TWI649420B - Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株及其生產之新穎乳糖氧化酵素與轉化乳糖酸方法 - Google Patents

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Abstract

本發明有關於一種 Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株及其生產之新穎乳糖氧化酵素與轉化乳糖酸方法，所述 Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株生產新穎乳糖氧化酵素的產率高，且新穎乳糖氧化酵素係具有較高的反應性與專一性，可將乳糖轉化為乳糖酸(lactobionic acid)。

Description

Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株及其生產之新穎乳糖氧化酵素與轉化乳糖酸方法
本發明係有關於一種 Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株及其生產之新穎乳糖氧化酵素(Lactose oxidase)與方法，尤其係指一種由寄存編號BCRC 930190之NUK-21菌株(學名： Myrmecridium flexuosum)分離出的乳糖氧化酵素，其具有高受質專一性、高催化率與高乳糖轉化率，可有效地氧化乳糖以轉化為乳糖酸。
乳糖酸(lactobionic acid)為ㄧ種高附加價值乳糖衍生物，可廣泛地應用於食品、化妝品、醫藥以及工業上。早年並無適合的菌株以及酵素生產乳糖酸，因此大多係藉由化學轉化方式生產乳糖酸，例如以溴水氧化乳糖(Carbohydr Res. 2005 Dec 12;340(17):2698-705)，可以生產大量的乳糖酸成品，但此方法會伴隨有毒副產物的生成並造成環境汙染。
微生物生產乳糖酸之方法係利用發酵槽進行微生物發酵以大量生產乳糖酸。已知能發酵生產乳糖酸的菌株有假單胞菌 Pseudomonas taetrolens(Bioresour Technol. 2011 Oct;102(20):9730-6；Bioresour Technol. 2012 Apr;109:140-7；Bioresour Technol. 2013 Apr;134:134-42)、運動發酵單孢菌( Zymomonas mobilis)、洋蔥伯克氏菌( Burkholderia cepacia)、醋桿菌( Acetobacter orientalis)等。然而，有些高產量菌株屬於突變株，會造成安全方面之疑慮。另外，上述微生物發酵方法雖然可於發酵槽中產生含有乳糖酸之發酵液，但後續純化困難，因此後續有人提出酵素生產方法。
利用酵素生產乳糖酸之方法係藉由具特異性的酵素進行一連串的反應，以將乳糖氧化。此方法之優點為可將較純的乳糖直接轉化成乳糖酸，大幅減少下游純化步驟，因此相較於微生物發酵法，酵素催化法能以較便宜的方式獲得高純度乳糖酸。然而，酵素催化法的是將會產生所需酵素之菌種培養後，將酵素萃取並純化，隨後將酵素液與含有乳醣的培養基一同反應，再將培養基進行超過濾以分離大分子與小分子，最後進行管柱純化，以得到所需純度之乳糖酸。故，酵素催化法的乳糖酸產量上無法如發酵槽般大量生產。
近年來出現了一些較適合工業化的酵素，例如目前由諾和諾德(Novo Nordisk)以及科漢森(Chr. Hansen)策略聯盟推出的LactoYIELD ®，其係使用新穎的carbohydrate:acceptor oxidoreductase (Eur J Biochem. 2001 Feb;268(4):1136-42)進行轉化，此種酵素與纖維二糖去氫酶需要添加輔因子作為電子接受者不同，可使用溶氧(dissolved oxygen)作為電子接受者，故能大幅降低生產成本。然而，上述研究結果發現原本菌株所生產的酵素對於乳糖的專一性僅為52% (對於纖維二糖的專一性為100%)，可能由於原先菌株產量少或毒性等問題，因此轉基因到另一菌株進行表現，對於乳糖的專一性驟降到28% (纖維二糖100%)。
另，中國專利公告第CN 1976593 B號「一種乳糖酸高產率的酶工藝」與美國專利公開第US 20070105200 A1號「Enzymatic process for obtaining increased yield of lactobionic acid」，亦揭示一種來自真菌 Microdochium nivale的醣類氧化酶，由於其轉化乳糖酸的效率不佳，仍須加入過氧化氫酶(catalase)以增進乳糖轉化為乳糖酸的轉化率。
爰此，如何研創產量更好的菌株、反應性以及專一性更高的氧化酵素，以更有效率地生產乳糖酸仍為相關領域待解決之問題。
今，發明人即是鑑於上述現有用於生產乳糖酸技術於實際實施使用時仍具有多處缺失，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明主要目的為提供一種 Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株及其生產之新穎乳糖氧化酵素與轉化乳糖酸方法，其係指一種由 Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株分離出的乳糖氧化酵素具有高受質專一性與高催化率與高乳糖轉化率，可有效地氧化乳糖以轉化為乳糖酸。
