CN1308442C - 纯化酶的方法和按此产生出的经纯化的酶以及该酶的用途 - Google Patents

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CN1308442C CNB028131347A CN02813134A CN1308442C CN 1308442 C CN1308442 C CN 1308442C CN B028131347 A CNB028131347 A CN B028131347A CN 02813134 A CN02813134 A CN 02813134A CN 1308442 C CN1308442 C CN 1308442C
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Abstract

本发明涉及用于纯化至少一种在溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)发酵上清液中含有的酶的方法。根据本发明，发酵上清液中的酶通过多步骤层析方法来分离，该层析方法包括仅使用基于苯乙烯/二乙烯基苯和/或基于特别是羟磷灰石的层析材料。

Description

纯化酶的方法和按此产生出的经纯化 的酶以及该酶的用途
应用领域
本发明涉及用于纯化至少一种在溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)发酵上清液中含有的酶的方法，和按此生产经纯化的酶，以及酶用途。
现有技术
细菌溶组织梭菌在含有蛋白胨的营养培养基中培养时可形成细胞外的复合酶混和物，该复合酶混和物含有胶原酶、不同的蛋白水解酶以及低分子量的组分。具有65-125kD范围内的分子量和5-6.5等电点的I型和II型胶原酶(梭菌肽酶A，EC 3.4.24.3)作为主要组分已有描述(Bond，van Wart；Biochemistry，1984，23，3077-3085)。另外的主要组分为以异二聚体形式出现的SH-蛋白酶梭菌蛋白酶(梭菌肽酶B，EC 3.4.22.8)，其分子量为大约59kD，和未经很好描述的所谓的中性蛋白酶(酪蛋白酶)，用MALDI-TOF测得其分子量为34.5kD。
胶原酶是切割胶原纤维蛋白的肽键的酶。它们用于生物化学和医学之中，例如为了分离组织的细胞或细胞连结。I型和II型胶原酶的区别在于它们对于高分子量胶原和小的合成底物的活性。I型胶原酶优选地切割高分子量胶原，而II型胶原酶主要与合成底物反应，例如PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(Wünsch，Heidrich；Z.Physiol.Chem.333，1963，149-151)、His-Pro(Nordwig，Wünsch；Z.Physiol.Chem.316，1959，287)或Phe-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala(van Wart，Steinbrink；Anal.Biochem.113，1981，356-365)。这两种类型的胶原酶也都可以通过反相层析(RPC)来明确地加以区分。
US 5,332,503描述了用于色谱层析纯化溶组织梭菌胶原酶的方法。该层析方法此外包括凝胶过滤步骤以及使用反应型红色琼脂糖凝胶的染料-配体亲和层析。该方法在依照GMP条件下生产用于药物目的的胶原酶时显示出明显的缺点。因此，在该过程中所使用的反应型红色琼脂糖凝胶带来了称之为层析材料渗漏和相关的毒理问题的风险。此外，凝胶过滤步骤基本上是消耗时间和昂贵的，而且较少提供有效的就地清理(cleaning-in-place，CIP)的可能性。这使得难以在工业规模上使用该方法。此外，该方法需要使用去污剂，因此必须需要高额费用来进行纯化确认，和可能发生不希望的终产品的变化。最后，该方法无法分离I型和II型胶原酶。
