CN101255450A

CN101255450A - 利用米根霉发酵产l-苹果酸的工艺

Info

Publication number: CN101255450A
Application number: CNA2008100189249A
Authority: CN
Inventors: 黄和; 何皓; 刘宁; 李霜; 盛晓燕
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2008-01-31
Filing date: 2008-01-31
Publication date: 2008-09-03
Anticipated expiration: 2028-01-31
Also published as: CN101255450B

Abstract

本发明公开了一种利用米根霉发酵产L－苹果酸的工艺，包括米根霉孢子悬浮液的制备、种子培养以及发酵生产L－苹果酸，并在发酵过程中向发酵培养基中添加Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Al³⁺、Cr⁶⁺中的一种或几种，以改变米根霉的传统代谢途径，使其发酵主要产物为L－苹果酸。该方法可以使产物L－苹果酸从安全菌种米根霉发酵的副产物变成主产物，避免了使用致癌菌种黄曲霉发酵生产L－苹果酸的不安全性。而且，该工艺较明显地提高了米根霉发酵生产L－苹果酸的得率，而且操作简单，高效经济，适合于产业化生产。

Description

利用米根霉发酵产L-苹果酸的工艺

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，涉及L-苹果酸的发酵生产新工艺，具体涉及通过添加金属离子促进米根霉发酵产L-苹果酸的方法。

背景技术

L-苹果酸是一种重要的有机酸，它广泛应用在食品、医药、保健品、化工及日化等领域。L-苹果酸是生物三羧酸循环的中间体，易被人体吸收，因此最主要的用途是作为酸味剂和保鲜剂用于食品工业，是继柠檬酸、乳酸之后的世界第三大酸味添加剂，并占有该市场份额的10％。因其口感接近天然果汁并具有天然香味，酸味柔和、爽快，与柠檬酸相比，刺激性缓慢、保留时间长，产生的热量更低，并且不损伤口腔和牙齿等特点，因此有逐渐替代柠檬酸的势头，是目前世界食品工业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。

L-苹果酸的生产方法主要有直接提取法、化学合成法、固定化酶或细胞转化法和发酵法4种。直接提取法由于在原材料中含量相对较少，原料来源有限，生产成本很高，批量生产有困难，因此这一工艺方法应用局限性较大；化学合成法是早期L-苹果酸的生产方法，生产工艺比较复杂，工艺条件要求高，分离精制技术难度大，加之原料为化工产品，应用受到限制，目前很少采用；由于固定化酶或细胞转化法需用的原料富马酸多为石油基产品，限制了L-苹果酸在食品、医药等安全领域的应用，随着化石资源的枯竭也必将影响L-苹果酸的可持续性生产。

综上，化学合成法、固定化酶法、固定化细胞转化法均采用了石油基产品富马酸为原料，随着石油价格的持续大幅攀升，以及消费者对化学合成产品持谨慎和怀疑态度，利用可再生生物质资源进行天然L-苹果酸产品生产的微生物发酵法日益倍受关注。用发酵法来制备L-苹果酸可以实现人类社会生产由传统的以不可再生化石资源为原料的石油炼制向以可再生生物质资源为原料的生物炼制转型，逐渐减少对日益枯竭的石油资源的依赖。

发酵法生产L-苹果酸的研究还未有重大进展，目前正在研究的发酵法生产L-苹果酸的工艺主要有三类：一是糖质原料一步法发酵；二是两步发酵法；三是以富马酸为原料的直接发酵法。其中两步发酵法由于涉及到两种微生物，培养条件要求严格，发酵周期也过长，产酸率相对较低，故其局限性较大，与一步法相比更难工业化；而以富马酸为底物，虽然其产酸水平高、发酵周期短，但因其所用的原料富马酸为石油基产品，生产成本较高，同时随着化石资源的枯竭也必将影响L-苹果酸的可持续性生产，在这一点上与固定化酶或细胞转化法局限性是相同的。

