CN105121456A - 经由去糖基化步骤对蛋白质的改良纯化 - Google Patents

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Abstract

一种使用去糖基化步骤纯化目的多肽的方法。

Description

经由去糖基化步骤对蛋白质的改良纯化
技术领域
本发明涉及一种使用去糖基化步骤纯化目的多肽的方法。
背景技术
蛋白质纯化方案通常包括一个或多个色谱步骤。色谱中的程序的一个实例是使含有蛋白质的溶液流过装填有各种材料的柱。不同的蛋白质与柱材料不同地相互作用，并且因此可以由通过柱所需要的时间或从柱上洗脱蛋白质所需要的条件来分离。
色谱是用于分离混合物的一组实验室技术的集合术语。使混合物溶解于被称为流动相的流体中，所述流动相携带混合物通过容纳被称为固定相的另一种材料的结构。混合物的各种组分以不同的速度行进，引起它们分离。分离是基于流动相与固定相之间的差分分配(differentialpartitioning)。化合物的分配系数的细微差别导致在固定相上的差分滞留并且因此改变分离。
存在许多不同的色谱方法。
疏水作用色谱(HIC)是基于包含疏水区的配体(例如苄基)。配体的疏水部分吸引蛋白质上的疏水区，并且蛋白质上的疏水区越大，配体与该特定蛋白质之间的吸引力就越强。
离子交换色谱根据化合物的离子电荷的本质和程度分离化合物。将要使用的柱是根据电荷的类型和强度来选择。阴离子交换树脂具有正电荷(例如胺)并且被用于保留和分离负电性的化合物，而阳离子交换树脂具有负电荷(例如羧酸盐基团)并且被用于分离正电性的分子。
如所属领域中已知的，混合模式色谱(MMC)或多元色谱是指利用固定相与分析物之间超过一种形式的相互作用以便实现其分离的色谱方法。其与常规单一模式色谱的不同之处在于，MMC中的次要相互作用不能太弱，并且因此其也有助于溶质的保留。
作为MMC的实例，配体例如可以是苄胺，其中苄基可被视作疏水部分并且胺可被视作正电荷部分(即，用于例如阴离子交换)。
蛋白质的糖基化是真核生物中常用的翻译后修饰。糖基化可以是N连接型(连接到Asn上)或O连接型(连接到Ser或Thr上)。糖基化对酶的作用可以影响其许多特性，例如溶解度、疏水性等，并且相反的作用(所谓的去糖基化)也会影响蛋白质特性。
如所属领域中已知的，术语“糖苷酶”(也称作糖苷水解酶)是指催化糖苷键结/键的水解的酶，糖苷酶在本文中也被称为去糖基化酶。
牛奶凝固酶(例如凝乳酶和胃蛋白酶)使牛奶发生酶促凝固是乳酪制造中最重要的过程中的一个。酶促牛奶凝固是两阶段工艺：在第一阶段中，蛋白水解酶、凝乳酶或胃蛋白酶攻击κ-酪蛋白，导致酪蛋白胶束结构的亚稳态，和在第二阶段中，牛奶随后凝固并且形成凝固物。
凝乳酶(EC3.4.23.4)和胃蛋白酶(EC3.4.23.1)(哺乳动物胃的牛奶凝固酶)是属于一大类肽酶的天冬氨酸蛋白酶。
WO01/58924A2(UpfrontChromatographyA/S,丹麦)描述使用混合模式配体苄胺对牛奶凝固酶(例如凝乳酶)进行色谱纯化。
WO01/58924A2没有描述在纯化过程中在目的蛋白质吸附/结合到配体上之 前，与目的蛋白质的去糖基化有关的本文显著相关性的任何内容。
发明内容
本发明要解决的一个问题是提供一种用于纯化目的多肽的新颖方法，其中能够获得增加量的目的多肽(分子数)。
如本文中所讨论的并且不希望受限于理论，本文中相关的重要技术教导内容涉及本发明的发明人已经确定，通过对目的糖蛋白进行适当去糖基化，目的糖蛋白可以获得对包含疏水部分和/或正电性部分的配体的更好/更高结合能力。
因此，去糖基化步骤是本领域技术人员执行的常规步骤，本领域技术人员知晓许多不同的糖苷酶并且知晓如何将合适的糖苷酶添加到样品中以便获得目的多肽/蛋白质的本文相关去糖基化。
此外，本领域技术人员知晓许多不同的本文相关配体(参见例如综述文章：Yang等人,JournalofChromatographyA,1218(2011)8813-8825)。
本领域技术人员知晓许多本文中相关的纯化/分离技术，其是基于目的蛋白质被吸附/结合到配体上，实例是例如柱色谱、膨胀床色谱(EBA)、离子交换色谱等。
在工作实例中，在本文中可以看到两种结构不同的酶(来源于米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)的毛霉胃蛋白酶(mucorpepsin)和骆驼凝乳酶)的去糖基化获得了对苄胺配体(即可被视作包含疏水部分(苄基)和正电性部分(胺)的配体)的显著更好的结合能力。
在工作实例中，在本文中可以看到，对于可被视作仅包含疏水部分的配体(参见本文中的实施例3)和可被视作仅包含正电性部分的配体(参见本文中的实施例4)，也证实了上文提到的得到积极提高的结合能力。
不希望受限于理论，可能的情况是，与例如配体的疏水部分的更高程度的结合可以通过因为亲水聚糖的损失而引起对配体的亲和力的增加来解释。
不希望受限于理论，可能的情况是，与例如配体的正电性部分的更高程度的结合可以通过聚糖损失而引起的蛋白质表面上电荷的局部暴露的变化来解释。
因此，本发明的第一方面涉及一种用于从包含目的多肽的水性介质中纯化此类目的多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i):获得由包括糖基化形式的目的多肽的许多组分组成的水性样品；
(ii):将糖苷酶和/或化学处理(例如用高碘酸盐处理)添加到步骤(i)的样品中，以便使目的多肽去糖基化以获得水性负载介质；
(iii):将步骤(ii)的负载介质施加到固相上，以便获得目的多肽到配体上的吸附，所述固相包含固体底基质，所述固体底基质含有包含疏水部分和/或正电性部分的配体；
(iv):从固相上洗脱目的多肽以便回收目的多肽，并且因此获得经过纯化的目的多肽；
其中与同样执行的用于纯化目的多肽的不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的经过纯化的目的多肽的量(分子数)增加了至少5％。
优选地，在第一方面的步骤(ii)中添加糖苷酶。
对于本领域技术人员来说，实施同样执行的比较方法以测试在步骤(iv)中获得的经过纯化的目的多肽的量(分子数)是否因为在步骤(ii)中添加了糖苷酶而增加了至少5％是一项常规工作。
本领域技术人员简单地执行第一方面的方法和比较方法，其中除了在比较方法中没有在步骤(ii)添加糖苷酶之外，其它的一切都完全相同。
如果结果是，与同样执行的比较方法(即没有步骤(ii))相比，在步骤(iv)中获得的经过纯化的目的多肽的量(分子数)增加了至少5％，那么情况便是，与同样执行的用于纯化目的多肽的不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的经过纯化的目的多肽的量(分子数)增加了至少5％。
优选地，与同样执行的用于纯化目的多肽的不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的目的多肽的量(分子数)增加了至少10％。
更优选地，与同样执行的用于纯化目的多肽的不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的目的多肽的量(分子数)增加了至少25％。
甚至更优选地，与同样执行的用于纯化目的多肽的不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的目的多肽的量(分子数)增加了至少50％。
如所属领域中已知的，分子数的合适单位是被称为摩尔的单位。
如所属领域技术人员所理解的，包含步骤(iv)的经过纯化的目的多肽的组合物将具有不同的糖基化特征，即其可被视为新的组合物。
因此，本发明的第二方面涉及一种包含经过纯化的目的多肽的组合物，其中所述组合物可通过如本文中所述的第一方面和其实施方案的方法获得。
不希望受限于理论，人们认为，牛奶凝固酶的所有市售相关产品都是通过使用真核生产宿主细胞生产或者从例如相关的动物胃(例如牛的胃)提取，所述真核生产宿主细胞或相关的动物胃在生产/表达(例如重组生产)期间使目的牛奶凝固酶糖基化，换句话说，牛奶凝固酶的所有市售相关产品都是被糖基化的酶。
市售相关实例是例如在EP0805866B1(Harboe等人,Chr.HansenA/S,丹麦)中描述的来源于米黑根毛霉(Rhizomucormieheias)的毛霉胃蛋白酶，其中市售相关产品(Chr.HansenA/S)是通过使用米黑根毛霉真核生产宿主细胞来生产。
另一个实例是在例如WO02/36752A2(Chr.Hansen)中描述的单峰驼(Cameliusdromedarius)凝乳酶，其中市售相关产品M(Chr.HansenA/S)是通过使用黑曲霉(Aspergillusnigeras)真核生产宿主细胞来生产。
如以上所讨论并且不希望受限于理论，本文中相关的重要技术教导内容涉及本发明的发明人已经确定，通过对目的糖蛋白进行适当去糖基化，糖蛋白可以获得对包含疏水部分和/或正电性部分的配体的更好/更高结合能力。
因此，基于本文中的技术教导内容，人们可以说，本领域技术人员可以常规地确定如本文所述的第一方面的方法的一种替代性方法，用于纯化市售的相关目的牛奶凝固酶，其中所述方法基本上在使用不导致牛奶凝固酶的显著糖基化的生产宿主细胞时可以见到。
这种未被显著糖基化的目的牛奶凝固酶然后可以通过将其施加到如本文所述的与本发明的第一方面和其实施方案有关的相关配体上来纯化。
