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一种微生物转化制备乳糖酸的方法 Download PDF

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一种微生物转化制备乳糖酸的方法，属于食品生物技术领域。本发明提供一株微生物转化制备乳糖酸的菌株，其分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)SK17.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2010216。用荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescence)SK17.001微生物作为菌种，以乳糖为转化底物，添加氮源及无机盐组成发酵培养基，微生物转化法制备乳糖酸。在发酵过程中通过添加碱类物质CaCO3，使得发酵过程中pH保持恒定，提高乳糖的转化率。优选条件下转化率达到90%以上。本发明所得产品乳糖酸安全可靠，可用作医药中间体、食品添加剂，具有抗氧化、增强难溶矿物质的吸收等生理功能。

Description

一种微生物转化制备乳糖酸的方法
技术领域
本发明涉及乳糖酸的制备方法，具体涉及一种微生物转化制备乳糖酸的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
乳糖酸(lactobionic acid)是第三代果酸，是集延缓衰老、保湿、抗氧化和促进机体更新等多种功效于一身的最先进果酸。由于其本身存在于机体中，所以不存在有刺激性问题，具有优异的抗氧化能力，用在器官移植中，可防止器官受到自由基的伤害；乳糖酸还可避免细胞膜因氧化而受到的破坏，具有极佳的保水性，是化妆品中的重要组分。乳糖酸是器官移植缓冲液中的重要组分，和金属螯合后的产物可降低由于离子催化产生的羟基对组织的损伤。乳糖酸还可增加大环内酯类抗生素的溶解度，如红霉素的乳糖酸水溶液的溶解度比红霉素高出50-100倍；乳糖酸的钙盐的溶解度较高，可用来补充钙的吸收，也可用来做葡萄糖酸钙的过饱和溶液。乳糖酸可以降低酸味，减少成熟时间，在干酪和酸奶的生产中，可促进风味，消除苦味；乳糖酸有很强的甜味，比乳酸具有更温和、更甜的风味，可作为酸化剂使用。乳糖酸可以促进矿物质盐的吸收，如可通过铁或铜的乳糖酸钙螯合物的形式加入饮料中，且不会增加异味和气味，当这些金属直接加入时，会产生不良的气味。乳糖酸还可作为洗涤剂的组分。在化妆品中加入乳糖酸，可抗氧化、抗衰老。乳糖酸的CAS登录号：96-82-2。
目前乳糖酸的制备有化学催化合成法以及微生物转化法。化学催化合成法有许多不利的因素，例如产生多种副产物和化学污染物，而形成的众多副产物又使分离、纯化步骤变得复杂。近年来研究人员都在寻找微生物转化法来制备乳糖酸。微生物转化法生产乳糖酸具有高效，低成本，转化率高，副产物少等优点。
发明内容
本发明的目的是提供利用微生物将乳糖转化为乳糖酸的方法。具体内容涉及利用微生物转化法制备乳糖酸的方法。本发明采用的微生物菌种能够将乳糖转化为乳糖酸，转化率高、副产物少，通过发酵转化取得了显著效果。
本发明的技术方案：一株微生物转化制备乳糖酸的菌株，其分类命名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）SK 17.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2010216。
一种用所述菌株微生物转化制备乳糖酸的方法，以CCTCC NO：M 2010216为出发菌株，以乳糖为转化底物，采用碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基，微生物转化制备乳糖酸，工艺为：
    （1）菌种：采用CCTCC NO：M 2010216为出发菌株；
（2）菌种保藏：所用菌种保藏在保藏培养基上保存，两周转接一次；
保藏培养基：PDA培养基；
（3）种子培养：从保藏培养基转入种子培养基需活化2次，每次30℃下培养24 h；
种子培养基的组分以g/100mL计为：蔗糖3，蛋白胨1，酵母膏1，氯化钾0.05，磷酸氢二钾0.1，硫酸镁0.02，硝酸钠0.3，以双蒸水配制，pH 5.5-7；
（4）微生物转化：将CCTCC NO：M 2010216菌株添加到发酵培养基中，利用微生物产的糖类转化酶将乳糖转化为乳糖酸；
发酵培养基的组分以g/100mL计为：碳源3.0-5.0，氮源 0.5-3.5，磷酸钾0.2，硫酸镁 0.2，硫酸锰 0.005，以双蒸水配制，pH 6.0-6.2；
所述碳源为乳糖，所述氮源为酵母膏和/或蛋白胨；
转化底物乳糖在培养基中的浓度为3%-10%W/V，种子培养液以6%的接种量，接入添加不同氮源以及无机盐组成的发酵培养基中，250 mL三角瓶装液量为30mL；在28-30℃，200-220 rpm的条件下培养24-60h，得到含乳糖酸的发酵液；