為了達到上述實施目的，本發明提供一種經分離且純化之 Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株，其為寄存編號BCRC 930190之NUK-21菌株(學名： Myrmecridium flexuosum)，並將上述分離株接種於一適合培養基中，及在適當條件下進行培養以獲得培養物，係可進一步分離出新穎乳糖氧化酵素，其分子量為47.2 kDa，酵素含鋅離子做為輔酵素(coenzyme)。NUK-21乳糖氧化酵素的 E 280nm 1%為7.58。對於乳糖之催化反應速率Km為0.076 mM，K cat每秒為97，因低的Km值，對乳糖酸之轉化率可達100%。
於本發明之一實施例中，培養基係含有麩皮與水組成之固體培養基、或含有麩皮組成且添加有氯化鈉(NaCl)與二價銅離子之液體培養基，或含有脫脂黃豆粉組成之液體培養基；舉例而言，酵素生產培養基可為含有麩皮與水之比例為1：1.5至1：2.5組成之麩皮固體培養基(solid-state fermentation, SSF)，亦可進一步以添加麩皮或脫脂黃豆粉組成之液體培養基(Submerged fermentation , SmF)，來生產出細胞外新穎乳糖氧化酵素。又，含有麩皮的液體培養基最佳為添加有0.5%氯化鈉(NaCl)與0.01%二價銅離子(如硫酸銅)具有較高的酵素活性。
於本發明之一實施例中，固體培養基培養3.5天後，酵素活性達到6單位/克固體培養基，液體培養基培養4天後，酵素活性達到0.55單位/毫升液體培養基。
於本發明之一實施例中，培養之溫度為25℃-35℃，且培養之時間為3-7天。
相較於現有技術，本發明之菌株不僅具有高產率(每5克麩皮可產生約25單位以上的乳糖氧化酵素)，且其乳糖氧化酵素更具有高受質專一性、高乳糖酸轉化率與高催化率，因此應用於生產乳糖酸，具有低成本之優點。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明提供一種經分離且純化之 Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株(簡稱NUK-21)，其為寄存編號BCRC 930190之NUK-21菌株(學名： Myrmecridium flexuosum)。
本發明亦提供一種製備NUK-21培養物之方法，其包含將NUK-21菌株的分離株接種於一適合培養基中，及在適當條件下進行培養以獲得培養物，係可進一步分離出新穎乳糖氧化酵素；較佳而言，培養基係含有麩皮與水組成之固體培養基、或含有麩皮組成且添加有氯化鈉(NaCl)與二價銅離子之液體培養基，或含有脫脂黃豆粉組成之液體培養基；例如酵素生產培養基可為含有麩皮與水之比例為1：1.5至1：2.5組成之麩皮固體培養基(SSF)，亦可進一步以添加麩皮或脫脂黃豆粉組成之液體培養基(SmF)，來生產出細胞外新穎乳糖氧化酵素；並且於溫度為25℃-35℃，培養3-7天。其中，含有麩皮的液體培養基最佳為添加有0.5%氯化鈉(NaCl)與0.01%二價銅離子(如硫酸銅)具有較高的酵素活性。
本發明亦提供一種新穎乳糖氧化酵素，其係分離自如上述方法所製得之培養物，新穎乳糖氧化酵素之分子量為47.2 kDa，酵素含鋅離子做為輔酵素(coenzyme)。對於乳糖之催化反應速率Km為0.076 mM，K cat每秒為97，因低的Km值對乳糖酸之轉化率為100%。
本發明亦提供一種生產新穎乳糖氧化酵素之方法，其包含下述步驟：(a)將NUK-21菌株接種於一麩皮固體培養基；以及(b)使NUK-21菌株於溫度25℃-35℃培養3-7天，以得到新穎乳糖氧化酵素，其中NUK-21菌株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 930190。較佳而言，培養基係含有麩皮與水組成之固體培養基、或含有麩皮組成且添加有氯化鈉(NaCl)與二價銅離子之液體培養基，或含有脫脂黃豆粉組成之液體培養基；例如酵素生產培養基可為含有麩皮與水之比例為1：1.5至1：2.5組成之麩皮固體培養基(SSF)，亦可進一步以添加麩皮或脫脂黃豆粉組成之液體培養基(SmF)，來生產出細胞外新穎乳糖氧化酵素；並且於溫度為25℃-35℃，培養3-7天。其中，含有麩皮的液體培養基最佳為添加有0.5%氯化鈉(NaCl)與0.01%二價銅離子(如硫酸銅)具有較高的酵素活性。
本發明亦提供一種利用新穎乳糖氧化酵素轉化乳糖酸的方法，其包含將NUK-21分離株接種於一適合培養基中，及在適當條件下進行培養以轉化乳糖酸，其中培養基係含有麩皮與水組成之固體培養基、或含有麩皮組成且添加有氯化鈉(NaCl)與二價銅離子之液體培養基，或含有脫脂黃豆粉組成之液體培養基；例如培養基可為含有麩皮與水之比例為1：1.5至1：2.5組成之麩皮固體培養基(SSF)，亦可進一步以添加麩皮或脫脂黃豆粉組成之液體培養基(SmF)，來生產出細胞外新穎乳糖氧化酵素，其中，含有麩皮的液體培養基最佳為添加有0.5%氯化鈉(NaCl)與0.01%二價銅離子(如硫酸銅)具有較高的酵素活性。較佳而言，固體培養基培養3.5天後，酵素活性達到6單位/克固體培養基；液體培養基培養4天後，酵素活性達到0.55單位/毫升液體培養基。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
為了開發臨床檢驗以及能轉化特殊產物用途之酵素，發明人自1990 年來不斷從各地土壤中尋找具有價值並且適用於產業化之相關酵素。近日於高雄楠梓區土壤中分離出一株能生產乳糖氧化酵素(Lactose oxidase)之真菌，NUK-21在MEA培養基(Malt extract agar)於25℃培養13天，菌落顏色呈淺橘色到橘色，菌落中心覆蓋孢子呈粉狀。在光學顯微鏡(NIKON ECLIPSE E100)下觀察，分生孢子柄不分支、平直或曲折、厚壁、具橫隔，如第一圖顯微鏡放大圖(400x)所示。產孢細胞著生在分生孢柄上，圓柱形，平直或曲折，長度多變，半透明到淺棕色，具有分散的疙瘩狀小齒。分生孢子單生、透明、薄壁、光滑或微細疣狀，無橫隔，形狀為橢圓形、卵圓形或梭形，大小為3.4-8.6 × 2.5-4.7 μm。
