CN105331644A - 一种乳糖酸的酶法制备及测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乳糖酸的酶法制备方法，以乳糖为底物，以重组Microdochium？nivale还原糖氧化酶催化乳糖制备乳糖酸，并对反应得到的乳糖酸进行测定。本发明高效、低成本，且乳糖酸的转化率接近100％，为乳糖酸在工业中的应用提供了技术依据。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，尤其是涉及一种乳糖酸的酶法制备方法。
背景技术
Microdochiumnivale还原糖氧化酶可以将末端带有还原性糖残基的单糖和低聚糖氧化成相应的酸，没有其他副产物产生，具有更加有效催化乳糖氧化形成乳糖酸的潜力。但是Microdochiumnivale还原糖氧化酶在野生菌中的表达有产量低，酶活低且不易纯化等缺点，而毕赤酵母表达系统具有操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低、可以对外源蛋白翻译后修饰等优点，因此将Microdochiumnivale还原糖氧化酶基因导入到载体pPICZαA中，并在毕赤酵母X33中胞外表达得到重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶。
乳糖酸是一种新型多羟基有机酸，是集抗氧化、修护、抗衰老、保湿、促进机体更新等多种功效于一身的最先进的果酸。乳糖酸在医学中是器官移植前保护性缓冲液的重要组分，可螯合Fe3+，降低由于离子催化产生的氢氧自由基对组织的损伤，增加了器官的保存性。在美容行业中，由于乳糖酸有极强的吸水性，并且能够促进上皮形成，加速伤口愈合，有修护肌肤的功效，因此在医疗或美容整形手术后，乳糖酸常用于防止皮肤干燥以及肌肤修护。此外，乳糖酸在食品中可以做为食品添加剂，并且能够与矿物质盐形成复合物，促进肠道中益生菌的生长以及对矿物质的吸收。在酸奶的制作过程中，乳糖酸的存在能够改善酸奶凝乳的持水力、调和酸味、促进风味形成。在肉制品中添加一定量的乳糖酸，可以减少肉制品在冷冻后产生的水分损失。
目前制备乳糖酸的方法有生物制备法、化学氧化法、电化学法和催化氧化法等多种方法，但是都存在着副产物多，产物的分离纯化比较复杂以及化学污染等问题，其大规模生产和工业化应用均受到极大限制。因此找到一种高效、专一、绿色的并具有工业化大规模生产潜能的乳糖酸的制备方法具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种乳糖酸的酶法制备及测定方法。本发明高效、低成本，且乳糖酸的转化率接近100％，为乳糖酸在工业中的应用提供了技术依据。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种乳糖酸的酶法制备方法，以乳糖为底物，以重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶催化乳糖制备乳糖酸，并对反应得到的乳糖酸进行测定。
所述制备乳糖酸具体包括以下步骤：
(1)重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶的全基因合成及表达载体的构建：
根据Microdochiumnivale还原糖氧化酶的lipA基因的核苷酸序列GenBankAccessionNo.BD103535.1在Bioedit软件的辅助下推导出该基因的核苷酸序列；
在DNAWorks软件的辅助下，以毕赤酵母密码子使用频率表为基准，对lipA的密码子进行优化，并根据密码子的内在分布情况，在优化后的lipA基因序列中引入酶切位点EcoRI和NotI；
根据引入的酶切位点将全基因分成了F1、F2和F3三个片段；在Gene2Oliga软件的辅助下分别设计用于合成F1、F2和F3三个片段的寡核苷酸；各寡核苷酸序列及组装见图1；各寡核苷酸片段在AppliedBiosystem公司381A型DNA合成仪上采用固相亚硝酸胺法合成寡核苷酸片段，合成片段经过脱盐，PAGE纯化后备用；
将纯化后的F1、F2和F3三个片段的寡核苷酸进行拼接，PCR克隆导入到载体pPICZαA中，转化至毕赤酵母X33，筛选并获得阳性克隆子，得到重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶基因工程菌X33-pPICZαA-MnCO；
(2)重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶的制备：