因此，本发明的另一方面涉及一种用于从包含目的牛奶凝固酶的水性介质中纯化此类目的牛奶凝固酶的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(I):在生产宿主细胞中生产目的牛奶凝固酶，其中所述生产宿主细胞不导致牛奶凝固酶的显著糖基化，以获得由包括至少10克(干物重)(例如优选地至少100克或至少1kg干物重)基本上未被糖基化形式的目的牛奶凝固酶的许多组分组成的水性样品，并且因此获得水性负载介质；
(II):将步骤(I)的负载介质施加到固相上，以便获得目的多肽到配体上的吸附，所述固相包含固体底基质，所述固体底基质含有包含疏水部分和/或正电性部分的配体；和
(III):从固相上洗脱目的牛奶凝固酶以便回收目的牛奶凝固酶，并且因此获得经过纯化的目的牛奶凝固酶。
如本领域技术人员在本发明中所理解的，步骤(I)的合适生产宿主细胞的本文相关实例可以是例如原核生产宿主细胞(例如杆菌属的大肠杆菌)。
如所属领域中已知的，一些真核生产宿主细胞也可能是特征在于不导致目的蛋白质(这里是目的牛奶凝固酶)的显著糖基化的细胞。这种细胞的本文中相关的合适实例是基因工程细胞，其中糖基化所必需的基因被失活(例如删除或突变)。
如本领域技术人员在本发明中所理解的，第一方面的方法的在本文中描述的合适相关实施方案也可能是以上刚刚描述的另一方面的方法的优选实施方案，例如优选的配体可以是例如苄胺，和/或优选的目的牛奶凝固酶可以是例如来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶；或凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
定义
本文相关术语的所有定义都与本领域技术人员关于本文中的相关技术背景所理解的内容一致。
术语“酶”是指具有酶活性的酶，即活性酶。举例来说，当酶是牛奶凝固酶(例如凝乳酶)时，活性可以是以国际牛奶凝固单位(IMCU)表示的实测牛奶凝固活性(C)。所述活性可通过标准方法(ISO11815IDF157,2007)测定，其描述通过裂解κ-酪蛋白的Phe105-Met106键或附近的键使牛奶聚集的能力。
术语“聚糖”是指多糖或低聚糖。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物，并且可以是线性的或分支的。聚糖也可以用于指例如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖等复合糖的碳水化合物部分。
术语“糖苷酶”(也称为糖苷水解酶)是指催化糖苷键结/键的水解的酶，糖苷键是一类将碳水化合物(糖)分子接合到另一个基团(其可以是另一个碳水化合物，也可以不是另一个碳水化合物)上的共价键。使N连接型聚糖部分地或完全地去糖基化的糖苷酶在本文中可以被称为N连接型糖苷酶。类似地，使O连接型聚糖部分地或完全地去糖基化的糖苷酶在本文中可以被称为O连接型糖苷酶。
术语N连接型糖苷酶是所属领域中明确定义的术语，并且本领域技术人员知晓具体目的糖苷酶是或不是N连接型糖苷酶。
类似地，术语O连接型糖苷酶是所属领域中明确定义的术语，并且本领域技术人员知晓具体目的糖苷酶是或不是O连接型糖苷酶。
糖苷酶在本文中也可以被称为去糖基化酶。
术语“糖基化”是将聚糖连接到蛋白质、脂质或其它有机分子上的酶促过程。
术语“N连接型聚糖”是指通常被连接到天门冬酰胺或精氨酸侧链的氮上的聚糖。
术语“O连接型聚糖”是指通常被连接到丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟基赖氨酸或羟脯氨酸侧链的羟基氧上，或例如神经酰胺等脂质的氧上的聚糖。
术语“多肽”涉及通过肽键结合在一起的氨基酸的单个线性聚合物链。
术语“糖基化形式的多肽”是含有共价连接到多肽侧链上的低聚糖链(聚糖)的多肽。碳水化合物通过共翻译修饰或翻译后修饰被连接到多肽上。这在本文中可以替代性地被称为“糖多肽”。
术语“蛋白质”涉及由一个或多个氨基酸链组成的相对较大的生物分子。如所属领域中所理解的，蛋白质是多肽的一个实例。
术语“糖基化形式的蛋白质”是含有共价连接到蛋白质侧链上的低聚糖链(聚糖)的蛋白质。碳水化合物通过共翻译修饰或翻译后修饰被连接到多肽上。这在本文中可以替代性地被称为“糖蛋白”。
术语“序列同一性”涉及两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性。
对于本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度是根据现有技术测定并且优选地使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)测定，所述Needleman-Wunsch算法在优选3.0.0版本或更高版本的EMBOSS程序包的Needle程序中实施(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等人,2000,TrendsGenet.16:276-277)。使用的可选参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。以Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)被用作同一性百分比并且计算如下：
(相同残基x100)/(比对长度–比对中的空位总数)。
对于本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性的程度是根据现有技术测定并且优选地使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,上文)测定，所述Needleman-Wunsch算法在优选3.0.0版本或更高版本的EMBOSS程序包的Needle程序中实施(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等人,2000,TrendsGenet.16:276-277)。使用的可选参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。以Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)被用作同一性百分比并且计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度–比对中的空位总数)。
以下仅以实例的方式描述了本发明的实施方案。
具体实施方式
目的多肽
不希望受限于理论，人们认为第一方面的方法在原则上可能与任何目的多肽具有相关性。
目的多肽最好是目的蛋白质。
目的蛋白质可以是目的酶，例如脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素、β-半乳糖苷酶或过氧化物酶。
如所属领域中已知的，牛奶凝固酶(例如凝乳酶和胃蛋白酶)使牛奶发生酶促凝固是乳酪制造中最重要的过程中的一个。酶促牛奶凝固是两阶段工艺：在第一阶段中，蛋白水解酶、凝乳酶或胃蛋白酶攻击k-酪蛋白，导致酪蛋白胶束结构的亚稳态，和在第二阶段中，牛奶随后凝固并且形成凝固物。
凝乳酶(EC3.4.23.4)和胃蛋白酶(EC3.4.23.1)(哺乳动物胃的牛奶凝固酶)是属于一大类肽酶的天冬氨酸蛋白酶。
牛奶凝固酶的另一个实例是毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)。
本文中的工作实例已经证实了，第一方面的方法可以用于改善两种不同凝乳酶(一种是来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶，另一种是来源于单峰驼的凝乳酶)的纯化。
在一个优选实施方案中，目的酶是目的天冬氨酸蛋白酶。
在一个优选实施方案中，目的酶是目的牛奶凝固酶，优选地是选自由以下各项组成的群组的牛奶凝固酶：凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)。
在一个优选实施方案中，目的酶是例如EP0805866B1(Harboe等人,Chr.HansenA/S,丹麦)中描述的来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶。
如EP0805866B1的段落[0021]中所述的，来源于米黑根毛霉的本文相关毛霉胃蛋白酶在其活性形式中包含361个氨基酸残基，并且具有不包括糖基部分的约38,701的计算分子量。
如EP0805866B1的段落[0013]中所解释的，来源于米黑根毛霉的本文相关毛霉胃蛋白酶作为由Chr.HansenA/S在市面销售。
本文相关的目的酶是在例如WO02/36752A2(Chr.Hansen)中描述的单峰驼凝乳酶。其在本文中可被替代性地称为骆驼凝乳酶，并且在本文的SEQIDNO:1中显示公众已知的氨基酸序列。
因此，在一个优选实施方案中，目的酶是凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％(优选地至少95％，更优选地至少99％)序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