从文献US 5,830,741和US 5,952,215中，已知用于分离I型和II型胶原酶的纯化方法，其包括染料-配体亲和层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析。此处也有亲和层析中所使用的染料渗漏的风险。此外，所使用的层析材料只允许相对较低的流速。此外，所有的层析步骤是通过梯度洗脱来进行的，由此结合在层析材料上的酶用线性盐浓度和/或pH梯度洗脱下来。因此，该已知的方法结果是非常消耗时间的。
从US-A-5,332,503中，已知用于纯化粗制的胶原酶的方法。该胶原酶纯化方法包括制备稳定的粗制胶原酶溶液，该溶液含有胶原酶、色素、毒素、细菌材料和由于蛋白水解酶(包括梭菌蛋白酶、胰蛋白酶和酪蛋白酶)形成的杂质。将该稳定的胶原酶溶液上载到羟磷灰石柱材料上，用第一溶液(大约0.05M至大约0.3M磷酸缓冲液)洗脱色素和酪蛋白酶，然后用第二溶液(大约0.35M至大约0.5M磷酸缓冲液)洗脱胶原酶、胰蛋白酶和梭菌蛋白酶以获得第一收集溶液。然后将第一收集溶液上载到凝胶过滤材料上，并用pH中性缓冲溶液洗脱胶原酶和梭菌蛋白酶以获得第二收集溶液。然后将第二收集溶液上载到反应型红色120琼脂糖柱材料上，并用pH中性缓冲溶液洗脱胶原酶以获得经纯化的胶原酶。该方法以高收率提供了非常纯的胶原酶，而同时减少了洗脱溶液的消耗，和避免了无法计算的梯度洗脱技术。
相应地，该方法显示了下列步骤：
-将稳定的胶原酶粗制溶液上载到含有羟磷灰石柱材料的柱上；
-用第一溶液(大约0.05M至大约0.3M磷酸盐，缓冲至大约6至大约8的pH值，和非离子型表面活性剂)从羟磷灰石柱材料上洗脱色素和酪蛋白酶；
-用第二溶液(大约0.35M至大约0.5M磷酸盐，缓冲至大约6至大约8的pH值，和非离子型表面活性剂)洗脱胶原酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶以获得第一收集溶液；
-将该第一收集溶液上载到含有凝胶过滤材料的柱上；
-用含有pH中性缓冲液的第三溶液洗脱胶原酶和梭菌蛋白酶以获得第二收集溶液；
-将该第二收集溶液上载到含有反应型红色120琼脂糖柱材料的柱上；和用含有pH中性缓冲液的第四溶液洗脱胶原酶以获得含有经纯化的胶原酶的溶液。
对于此方法，必须从稳定的粗制胶原酶开始。
KLOECK GERD等人的参考文献：“来自商业胶原酶制剂的级分：在来自猪胰腺的胰岛的酶分离中的用途(Fractions fromcommercial collagenase preparations：Use in enzymic isolationof the islets of Langerhans from porcine pancreas)”(CELLTRANSPLANTATION，vol.5，No.5，1996，pp543-551，XP001146029ISSN：0963-6897)研究了移植经分离的胰岛以用于治疗糖尿病。从胰腺中分离胰岛需要组织的特异性解离。使用商购可得的来自溶组织梭菌的胶原酶用于此目的。可是，这些商购可得的酶的效用是不可预测的，并从在供应商之间甚至从一个供应批次至另一个供应批次都具有相当大的变化。这主要是由于它们特异性胶原酶活性的差异和存在其他分解酶以及其他杂质。于此，应用自由流动区域电泳(FFZE)以分离活性蛋白质组分和不希望的组分，和用受控的分解活性组合来生产消化的酶化合物。通过FFZE分级分离粗制的胶原酶导致产生部分纯化的蛋白质级分，其中胶原酶和胰蛋白酶的活性得到了富集，而且其只含有微量的中性蛋白酶。这些制剂据说已经证明在从猪胰腺中分离出有活力的胰岛的体外试验中非常有效。为了按比例增加这些具有指定酶组合的胶原酶的生产，通过使用羟磷灰石上的FPLC层析来分级分离商购可得的溶组织梭菌胶原酶的两个不同供应物(一个供应对于胰岛的分离是有活性的，另一个是无活性的)。于此，从胰腺组织中分离出胰岛的高效率与高特异性的胰蛋白酶和胶原酶活性以及小部分的中性蛋白酶有关。在此研究中发展出的层析方案使无活性的胶原酶供应物转变为可能成功分离胰岛的制剂。
在BOND M D等人的参考文献：“用红色染料配体层析来纯化和分离溶组织梭菌的单个胶原酶EC-3.4.23.3(Purification andseparation of individual collagenases EC-3.4.23.3 ofClostridium histolyticum using red dye ligand chromatography)”(BIOCHEMISTRY，vol.23，No.13，1984，pp3077-3085，XP002232416ISSN：0006-2960)中，通过使用红色染料的亲和层析纯化和分离了溶组织梭菌的单个胶原酶。在这一方面，其程序如下：
