨、0.32的KH2PO4、0.45的K2HPO4、0.82的NaH2PO4、0.75的Na2HPO4、0.06的MgSO4.7H2O，培养得到孢子悬液，孢子悬液的浓度为1×106个/mL。
2)发酵：向装液量的体积比为20％的发酵培养基中接入体积比为10％的孢子悬液，加入50g/L的CaCO3，32℃条件下通风培养160h。发酵培养基以g/L计，含有：100葡萄糖、3胰蛋白胨、0.1K2HPO4、0.2KH2PO4。在发酵至25h时，以g/L计加入FeSO4·7H2O 0.05、MnSO40.01。在发酵至90h时，以g/L计补加入40葡萄糖。在发酵至60h时用质量分数为15～20％的碳酸钠调节发酵培养基的pH至5。发酵结束，测得的L-苹果酸产量为123.6g/L。
对比例1
本实施例的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，包括以下步骤：
1)种子培养：将米曲霉菌液接入种子罐中进行培养，在温度30℃，转速200rpm条件下培养16h，种子培养的培养基以g/L计，含有：30的葡萄糖、3的胰蛋白胨、0.32的KH2PO4、0.45的K2HPO4、0.82的NaH2PO4、0.75的Na2HPO4、0.06的MgSO4.7H2O，培养得到孢子悬液，孢子悬液的浓度为1×106个/mL。
2)发酵：向装液量的体积比为20％的发酵培养基中接入体积比为10％的孢子悬液，加入50g/L的CaCO3，30℃条件下通风培养160h。发酵培养基以g/L计，含有：140葡萄糖、3胰蛋白胨、0.1K2HPO4、0.2KH2PO4。在发酵至28h时，以g/L计加入FeSO4·7H2O 0.05、MnSO40.01。在发酵至70h时用质量分数为15～20％的碳酸钠调节发酵培养基的pH至5。发酵结束，测得的L-苹果酸产量为112.3g/L。
对比例2
本实施例的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，包括以下步骤：
1)种子培养：将米曲霉菌液接入种子罐中进行培养，在温度30℃，转速200rpm条件下培养16h，种子培养的培养基以g/L计，含有：30的葡萄糖、3的胰蛋白胨、0.32的KH2PO4、0.45的K2HPO4、0.82的NaH2PO4、0.75的Na2HPO4、0.06的MgSO4.7H2O，培养得到孢子悬液，孢子悬液的浓度为1×106个/mL。
2)发酵：向装液量的体积比为20％的发酵培养基中接入体积比为10％的孢子悬液，加入50g/L的CaCO3，30℃条件下通风培养160h。发酵培养基以g/L计，含有：100葡萄糖、3胰蛋白胨、0.1K2HPO4、0.2KH2PO4、FeSO4·7H2O 0.05、MnSO4 0.01。在发酵至90h时，以g/L计补加入40葡萄糖。在发酵至70h时用质量分数为15～20％的碳酸钠调节发酵培养基的pH至5。发酵结束，测得的L-苹果酸产量为120.7g/L。
对比例3
本实施例的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，包括以下步骤：
1)种子培养：将米曲霉菌液接入种子罐中进行培养，在温度30℃，转速200rpm条件下培养16h，种子培养的培养基以g/L计，含有：30的葡萄糖、3的胰蛋白胨、0.32的KH2PO4、0.45的K2HPO4、0.82的NaH2PO4、0.75的Na2HPO4、0.06的MgSO4.7H2O，培养得到孢子悬液，孢子悬液的浓度为1×106个/mL。
2)发酵：向装液量的体积比为20％的发酵培养基中接入体积比为10％的孢子悬液，加入50g/L的CaCO3，30℃条件下通风培养160h，pH自然。发酵培养基以g/L计，含有：100葡萄糖、3胰蛋白胨、0.1K2HPO4、0.2KH2PO4。在发酵至28h时，以g/L计加入FeSO4·7H2O0.05、MnSO4 0.01。在发酵至90h时，以g/L计补加入40葡萄糖。发酵结束，测得的L-苹果酸产量为90.5g/L。
以上列举的仅是本发明的较佳具体实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，其特征在于，包括以下步骤：向装液量20％的发酵培养基中接入10％的孢子悬液，加入40～50g/L的CaCO3，30～32℃条件下通风培养140～160h；所述发酵培养基以g/L计，含有：100碳源、3氮源、0.1K2HPO4、0.2KH2PO4；在发酵至24～28h时，以g/L计加入FeSO4·7H2O 0.05、MnSO4 0.01；在发酵至80～90h时，以g/L计补加入40碳源；在发酵至60～70h时用质量分数为15～20％的碳酸钠调节发酵培养基的pH至5～5.5；所述碳源为葡萄糖或淀粉；所述氮源为胰蛋白胨或鱼粉蛋白胨。
2.根据权利要求1所述的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，其特征在于，所述孢子悬液的浓度为1×106个/mL。
3.根据权利要求1所述的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，其特征在于，所述孢子悬液的制备过程为：将米曲霉菌株从斜面接入种子培养基，种子培养温度为30℃，转速为200rpm，培养16h。
4.根据权利要求3所述的利用米曲霉发酵制备L-苹果酸的工艺，其特征在于，所述种子培养基以g/L计，含有：30的葡萄糖、3的胰蛋白胨、0.32的KH2PO4、0.45的K2HPO4、0.82的NaH2PO4、0.75的Na2HPO4、0.06的MgSO4.7H2O。
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