取名為NUK-21菌株，並於財團法人食品工業研究所生物材料寄存，2017年9月19日申請，號碼為BCRC 930190。
實施例一： 菌種培養及其與酵素活性之關係
(1) 菌種培養：NUK-21菌株生長於的MY平板培養基(含0.3%麥芽抽出物、0.3%酵母抽出物、0.5% peptone、1%葡萄糖以及1.5%洋菜膠)，於30℃進行培養3-5天。之後，切下2×2公分生長於平板培養基的菌種，接種於內含有5克麩皮及水混合成的250 毫升三角錐形瓶中，於30℃培養3-5天，待菌絲長滿麩皮表面，加入50毫升含0.2% SDS之50 mM Tris-HCl (pH 7.8)緩衝液(A緩衝液)進行酵素萃取，以紗布過濾去除殘餘之麩皮，離心去除菌體後取得上清酵素液並進行酵素活性測定。
(2)固態發酵(SSF)：將5克麩皮添加不同水分做成的培養基中，30℃培養3.5天後，以水分添加7.5至12.5 ml之間組成的固體培養基培養時，有最好的酵素活性生產條件，每克麩皮培養基可達6單位乳糖氧化酵素活性單位。
(3) 固態發酵(SSF)中分析成長天數與成長溫度：將5克麩皮添加10 ml水分做成的培養基，30℃培養2-7天，依不同時間取出培養基，以50 ml含0.2% SDS的A緩衝液進行萃取，並測定其酵素活性，結果請參閱第二圖，乳糖氧化酵素活性第2天時仍較低，第3天活性上升，觀察第3天的培養菌瓶，明顯發現麩皮佈滿灰色微小菌絲之外，麩皮顏色也由黃棕色轉為偏深棕色，於第4天時酵素活性達到最高。酵素最佳的生產時間為的4天。另，將5克麩皮添加10 ml水分做成的培養基，酵素最佳的生產溫度為30℃。另，第二圖亦顯示，最適合培養溫度約為30℃，於35℃時萃取液活性僅剩下23%。
(4) 液態發酵(SmF)：在液態發酵生產中，參考林等人發表的文獻由基礎培養基組成(含0.5%食鹽、0.2%二鉀一氫磷酸鹽及0.02%硫酸鎂)進行最佳的生產之探討，結果如表一，初步發現在氮源選擇上，脫脂黃豆粉和麩皮是良好的氮源來源， NUK-21菌在含有脫脂黃豆粉或麩皮之培養基中，與其他不同種類氮源相比可提高酵素生產量。
表一：不同種類氮源對NUK-21菌生產乳糖氧化酵素之影響 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 氮源 (4%) </td><td> 酵素活性 (活性單位/毫升) </td><td> 蛋白質 (毫升/毫克) </td></tr><tr><td> 粗糠 </td><td> 0 </td><td> － </td></tr><tr><td> 米糠 </td><td> 0 </td><td> － </td></tr><tr><td> 脫脂黃豆粉 </td><td> 0.22±0.05 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> 麩皮 </td><td> 0.18±0.04 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> 玉米粉 </td><td> 0 </td><td> － </td></tr><tr><td> 小米 </td><td> 0 </td><td> － </td></tr></TBODY></TABLE>
進一步地，分別將脫脂黃豆粉和麩皮進行最佳的生產之探討，藉由氮源種類與濃度的選擇、碳源的選擇、最適培養溫度、pH值、NaCl、界面活性劑及不同金屬離子找出最佳的液態培養條件，提供大量酵素發酵的生產。
在脫脂黃豆粉部分發現NaCl的存在與否對於液態培養之影響很大，不添加NaCl培養的酵素活性大增，最後最適生產的條件為4%脫脂黃豆粉、1%纖維素、0.2%二鉀一氫磷酸鹽及0.02%硫酸鎂，以轉速130 rpm恆溫30℃震盪培養4天，有最好的酵素生產，每毫升可達0.55活性單位，如第三圖所示。
在麩皮部分發現NaCl的存在與否對於液態培養之影響不大，但金屬離子對於液態培養之影響就很大，經詳細探討最後最適生產的條件為4%麩皮、0.5% NaCl、0.2%二鉀一氫磷酸鹽及0.02%硫酸鎂組成之基礎培養基，添加0.01%不同的金屬離子於培養基，以轉速130 rpm恆溫30℃震盪培養4天；如表二所示，有些金屬離子與對照組(空白組)相比酵素活性約可增加2倍；其中添加0.01%二價銅離子有最好的酵素活性，每毫升可達0.61活性單位。
表二：不同種類金屬離子對NUK-21菌生產乳糖氧化酵素之影響 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 金屬離子 (0.01%) </td><td> 酵素活性 (活性單位/毫升) </td></tr><tr><td> 空白組 </td><td> 0.23 </td></tr><tr><td> 硫酸銅 </td><td> 0.61 </td></tr><tr><td> 硫酸鎘 </td><td> 0.42 </td></tr><tr><td> 硫酸鉀 </td><td> 0.26 </td></tr><tr><td> 硫酸鐵 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> 硫酸鋅 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> 硫酸鈉 </td><td> 0.26 </td></tr><tr><td> 硫酸錳 </td><td> 0.37 </td></tr><tr><td> 硫酸鋁 </td><td> 0.37 </td></tr><tr><td> 氯化鎳 </td><td> 0.43 </td></tr><tr><td> 氯化鈣 </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> 三氯化鐵 </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td> 氯化鈷 </td><td> 0.26 </td></tr><tr><td> 氯化鉛 </td><td> 0.29 </td></tr><tr><td> 氯化錫 </td><td> 0.32 </td></tr><tr><td> 氯化汞 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> 硝酸銀 </td><td> 0.28 </td></tr></TBODY></TABLE>