纵观以上几种生产方法，以糖质为原料的一步发酵法生产L-苹果酸的工艺最经济、最有发展前途。该方法生产成本低、潜力大、产品安全性高、原料来源丰富。但目前微生物一步发酵法尚未见工业化大量生产的报道，存在的主要问题是产酸尚未达到理论值，发酵周期太长，并且目前报道的能直接利用糖质原料进行一步发酵生产L-苹果酸的微生物多为黄曲霉(Aspergillus flavus)菌株，由于其次生代谢产物黄曲霉毒素对人体及动物有致癌作用，不符合食品工业的要求。米根霉(Rhizopus oryzae)是经美国FDA认证的安全菌株，其发酵产物不存在对人体及动物有害的物质，且其中存在类似黄曲霉的L-苹果酸代谢途径(见附图1)。在黄曲霉发酵过程中L-苹果酸作为代谢终产物积累，而米根霉将L-苹果酸进一步代谢为富马酸。因此，米根霉在广泛应用于L-乳酸和富马酸的生产过程中，L-苹果酸往往作为一种代谢副产物出现，尚未引起人们的重视。由于L-苹果酸只是传统米根霉发酵产物中的一种副产物，因此目前国内外尚未有利用米根霉体系发酵生产主产物L-苹果酸的方法。

发明内容

本发明的技术目的在于能提供一种利用安全菌种米根霉(Rhizopus oryzae)作为生产菌种，改变米根霉的传统代谢途径(见附图2)，使其发酵主要产物为L-苹果酸的方法，并达到发酵生产L-苹果酸的目的。

为实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案包括米根霉孢子悬浮液的制备、种子培养以及发酵生产L-苹果酸，其特征在于在发酵过程中向发酵培养基中添加Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Al³⁺、Cr⁶⁺溶液中的一种或几种，使其发酵产物主要为L-苹果酸，并提高L-苹果酸的产量。

具体步骤为：

1、米根霉孢子悬浮液的制备

实施本发明所使用的生产菌种米根霉(Rhizopus oryzae)菌株包括：米根霉Rhizopusoryzae ATCC 20344，购自美国典型菌种保藏中心；米根霉Rhizopus oryzae ME-F11，来自本发明人的申请号为200710024503.2、名称为“一种富马酸产生菌及其诱变筛选方法和应用”的专利保藏菌株，其保藏登记号为CCTCC NO：M 207066；米根霉Rhizopusoryzae 3.0242，购自中科院微生物研究所。

孢子萌发培养基为常规产孢子培养基，例如，麸皮培养基、YMP培养基、PDA培养基、查氏培养基等。

孢子悬浮液制备方法为制备孢子悬浮液的常规方法：例如用洗脱液重悬孢子萌发培养基琼脂斜面上培养5～7天的孢子。这种洗脱液可以是聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯的磷酸盐缓冲液；或者吐温80溶液；或者无菌生理盐水；或者无菌水等均适用于本发明。

2、种子培养

种子培养基为根霉属种子培养的常规种子培养基。

本发明所述的种子培养方法为：将孢子悬浮液进行稀释到1.7×10⁷个/mL，转接到无菌的种子培养基中，在32～35℃下培养18～28h。

种子培养结束即可以得到的种子培养液中的米根霉生长形态呈小球状，直径500μm左右。

3、发酵生产L-苹果酸

1)关于发酵培养基

各种适合根霉属发酵的培养基都适用于本发明。

一种合适的碳源由诸如葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖、转化糖、麦芽糖、糖蜜、各种淀粉、谷物制品或者其它包含了前述任一物质的原料的一类有机碳源组成。葡萄糖是一种优先选择的有机碳源，每100mL培养基大约10g～16g。在发酵得到产物阶段，一种合适的碳源由诸如上述的有机碳源和一种无机碳酸盐组成。一种首选的无机碳酸盐是碳酸钙。

合适的氮源包括诸如尿素、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、天冬酰胺以及蛋白质水解物(例如酪蛋白水解物和乳清水解物)这样的有机和无机氮源。其中尿素和硫酸铵是首选。为了优化L-苹果酸的得率，米根霉培养中可利用的氮源浓度应该被限制在10～30mmol/L培养基。

添加到根霉属培养基的无机盐应该包括磷酸盐、硫酸盐、镁离子和锌离子。合适的磷酸盐包括KH₂PO₄和K₂HPO₄，NaH₂PO₄和Na₂HPO₄，磷酸二氢铵或者前述的混合物。在首选的发酵基础培养基中，碳源是葡萄糖和碳酸钙，氮源是硫酸铵，再加上磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌和玉米浆或者生物素。