将菌种X33-pPICZαA-MnCO接种到YPD中，25-30℃，200-220rmp/min培养至OD600值为2-4，按照3％的接种量接种到BMGY中，25-30℃，200-220rmp/min培养至OD600值为4-5，用无菌管离心收集菌体，菌体用BMMY悬浮，加入到含有BMMY的锥形摇瓶中，25-30℃，200-220rmp/min每隔12h添加甲醇至终浓度0.5％，诱导表达72h，离心收集上清液；
将上清液放入pH6.0的20mmol/L的PBS中透析48h，去除培养基中的大分子得到粗酶液，再通过镍离子亲和层析柱HisTrapHP纯化粗酶液，得到纯度大于95％的重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶；
(3)乳糖酸的制备：
取5-20mmol/L的乳糖溶液100-200ml，40℃加热溶解，用0.1mol/L的Na2CO3溶液调节pH至5.0-6.0，转移至三口烧瓶搅拌反应器中，向该反应体系中加入1000U的过氧化氢酶，通入空气的量为0.6-1.0L/min，每隔12h加入500-1500U的重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶，于40-60℃下反应48-60h，沸水浴加热10-15min终止反应，4℃、10000rmp/min离心10-15min后收集反应液，即得。
本发明还提供了乳糖酸的检测方法，采用液质联用HPLC-MS对乳糖酸样品进行测定，具体包括以下步骤：
将乳糖酸的标准样品和制备得到的乳糖酸样品分别用10ml的超纯水溶解配制成1mg/ml的样品溶液，分别用液相色谱仪和质谱仪进行测试，测试时的进样量均为5μL；然后比对乳糖酸的标准样品和制备得到的乳糖酸样品的液相色谱和质谱曲线，两者一致则表明制备得到的乳糖酸样品合格。
所述液相色谱条件是色谱仪：WATERSACQUITYUPLC；分析柱：BEHCSH2.1X100mm1.7um；采用紫外检测器；柱温设置为40-50℃；流速设置为0.3-0.5ml/min；流动相为A:100％乙腈，B:0.1％甲酸；采用梯度洗脱法，程序如下：0-4min达到5％的A，5-7min达到50％A，7-10min达到0％A；
所述质谱条件是用电喷雾电离源ESI；毛血管电压设置为3.0-4.0kVolts；锥孔电压设置为30-40Volts；离子源温度为100-120℃；脱溶剂气温度为300-350℃；脱溶剂气流量为500lit/hr；质量范围为100-1000m/z；乳糖酸荷质比357m/z。
本发明有益的技术效果在于：
本发明首次实现了还原糖氧化酶氧化乳糖制备乳糖酸，且转化率接近100％，并且对乳糖酸进行测定。乳糖酸的高保湿、抗衰老、抗氧化、促进机体更新等特性使得其具有巨大的应用前景，本发明为实现乳糖酸的工业化生产提供了技术支持。
附图说明
图1为重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶各寡核苷酸序列及组装形式。
图2为实施例1制备得到的乳糖酸的高效液相图；
图3为实施例1制备得到的乳糖酸的质谱图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例，对本发明进行具体描述。实施例中过氧化氢酶，乳糖酸标准样品均购自sigma公司，其余试剂皆为市售。其中乳糖酸标准样品是纯度大于97％的乳糖酸。液质联用仪用为WATERSMALDISYNAPTQ-TOFMS，液相用的色谱仪为WATERSACQUITYUPLC。
实施例1
(1)重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶的全基因合成及表达载体的构建：
根据Microdochiumnivale还原糖氧化酶的lipA基因的核苷酸序列GenBankAccessionNo.BD103535.1在Bioedit软件的辅助下推导出该基因的核苷酸序列；
在DNAWorks软件的辅助下，以毕赤酵母密码子使用频率表为基准，对lipA的密码子进行优化，并根据密码子的内在分布情况，在优化后的lipA基因序列中引入酶切位点EcoRI和NotI；
根据引入的酶切位点将全基因分成了F1、F2和F3三个片段；在Gene2Oliga软件的辅助下分别设计用于合成F1、F2和F3三个片段的寡核苷酸；各寡核苷酸序列及组装见图1；各寡核苷酸片段在AppliedBiosystem公司381A型DNA合成仪上采用固相亚硝酸胺法合成寡核苷酸片段，合成片段经过脱盐，PAGE纯化后备用；
将纯化后的F1、F2和F3三个片段的寡核苷酸进行拼接，PCR克隆导入到载体pPICZαA中，转化至毕赤酵母X33，筛选并获得阳性克隆子，得到重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶基因工程菌X33-pPICZαA-MnCO；