在溶组织梭菌培养物滤液中存在的六种胶原酶已进行纯化直至同质。通过用羟磷灰石、Sephacryl S-200和L-精氨酸-亲和-凝胶202的层析除去褐色素和最大部分对于酪蛋白、苯甲酰基-精氨酸-乙基酯和弹性蛋白的活性污染的蛋白酶。反应型红色120染料亲和层析将具有非常相似的物理化学特性的胶原酶分离成四个级分。通过使用DEAE纤维素和SP-Sephadex的层析来进行最后的纯化。所有的六种胶原酶按照它们的纯化顺序称为α、β、γ、δ、ε、ζ，它们显示出对于胶原的高活性和不具有任何其他的蛋白水解活性。每一个在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上形成一条单一的带。分离了α-酶和γ-酶这两个不同的亚种，它们具有相同的分子量和相同的活性，但是具有不同的等电点。在其他胶原酶中有着稍微较不清晰的微异质性。基于它们对于天然胶原和对于合成肽2-呋喃丙烯酰-L-亮氨酰甘氨酰-L-脯氨酰-L-丙氨酸(FALGPA)的活性，将这六种胶原酶分成两类。种类I的胶原酶(α、β和γ)具有高的胶原酶活性和中等的FALGPA活性，而种类II的胶原酶(δ、ε和ζ)具有中等的胶原酶活性和高的FALGPA活性。因此，通过使用的红色染料的亲和层析来进行该纯化和分离方法。
在ROUNDS M A等人的参考文献：“用于蛋白质高效液相层析的基于聚(苯乙烯-二乙烯基苯)的强阴离子交换包装材料(Poly(styrene-divinylbenzene)-based strong anion-exchangepacking material for hingh-performance liquid chromatographyof proteins)”(JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY，NETHERLANDS 26 JUN1987，vol.397，6月26日，1987(1987-06-26)，pp25-38，XP002087598，ISSN：0021-9673)中所描述的方法研究了基于聚(苯乙烯-二乙烯基苯)的阴离子交换柱材料，其用于蛋白质的HPLC层析，这些蛋白质是按如下步骤获得的：将经吸收的聚乙烯胺涂层涂布在经亚硫酸处理的大孔径聚(苯乙烯-二乙烯基苯)颗粒上。对于出现的结果产生的强阴离子交换柱材料的物理化学和层析特性进行仔细的测定。实验材料的动态结合容量是与大孔径二氧化硅可比较的。获得了蛋白量和酶活性的良好回收。新的柱对于不同的纯化方法和长时间保持与水性碱液接触具有抗性。在基于聚苯乙烯的柱中的保留时间与在二氧化硅柱和商购可得的聚合体强阴离子交换柱中相似。柱材料的层析分辨率等同于或高于其他两种柱材料。
LEONARD M等人的参考文献：“包被聚乙烯醇的大孔径聚苯乙烯颗粒作为蛋白质层析的固定相(Polyvinyl alcohol-coatedmacroporous polystyrene particles as stationary phases for thechromatography of proteins)”(JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY BBIOMEDICAL  APPLICATIONS，vol.664，No.1，1995，pp39-46，XP004043704)研究了包被聚乙烯醇的大孔径聚苯乙烯颗粒作为蛋白质层析的固定相，并公开了用于通过聚乙烯醇(PVA)的吸附来进行大孔径聚(苯乙烯-二乙烯基苯)(PS-DVB)小珠亲水化的方法。PVA牢固地吸附在PS-DVB表面上，但当其经受蛋白质溶液时会再次部分地被解吸。为了克服这一问题，通过交联稳定了吸附的聚合体层。我们报导了聚合体吸附和交联条件对于经吸附的PVA量、对于聚合体层的稳定性和对于牛血清蛋白这一强疏水性蛋白质的亲水化效用的作用。经包被的载体的特性也通过大小排阻层析进行了测定。已经显示出PVA涂层强烈地减少了疏水相互作用。已经确定经修饰的PS-DVB颗粒的孔大小随着增加吸附的PVA量而显著地减少。