（5）在发酵过程中需要加入弱碱或碳酸盐调节pH，优选的是CaCO3。通过添加碱类物质CaCO3，使得发酵过程中 pH 6.0-6.2保持恒定，以此提高乳糖的转化率。
所述微生物转化制备乳糖酸的方法，转化底物乳糖在发酵培养基中的浓度优选为3%-5%W/V，在28-30℃，200-220 rpm的条件下培养时间优选为36-60h。
乳糖酸应理解为乳糖酸及其盐类，如乳糖酸钙。
检测乳糖酸的方法如下：
取发酵液离心，上清液经微孔滤膜过滤（0.22μm），滤液经HPLC分析。HPLC条件：液相色谱仪Agilent1100；色谱柱：Shodex SH1011（8.0×300（mm））；流动相为0.01N H2SO4；检测器：紫外检测器，210nm，柱温：50℃，流速：0.8mL/min，进样量：10μL，乳糖酸标样浓度：1%。
本发明的有益效果：本发明提供了一种利用微生物转化制备乳糖酸的方法，表明荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）SK17.001在乳糖浓度为3﹪时，培养60h转化率能达到91%。乳糖浓度为10%时，培养135h，转化率达到90%以上。
    生物材料样品保藏：荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）SK 17.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期：2010年9月2日，保藏编号CCTCC NO：M 2010216。
附图说明
图1 乳糖酸液相色谱图。
具体实施方式
通过实验，得到了影响发酵转化乳糖酸产率的主要因素：
实施例1. 发酵时间对乳糖酸产量的影响
按说明书所述的发酵条件，发酵培养基中底物为3%的乳糖，通过对Pseudomonas flurosecence SK17.001在不同发酵时间产乳糖酸的检测，发现发酵60h乳糖酸含量最高，发酵时间对产乳糖酸的影响如表1所示。
表1、3%乳糖浓度下的发酵时间对转化产乳糖酸的影响
时间(h) 24 36 48 60
乳糖酸 (g/100mL) 1.02 2 2.5 2.71
实施例2  底物浓度对转化率的影响
3%乳糖，0.5% CaCO3，起始pH6.2，温度30℃，220rpm，Pseudomonas fluorescence SK 17.001培养60h，乳糖转化为乳糖酸的转化率可达到91%。
10%乳糖，1.5% CaCO3，起始pH6.2，温度30℃，220rpm, Pseudomonas fluorescence SK 17.001培养120h，乳糖转化为乳糖酸的转化率可达到80%。
20%乳糖，3% CaCO3，起始pH 6.2，温度30℃，220rpm, Pseudomonas fluorescence SK 17.001培养120h，乳糖转化为乳糖酸的转化率可达到62.5%。
在培养基中添加不同浓度的底物，用上述优选的培养基对Pseudomonas flurosecence SK 17.001进行转化，在所述转化时间后进行检测，发现随着培养基中乳糖浓度的增加，转化率呈下降的趋势，如表2所示。
表2 底物浓度对转化率的影响
乳糖浓度 3﹪ 10﹪ 15﹪ 20﹪
转化率 91﹪ 80﹪ 69﹪ 62.5﹪
实施例3 在底物之外再添加不同的碳源对转化率的影响
20%乳糖，2%果糖，3%CaCO3，起始pH 6.2，温度30℃，220rpm, Pseudomonas fluorescence SK 17.001培养120h，乳糖转化为乳糖酸的转化率可达到90%。
20%乳糖，2%葡萄糖，3%CaCO3，起始pH 6.2，温度30℃，220rpm, Pseudomonas fluorescence SK 17.001培养120h，乳糖转化为乳糖酸的转化率可达到84%。
20%乳糖，2%甘油，3%CaCO3，起始pH 6.2，温度30℃，220rpm, Pseudomonas fluorescence SK 17.001培养120h，乳糖转化为乳糖酸的转化率可达到70%。
20%乳糖，0.2%果糖，3%CaCO3，起始pH 6.2，温度30℃，220rpm, Pseudomonas fluorescence SK 17.001培养120h，乳糖转化为乳糖酸的转化率可达到75%。
20%乳糖，0.2%葡萄糖，3%CaCO3，起始pH 6.2，温度30℃，220rpm, Pseudomonas fluorescence SK 17.001培养120h，乳糖转化为乳糖酸的转化率可达到75%。
表3 添加不同碳源对乳糖转化率的影响
碳源 2﹪果糖 2﹪葡萄糖 2﹪甘油 对照（不另行添加）
转化率 90﹪ 84﹪ 70﹪ 62.5﹪
采用微生物能将乳糖转化为乳糖酸，转化率高、副产物少。通过微生物转化取得了显著效果，为乳糖酸的微生物转化提供了一个新途径。