(2)重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶的制备：
将菌种X33-pPICZαA-MnCO接种到YPD中，25℃，200rmp/min培养至OD600值为2，按照3％的接种量接种到BMGY中，25℃，200rmp/min培养至OD600值为4，用无菌管离心收集菌体，菌体用BMMY悬浮，加入到含有BMMY的锥形摇瓶中，25℃，200rmp/min每隔12h添加甲醇至终浓度0.5％，诱导表达72h，离心收集上清液；
将上清液放入pH6.0的20mmol/L的PBS中透析48h，去除培养基中的大分子得到粗酶液，再通过镍离子亲和层析柱HisTrapHP纯化粗酶液，得到纯度大于95％的重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶；
(3)乳糖酸的制备：取1mmol/L的乳糖溶液100ml，40℃加热溶解，用0.1mol/L的Na2CO3溶液调节pH至5.0，转移至三口烧瓶搅拌反应器中，向该反应体系中加入1000U的过氧化氢酶，通气量为0.6L/min，每隔12h加入500U的重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶，于40℃下反应48h，沸水浴加热10-15min终止反应，4℃、10000rmp/min离心15min后收集反应液。
(4)产物测定：用液质联用(HPLC-MS)对乳糖酸样品进行了测定，操作如下：称取0.01g乳糖酸标样，用10ml的超纯水溶解配制成1mg/ml的样品溶液，进样量是5μL。采用的液相色谱条件是：色谱仪：WATERSACQUITYUPLC；分析柱：BEHCSH2.1X100mm1.7um；柱温：40℃；采用紫外检测器；设置流速为0.2ml/min；流动相采用：A:100％乙腈，B:0.1％甲酸；洗脱条件采用梯度洗脱法，程序如下：0-4min达到5％的A，5-7min达到50％A，7-10min达到0％A。采用的质谱条件是：用电喷雾电离源(ESI)；毛血管电压设置为3.0kVolts；锥孔电压设置为30Volts；离子源温度为100℃；脱溶剂气温度为300℃；脱溶剂气流量为500lit/hr；质量范围为100-1000m/z；乳糖酸荷质比357m/z。
从图2中可以看出，乳糖反应液和乳糖酸标样的出峰时间均为1.03min，从图3中可以看出，在此出峰时间下的物质的荷质比是357m/z，判断为乳糖酸。
实施例2
(1)重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶的全基因合成及表达载体的构建：
根据Microdochiumnivale还原糖氧化酶的lipA基因的核苷酸序列GenBankAccessionNo.BD103535.1在Bioedit软件的辅助下推导出该基因的核苷酸序列；
在DNAWorks软件的辅助下，以毕赤酵母密码子使用频率表为基准，对lipA的密码子进行优化，并根据密码子的内在分布情况，在优化后的lipA基因序列中引入酶切位点EcoRI和NotI；
根据引入的酶切位点将全基因分成了F1、F2和F3三个片段；在Gene2Oliga软件的辅助下分别设计用于合成F1、F2和F3三个片段的寡核苷酸；各寡核苷酸序列及组装见图1；各寡核苷酸片段在AppliedBiosystem公司381A型DNA合成仪上采用固相亚硝酸胺法合成寡核苷酸片段，合成片段经过脱盐，PAGE纯化后备用；
将纯化后的F1、F2和F3三个片段的寡核苷酸进行拼接，PCR克隆导入到载体pPICZαA中，转化至毕赤酵母X33，筛选并获得阳性克隆子，得到重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶基因工程菌X33-pPICZαA-MnCO；
(2)重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶的制备：
将菌种X33-pPICZαA-MnCO接种到YPD中，28℃，210rmp/min培养至OD600值为3，按照3％的接种量接种到BMGY中，28℃，210rmp/min培养至OD600值为5，用无菌管离心收集菌体，菌体用BMMY悬浮，加入到含有BMMY的锥形摇瓶中，28℃，210rmp/min每隔12h添加甲醇至终浓度0.5％，诱导表达72h，离心收集上清液；
将上清液放入pH6.0的20mmol/L的PBS中透析48h，去除培养基中的大分子得到粗酶液，再通过镍离子亲和层析柱HisTrapHP纯化粗酶液，得到纯度大于95％的重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶；