(5)產物分析：在0.1 ml反應溶液中包含0.08活性單位乳糖氧化酵素與2.5%乳糖受質，反應12小時後，取適量反應物點於2x8公分矽膠薄層層析板上( silica 60購自Merck 公司)，並以異丙醇比水為4比1之展開液進行展開；再以50%硫酸噴霧均勻噴灑至矽膠薄層片上，於150℃中烘烤呈色。
請參閱第四圖，初步以矽膠薄層色層分析法分析，比對Rf值，乳糖反應物的濃度有些許的減少，但多出極性較高的產物。與乳糖酸標準品相比，產物與標準品乳糖酸相同位置是相吻合的。若將乳糖氧化酵素量提高至0.6活性單位酵素，於相同乳糖濃度下，在16小時可將乳糖完全轉化成乳糖酸，如第五圖。
實施例二：酵素純化與性質分析
(1) 酵素純化：將MY平板培養基於30℃培養種菌4天，切下2×2公分生長於平板培養基的菌種，接種於內含有5克麩皮及10 ml水混合成的250 毫升三角錐形瓶中，於30℃培養3-5天，待菌絲長滿麩皮表面，加入50 毫升含0.2% SDS之A緩衝液進行酵素萃取，均勻攪拌後靜置約20分鐘。將紗布套至燒杯，過濾麩皮後擰乾，以8,000g 離心30分鐘去除菌體與沉澱物後，取得上清酵素液並進行酵素活性測定。
接續，利用硫酸銨[(NH 4) 2SO 4]沉澱劃分、疏水性管柱Toyopearl phenyl-650M (購自TOSOH)、分子篩HW-50 (Fractogel HW-50 gel filtration；購自Merck)與Ultrogel-hydroxyapatite 管柱層析(購自Pall公司)步驟，得到相對純化之酵素。
硫酸銨沉澱：量取去除菌體之樣本體積後，以55%硫酸銨沉澱進行沉澱，硫酸銨投入時間約為40分鐘，全程以碎冰維持低溫狀態，硫酸銨投入完畢後靜置過夜。隔日離心並取上清液，準備進入管柱層析。
疏水性管柱Toyopearl phenyl-650：將硫酸銨步驟所得上清液通入經過以含55%硫酸銨之A緩衝液緩衝液平衡後之Toyopearl phenyl-650管柱( 3×25 公分)，再利用55%-0%之硫酸銨梯度進行溶離將酵素沖堤出來，梯度製造器兩邊體積皆為600 毫升，操作流速為每小時80 毫升。
樣本濃縮：為了進行分子篩管柱分離，酵素須濃縮體積，將上步驟收集所得酵素液添加硫酸銨至55%飽和度後，再通入已經相同55%飽和度硫酸銨平衡好的Toyopearl phenyl-650管柱( 2×12 公分)小管柱後，直接以A緩衝液沖出收集濃縮酵素液，操作流速為每小時100 毫升。
分子篩Fractogel HW-50：將上步驟收集所得酵素液通入已含0.2%十二烷基硫酸鈉之A緩衝液平衡之Fractogel HW-50分子篩管柱(2.5×100公分 )中，再以含0.2%十二烷基硫酸鈉之A緩衝液進行沖堤，操作流速為每小時15 毫升。先以樣品20倍體積之10 mM K 2HPO 4-NaH 2PO 4(pH：7)緩衝液進行透析，透析時間不低於16小時。
Ultrogel-hydroxyapatite管柱層析：為了進一步純化出酵素採以 Ultrogel-hydroxyapatite管柱，酵素須進行緩衝液更換，樣品先以20倍體積之10 mM K 2HPO 4-NaH 2PO 4磷酸緩衝液(pH 7.0)在4℃下進行透析，透析時間不低於16小時，將上步驟收集所得酵素液通入已用10 mM K 2HPO 4-NaH 2PO 4(pH 7.0)緩衝液平衡好的Ultrogel-hydroxyapatite管柱(3×15 公分)，先以10 mM磷酸緩衝液沖堤初不吸附之蛋白質，在以 10 mM至400 mM K 2HPO 4-NaH 2PO 4磷酸緩衝液沖出酵素，操作流速為每小時80 毫升。
結果請參閱表三，經過各步驟之純化之後，乳糖氧化酵素之比活性(Specific activity)由原來的每毫克0.7 活性單位上升至5.3 活性單位，純化倍率(Purification fold)為7.6倍，回收率(Recovery yield)為5.4%。
表三：由NUK-21純化乳糖氧化酵素之各步驟比較結果 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 步驟 </td><td> 總體積(毫升) </td><td> 總蛋白質 </td><td> 總活性(活性單位) </td><td> 比活性 (活性單位/毫克) </td><td> 純化倍率 </td><td> 回收率 (%) </td></tr><tr><td> 粗萃物 </td><td> 980 </td><td> 418 </td><td> 288.2 </td><td> 0.7 </td><td> 1.0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 硫酸銨沉澱 </td><td> 1160 </td><td> 274 </td><td> 281.5 </td><td> 1 </td><td> 1.4 </td><td> 97.7 </td></tr><tr><td> phenyl-650M疏水性管柱 </td><td> 378 </td><td> 113 </td><td> 266.8 </td><td> 2.4 </td><td> 3.4 </td><td> 92.6 </td></tr><tr><td> HW-50分子篩管柱 </td><td> 118 </td><td> 7.5 </td><td> 21.7 </td><td> 2.9 </td><td> 4.1 </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Ultrogel-hydroxyapatite 管柱層析 </td><td> 192 </td><td> 2.9 </td><td> 15.5 </td><td> 5.3 </td><td> 7.6 </td><td> 5.4 </td></tr></TBODY></TABLE>