优选地，目的酶是凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
第一方面的步骤(i)-获得具有糖基化形式的目的多肽的样品
第一方面的步骤(i)涉及获得由包括糖基化形式的目的多肽的许多组分组成的水性样品。
样品可以是其中大部分目的多肽都处于糖基化形式的样品。
然而，其替代性地可以是其中例如少于50％的目的多肽处于糖基化形式的样品。
对于本领域技术人员来说，获得此类样品是一项常规工作。
例如，其可以通过在真核生产宿主细胞中的重组生产例如目的蛋白质来获得，如所属领域中已知的，真核生产宿主细胞可以在重组生产/表达期间使目的蛋白质糖基化。
因此，通过在真核生产宿主细胞中生产(例如重组生产)例如目的蛋白质，人们可以获得步骤(i)需要的由包括糖基化形式的目的多肽/蛋白质的许多组分组成的样品。
如所属领域中已知的，在例如目的蛋白质的进一步下游纯化之前，人们通常去除/分离发酵介质中的生产宿主细胞和其它不需要的物质(例如通过离心和/或过滤)，也就是为了得到包含目的蛋白质但不含过多不需要的组分(例如生产宿主细胞)的样品。如所属领域中已知的，该样品有时候可被称为未纯化的第一滤液，此术语可在本文中使用并且其可以是步骤(i)的由包括糖基化形式的目的多肽的许多组分组成的本文相关样品的一个实例。
或者，其可以是经过更高纯化的样品，例如其中已经通过使用例如尺寸排阻色谱(SEC)进行第一纯化的样品。
用于生产(例如重组生产)例如目的蛋白质的许多合适的真核生产宿主细胞在所属领域中是已知的，本文相关例子是例如哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)或真菌细胞(例如曲霉细胞，优选地黑曲霉或米曲霉)。
WO02/36752A2(Chr.Hansen)描述一种使用曲霉细胞(优选地黑曲霉)作为生产宿主细胞来生产单峰驼凝乳酶(骆驼凝乳酶)的重组方法。
因此，当目的酶是牛奶凝固酶(例如选自由凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)组成的群组)时，重组生产宿主细胞最好是曲霉细胞(优选地黑曲霉)。
来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶可以优选地通过使用米黑根毛霉作为生产宿主细胞来生产。
第一方面的步骤(ii)-添加糖苷酶到步骤(i)的样品中
第一方面的步骤(ii)涉及添加糖苷酶到步骤(i)的样品中以便将目的多肽(例如蛋白质)去糖基化以获得水性负载介质。
术语“负载介质”单纯涉及在步骤(ii)中获得的介质，其随后用于第一方面的步骤(iii)中。
负载介质可以是其中步骤(i)的样品的大多数糖多肽已经被去糖基化的负载介质。
或者，负载介质可以是其中步骤(i)的样品的例如少于50％的糖多肽已经被去糖基化的负载介质。
在本文中，此步骤(ii)可被视为关键步骤，并且其与第一方面的方法的主要目标/优势相关联，所述主要目标/优势在于改良纯化方法，并且因此得到增加量的经过纯化的目的多肽/蛋白质。
如上文所讨论的并且不希望受限于理论，本文中相关的重要技术教导内容涉及本发明的发明人已经确定，通过对目的糖蛋白进行适当去糖基化，目的糖蛋白可以获得对包含疏水部分和/或正电性部分的配体的更好/更高结合能力。
因此，此步骤是本领域技术人员所执行的一个常规步骤，本领域技术人员知晓许多不同的糖苷酶并且知晓如何添加合适的糖苷酶到样品中以便获得目的多肽/蛋白质的本文相关去糖基化。
此外，通过进行相对有限的量的例如试验性实验/误差实验，本领域技术人员可以确定与具体目的多肽/蛋白质有关的优选糖苷酶，即在本文中可以适当地将目的多肽/蛋白质去糖基化的糖苷酶。
对于本领域技术人员来说，确定在步骤(ii)中添加的活性糖苷酶的合适/最佳量以便实现目的多肽/蛋白质的本文相关去糖基化也是常规工作。
第一方面的方法的最后一段涉及与同样执行的用于纯化目的多肽的不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的经过纯化的目的多肽的量(分子数)增加了至少5％。
如本领域技术人员所理解的，此段落暗示了第一方面的步骤(ii)的限制，如果例如在步骤(ii)中使用无活性的糖苷酶或不工作的糖苷酶，那么将不会获得经过纯化的目的多肽的量的5％增加。
还预期可以通过提供除表达目的多肽以外还表达糖苷酶(例如Endo-H)的生产宿主细胞，借此最初糖基化的目的多肽在细胞内或在分泌后将被去糖基化，从而获得第一方面的步骤(ii)中的去糖基化。
因此，本发明的一个实施方案可以是：
其中通过在真核生产宿主细胞中生产(例如重组生产)目的多肽或蛋白质来获得第一方面的步骤(i)中需要的由包括糖基化形式的目的多肽/蛋白质的许多组分组成的样品；和
其中通过在步骤(i)中使用的除了表达目的多肽/蛋白质以外还表达糖苷酶(例如Endo-H)的生产宿主细胞来进行步骤(ii)的糖苷酶的添加，借此最初糖基化的目的多肽在细胞内或在分泌后将被去糖基化，从而可以获得步骤(ii)的水性负载介质。
优选地，在第一方面的步骤(ii)中添加糖苷酶是通过体外添加活性糖苷酶来进行。
如上文所讨论的，术语“糖苷酶”(也称为糖苷水解酶)是指催化糖苷键结/键的水解的酶，糖苷键是一类将碳水化合物(糖)分子接合到另一个基团(其可以是另一个碳水化合物，也可以不是另一个碳水化合物)上的共价键。
如上所述，糖苷酶在本文中也可以被称为去糖基化酶。
糖苷酶可以是天然糖苷酶，或者其可以是天然糖苷酶的变异体/突变体，如本领域技术人员已知的，人们可以制造目的酶(这里是糖苷酶)的突变变异体以便例如提高酶的稳定性，同时维持酶的关键酶活性(这里是糖苷酶活性)。
本领域技术人员可能知晓或常规地能够确定目的多肽/蛋白质包含本文中相关的N连接型或O连接型糖基化，从而常规地能够确定在本文中优选使用N连接型糖苷酶还是O连接型糖苷酶。
例如，许多本文中的市售相关蛋白质包含N连接糖基化，因此优选使用N连接型糖苷酶。
因此，优选地，在步骤(ii)中使用的糖苷酶是N连接型糖苷酶。
如上文所讨论的，术语N连接型糖苷酶是所属领域中明确定义的术语，并且本领域技术人员知晓具体目的糖苷酶是或不是N连接型糖苷酶。
此外，现有技术描述许多不同的本文中合适的N连接型糖苷酶。
本文中合适的N连接型糖苷酶的实例可以是选自由以下各项组成的群组的至少一种糖苷酶：肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡糖胺基)天门冬酰胺酰胺酶(EC编号：3.5.1.52；别称：N-糖苷酶-F或PNGase-F)和内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。
上文刚刚描述的N连接型糖苷酶在本文中可以被描述为具有N连接型糖苷酶活性但是没有本文中的显著O连接型糖苷酶活性的糖苷酶。
因此，在本文中优选的是，N连接型糖苷酶是不具有本文中相关的O连接型糖苷酶活性(例如没有O连接型糖苷酶活性)的N连接型糖苷酶。
N-糖苷酶-F也称为PNGase-F，其是可来源于败毒产黄菌(Flavobacteriummesingosepticum)的天门冬酰胺酰胺酶(EC3.5.1.52)。其催化从糖蛋白上完全且完整地裂解N-连接型低聚糖。其可以作为市售产品以名称PNGase-F获自NewEnglandBiolabsInc.，或者在如大肠杆菌的菌株中重组生产。
内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96)也称为ENDO-H，其可来源于褶皱链霉菌(Streptomycesplicatus)。ENDO-H催化N连接型糖基化物的两个N-乙酰葡萄糖胺之间的糖苷键的水解。其可作为市售产品以名称ENDO-H获自NewEnglandBiolabsInc.。
具体来说，当目的酶是牛奶凝固酶(例如选自由凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)组成的群组)时，优选地，N连接型糖苷酶是内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。
当目的酶是来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶(参见上文)时或者当目的酶是骆驼凝乳酶(例如来自于单峰驼，参见上文)时，在步骤(ii)中使用ENDO-H作为N连接型糖苷酶是尤其优选的。
如上文所讨论的，术语O连接型糖苷酶是所属领域中明确定义的术语，并且本领域技术人员知晓具体目的糖苷酶是或不是O连接型糖苷酶。
此外，现有技术描述许多不同的本文中合适的O连接型糖苷酶。
本文中合适的O连接型糖苷酶的实例可以是选自由以下各项组成的群组的至少一种糖苷酶：α-N-乙酰基-半乳糖氨酶(EC编号：3.2.1.49；别称：GalNAC)、α-半乳糖苷酶(EC编号：3.2.1.22)和神经氨酸酶(EC编号：3.2.1.18)。
GalNAC是高特异性的外切糖苷酶，其催化α连接的D-N-乙酰-半乳糖胺残基的水解。其可作为市售产品获自NewEnglandBiolabsInc。
根据此项技术在本文中确定糖苷酶的有效量/活性。
根据此项技术，对于N连接型糖苷酶(例如PNGase-F和Endo-H)来说，1个活性单位被定义成在10μl的总反应体积中在37℃在1小时内从10μg变性RNase-B中去除>95％的碳水化合物所需要的酶量。