NASH D C等人的参考文献：“用于蛋白质纯化的聚苯乙烯基质的修饰：聚(乙烯醇)的吸附对于用于亲和层析的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)小珠的特性的作用(Modification of polystyrenic matrices forthe purification of proteins：Effect of the adsorption ofpoly(vinylalcohol)on the characteristics ofPoly(styrene-divinylbenzene)beads for use in affinitychromatography)”(JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A，ELSEVIER SCIENCE，NL，vol.758，No.1，1月10日，1997(1997-01-10)，pp53-64，XP004034014 ISSN：0021-9673)公开了用于蛋白质纯化的聚苯乙烯基质的修饰，并研究了聚(乙烯醇)的吸附对于用于亲和层析的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)小珠的特性的作用，由此该过程如下：通过使用聚(乙烯醇)(PVA)来修饰聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-(PSDVB)-层析基质(CG1000-sd(TosoHaas))以形成适合于添加用于选择性蛋白质纯化的功能基团的基质。该经修饰的基质的特性已用BET-氮吸附/解吸技术进行了检查，并确定PVA的吸附导致小珠的微孔被填充而小珠的大孔却基本上未被修饰。在经修饰的基质上没有发生蛋白质吸附。将染料配体(Procion Blue MX-R)共价结合到PVA-PSDVB基质上，并测定了PVA-PSDVB基质的溶菌酶容量。可将该基质与商购可得的BlueSepharose Fast Flow这一基于交联琼脂糖的亲和基质进行比较。该染料-PVA-PSDVB基质据说对于氢氧化钠的清洗是稳定的。
任务、解决方案、优点
基于这一背景，本发明的任务为形成可用于分离和纯化至少一种溶组织梭菌的细胞外主酶的方法，其克服了所描述的现有技术的缺点。
该任务是通过具有以下特征的方法完成的。
根据本发明的方法在于用层析方法分离发酵上清液中的酶，该层析方法仅使用基于陶瓷羟磷灰石的第一层析材料和基于苯乙烯/二乙烯基苯的第二层析材料，由此
a)该层析方法包括在经烧结的羟磷灰石上的第一层析阶段，在基于苯乙烯/二乙烯基苯的阴离子交换材料上的第二层析阶段，和最终在基于苯乙烯/二乙烯基苯的阳离子交换材料上的第三层析阶段，由此从经烧结的羟磷灰石材料上的洗脱以至少200cm/h特别是至少300cm/h的流速进行，从苯乙烯/二乙烯基苯材料上的洗脱以至少500cm/h特别是至少1000cm/h的流速进行，
b)第一层析阶段以至少两个洗脱阶段进行，在此中性蛋白酶(酪蛋白酶)与I型和II型胶原酶及梭菌蛋白酶分离开，
c)将来自第一层析阶段的基本上无酪蛋白酶的级分经历具有至少两个洗脱阶段的第二层析阶段，由此I型胶原酶和II型胶原酶相互分离开，
d)将来自第二层析阶段的含有I型胶原酶的级分经历具有至少两个洗脱阶段的第三层析阶段，由此I型胶原酶与梭菌蛋白酶分离开，
e)将来自第二层析阶段的含有II型胶原酶的级分经历具有至少两个洗脱阶段的第三层析阶段，由此II型胶原酶与梭菌蛋白酶分离开，
f)这些层析阶段于4-25℃的温度进行。