蛋白質含量測定：採用 Bradford protein assay (Bradford, 1976)方法。試管中分別配置0.8毫升含不同濃度牛血清蛋白(2-10 μg)或酵素樣品，再分別加入0.2毫升Bio-Rad Protein Assay 試劑混和均勻後靜置10分鐘，並測定OD 595nm吸光變化，定出不同濃度牛血清蛋白標準蛋白質曲線後，再由酵素樣品OD 595nm吸光值，計算出其蛋白質濃度，R 值須大於0.99。
蛋白質電泳分析：利用Chrambach and Rodbard 的SDS-PAGE(聚丙烯醯胺膠體)電泳方法測定酵素之分子量。以Amersham 鑄膠系統製膠，stacking gel為5%聚丙烯醯胺膠體及running gel為10%聚丙烯醯胺膠體。蛋白質樣品先與樣品緩衝液(sample buffer)以6:1混合，於100℃加熱5分鐘。電泳於4℃下進行，Stacking以80 伏特泳動至running gel介面後再提升至120伏特；之後，以Coomassie 溶液進行染色20分鐘，再用10%醋酸水溶液脫色。
利用SDS-PAGE鑑定蛋白質，如第六圖所示，使用10% SDS-PAGE測定乳糖氧化酵素之分子量，由分子量標誌來推算，利用內插法可以推定出乳糖氧化酵素分子量為47.2 kDa。在類似活性的酵素中係屬於分子量較小者。
酵素輔酶(prosthetic group)分析：氧化酵素通常具有輔酶來轉換接受電子，此類輔酶有核黃素類、血基質 (heme)或是金屬(如銅離子)，一般可使用可見光光譜掃描偵測出。NUK-21乳糖氧化酵素在光譜上並無觀察到類似訊號 (資料無附)，但以感應耦合電漿質譜儀(ICP-MASS)分析時，結果得知中純化之NUK-21乳糖氧化酵素含有金屬鋅離子作為輔酶，氧化酵素含有鋅離子在氧化酵素上是一重大發現。NUK-21乳糖氧化酵素的 E 280nm 1%為7.58，也符合其不帶有在可見光光譜會呈色輔酶的性質。
(2) 最適反應pH值測試：配置 50 mM不同種類以及pH值的緩衝溶液CH3COOH-CH3COONa (pH: 4.5-5.5)、K 2HPO 4-NaH 2PO 4(pH: 5.5-8.0)、Tris-HCl (pH: 7.0-9.0)、Na2CO3-NaHCO3 (pH: 9.0-11)。將基質、緩衝溶液與酵素預先混合反應2分鐘，再加入4-aminoantipyrine (4-AA)呈色液，於室溫下使用分光光度計進行OD 500nm動力學測定(15秒偵測一次，共90秒)，藉由4-AA測定法(Allain et al., 1974)進行酵素活性測定。4-AA測定法之原理為乳糖氧化酵素氧化乳糖為乳糖酸後，會將溶氧還原成過氧化氫，而過氧化氫、苯酚及4-AA在過氧化酶催化下產生紅色Quinoneimine結構，並在OD 500nm穩定呈色。
酵素活性單位定義為每分鐘能產生1 μ莫耳的過氧化氫的酵素濃度。反應式以及酵素活性計算方式如下。每毫升反應液為含有0.7mM乳糖、0.7 μ莫耳 4-aminoantipyrine、6 μ莫耳苯酚、3 unit過氧化氫酶與30 mM A緩衝液。酵素活性計算：unit/毫升 =(ΔA 500nm/t) × (Vt/6.8) × (1/Ve) × n；其中ΔA 500nm: t 分鐘內之A 500nm變化量、6.8: 呈色物之吸光係數(mM -1cm -1)、Vt: 反應總體積、Ve: 所加入酵素液之體積、n: 酵素液之稀釋倍數。
結果請參閱第七圖，本發明之乳糖氧化酵素最適合pH值約為7.5，相較於纖維二糖去氫酶最適pH介於4-5，carbohydrate:acceptor oxidoreductase 最適pH為5.5，glucooligosaccharide oxidase 以及cellooligosaccharide oxidase 最適pH為10。本發明之乳糖氧化酵素最適反應pH值接近中性，與觸酶(catalase)的最適pH值相近，未來搭配觸酶(catalase)去除過氧化氫來生產乳糖酸，較具有商業生產上之優勢。
(3) pH值穩定性測試：配置50 mM不同種類以及pH緩衝溶液。酵素與緩衝溶液預先以2:8先混合，於30℃水浴下反應1小時後，於室溫下使用分光光度計進行OD 500nM動力學測定(15秒偵測一次，共90秒)，並計算各組別之相對活性。
請參閱第八圖，乳糖氧化酵素於pH值5.5-9在一個小時之穩定性測試後皆具有80%以上之活性。
(4) 最適反應溫度測試：利用溶氧電極儀(HQ 430d/HACH公司，美國)測定法進行乳糖氧化酵素活性於不同反應溫度之測定，由於酵素反應消耗氧氣之特性，因此可藉由溶氧電極偵測酵素反應時氧氣下降速率。於5 毫升反應槽中加入4.85毫升A緩衝液內含0.7 mM乳糖，於30℃中平衡5分鐘後加入適量酵素觀察記錄儀上氧消耗之變化。
由第九圖結果可知乳糖氧化酵素於溫度40℃時具有最高活性，30℃具有85%相對活性。
(5) 溫度穩定性測試：酵素與A緩衝液以2:8 之比例混合，分置於不同溫度之水浴中，保溫1小時後，於室溫下使用分光光度計進行OD 500nm動力學測定(15秒偵測一次，共90秒)，並計算各組別之相對活性。
另，參閱第十圖乳糖氧化酵素在20℃-50℃之間，1個小時條件下仍保有90%以上的活性，但於60℃下則幾乎已失去活性。