对于GalNAC(O连接型糖苷酶)来说，1个活性单位被定义成在10μl的总反应体积中在37℃在1小时内从1nmol(GalNAcα1-3)(Fucα1-2)Galα1-4Glc-7-氨基-4-甲基-香豆素(AMC)上裂解>95％的末端α-D-N-乙酰-半乳糖胺所需要的酶量。
许多本文中相关的糖苷酶是由例如NewEnglandBiolabs公司在市面有售的，还参考NewEnglandBiolabs的产品目录(例如在其网页上在线获得)以获得关于本文中相关的糖苷酶活性单位的具体标准定义的其它细节。
与涉及添加糖苷酶到步骤(i)的样品中的步骤(ii)有关，在本文中认为，为了实现步骤(ii)中的目的多肽或蛋白质的本文相关去糖基化，每微克样品多肽/蛋白质添加0.001个糖苷酶活性单位到每微克样品多肽/蛋白质添加1000个糖苷酶活性单位是足够的。
如果与具体目的相关，人们可以添加更多糖苷酶，例如每微克样品多肽/蛋白质添加高达20000个糖苷酶活性单位。
如上文所讨论的，在本文中根据现有技术确定糖苷酶的有效量/活性。
第一方面的步骤(iii)-将负载材料施加到配体上
第一方面的步骤(iii)涉及将步骤(ii)的负载介质施加到固相上，以便获得目的多肽到配体上的吸附，所述固相包含固体底基质，所述固体底基质含有包含疏水部分和/或正电性部分的配体。
优选地，步骤(iii)的固体底基质是含有包含疏水部分的配体的固体底基质。
术语“固体底基质”是指固体骨架材料，其含有允许配体共价连接到所述骨架材料上的反应性官能团。此术语在本文中也被称为固体载体基质。
如所属领域中已知的，骨架材料可以是无机的，例如硅石，或有机的。作为实例，本文中有用的有机骨架材料包括纤维素和其衍生物、琼脂糖、右旋糖酐、聚合物(例如聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯)、共聚物。此外，可使用三元聚合物和更高元的聚合物，条件是单体中的至少一种含有所得聚合物中的反应性官能团。
如所属领域中已知的，固体底基质的一个实例可以是所谓的树脂，如所属领域中已知的，此术语可以关于离子交换色谱(IEC)使用。
如所属领域中已知的，固体底基质可以优选地是粒子，例如固体底基质可以包括粒子尺寸小于750μm的粒子或粒子尺寸小于100μm的粒子。
固体载体基质的允许配体基团共价连接的反应性官能团在所属领域中是众所周知的，并且包括例如羟基、羧基、巯基和氨基。
如本文中所使用，术语“配体”是指由如本文中定义的疏水部分和/或正电性部分、以及用于将配体共价连接到固体底基质上的间隔臂组成的基团/部分。间隔臂可以是能够将所选基团/部分共价连接到固体底基质上的任何基团或取代基。此类间隔臂在所属领域中是众所周知的，并且包括例如烯基、芳族基、烷基芳族基、酰胺基、氨基、脲基、氨基甲酸酯基。
包含目的多肽的水性负载介质与本文中所述的配体在允许目的多肽结合/吸附到配体上的条件下接触。本领域技术人员知晓如何调节条件(例如，调节例如在3-10的范围的pH，包括4-8的范围，和/或调节流动速率)以便获得目的多肽/蛋白质到目的配体上的适当吸附。
因此，此步骤(iii)是本领域技术人员所执行的常规步骤，并且本领域技术人员知晓许多不同的本文相关配体(参见例如综述文章：Yang等人,JournalofChromatographyA,1218(2011)8813-8825)。
此外，本领域技术人员知晓许多本文中相关的纯化/分离技术，其中将包含目的多肽/蛋白质的本文相关介质施加到固相上以获得目的多肽/蛋白质到配体上的吸附，所述固相包含固体底基质，所述固体底基质含有本文相关配体。
因此，如本文中所述的第一方面或其实施方案的方法例如可以是一种方法，其中通过使用选自由以下各项组成的群组的至少一种纯化技术执行步骤(iii)和步骤(iv)：色谱法、柱色谱、床吸附、膨胀床吸附(EBA)、成批吸附、薄膜吸附和离子交换色谱(IEC)。
优选地，如本文中所述的第一方面或其实施方案的是这样一种方法，其中通过使用膨胀床吸附(EBA)纯化技术执行步骤(iii)和步骤(iv)。
所有这些纯化技术都是本领域技术人员众所周知的，因此，对于本领域技术人员来说，适当执行与具体目的多肽/蛋白质和所用的合适具体配体相关的步骤(iii)和(iv)是常规工作。
换句话说，对于本领域技术人员来说，确定合适溶剂、缓冲剂等以便在步骤(iii)使目的多肽适当吸附到配体上和在步骤(iv)适当洗脱目的多肽是常规工作。
因此，不认为在本文中非常详细地描述这些步骤是有必要的。
如所属领域中已知的，术语“色谱”涉及一种物理分离方法，其中欲分离的组分分布在两相之间，一个相被称为固定的(固定相)，而另一个相(流动相)以一定方向移动。
如所属领域中已知的，术语“柱色谱”涉及一种分离技术，其中固定床处于管内。固体固定相或用液体固定相包被的载体的粒子可以填满管(填充柱)的全部内部体积，或者在内部管壁上或沿着内部管壁聚集，在管的中部给流动相留出一条开放的不受限制的路径(空心管柱)。
如所属领域中已知的，术语“膨胀床吸附(EBA)”涉及一种能够加工粘稠液体和微粒液体的制备色谱技术。
EBA中的蛋白质结合原则与经典柱色谱相同，并且可以使用普通离子交换、疏水性相互作用和亲和色谱配体。当经典柱色谱使用由填充床制造的固相时，EBA使用流化态的粒子。EBA树脂含有不同尺寸和密度的粒子，在膨胀时产生粒子尺寸的梯度，并且当床处于其膨胀状态时，形成局部回路。例如全细胞或细胞碎片等粒子可能堵塞填充床柱，但是容易通过流化床。因此可以对破裂细胞的粗制培养培养肉汤或浆料使用EBA，从而避免当使用填充床时可能需要的例如离心和过滤等初始清理步骤。
术语“床吸附”、“成批吸附”和“薄膜吸附”都是众所周知的，并且在本文中由本领域技术人员清楚了解的。
如所属领域中已知的，配体的疏水部分可以例如是脂族基或芳族基。
脂族基可以例如是具有不同长度的烷基，例如C2到C40烷基或C4到C30烷基；
具有不同长度的烯基，例如C2到C40烯基或C4到C30烯基；或例如
具有不同长度的炔基，例如C2到C40炔基或C4到C40炔基。
芳族基可以例如是苯基或苄基。
在一个优选实施方案中，配体的疏水部分是苄基或苯基。
如所属领域中已知的，配体的正电性部分可以例如是氨基或例如季铵基。
如所属领域中已知的，阴离子交换树脂具有正电荷并且用于保持和分离负电性化合物。
因此，本文中第一方面的方法的步骤(iii)的包含含配体的树脂的固相可被称为阴离子交换树脂，所述配体包含正电性部分。
因此，配体的正电性部分可以例如是用于阴离子交换的氨基或用于阴离子交换的季铵基。
在一个优选实施方案中，配体包含疏水部分和正电性部分。
优选地，疏水部分是苄基，并且正电性部分是氨基，即配体是苄胺。
如所属领域中已知的，混合模式色谱(MMC)是一类色谱方法，其中在固定相与进料中的溶质之间发生多种相互作用模式。MMC不是新颖的概念。举例来说，已经在离子交换色谱(IEC)和亲和色谱(AFC)中观察到疏水性相互作用。在尺寸排阻色谱(SEC)中经常存在静电效应。MMC与单模式色谱截然不同，因为第二种相互作用不能太弱，并且这两种相互作用都应当促进溶质的保留(术语“溶质”是指色谱中的样品组分，例如本文中步骤(ii)的负载介质的组分)。关于进一步的MMC相关信息，请参考例如综述文章：标题为“Mixed-modechromatographyanditsapplicationstobiopolymers”的Yang等人,JournalofChromatographyA,1218(2011)8813-8825。
因此，当配体包含疏水部分和正电性部分时，如本文中所述的方法优选地是一种其中通过使用混合模式色谱技术执行步骤(iii)和步骤(iv)的方法。
第一方面的步骤(iv)-将负载材料施加到配体上
第一方面的步骤(iv)涉及从固相上洗脱目的多肽以便回收目的多肽，从而获得经过纯化的目的多肽。
如上文所讨论的，对于本领域技术人员来说，适当执行与具体目的多肽/蛋白质和所用的合适具体配体相关的步骤(iii)和(iv)是常规工作。
换句话说，对于本领域技术人员来说，确定合适溶剂、缓冲剂等以便在步骤(iii)使目的多肽适当吸附到配体上和在步骤(iv)适当洗脱目的多肽是常规工作。
因此，不认为在本文中非常详细地描述例如步骤(iv)是有必要的。
步骤(iv)的经过纯化的目的多肽可以是其中大多数经过纯化的多肽都处于未被糖基化形式的组合物。
或者，步骤(iv)的经过纯化的目的多肽可以是其中例如少于50％的经过纯化的多肽都处于未被糖基化形式的组合物。
本发明的独立方面-骆驼凝乳酶本身的去糖基化
如以下工作实例中所讨论的，骆驼凝乳酶的去糖基化(优选地通过使用Endo-H)可以使牛奶凝固活性增加高达约10-15％。
因此，本发明的一个独立方面涉及一种包含至少1克(干物重)凝乳酶的组合物，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，其中所述组合物中至少85％(w/w)的凝乳酶分子在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化。
优选地，组合物中至少90％(w/w)的凝乳酶在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化，更优选地组合物中至少95％(w/w)的凝乳酶在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化，并且甚至更优选地组合物中至少98％(w/w)的凝乳酶在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化。