由此可用单阶段或优选地用多阶段层析方法来分离溶组织梭菌发酵上清液中的酶，该层析方法仅使用基于苯乙烯/二乙烯基苯和基于陶瓷羟磷灰石的层析材料，以实现非常快速和廉价的酶纯化，由此获得高纯度的酶。它们由于没有毒理上危险的物质从而特别适合在药学和生物化学中使用。本方法不需要任何产品接触步骤，这使得其在制药领域中的应用特别具有优势。其可用于生产无菌胶原酶。于此，将苯乙烯/二乙烯基苯理解为由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯构成的共聚体。通过用最不同的功能基团对该基质进行置换，使蛋白质与材料可能结合并因此造成其分离。依赖于功能基团的选择，可以使用不同的结合和分离机制，例如阳离子交换或阴离子交换机制。与此相反，羟磷灰石涉及到具有总分子式Ca10(PO4)6(OH)2的磷酸钙，其由于离子静电相互作用和较强的离子配位键而使得能够进行蛋白质的结合。可是，蛋白质结合于羟磷灰石上的机制细节还不被了解。
所使用的层析材料允许在良好分离特性下设置高流速，从而导致非常短的纯化时间。如果根据本发明的优选实施方案使用经烧结的(即陶瓷的)羟磷灰石是特别有效的。使用陶瓷羟磷灰石与非烧结的(结晶)羟磷灰石相比较具有这样的优点，即材料能够可再生性产生，并由于其孔结构而只产生非常低的反压，由此柱损坏的风险变得最小并且形成高的线性流速是可能的。从经烧结的羟磷灰石材料上的洗脱优选地以至少200cm/h的流速进行，特别是以至少300cm/h的流速。在苯乙烯/二乙烯基苯聚合物材料的情况下，至少500cm/h的流速甚至是优选的，特别是至少1000cm/h的流速。以这种方式，操作时间与已知的方法相比较可显著地缩短。
采用下面的方法可进一步操作时间的缩短以及操作费用的简化，即至少一个层析阶段，优选所有的层析阶段以分步洗脱的方式进行。与梯度洗脱相比较，由此可以进一步节省洗脱试剂和因此所需的昂贵的缓冲物质。此外，在该操作规模上梯度的产生是个问题。
根据本发明的有利的实施方案，层析材料以这样的方式进行选择，即单个的层析步骤仅基于静电相互作用和/或离子键和/或离子配位键。特别有利地，本方法包括至少一个阴离子交换层析阶段和/或至少一个阳离子交换层析阶段和/或至少一个羟磷灰石层析阶段。在一个三阶段层析方法中已经获得了特别好的结果，其中第一阶段在经烧结的羟磷灰石材料上进行，第二阶段在基于苯乙烯/二乙烯基苯的阴离子交换材料上进行，第三层析阶段在基于苯乙烯/二乙烯基苯的阳离子交换材料上进行，优选地以所述次序进行，可是其他次序也是可以的；阶段的数目也可以变化。
优选地，根据本发明的方法因此不包括任何消耗时间和成本的凝胶过滤步骤，经此将待分离的酶的自消化风险减至最小。而且，舍弃凝胶过滤使得能够在4-25℃的宽温度范围内进行层析阶段，即也可以在室温下进行。此外，该方法不包括任何亲和层析阶段，因此不存在层析材料上亲和配体的渗漏和由此将其洗掉的风险。最后，根据本发明的方法没有任何可能引起不希望的蛋白质结构变化的蛋白质沉淀步骤。因此，进一步存在这样的优点，即没有使用去污剂或离液序列高的物质(硫酸铵、聚乙二醇等等)，随后去除这些物质总是与高额操作费用联系在一起。
所使用的层析材料进一步具有这样的优点，即其在很宽的范围内是化学惰性的，从而能够用相对高浓度的碱液如3摩尔的氢氧化钠浓溶液来纯化。这保证了非常有效的纯化，和因此保证材料的功能性维护，以及保证了该方法的良好重复性。此外层析材料的高压稳定性使之能够在高压液相层析方法(HPCL)中使用。由于不存在由方法条件决定的毒理上有顾虑的物质如亲和配体或去污剂，因此根据本发明纯化出的蛋白质，尤其是I型和/或II型胶原酶和/或梭菌蛋白酶和/或中性蛋白酶(酪蛋白酶)能够特别有利地用于药物或生物化学目的。
附图的简短描述
本发明借助于图1举例说明。
本发明的详细描述和实施本发明的最佳方式
在动物或植物来源的发酵培养基中进行溶组织梭菌的培养之后，例如通过离心或过滤从发酵上清液中分离出细胞和其他不溶解的组分。该发酵上清液中含有I型和II型胶原酶、梭菌蛋白酶和酪蛋白酶作为主要组分，其可在这些蛋白质的层析分离之前以通常的方式进行浓集。
在本发明的第一步骤中，将该发酵上清液泵压流经填充I型或II型陶瓷羟磷灰石材料(CHT)的层析柱，在此除了不同的其他成分之外所述酶与磷灰石结合。在4-25℃和6-9的pH值，采用＞300cm/h的线性流速并以分步洗脱的方式进行洗脱。于此，含有0-1000mM碱卤化物的磷酸缓冲液是适合的，由此磷酸盐浓度逐渐地由10mM增加至350mM磷酸盐。可选择地或附加地，缓冲液的pH值逐渐地由6增加至9。优选地进行三个洗脱阶段。在第一洗脱阶段获得的级分1仅仅含有低分子量的组分。第二洗脱阶段的级分2除了低分子量的成分之外还含有中性蛋白酶(酪蛋白酶)。第三洗脱阶段的级分3也含有低分子量的成分、全部的梭菌蛋白酶以及I型和II型胶原酶。