實施例三： 檢測酵素基質專一性
配置35 mM不同醣類以供反應進行稀釋為10倍Km反應濃度0.7 mM，100 倍Km反應濃度7 mM。於室溫下使用分光光度計進行OD 500nm動力學測定(15秒偵測一次，共90秒)，並計算各組別之相對活性。
請參閱表四，在低濃度(0.7 mM)單糖與雙糖受質下，本發明之乳糖氧化酵素對於乳糖、纖維二糖以及麥芽糖之相對活性分別為100%、83.4%以及4.1%，顯然對於乳糖以及纖維二糖具有較佳的反應能力。在高濃度(7 mM)受質下，相對活性的表現也大致與低濃度(0.7 mM)受質的表現相同。
表四：基質結構與NUK-21生產乳糖氧化酵素的基質專一性 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 受質 </td><td> 鍵結方式 (Bonding type) </td><td> 相對活性 (%) </td></tr><tr><td> 0.7 mM受質 </td><td> 7 mM受質 </td></tr><tr><td> 乳糖 </td><td> Gal-Glu, β 1→4 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 纖維二糖 </td><td> Glu-Glu, β 1→-4 </td><td> 83.4 </td><td> 81.7 </td></tr><tr><td> 麥芽糖 </td><td> Glu-Glu, α 1→4 </td><td> 4.1 </td><td> 24.8 </td></tr><tr><td> 蔗糖 </td><td> Glu-Fru, α 1→2 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 乳糖酸 </td><td> Gal-Glu, β 1→4 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 半乳糖 </td><td> － </td><td> 0 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> 葡萄糖 </td><td> － </td><td> 0 </td><td> 9.2 </td></tr><tr><td> 果糖 </td><td> － </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 木糖 </td><td> － </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 木糖醇 </td><td> － </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 山梨醇 </td><td> － </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></TBODY></TABLE>
另，如表五所示，相較於其他已發表之醣類氧化酵素對於雙糖地反應性上，明顯地纖維二糖的專一性皆會高於對於乳糖的專一性，但本發明之乳糖氧化酵素對乳糖的專一性卻能高於對纖維二糖的專一性。在Km值比較上，乳糖、纖維二糖以及麥芽糖分別為0.076 mM、0.037 mM以及21.74 mM (表中未顯示)，顯然，此乳糖氧化酵素對於纖維二糖及乳糖的親和力較佳。另，在K cat的比較上，乳糖、纖維二糖以及麥芽糖分別為97.08 S -1、86.22 S -1以及80.47 S -1(表中未顯示)，本發明之乳糖氧化酵素在K cat值是已發表文獻中最好的。
表五：NUK-21菌生產乳糖氧化酵素(乳糖氧化酶)與不同菌源糖類氧化酵素之動力參數值比較 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 酵素 </td><td> 菌株 </td><td> 催化反應速率Km (mM) </td><td> 受質專一性(%) </td></tr><tr><td> 乳糖 </td><td> 纖維二糖 </td><td> 乳糖 </td><td> 纖維二糖 </td></tr><tr><td> 乳糖氧化酶 </td><td><i>Myrmecridium flexuosum</i> NUK-21 </td><td> 0.076 </td><td> 0.037 </td><td> 100 </td><td> 83.4 </td></tr><tr><td> 纖維二糖去氫酶(Cellobiose dehydrogenase) </td><td><i>Sporotrichum pulverulentum</i></td><td> － </td><td> － </td><td> 100 </td><td> 162 </td></tr><tr><td> 纖維二糖氧化酶(Cellobiose oxidase) </td><td><i>Sporotrichum pulverulentum</i></td><td> 0.58 </td><td> 0.042 </td><td> － </td><td> － </td></tr><tr><td> Carbohydrate:acceptor oxidoreductase </td><td><i>Paraconiothyrium sp.