(3)乳糖酸的制备：取5mmol/L的乳糖溶液150ml，40℃加热溶解，用0.1mol/L的Na2CO3溶液调节pH至5.5，转移至三口烧瓶搅拌反应器中，向该反应体系中加入1000U的过氧化氢酶，通气量为0.8L/min，每隔12h加入1000U的还原糖氧化酶，于55℃下反应54h，沸水浴加热10min终止反应，4℃、10000rmp/min离心15min后收集反应液。
(4)产物测定：用液质联用(HPLC-MS)对乳糖酸样品进行了测定，操作如下：称取0.01g乳糖酸标样，用10ml的超纯水溶解配制成1mg/ml的样品溶液，进样量是5μL采用的液相色谱条件是：色谱仪：WATERSACQUITYUPLC；分析柱：BEHCSH2.1X100mm1.7um；柱温：45℃；采用紫外检测器；设置流速为0.4ml/min；流动相采用：A:100％乙腈，B:0.1％甲酸；洗脱条件采用梯度洗脱法，程序如下：0-4min达到5％的A，5-7min达到50％A，7-10min达到0％A。采用的质谱条件是：用电喷雾电离源(ESI)；毛血管电压设置为3.5kVolts；锥孔电压设置为35Volts；离子源温度为110℃；脱溶剂气温度为325℃；脱溶剂气流量为500lit/hr；质量范围为100-1000m/z；乳糖酸荷质比357m/z。
实施例3
(1)重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶的全基因合成及表达载体的构建：
根据Microdochiumnivale还原糖氧化酶的lipA基因的核苷酸序列GenBankAccessionNo.BD103535.1在Bioedit软件的辅助下推导出该基因的核苷酸序列；
在DNAWorks软件的辅助下，以毕赤酵母密码子使用频率表为基准，对lipA的密码子进行优化，并根据密码子的内在分布情况，在优化后的lipA基因序列中引入酶切位点EcoRI和NotI；
根据引入的酶切位点将全基因分成了F1、F2和F3三个片段；在Gene2Oliga软件的辅助下分别设计用于合成F1、F2和F3三个片段的寡核苷酸；各寡核苷酸序列及组装见图1；各寡核苷酸片段在AppliedBiosystem公司381A型DNA合成仪上采用固相亚硝酸胺法合成寡核苷酸片段，合成片段经过脱盐，PAGE纯化后备用；
将纯化后的F1、F2和F3三个片段的寡核苷酸进行拼接，PCR克隆导入到载体pPICZαA中，转化至毕赤酵母X33，筛选并获得阳性克隆子，得到重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶基因工程菌X33-pPICZαA-MnCO；
(2)重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶的制备：
将菌种X33-pPICZαA-MnCO接种到YPD中，30℃，220rmp/min培养至OD600值为4，按照3％的接种量接种到BMGY中，30℃，20rmp/min培养至OD600值为5，用无菌管离心收集菌体，菌体用BMMY悬浮，加入到含有BMMY的锥形摇瓶中，30℃，220rmp/min每隔12h添加甲醇至终浓度0.5％，诱导表达72h，离心收集上清液；
将上清液放入pH6.0的20mmol/L的PBS中透析48h，去除培养基中的大分子得到粗酶液，再通过镍离子亲和层析柱HisTrapHP纯化粗酶液，得到纯度大于95％的重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶；
(3)乳糖酸的制备：取10mmol/L的乳糖溶液150ml，40℃加热溶解，用0.1mol/L的Na2CO3溶液调节pH至6.0，转移至三口烧瓶搅拌反应器中，向该反应体系中加入1000U的过氧化氢酶，通气量为1.0L/min，每隔12h加入1500U的重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶，于55℃下反应60h，沸水浴加热10min终止反应，4℃、10000rmp/min离心15min后收集反应液。
(4)产物测定：用液质联用(HPLC-MS)对乳糖酸样品进行了测定，操作如下：称取0.01g乳糖酸标样，用10ml的超纯水溶解配制成1mg/ml的样品溶液，进样量是5μL采用的液相色谱条件是：色谱仪：WATERSACQUITYUPLC；分析柱：BEHCSH2.1X100mm1.7um；柱温：50℃；采用紫外检测器；设置流速为0.5ml/min；流动相采用：A:100％乙腈，B:0.1％甲酸；洗脱条件采用梯度洗脱法，程序如下：0-4min达到5％的A，5-7min达到50％A，7-10min达到0％A。采用的质谱条件是：用电喷雾电离源(ESI)；毛血管电压设置为4.0kVolts；锥孔电压设置为40Volts；离子源温度为120℃；脱溶剂气温度为350℃；脱溶剂气流量为500lit/hr；质量范围为100-1000m/z；乳糖酸荷质比357m/z。