此外，本发明的一个独立方面涉及一种包含至少1克(干物重)凝乳酶的组合物，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，其中所述组合物中至少85％(w/w)的凝乳酶分子具有低于38.5KDa的质谱峰。
优选地，组合物中至少90％(w/w)的凝乳酶具有低于38.5KDa的质谱峰，更优选地组合物中至少98％(w/w)的凝乳酶具有低于38.5KDa的质谱峰。
此外，本发明的一个独立方面涉及一种用于获得包含至少1克(干物重)去糖基化活性凝乳酶的组合物的方法，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，其中所述方法包括以下步骤：
(A):将活性N连接型糖苷酶添加到由包括至少1g(干物重)糖基化形式的凝乳酶的许多组分组成的样品中以便将凝乳酶去糖基化；
(B):获得(例如通过纯化)步骤(A)的去糖基化样品以得到包含至少1克(干物重)去糖基化活性凝乳酶的组合物；和
其中与同样执行的用于获得凝乳酶的不包括步骤(A)的比较方法相比，在步骤(B)中获得的去糖基化活性凝乳酶的活性(IMCU/mg)增加了至少5％。
优选地，步骤(A)中的糖苷酶是肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡糖胺基)天门冬酰胺酰胺酶(EC编号：3.5.1.52；别称：N-糖苷酶-F或PNGase-F)和内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。
更优选地，步骤(A)中的糖苷酶是内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。
对于本领域技术人员来说，获得步骤(A)的由包括至少1g(干物重)糖基化形式的凝乳酶的许多组分组成的样品是常规工作。
其可以例如通过在例如真菌细胞(例如曲霉细胞，优选地黑曲霉或米曲霉)等真核生产宿主细胞中生产(例如重组生产)例如目的蛋白质来获得。
如所属领域的技术人员所理解的，步骤(B)的包含获得的去糖基化活性凝乳酶的组合物将具有不同的糖基化特征，即其因此可被视为新的组合物。
因此，本发明的另一个独立方面涉及一种包含去糖基化活性凝乳酶的组合物，其中所述组合物可通过如本文中所述的以上独立方面和其实施方案的用于获得包含至少1克(干物重)去糖基化活性凝乳酶的组合物的方法来获得。
对于以上刚刚提到的所有独立方面和其实施方案，凝乳酶优选地包含SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
关于以上刚刚提到的这些独立方面，下文讨论的现有技术可以具有关联性。
在天冬氨酸蛋白酶中，已经显示来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶的去糖基化可以使牛奶凝固活性提高高达约25％(EP0805866B1/US6127142A；Harboe等人,Chr.HansenA/S,丹麦)。
是(由Chr.HansenA/S；丹麦)市售的牛奶凝固酶，其是通过真菌寄生隐丛赤壳菌(Cryphonectriaparasitica)的选定菌株的发酵来生产的。
是(由Chr.HansenA/S；丹麦)市售的牛奶凝固酶，其来自于牛。
本发明的申请人的未公开结果证实了，或的去糖基化没有导致显著提高的牛奶凝固活性，即，如本领域技术人员所预期的，并不是所有的酶在去糖基化之后都得到提高的活性。
WO02/36752A2(Chr.HansenA/S,丹麦)描述所谓的非牛凝乳酶(例如来自于绵羊、山羊、骆驼、水牛或羊驼)的重组生产。在第13页笼统地描述了此类非牛凝乳酶可以被去糖基化。然而，关于提到的所谓的非牛凝乳酶(例如骆驼凝乳酶)的去糖基化，WO02/36752A2没有提供本文中相关的实验数据。
本文中的方面/实施方案-以权利要求格式呈现
本文中描述的本发明的方面和优选实施方案可以在所谓的权利要求格式下呈现/描述，这在下文中进行。
1.一种用于从包含目的多肽的水性介质中纯化此类目的多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i):获得由包括糖基化形式的目的多肽的许多组分组成的水性样品；
(ii):将糖苷酶和/或化学处理(例如用高碘酸盐处理)添加到步骤(i)的样品中，以便使所述目的多肽去糖基化以获得水性负载介质；
(iii):将步骤(ii)的负载介质施加到固相上，所述固相包含固体底基质，所述固体底基质含有包含疏水部分和/或正电性部分的配体，以便获得所述目的多肽到所述配体上的吸附；
(iv):从所述固相上洗脱所述目的多肽以便回收所述目的多肽，从而获得经过纯化的目的多肽；
其中与同样执行的用于纯化所述目的多肽的但不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的经过纯化的目的多肽的量(分子数)增加了至少5％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(ii)中添加糖苷酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在权利要求1的步骤(ii)中添加糖苷酶是通过体外添加活性糖苷酶来进行。
4.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中与同样执行的用于纯化所述目的多肽但不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的所述目的多肽的量(分子数)增加了至少50％。
5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述目的多肽是目的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述目的蛋白质是目的酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述目的酶是目的牛奶凝固酶。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是选自由以下各项组成的群组的牛奶凝固酶：凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是：
来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶；或
凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少99％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中权利要求1的步骤(i)中需要的由包括糖基化形式的目的多肽/蛋白质的许多组分组成的样品通过在真核生产宿主细胞中生产(例如重组生产)目的多肽或蛋白质来获得。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述真核生产宿主细胞是曲霉(Aspergillus)细胞，优选地是黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述目的蛋白质是目的牛奶凝固酶，并且所述目的牛奶凝固酶是：
来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶，并且所述真核生产宿主细胞是米黑根毛霉；或
凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，并且所述真核生产宿主细胞是曲霉细胞，优选地是黑曲霉或米曲霉。
14.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中在步骤(ii)中使用的糖苷酶是N连接型糖苷酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述N连接型糖苷酶是选自由以下各项组成的群组的至少一种糖苷酶：肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡糖胺基)天门冬酰胺酰胺酶(EC编号：3.5.1.52；别称：N-糖苷酶-F或PNGase-F)和内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述N连接型糖苷酶是内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)，并且所述目的蛋白质是目的牛奶凝固酶，并且所述目的牛奶凝固酶是：
来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶；或
凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