2)发酵方法

本发明所述的发酵方法为：将培养好的种子培养基按照5％～20％的接种量接种于发酵培养基中，在发酵初始阶段，即发酵一开始即向发酵培养基中添加金属离子Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Al³⁺、Cr⁶⁺中的一种或几种，整个发酵过程于30℃～35℃下培养96～120h。

通过该发酵方法，L-苹果酸的产量达10.67～19.10g/L，L-苹果酸的产量提升19％～176％。

本发明所述的另一发酵方法为：将培养好的种子培养基按照5％～20％的接种量接种于发酵培养基中，在产酸阶段，即当发酵过程进行到18～28h时，向发酵培养基中添加金属离子Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Al³⁺、Cr⁶⁺中的一种或几种，整个发酵过程于30℃～35℃下培养96～120h。

通过该发酵方法，L-苹果酸的产量达10.07～24.12g/L，L-苹果酸的产量提升39％～244％。

本发明所述的加入培养基中的Fe³⁺浓度为0.07～0.26mmol/L，Mn²⁺浓度为0.12～0.30mmol/L，Cr³⁺浓度为0.02～0.25mmol/L，Co²⁺浓度为0.02～0.15mmol/L，Al³⁺浓度为0.13～0.30mmol/L，Cr⁶⁺浓度为0.05～0.25mmol/L。

本发明所述的加入培养基中的Fe³⁺浓度为0.12～0.21mmol/L，Mn²⁺浓度为0.15～0.25mmol/L，Cr³⁺浓度为0.11～0.20mmol/L，Co²⁺浓度为0.05～0.11mmol/L，Al³⁺浓度为0.15～0.23mmol/L，Cr⁶⁺浓度为0.11～0.20mmol/L。

本发明所述的加入培养基中的最佳Fe³⁺浓度为0.16mmol/L，Mn²⁺浓度为0.19mmol/L，Cr³⁺浓度为0.15mmol/L，Co²⁺浓度为0.09mmol/L，Al³⁺浓度为0.19mmol/L，Cr⁶⁺浓度为0.17mmol/L。

本发明的有益效果在于通过添加特定金属离子改变了米根霉的代谢过程，提高L-苹果酸的积累水平。该方法可以使产物L-苹果酸从安全菌种米根霉发酵的副产物变成主产物，避免了使用致癌菌种黄曲霉发酵生产L-苹果酸的不安全性。而且，该工艺较明显地提高了米根霉发酵生产L-苹果酸的得率，而且操作简单，高效经济，适合于产业化生产。

附图说明

图1米根霉传统代谢途径示意图

图2米根霉发酵产L-苹果酸代谢原理示意图

具体实施方式

实施例1

本实施例使用的生产菌株为米根霉Rhizopus oryzae ATCC 20344。

一、培养基配制

孢子萌发培养基：YMP培养基

种子培养基(g/L)：葡萄糖50，尿素2.0，CaCl₂ 1.0，K₂HPO₄ 0.6，MgSO₄ 0.3，ZnSO₄0.0176，FeSO₄ 0.0005，pH值2.5。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖80，(NH₄)₂SO₄ 2.0，K₂HPO₄ 0.15，KH₂PO₄ 0.15，MgSO₄0.1，酒石酸0.0075，生物素1.2×10^-6mol/L，CaCO₃ 60，初始pH值4。

以上各种培养基均在115～120℃下灭菌20min，CaCO₃装在烧瓶中干热灭菌24 h或者制成50％的浆液在发酵罐中灭菌1小时。氮源和培养基其它组分分开灭菌，然后无菌操作添加到先前的培养基混合物中进行接种。待葡萄糖灭菌完成，温度降到60～70℃时，无菌操作下加入CaCO₃、(NH₄)₂SO₄和其它盐溶液。

二、孢子悬浮液的制备

选择于产孢子培养基上产孢子良好的米根霉Rhizopus oryzae YMP琼脂斜面，配制0.05M的含0.1％聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯的磷酸盐缓冲液(pH6.8)洗脱液，用30mL重悬在YMP琼脂斜面培养基上培养5～7天的孢子。