</i></td><td> 0.11 </td><td> 0.13 </td><td> － </td><td> － </td></tr><tr><td> Carbohydrate:acceptor oxidoreductase (Novo) </td><td><i>Microdochium nivale</i></td><td> 0.066 </td><td> － </td><td> 52 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 葡萄寡糖氧化酶 (Glucooligosaccharide oxidase) </td><td><i>Acremonium strictum</i></td><td> 0.38 </td><td> 0.12 </td><td> 100 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 纖維寡糖氧化酶(Cellooligosaccharide oxidase) </td><td><i>Sarocladium oryzae</i></td><td> 2.7 </td><td> 19.8 </td><td> 83 </td><td> 100 </td></tr></TBODY></TABLE>
實施例四：檢測金屬離子對於酵素活性之影響
將純化酵素加入含有1 mM不同金屬溶液之A緩衝液中，於30℃水浴下保溫1小時後，以溶氧電極法測其相對活性。
利用溶氧電極儀(HQ 430d/HACH公司，美國)測定法進行乳糖氧化酵素活性於不同反應溫度之測定，由於酵素反應消耗氧氣之特性，因此可藉由溶氧電極偵測酵素反應時氧氣下降速率。於5 毫升反應槽中加入4.85毫升A緩衝液和適量酵素及1 mM不同金屬溶液，於30℃中反應1小時後，再加入0.7 mM乳糖後，觀察記錄儀上氧消耗之變化。
結果請參閱表六，大部分受試金屬離子對酵素的活性影響不大，但酵素活性受到Fe 2+與Sn 2+抑制保有61.%，Pb 2+則為些微抑制剩下89.7%，而Hg 2+卻可增加至153.8%。對於大部分酵素，汞離子通常為抑制劑，本發明之乳糖氧化酵素在Hg 2+的影響下反而增加了約50%的活性，可能與酵素本身含有鋅離子有關。
表六：金屬離子對NUK-21菌生產乳糖氧化酵素活性之影響 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 金屬離子 (1 mM) </td><td> 相對活性 (%) </td></tr><tr><td> 控制組 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> AgNO<sub>3</sub></td><td> 107.9 </td></tr><tr><td> CaCl<sub>2</sub></td><td> 109.5 </td></tr><tr><td> CdSO<sub>4</sub></td><td> 100 </td></tr><tr><td> CoCl<sub>2</sub></td><td> 110.2 </td></tr><tr><td> CuSO<sub>4</sub></td><td> 96.8 </td></tr><tr><td> FeSO<sub>4</sub></td><td> 61.1 </td></tr><tr><td> FeCl<sub>3</sub></td><td> 103.2 </td></tr><tr><td> HgCl<sub>2</sub></td><td> 153.8 </td></tr><tr><td> NiSO<sub>4</sub></td><td> 100 </td></tr><tr><td> PbCl<sub>2</sub></td><td> 89.7 </td></tr><tr><td> SnCl<sub>2</sub></td><td> 61.3 </td></tr></TBODY></TABLE>
實施例五：檢測化合物對於酵素活性之影響
選用不同之化學修飾劑與純化酵素，於30℃水浴下保溫1小時後，以溶氧電極法測其相對活性。
請參閱表七，所測試的各種化學藥劑中，僅有2-bromo-4'-nitroacetophenol對於乳酸氧化酵素有較明顯的抑制作用。
表七：化學藥劑對NUK-21菌生產乳糖氧化酵素活性之影響 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 化合物 (1 mM) </td><td> 濃度(mM) </td><td> 相對活性 (%) </td></tr><tr><td> 控制組 </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 2,4'-dibromoacetophenone </td><td> 1 </td><td> 99 </td></tr><tr><td> 2-bromo-4'-nitroacetophenone </td><td> 1 </td><td> 87.8 </td></tr><tr><td> NaN<sub>3</sub></td><td> 1 </td><td> 131.3 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 </td><td> 136.3 </td></tr><tr><td> N-ethylmaleimide </td><td> 1 </td><td> 139.5 </td></tr><tr><td> 1,10-phenanthroline </td><td> 1 </td><td> 98.8 </td></tr><tr><td> H<sub>2</sub>O<sub>2</sub></td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 1 </td><td> 104.9 </td></tr><tr><td> 2-bromo-4'-nitroacetophenone </td><td> 4 </td><td> 53 </td></tr></TBODY></TABLE>