级分3将会通过例如超滤/透滤或纤滤或透析进行脱盐，并视需要进行浓集。然后，将经脱盐的溶液在第二层析步骤中经历阴离子交换层析。将基于苯乙烯/二乙烯基苯的层析材料用于此，其例如用四元的氨基团进行功能化。于此，可以使用商购可得的材料(例如Pharmacia公司的Source，PerSeptive公司的POROS，Biorad公司的Makroprep)。当将级分3上载到阴离子交换器上时，已经进行了阳离子或非离子低分子量组分的分离。于4-25℃在具有7-9.5的pH范围的缓冲体系中以分步洗脱的方式进行结合组分的洗脱，其线性流速为大于500cm/h，其中碱卤化物或碱土卤化物的浓度从1至1000mM逐渐变化，和/或pH值从9.5至6逐渐变化。优选地分离出两个级分，由此第一洗脱阶段的级分4含有梭菌蛋白酶和II型胶原酶，第二洗脱阶段的级分5也含有梭菌蛋白酶，以及I型胶原酶。
将级分4和5彼此分别在第三层析阶段中经历阳离子交换层析。于此，也使用基于苯乙烯/二乙烯基苯材料的柱填充物，可是其在此用阳离子结合基团例如SO3H进行功能化。上面提到的商业材料也可在此处使用。于4-25℃在具有5.7-7的pH范围的缓冲体系中以分步洗脱的方式进行阳离子交换剂的洗脱，其线性流速为至少500cm/h。于此，碱卤化物或碱土卤化物的浓度在洗脱缓冲液中于0-300mM之间逐渐调整，和/或pH值于5-7之间逐渐调整。洗脱优选地以两个阶段进行，由此在第一洗脱阶段获得各自的胶原酶，和在第二洗脱阶段获得梭菌酶。
实施例
根据标准方法，溶组织梭菌的培养物通过在液体培养中使用动物或植物营养培养基来进行发酵直至所希望的细胞密度。在用通常的方法例如离心或过滤分离细胞之后，将2000ml浓缩的发酵上清液以300cm/h的线性流速泵压流经用1700ml I型陶瓷羟磷灰石填充的层析柱上。于20-25℃用磷酸缓冲液采用300cm/h的线性流速并以三个阶段来洗脱与羟磷灰石柱结合的成分，其中磷酸盐浓度逐渐增加。在第一洗脱阶段中，用大约10CV(柱体积)的10mM磷酸缓冲液/100mM NaCl进行洗脱，由此获得级分1，其主要含有低分子量的组分。然后用大约3CV的60mM磷酸缓冲液/100mM NaCl进行洗脱，从而获得级分2，其含有酪蛋白酶且同样含有低分子量的成分。对于第三洗脱阶段，用大约5CV的200mM磷酸缓冲液/100mM NaCl进行洗脱。以这种方式收集的级分3含有梭菌蛋白酶和所有的I型和II型胶原酶。将级分2进行脱盐并冻干。最后视需要用标准方法来完成低分子量组分和酪蛋白酶的分离。
将级分3通过例如超滤/透滤或纤滤或透析进行脱盐，并视需要浓集。然后将级分3用适当的缓冲液(例如500mM Tris，pH 9.0-9.3)调整至9.0-9.3的pH值。将经缓冲的溶液于20-25℃以大约1000cm/h的线性流速泵压流经作为阴离子交换器功能化的苯乙烯/二乙烯基苯柱(PerSeptive公司的POROS 50 PI)。然后用大约5CV Tris-缓冲液洗涤柱。于20-25℃和大约1000cm/h的线性流速在两个洗脱阶段中以增加的盐浓度来进行洗脱。通过使用40mM Tris-缓冲液/6mMCaCl2/30mM NaCl pH 9.0-9.3进行洗脱而获得级分4，其含有梭菌蛋白酶，以及II型胶原酶。级分5也含有梭菌蛋白酶以及含有I型胶原酶，其是通过在第二洗脱阶段中使用40mM Tris/6mM CaCl2/70mM NaClpH 9.0-9.3进行洗脱而获得的。
级分4和5例如通过逆50升H2O透析24小时进行脱盐，并用50mMMES缓冲液调整至5.9-6.1的pH值。这两个级分相互分别在基于苯乙烯/二乙烯基苯材料的阳离子交换柱(例如PerSeptive公司的POROS50HS)上进行层析。对于此目的，将这些级分以大约700cm/h的线性流速于20-25℃上载到柱上，并在相同的条件下进行洗脱。从级分4中洗脱II型胶原酶或者从级分5中洗脱I型胶原酶分别于20-25℃在用10mM MES缓冲液/20-40mM NaCl pH 5.9-6.1的第一洗脱阶段中进行。两个级分的梭菌蛋白酶随后分别用10mM MES缓冲液/90-110mMNaCl pH 5.9-6.1洗脱。合并含有梭菌蛋白酶的溶液。将所有的溶液进行脱盐，逆2mM CaAc2进行透析，然后冻干。