三、种子培养

将孢子悬浮液稀释到孢子浓度为1.7×10⁷个/mL，按接种量4％转接到无菌的装液量为50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在35℃下220rpm摇床培养24h，得到种子液。种子培养结束即可以得到的种子培养液中的米根霉生长形态呈小球状，直径500μm左右。

四、发酵生产L-苹果酸

发酵产物定性定量检测方法为：经一定方式处理后的发酵液样品，采用DIONEXsummit P680高效液相色谱测定其中的L-苹果酸及其它诸如富马酸等杂酸含量。色谱柱为Alltech有机酸色谱柱250mm×4.6mm，柱温为35℃，紫外检测波长210nm，流动相为0.025mol/L的pH＝2.5的KH₂PO₄溶液，流速为1mL/min，进样量为20μL。

将步骤三所得的种子液，按接种量5％接种于装液量3.5L的5L发酵罐中进行发酵，在34℃下通气率为0.5v/v，通过搅拌速率维持在800rpm对溶氧浓度进行控制，培养108h。在发酵一开始即发酵初始，或发酵过程进行到24h时即产酸阶段加入FeCl₃、MnSO₄·H₂O、CrCl₃·6H₂O、CoCl₂·6H₂O、Al₂(SO4)₃、Na₂Cr₂O₇·2H₂O中的一种，其发酵产酸结果如表1所示：

表1加入一种金属离子溶液的产酸结果

注：A为L-苹果酸，B为富马酸。

实施例2

本实施例使用的生产菌株为米根霉Rhizopus oryzae ME-F11，且本实施例的第一、二、三步与实施例1相同，第四步的发酵产物定性定量检测方法亦与实施例1相同。

将步骤三所得的种子液，按接种量5％接种于装液量3.5L的5L发酵罐中进行发酵，在35℃下通气率为0.5v/v，通过搅拌速率维持在800rpm对溶氧浓度进行控制，培养120h。在发酵一开始即发酵初始，或发酵过程进行到18h时即产酸阶段加入FeCl₃、MnSO₄·H₂O、CrCl₃·6H₂O、CoCl₂·6H₂O、Al₂(SO4)₃、Na₂Cr₂O₇·2H₂O中的两种，其发酵产酸结果如表2所示：

表2加入两种金属离子溶液的产酸结果

注：A为L-苹果酸，B为富马酸。

实施例3

本实施例使用的生产菌株为米根霉Rhizopus oryzae3.0242，且本实施例的第一、二、三步与实施例1相同，第四步的发酵产物定性定量检测方法亦与实施例1相同。

将步骤三所得的种子液，按接种量20％接种于装液量3.5L的5L发酵罐中进行发酵，在30℃下通气率为0.5v/v，通过搅拌速率维持在800rpm对溶氧浓度进行控制，培养96h。在发酵一开始即发酵初始，或发酵过程进行到28h时即产酸阶段加入FeCl₃、MnSO₄·H₂O、CrCl₃·6H₂O、CoCl₂·6H₂O、Al₂(SO4)₃、Na₂Cr₂O₇·2H₂O中的三种，其发酵产酸结果如表3所示：

表3加入三种金属离子溶液的产酸结果

注：A为L-苹果酸，B为富马酸。

实施例4

本实施例使用的生产菌株为米根霉Rhizopus oryzae ATCC 20344，且本实施例的第一、二、三步与实施例1相同，第四步的发酵产物定性定量检测方法亦与实施例1相同。

将步骤三所得的种子液，按接种量15％接种于装液量3.5L的5L发酵罐中进行发酵，在34℃下通气率为0.5v/v，通过搅拌速率维持在800rpm对溶氧浓度进行控制，培养120h。在发酵一开始即发酵初始，或发酵过程进行到28h时即产酸阶段加入FeCl₃、MnSO₄·H₂O、CrCl₃·6H₂O、CoCl₂·6H₂O、Al₂(SO4)₃、Na₂Cr₂O₇·2H₂O中的四种，其发酵产酸结果如表4所示：