乳糖酸較大化生產：在100毫升包含50 mM Tris-HCl (pH 7.5)緩衝液、50活性單位乳糖氧化酵素、2.5%乳糖及400活性單位過氧化氫酵素組成的反應溶液中，於28℃下以400 rpm攪拌，反應中以1 N 氫氧化鈉滴定將維持pH在7.5。反應物再以矽膠薄層層析分析，經反應10小時後可將乳糖完全轉化生成乳糖酸，如第十一圖。
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點:
1. 本發明之菌株可生產新穎乳糖氧化酵素並用以轉化乳糖酸，每5克麩皮可產生約25單位以上的乳糖氧化酵素，具有高產率(High production)之優點。
2. 本發明之新穎乳糖氧化酵素具有高受質專一性(Km為0.076 mM，K cat每秒為97)，且於溫度20℃-50℃和pH值5.5-9皆具有極佳穩定性。
3. 本發明之新穎乳糖氧化酵素具有高乳糖酸轉化率(100%)可在短時間內(10小時)將乳糖(lactose)全部轉化為乳糖酸(lactobionic acid)，因此於實際應用上可大幅降低生產成本並且適合用於工業上量產。
綜上所述，本發明之 Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株及其生產之新穎乳糖氧化酵素與轉化乳糖酸方法，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
無
第一圖：本發明 Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株型態示意圖。
第二圖：成長天數與成長溫度影響乳糖氧化酵素生產之分析圖。
第三圖：NUK-21菌於脫脂黃豆粉組成之液體培養下生產乳糖氧化酵素之時間變化分析圖。
第四圖：新穎乳糖氧化酵素部分轉化乳糖為乳糖酸之薄層色層分析圖。
第五圖：新穎乳糖氧化酵素完全轉化乳糖為乳糖酸之薄層色層分析圖。
第六圖：新穎乳糖氧化酵素之SDS-PAGE圖。
第七圖：新穎乳糖氧化酵素其最適反應pH值之分析圖。
第八圖：新穎乳糖氧化酵素其pH值穩定性之分析圖。
第九圖：新穎乳糖氧化酵素其最適反應溫度之分析圖。
第十圖：新穎乳糖氧化酵素其溫度穩定性之分析圖。
第十一圖：乳糖酸較大化生產之薄層色層分析圖。
財團法人食品工業研究所、2017年9月19日申請、BCRC 930190

Claims (9)

  1. 一種經分離且純化之Myrmecridium flexuosum NUK-21菌株，其為寄存編號BCRC 930190之NUK-21菌株(Myrmecridium flexuosum NUK-21)。
  2. 一種製備NUK-21培養物之方法，其包含將如請求項1之Myrmecridium flexuosum NUK-21菌株的分離株接種於一適合培養基中，及在培養之溫度為25℃-35℃進行培養3-7天以獲得該培養物。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該培養基係選自含有麩皮與水組成之固體培養基、含有麩皮組成且添加有氯化鈉(NaCl)與二價銅離子之液體培養基，或含有脫脂黃豆粉組成之液體培養基。
  4. 一種新穎乳糖氧化酵素，其係分離自如申請專利範圍第2至3中任一項所述之方法所製得之培養物，該新穎乳糖氧化酵素之分子量為47.2kDa，對於乳糖之催化反應速率Km為0.076mM，Kcat每秒為97，且對於乳糖之轉化率為100%。
  5. 一種生產新穎乳糖氧化酵素之方法，其包含下述步驟：(a)將Myrmecridium flexuosum NUK-21菌株接種於一適合培養基；以及(b)使該Myrmecridium flexuosum NUK-21菌株於溫度25 ℃-35℃培養3-7天，並經由純化步驟，以得到新穎乳糖氧化酵素，其中該Myrmecridium flexuosum NUK-21菌株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 930190；其中該純化步驟包括硫酸銨[(NH4)2SO4]沉澱劃分、疏水性管柱Toyopearl phenyl -650M、分子篩HW-50(Fractogel HW-50 gel filtration)與Ultrogel-hydroxyapatite管柱層析。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該培養基係選自含有麩皮與水組成之固體培養基、含有麩皮組成且添加有氯化鈉(NaCl)與二價銅離子之液體培養基，或含有脫脂黃豆粉組成之液體培養基。
  7. 一種利用新穎乳糖氧化酵素轉化乳糖酸的方法，其包含將如請求項1之Myrmecridium flexuosum NUK-21菌株的分離株接種於一適合培養基中，及在培養之溫度為25℃-35℃進行培養3-7天以轉化乳糖酸，其中該培養基係含有麩皮與水組成之固體培養基、或含有麩皮組成且添加有氯化鈉(NaCl)與二價銅離子之液體培養基，或含有脫脂黃豆粉組成之液體培養基。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該固體培養基培養3.5天後，酵素活性達到6單位/克固體培養基，該液體培養基培養4天後，酵素活性達到0.55單位/毫升液體培養基。
  9. 一種乳糖酸轉化生產之方法，其包含將分離自Myrmecridium flexuosum NUK-21菌株之新穎乳糖氧化酵素與乳糖進行反應，以獲得乳糖酸，其中該Myrmecridium flexuosum NUK-21菌株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 930190。
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