Claims (3)

1.一株微生物转化制备乳糖酸的菌株，其分类命名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）SK 17.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2010216。
2.一种用权利要求1所述菌株微生物转化制备乳糖酸的方法，其特征在于以CCTCC NO：M 2010216为出发菌株，以乳糖为转化底物，采用碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基，微生物转化制备乳糖酸，工艺为：
（1）菌种：采用CCTCC NO：M 2010216为出发菌株；
（2）菌种保藏：所用菌种在保藏培养基上保存，两周转接一次；
保藏培养基：PDA培养基；
（3）种子培养：从保藏培养基转入种子培养基需活化2次，每次30℃下培养24 h；
种子培养基的组分以g/100mL计为：蔗糖3，蛋白胨1，酵母膏1，氯化钾0.05，磷酸氢二钾0.1，硫酸镁0.02，硝酸钠0.3，以双蒸水配制，pH 5.5-7；
（4）微生物转化：将CCTCC NO：M 2010216菌株添加到发酵培养基中，利用微生物产的糖类转化酶将乳糖转化为乳糖酸；
发酵培养基的组分以g/100mL计为：碳源3.0-5.0，氮源 0.5-3.5，磷酸钾0.2，硫酸镁 0.2，硫酸锰 0.005，以双蒸水配制，pH 6.0-6.2；
所述碳源为乳糖，所述氮源为酵母膏和/或蛋白胨；
转化底物乳糖在发酵培养基中的浓度为3%-10%W/V，种子培养液以6%的接种量，接入添加不同氮源以及无机盐组成的发酵培养基中，250 mL三角瓶装液量为30mL；在28-30℃，200-220 rpm的条件下培养24-60h，得到含乳糖酸的发酵液；
（5）在发酵过程中通过添加碱类物质CaCO3，使得发酵过程中 pH 6.0-6.2保持恒定，以此提高乳糖的转化率。
3.根据权利要求2所述微生物转化制备乳糖酸的方法，其特征在于转化底物乳糖在发酵培养基中的浓度为3%-5%W/V，在28-30℃，200-220 rpm的条件下培养36-60h。
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