表4加入四种金属离子溶液的产酸结果

注：A为L-苹果酸，B为富马酸。

实施例5

将步骤三所得的种子液，按接种量12％接种于装液量3.5L的5L发酵罐中进行发酵，在33℃下通气率为0.5v/v，通过搅拌速率维持在800rpm对溶氧浓度进行控制，培养108h。在发酵一开始即发酵初始，或发酵过程进行到24h时即产酸阶段将FeCl₃、MnSO₄·H₂O、CrCl₃·6H₂O、CoCl₂·6H₂O、Al₂(SO4)₃、Na₂Cr₂O₇·2H₂O中的五种，其发酵产酸结果如表5所示：

表5加入五种金属离子溶液的产酸结果

注：A为L-苹果酸，B为富马酸。

实施例6

本实施例使用的生产菌株为米根霉Rhizopus oryzae 3.0242，且本实施例的第一、二、三步与实施例1相同，第四步的发酵产物定性定量检测方法亦与实施例1相同。

将步骤三所得的种子液，按接种量12％接种于装液量3.5L的5L发酵罐中进行发酵，在33℃下通气率为0.5v/v，通过搅拌速率维持在800rpm对溶氧浓度进行控制，培养108h。在发酵一开始即发酵初始，或发酵过程进行到24h时即产酸阶段将六种金属离子FeCl₃、MnSO₄·H₂O、CrCl₃·6H₂O、CoCl₂·6H₂O、Al₂(SO4)₃、Na₂Cr₂O₇·2H₂O均加入发酵体系，其发酵产酸结果如表6所示：

表6加入六种金属离子溶液的产酸结果

注：A为L-苹果酸，B为富马酸。

Claims

1、一种利用米根霉发酵产L-苹果酸的工艺，包括米根霉孢子悬浮液的制备、种子培养以及发酵生产L-苹果酸，其特征在于在发酵生产L-苹果酸过程中向发酵培养基中添加Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Al³⁺、Cr⁶⁺中的一种或几种，使其发酵产物主要为L-苹果酸，并提高L-苹果酸的产量。

2、根据权利要求1所述的发酵生产L-苹果酸的步骤，其特征在于将培养好的种子培养基按照5％～20％的接种量接种于发酵培养基中，在发酵初始阶段，即发酵一开始即向发酵培养基中添加金属离子Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Al³⁺、Cr⁶⁺中的一种或几种，整个发酵过程于30℃～35℃下培养96～120h。

3、根据权利要求1所述的发酵生产L-苹果酸的步骤，其特征在于将培养好的种子培养基按照5％～20％的接种量接种于发酵培养基中，在产酸阶段，即当发酵过程进行到18～28h时，向发酵培养基中添加金属离子Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Al³⁺、Cr⁶⁺中的一种或几种，整个发酵过程于30℃～35℃下培养96～120h。

4、根据权利要求2和3所述的发酵生产L-苹果酸的步骤，其特征在于添加的金属离子的浓度为：Fe³⁺浓度为0.07～0.26mmol/L，Mn²⁺浓度为0.12～0.30mmol/L，Cr³⁺浓度为0.02～0.25mmol/L，Co²⁺浓度为0.02～0.15mmol/L，Al³⁺浓度为0.13～0.30mmol/L，Cr⁶⁺浓度为0.05～0.25mmol/L。

5、根据权利要求2和3所述的发酵生产L-苹果酸的步骤，其特征在于添加的金属离子的浓度为：Fe³⁺浓度为0.12～0.21mmol/L，Mn²⁺浓度为0.15～0.25mmol/L，Cr³⁺浓度为0.11～0.20mmol/L，Co²⁺浓度为0.05～0.11mmol/L，Al³⁺浓度为0.15～0.23mmol/L，Cr⁶⁺浓度为0.11～0.20mmol/L。

6、根据权利要求2和3所述的发酵生产L-苹果酸的步骤，其特征在于添加的金属离子的浓度为：Fe³⁺浓度为0.16mmol/L，Mn²⁺浓度为0.19mmol/L，Cr³⁺浓度为0.15mmol/L，Co²⁺浓度为0.09mmol/L，Al³⁺浓度为0.19mmol/L，Cr⁶⁺浓度为0.17mmol/L。