测试例：乳糖酸的抗氧化作用
分别取5mmol/L，10mmol/L，20mmol/L的乳糖酸溶液通过铁还原抗氧化力(FRAP)测定法测定乳糖酸的抗氧化作用，乳糖酸通过还原Fe3+表现出抗氧化能力，样品的抗氧化能力以FRAP值表示：1FRAP单位＝1mmol/LFeSO4。其结果如下：
表1：乳糖酸的抗氧化能力
Claims (3)
1.一种乳糖酸的酶法制备方法，其特征在于：以乳糖为底物，以重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶催化乳糖制备乳糖酸，并对反应得到的乳糖酸进行测定。
2.根据权利要求1所述的乳糖酸的酶法制备方法，其特征在于所述制备乳糖酸具体包括以下步骤：
(1)重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶的全基因合成及表达载体的构建：
根据Microdochiumnivale还原糖氧化酶的lipA基因的核苷酸序列GenBankAccessionNo.BD103535.1在Bioedit软件的辅助下推导出该基因的核苷酸序列；
在DNAWorks软件的辅助下，以毕赤酵母密码子使用频率表为基准，对lipA的密码子进行优化，并根据密码子的内在分布情况，在优化后的lipA基因序列中引入酶切位点EcoRI和NotI；
根据引入的酶切位点将全基因分成了F1、F2和F3三个片段；在Gene2Oliga软件的辅助下分别设计用于合成F1、F2和F3三个片段的寡核苷酸；各寡核苷酸片段在AppliedBiosystem公司381A型DNA合成仪上采用固相亚硝酸胺法合成寡核苷酸片段，合成片段经过脱盐，PAGE纯化后备用；
将纯化后的F1、F2和F3三个片段的寡核苷酸进行拼接，PCR克隆导入到载体pPICZαA中，转化至毕赤酵母X33，筛选并获得阳性克隆子，得到重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶基因工程菌X33-pPICZαA-MnCO；
(2)重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶的制备：
将菌种X33-pPICZαA-MnCO接种到YPD中，25-30℃，200-220rmp/min培养至OD600值为2-4，按照3％的接种量接种到BMGY中，25-30℃，200-220rmp/min培养至OD600值为4-5，用无菌管离心收集菌体，菌体用BMMY悬浮，加入到含有BMMY的锥形摇瓶中，25-30℃，200-220rmp/min每隔12h添加甲醇至终浓度0.5％，诱导表达72h，离心收集上清液；
将上清液放入pH6.0的20mmol/L的PBS中透析48h，去除培养基中的大分子得到粗酶液，再通过镍离子亲和层析柱HisTrapHP纯化粗酶液，得到纯度大于95％的重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶；
(3)乳糖酸的制备：
取5-20mmol/L的乳糖溶液100-200ml，40℃加热溶解，用0.1mol/L的Na2CO3溶液调节pH至5.0-6.0，转移至三口烧瓶搅拌反应器中，向该反应体系中加入1000U的过氧化氢酶，通入空气的量为0.6-1.0L/min，每隔12h加入500-1500U的重组Microdochiumnivale还原糖氧化酶，于40-60℃下反应48-60h，沸水浴加热10-15min终止反应，4℃、10000rmp/min离心10-15min后收集反应液，即得。
3.一种权利要求1所述的乳糖酸的检测方法，其特征在于采用液质联用HPLC-MS对乳糖酸样品进行测定，具体包括以下步骤：
将乳糖酸的标准样品和制备得到的乳糖酸样品分别用10ml的超纯水溶解配制成1mg/ml的样品溶液，分别用液相色谱仪和质谱仪进行测试，测试时的进样量均为5μL；然后比对乳糖酸的标准样品和制备得到的乳糖酸样品的液相色谱和质谱曲线，两者一致则表明制备得到的乳糖酸样品合格。
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| CN111218486B (zh) * | 2020-03-23 | 2023-06-16 | 杭州巴洛特生物科技有限公司 | 一种利用生物法合成乳糖酸的工艺 |
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