17.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述固体底基质包括粒子尺寸小于750μm的粒子，并且其中所述固体底基质是由至少一种以下材料制造：硅石、纤维素、琼脂糖、右旋糖酐、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酸酯。
18.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述步骤(iii)和步骤(iv)是通过使用选自由以下各项组成的群组的至少一种纯化技术执行：色谱、柱色谱、床吸附、膨胀床吸附(EBA)、成批吸附、薄膜吸附和离子交换色谱(IEC)。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述步骤(iii)和步骤(iv)是通过使用膨胀床吸附(EBA)纯化技术执行。
20.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含疏水部分，并且其中所述配体的所述疏水部分是脂族基或芳族基。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述脂族基是：
C2到C40烷基；
C2到C40烯基；或
C2到C40炔基；
或
其中所述芳族基是苯基或苄基。
22.根据权利要求21所述的方法，所述配体的疏水部分是芳族基，所述芳族基是苄基。
23.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含正电性部分，并且其中所述配体的所述正电性部分是氨基。
24.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含疏水部分和正电性部分。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述配体是苄胺。
26.根据权利要求24到25中任一权利要求所述的方法，其中所述步骤(iii)和步骤(iv)是通过使用混合模式色谱(MMC)纯化技术执行，优选地其中混合模式色谱(MMC)纯化技术是膨胀床吸附(EBA)技术。
27.根据权利要求24到26中任一权利要求所述的方法，其中目的蛋白质是目的牛奶凝固酶。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是选自由以下各项组成的群组的牛奶凝固酶：凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是：
来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶；或
凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述配体是苄胺。
31.一种包含经过纯化的目的多肽的组合物，其中所述组合物可通过权利要求1到31中任一权利要求的方法获得。
32.一种用于从包含目的牛奶凝固酶的水性介质中纯化此类目的牛奶凝固酶的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(I):在生产宿主细胞中生产目的牛奶凝固酶，其中所述生产宿主细胞不导致所述牛奶凝固酶的显著糖基化，以获得由包括至少10克(干物重)(例如优选地至少1kg干物重)基本上未被糖基化形式的所述目的牛奶凝固酶的许多组分组成的水性样品，从而获得水性负载介质；
(II):将步骤(I)的负载介质施加到固相上，所述固相包含固体底基质，所述固体底基质含有包含疏水部分和/或正电性部分的配体，以便获得所述目的多肽到所述配体上的吸附；和
(III):从所述固相上洗脱所述目的牛奶凝固酶以便回收所述目的牛奶凝固酶，从而获得经过纯化的目的牛奶凝固酶。
33.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(I)的所述生产宿主细胞是原核生产宿主细胞(例如杆菌属的大肠杆菌)。
34.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(I)的所述生产宿主细胞是真核生产宿主细胞，其不导致所述目的牛奶凝固酶的显著糖基化。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述真核生产宿主细胞是基因工程细胞，其中糖基化所必需的基因被失活(例如删除或突变)。
36.根据权利要求32到35中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含疏水部分，并且其中所述配体的所述疏水部分是脂族基或芳族基。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述脂族基是：
C2到C40烷基；
C2到C40烯基；或
C2到C40炔基；
或
其中所述芳族基是苯基或苄基。
38.根据权利要求37所述的方法，所述配体的疏水部分是芳族基，所述芳族基是苄基。
39.根据权利要求32到38中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含正电性部分，并且其中所述配体的所述正电性部分是氨基。
40.根据权利要求32到39中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含疏水部分和正电性部分。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述配体是苄胺。
42.根据权利要求40到41中任一权利要求所述的方法，其中所述步骤(iii)和步骤(iv)是通过使用混合模式色谱(MMC)纯化技术执行，优选地其中混合模式色谱(MMC)纯化技术是膨胀床吸附(EBA)技术。
43.根据权利要求32到42中任一权利要求所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是选自由以下各项组成的群组的牛奶凝固酶：凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是：
来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶；或
凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述配体是苄胺。
46.一种包含至少1克(干物重)凝乳酶的组合物，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，其中所述组合物中至少85％(w/w)的凝乳酶分子在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述组合物中至少90％(w/w)的凝乳酶在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化，更优选地所述组合物中至少95％(w/w)的凝乳酶在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化，并且甚至更优选地所述组合物中至少98％(w/w)的凝乳酶在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化。
48.一种包含至少1克(干物重)凝乳酶的组合物，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，其中所述组合物中至少85％(w/w)的凝乳酶分子具有低于38.5KDa的质谱峰。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述组合物中至少90％(w/w)的凝乳酶具有低于38.5KDa的质谱峰，更优选地所述组合物中至少98％(w/w)的凝乳酶具有低于38.5KDa的质谱峰。
50.一种用于获得包含至少1克(干物重)去糖基化活性凝乳酶的组合物的方法，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，其中所述方法包括以下步骤：
(A):将活性N连接型糖苷酶添加到由包括至少1g(干物重)糖基化形式的所述凝乳酶的许多组分组成的样品中以便将所述凝乳酶去糖基化；
(B):获得(例如通过纯化)步骤(A)的去糖基化样品以得到包含至少1克(干物重)去糖基化活性凝乳酶的组合物；并且
其中与同样执行的用于获得所述凝乳酶的不包括步骤(A)的比较方法相比，在步骤(B)中获得的去糖基化活性凝乳酶的活性(IMCU/mg)增加了至少5％。
51.根据权利要求50所述的方法，其中步骤(A)中的所述糖苷酶是肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡糖胺基)天门冬酰胺酰胺酶(EC编号：3.5.1.52；别称：N-糖苷酶-F或PNGase-F)或内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。
52.根据权利要求50所述的方法，其中步骤(A)中的所述糖苷酶是内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。
53.根据权利要求50到52中任一权利要求所述的方法，权利要求50的步骤(A)中需要的由包括糖基化形式的凝乳酶的许多组分组成的样品通过在真核生产宿主细胞中生产(例如重组生产)目的多肽或蛋白质来获得。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述真核生产宿主细胞是真菌细胞(例如曲霉细胞，优选地黑曲霉或米曲霉)。
55.根据权利要求50到54中任一权利要求所述的方法，其中所述凝乳酶包含SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
56.一种包含去糖基化活性凝乳酶的组合物，其中所述组合物可通过根据权利要求50到55中任一权利要求所述的用于获得包含至少1克(干物重)去糖基化活性凝乳酶的组合物的方法获得。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述凝乳酶包含SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
实施例
实施例1：通过去糖基化步骤对牛奶凝固酶的改良纯化
材料：
步骤(i)：具有糖基化形式的目的多肽的样品
(a):在例如EP0805866B1中描述的来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶(Harboe等人,Chr.HansenA/S,丹麦)。其是使用米黑根毛霉作为生产宿主细胞来生产的。
(b):如WO02/36752A2(Chr.Hansen)中所描述的重组生产的(生产宿主细胞是黑曲霉)单峰驼凝乳酶。其在本文中可被替代性地称为骆驼凝乳酶，并且在本文的SEQIDNO:1中显示公众已知的氨基酸序列。
两种样品(a)和(b)是所谓的第一滤液，即，在进一步下游纯化之前，可以通过例如离心和/或过滤来去除/分离发酵介质中的生产宿主细胞和其它不需要的物质。
步骤(ii)：添加糖苷酶
使用的糖苷酶是ENDO-H。
步骤(iii)：含有配体的固体底基质
配体是苄胺，其共价结合到琼脂糖固体底基质粒子上。
在本实施例中其可被称为树脂。
此配体是包含疏水部分和/或正电性部分的配体的一个实例。
实验：
对每一种样品(即毛霉胃蛋白酶和骆驼凝乳酶)都执行两个膨胀床吸附(EBA)纯化实验，一个是根据本文中所述的第一方面的方法执行(即具有添加糖苷酶的步骤(ii))，另一个是比较实验，其中除了在比较实验中不使用添加糖苷酶的步骤(ii)之外，其它的一切都完全相同地执行。
结果：
被测定为以每毫升树脂的国际牛奶凝固单位(IMCU)表示的牛奶凝固活性(C)-与没有使用糖苷酶步骤(ii)的比较实验相比，因为使用了糖苷酶步骤(ii)，毛霉胃蛋白酶与配体的结合有约50％的提高，即活性增加50％(IMCU/ml树脂)。
如本文中所讨论的，EP0805866B1/US6127142A(Harboe等人,Chr.HansenA/S,丹麦)描述来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶的去糖基化可以使牛奶凝固活性提高高达约25％。
因此，第一方面的方法的糖苷酶步骤(ii)的使用似乎使经过纯化的毛霉胃蛋白酶的量(分子数)增加了至少25％。
被测定为以每毫升树脂的国际牛奶凝固单位(IMCU)表示的牛奶凝固活性(C)-与没有使用糖苷酶步骤(ii)的比较实验相比，因为使用了糖苷酶步骤(ii)，骆驼凝乳酶与配体的结合有约80％的提高，即活性增加80％(IMCU/ml树脂)。
如本文中所讨论的，骆驼凝乳酶的Endo-H去糖基化可以使牛奶凝固活性提高高达约10-15％。
因此，第一方面的方法的糖苷酶步骤(ii)的使用似乎使经过纯化的骆驼凝乳酶的量(分子数)增加了至少65％。
结论：
以上结果证实：
第一方面的方法的糖苷酶步骤(ii)的使用似乎使经过纯化的毛霉胃蛋白酶的量(分子数)增加了至少25％，和
第一方面的方法的糖苷酶步骤(ii)的使用似乎使经过纯化的骆驼凝乳酶的量(分子数)增加了至少65％。
实施例2：骆驼凝乳酶的去糖基化-提高活性
分析重组生产的(生产宿主细胞是黑曲霉，如例如WO02/36752A2,Chr.Hansen所描述的)单峰驼凝乳酶。其在本文中可被替代性地称为骆驼凝乳酶，并且在本文的SEQIDNO:1中显示公众已知的氨基酸序列。
骆驼凝乳酶的序列暗示两个潜在的糖基化位点：SEQIDNO:1的Asn158和Asn349。
通过疏水作用色谱分离骆驼凝乳酶的6种变异体。
利用质谱分析法、SDS-PAGE、牛奶凝固分析法、N端测序和去糖基化将这些变异体表征。
使用在线性正离子模式下操作的VoyagerEliteMALDITOF质谱仪(AppliedBiosystemsInc.,Framingham,MA)测量蛋白质质量。将分离的变异体脱盐，并在50R1微型柱上浓缩，随后用由70％乙腈和0.1％三氟乙酸中的20mg/ml芥子酸(sinnapinicacid)组成的基质溶液洗脱，并沉积在不锈钢MALDI标靶上。用0.5μl的于丙酮中的sinnapinicacid(20mg/ml)预处理靶点。分析3-50kDa的质量范围的样品。对数据进行基线校正和噪声滤波。
质谱分析法、SDS-PAGE和牛奶凝固分析法显示变异体的糖基化和活性是：
变异体编号 1 2 3 4 5 6
糖基化的数量 2 2 1 1 0 0
质谱峰(kDa)* 40.2 40.2 37.7 37.7 35.6 35.8
牛奶凝固活性(IMCU/mg) 123 289 396 467 474 426
*光谱中的峰的平均质量
在储存期间，在这两个糖基化位点之间的位点上发生降解。对于所有变异体都发现了含有Asn158的片段。在变异体1-4中其被糖基化，但是仅对于变异体5-6发现了未被糖基化的片段。这暗示单一糖基化变异体3+4在Asn158处被糖基化。这表明Asn349的额外的糖基化(对于变异体1+2)引起牛奶凝固活性的观察到的降低。因此，骆驼凝乳酶的去糖基化应当引起活性的增加。
用ENDO-H将包含上表的所有6种变异体的总样品去糖基化得到了具有提高的牛奶凝固活性(IMCU/mg)的组合物，牛奶凝固活性(IMCU/mg)大约提高了10-15％。
用PNGase-F将包含上表的所有6种变异体的总样品去糖基化并没有像ENDO-H那样提高牛奶凝固活性。
实施例3：通过去糖基化步骤对牛奶凝固酶的改良纯化
材料：
步骤(i)：具有糖基化形式的目的多肽的样品
由单峰驼重组生产，参见以上实施例1。
步骤(ii)：添加糖苷酶
使用的糖苷酶是ENDO-H。
步骤(iii)：含有配体的固体底基质
配体是苯基，其共价结合到琼脂糖(例如)固体底基质粒子上。
在本实施例中其可被称为树脂。
此配体是包含疏水部分的配体的一个实例。
实验：
对骆驼凝乳酶样品执行两个填充床纯化实验，一个是根据本文中所述的第一方面的方法执行(即具有添加糖苷酶的步骤(ii))，另一个是比较实验，其中除了在比较实验中不使用添加糖苷酶的步骤(ii)之外，其它的一切都完全相同地执行。
结果：
被测定为以每毫升树脂的国际牛奶凝固单位(IMCU)表示的牛奶凝固活性(C)-与没有使用糖苷酶步骤(ii)的比较实验相比，因为使用了糖苷酶步骤(ii)，骆驼凝乳酶与配体的结合有约75％的提高(基于10％突破)，即活性增加75％(IMCU/ml树脂)。
如本文中所讨论的，骆驼凝乳酶的Endo-H去糖基化可以使牛奶凝固活性提高高达约10-15％。
因此，第一方面的方法的糖苷酶步骤(ii)的使用似乎使经过纯化的骆驼凝乳酶的量(分子数)增加了至少60％。
结论：
以上结果证实：
第一方面的方法的糖苷酶步骤(ii)的使用似乎使经过纯化的骆驼凝乳酶的量(分子数)增加了至少60％。
实施例4：通过去糖基化步骤对牛奶凝固酶的改良纯化
材料：
步骤(i)：具有糖基化形式的目的多肽的样品
由单峰驼重组生产，参见以上实施例1。
步骤(ii)：添加糖苷酶
使用的糖苷酶是ENDO-H。
步骤(iii)：含有配体的固体底基质
配体是季胺，其共价结合到琼脂糖固体底基质粒子上。
在本实施例中其可被称为树脂。
此配体是包含正电性部分的配体的一个实例。
实验：
对骆驼凝乳酶样品执行两个成批吸附纯化实验，一个是根据本文中所述的第一方面的方法执行(即具有添加糖苷酶的步骤(ii))，另一个是比较实验，其中除了在比较实验中不使用添加糖苷酶的步骤(ii)之外，其它的一切都完全相同地执行。
结果：
被测定为以每毫升树脂的国际牛奶凝固单位(IMCU)表示的牛奶凝固活性(C)-与没有使用糖苷酶步骤(ii)的比较实验相比，因为使用了糖苷酶步骤(ii)，骆驼凝乳酶与配体的结合有约20％的提高(基于静态结合)，即活性增加20％(IMCU/ml树脂)。
如本文中所讨论的，骆驼凝乳酶的Endo-H去糖基化可以使牛奶凝固活性提高高达约10-15％。
因此，第一方面的方法的糖苷酶步骤(ii)的使用似乎使经过纯化的骆驼凝乳酶的量(分子数)增加了至少5％。
结论：
以上结果证实：
第一方面的方法的糖苷酶步骤(ii)的使用似乎使经过纯化的骆驼凝乳酶的量(分子数)增加了至少5％。
参考文献
1:WO01/58924A2(UpfrontChromatographyA/S,Denmark)
2:Yangetal,JournalofChromatographyA,1218(2011)8813-8825.Reviewarticlewithtitle“Mixed-modechromatographyanditsapplicationstobiopolymers”.
3:EP0805866B1/US6127142A；Harboeetal,Chr.HansenA/S,Denmark
4:WO02/36752A2(Chr.Hansen)

Claims (57)

1.一种用于从包含目的多肽的水性介质中纯化此类目的多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i):获得由包括糖基化形式的所述目的多肽的许多组分组成的水性样品；其特征在于
(ii):将糖苷酶和/或化学处理(例如用高碘酸盐处理)添加到步骤(i)的样品中，以便使所述目的多肽去糖基化以获得水性负载介质；
(iii):将步骤(ii)的负载介质施加到固相上，所述固相包含固体底基质，所述固体底基质含有包含疏水部分和/或正电性部分的配体，以便获得所述目的多肽到所述配体上的吸附；
(iv):从所述固相上洗脱所述目的多肽以便回收所述目的多肽，因此获得经过纯化的目的多肽；
其中与同样执行的用于纯化所述目的多肽的不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的经过纯化的目的多肽的量(分子数)增加了至少5％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(ii)中添加糖苷酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在权利要求1的步骤(ii)中添加糖苷酶是通过体外添加活性糖苷酶来进行。
4.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中与同样执行的用于纯化所述目的多肽的不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的所述目的多肽的量(分子数)增加了至少50％。
5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述目的多肽是目的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述目的蛋白质是目的酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述目的酶是目的牛奶凝固酶。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是选自由以下各项组成的群组的牛奶凝固酶：凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是：
来源于米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)的毛霉胃蛋白酶；或
凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少99％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中权利要求1的步骤(i)中需要的由包括糖基化形式的目的多肽/蛋白质的许多组分组成的样品通过在真核生产宿主细胞中生产(例如重组生产)目的多肽或蛋白质来获得。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述真核生产宿主细胞是曲霉(Aspergillus)细胞，优选地是黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述目的蛋白质是目的牛奶凝固酶，并且所述目的牛奶凝固酶是：
来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶，并且所述真核生产宿主细胞是米黑根毛霉；或
凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，并且所述真核生产宿主细胞是曲霉细胞，优选地是黑曲霉或米曲霉。
14.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中在步骤(ii)中使用的糖苷酶是N连接型糖苷酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述N连接型糖苷酶是选自由以下各项组成的群组的至少一种糖苷酶：肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡糖胺基)天门冬酰胺酰胺酶(EC编号：3.5.1.52；别称：N-糖苷酶-F或PNGase-F)和内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述N连接型糖苷酶是内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)，并且所述目的蛋白质是目的牛奶凝固酶，并且所述目的牛奶凝固酶是：
来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶；或
凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
17.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述固体底基质包括粒子尺寸小于750μm的粒子，并且其中所述固体底基质是由至少一种以下材料制造的：硅石、纤维素、琼脂糖、右旋糖酐、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酸酯。
18.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述步骤(iii)和步骤(iv)是通过使用选自由以下各项组成的群组的至少一种纯化技术执行的：色谱、柱色谱、床吸附、膨胀床吸附(EBA)、成批吸附、薄膜吸附和离子交换色谱(IEC)。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述步骤(iii)和步骤(iv)是通过使用膨胀床吸附(EBA)纯化技术执行的。
20.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含疏水部分，并且其中所述配体的所述疏水部分是脂族基或芳族基。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述脂族基是：
C2到C40烷基；
C2到C40烯基；或
C2到C40炔基；
或
其中所述芳族基是苯基或苄基。
22.根据权利要求21所述的方法，所述配体的疏水部分是芳族基，所述芳族基是苄基。
23.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含正电性部分，并且其中所述配体的所述正电性部分是氨基。
24.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含疏水部分和正电性部分。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述配体是苄胺。
26.根据权利要求24到25中任一权利要求所述的方法，其中所述步骤(iii)和步骤(iv)是通过使用混合模式色谱(MMC)纯化技术执行的，优选地其中混合模式色谱(MMC)纯化技术是膨胀床吸附(EBA)技术。
27.根据权利要求24到26中任一权利要求所述的方法，其中目的蛋白质是目的牛奶凝固酶。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是选自由以下各项组成的群组的牛奶凝固酶：凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是：
来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶；或
凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述配体是苄胺。
31.一种包含经过纯化的目的多肽的组合物，其中所述组合物可通过权利要求1到31中任一权利要求的方法获得。
32.一种用于从包含目的牛奶凝固酶的水性介质中纯化此类目的牛奶凝固酶的
方法，其中所述方法包括以下步骤：
(I):在生产宿主细胞中生产目的牛奶凝固酶，其中所述生产宿主细胞不导致所述牛奶凝固酶的显著糖基化，以获得由包括至少10克(干物重)(例如优选地至少1kg干物重)基本上未被糖基化形式的所述目的牛奶凝固酶的许多组分组成的水性样品，从而获得水性负载介质；
(II):将步骤(I)的负载介质施加到固相上，所述固相包含固体底基质，所述固体底基质含有包含疏水部分和/或正电性部分的配体，以获得所述目的多肽到所述配体上的吸附；和
(III):从所述固相上洗脱所述目的牛奶凝固酶以回收所述目的牛奶凝固酶，从而获得经过纯化的目的牛奶凝固酶。
33.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(I)的所述生产宿主细胞是原核生产宿主细胞(例如杆菌属(Bacillus)的大肠杆菌(E.coli))。
34.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(I)的所述生产宿主细胞是不导致所述目的牛奶凝固酶的显著糖基化的真核生产宿主细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述真核生产宿主细胞是基因工程细胞，其中糖基化所必需的基因被失活(例如删除或突变)。
36.根据权利要求32到35中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含疏水部分，并且其中所述配体的所述疏水部分是脂族基或芳族基。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述脂族基是：
C2到C40烷基；
C2到C40烯基；或
C2到C40炔基；
或
其中所述芳族基是苯基或苄基。
38.根据权利要求37所述的方法，所述配体的疏水部分是芳族基，所述芳族基是苄基。
39.根据权利要求32到38中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含正电性部分，并且其中所述配体的所述正电性部分是氨基。
40.根据权利要求32到39中任一权利要求所述的方法，其中所述配体包含疏水部分和正电性部分。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述配体是苄胺。
42.根据权利要求40到41中任一权利要求所述的方法，其中所述步骤(iii)和步骤(iv)是通过使用混合模式色谱(MMC)纯化技术执行的，优选地其中混合模式色谱(MMC)纯化技术是膨胀床吸附(EBA)技术。
43.根据权利要求32到42中任一权利要求所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是选自由以下各项组成的群组的牛奶凝固酶：凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是：
来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶；或
凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述配体是苄胺。
46.一种包含至少1克(干物重)凝乳酶的组合物，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，其中所述组合物中至少85％(w/w)的凝乳酶分子在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述组合物中至少90％(w/w)的凝乳酶在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化，更优选地所述组合物中至少95％(w/w)的凝乳酶在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化，并且甚至更优选地所述组合物中至少98％(w/w)的凝乳酶在SEQIDNO:1的位置Asn349处没有被糖基化。
48.一种包含至少1克(干物重)凝乳酶的组合物，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，其中所述组合物中至少85％(w/w)的凝乳酶分子具有低于38.5KDa的质谱峰。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述组合物中至少90％(w/w)的凝乳酶具有低于38.5KDa的质谱峰，更优选地所述组合物中至少98％(w/w)的凝乳酶具有低于38.5KDa的质谱峰。
50.一种用于获得包含至少1克(干物重)去糖基化活性凝乳酶的组合物的方法，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，其中所述方法包括以下步骤：
(A):将活性N连接型糖苷酶添加到由包括至少1g(干物重)糖基化形式的所述凝乳酶的许多组分组成的样品中以将所述凝乳酶去糖基化；
(B):获得(例如通过纯化)步骤(A)的去糖基化样品以得到包含至少1克(干物重)去糖基化活性凝乳酶的组合物；并且
其中与同样执行的用于获得所述凝乳酶的不包括步骤(A)的比较方法相比，在步骤(B)中获得的去糖基化活性凝乳酶的活性(IMCU/mg)增加了至少5％。
51.根据权利要求50所述的方法，其中步骤(A)中的所述糖苷酶是肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡糖胺基)天门冬酰胺酰胺酶(EC编号：3.5.1.52；别称：N-糖苷酶-F或PNGase-F)或内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。
52.根据权利要求50所述的方法，其中步骤(A)中的所述糖苷酶是内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。
53.根据权利要求50到52中任一权利要求所述的方法，权利要求50的步骤(A)中需要的由包括糖基化形式的凝乳酶的许多组分组成的样品通过在真核生产宿主细胞中生产(例如重组生产)目的多肽或蛋白质来获得。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述真核生产宿主细胞是真菌细胞(例如曲霉细胞，优选地黑曲霉或米曲霉)。
55.根据权利要求50到54中任一权利要求所述的方法，其中所述凝乳酶包含SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
56.一种包含去糖基化活性凝乳酶的组合物，其中所述组合物可通过根据权利要求50到55中任一权利要求所述的用于获得包含至少1克(干物重)去糖基化活性凝乳酶的组合物的方法获得。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述凝乳酶包含SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
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