根据已知的方法(见表)来测定所获得的酶的每个酶活性。此外，用反相层析测定了I型胶原酶、II型胶原酶和梭菌蛋白酶的纯度。结果概括在下表中：
表：
  活性   纯度e
  II型胶原酶   18100U/ga   大约82％
  I型胶原酶   5180U/gb   大约85％
  梭菌蛋白酶   322U/mgc   大约90％
  中性蛋白酶   1560U/mgd
a根据Wünsch E.，Heidrich H.-G.；Z.Physiol.Chem.333，149-151，1963测定；b根据Doi Shibata，Matoba；Anal.BioChem.118，173-184，1981测定；c根据Mitchel，Harrington；MethodsEnzymol.19，635-642，1970测定；d根据Moore，Stein；Biol.Chem.176，367，1948测定；e根据RPC测定。

Claims (25)

1.用于部分或完全纯化至少一种在溶组织梭菌发酵上清液中含有的酶的方法，其特征在于，通过仅使用基于陶瓷羟磷灰石的第一层析材料和基于苯乙烯/二乙烯基苯的第二层析材料的层析方法来分离发酵上清液中的酶，其中
a)该层析方法包括在经烧结的羟磷灰石上的第一层析阶段，在基于苯乙烯/二乙烯基苯的阴离子交换材料上的第二层析阶段，其中从经烧结的羟磷灰石材料上的洗脱以200cm/h以上的流速进行，
b)第一层析阶段以至少两个洗脱阶段进行，由此中性蛋白酶与I型和II型胶原酶和梭菌蛋白酶分离开，
c)将来自第一层析阶段的基本上无中性蛋白酶的级分经历具有至少两个洗脱阶段的第二层析阶段，由此I型胶原酶和II型胶原酶相互分离开，
d)这些层析阶段于4-25℃的温度进行。
2.根据权利要求1的方法，其中还包括基于苯乙烯/二乙烯基苯的阳离子交换材料上的第三层析阶段，从苯乙烯/二乙烯基苯材料上的洗脱以500cm/h以上的流速、4-25℃的温度进行，
a)将来自第二层析阶段的含有I型胶原酶的级分经历具有至少两个洗脱阶段的第三层析阶段，由此I型胶原酶和梭菌蛋白酶分离开，
b)将来自第二层析阶段的含有II型胶原酶的级分经历具有至少两个洗脱阶段的第三层析阶段，由此II型胶原酶和梭菌蛋白酶分离开。
3.根据权利要求2的方法，其中从苯乙烯/二乙烯基苯材料上的洗脱以1000cm/h以上的流速进行。
4.根据权利要求1的方法，其中从经烧结的羟磷灰石材料上的洗脱以300cm/h以上的流速进行。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶为酪蛋白酶。
6.根据权利要求1至5中任何一项所述的方法，其特征在于，所述酶为I型胶原酶和/或II型胶原酶和/或梭菌蛋白酶和/或中性蛋白酶。
7.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，该方法不包括任何凝胶过滤步骤。
8.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，该方法不包括任何蛋白质沉淀步骤。
9.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，该方法不包括对于低分子量物质、宿主细胞蛋白质、内毒素和/或核酸的降解步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该方法不包括对于DNA的降解步骤。
11.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，使用具有证明文件的层析介质。
12.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，使用压力稳定层析材料。
13.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，层析材料的纯化用浓缩的碱液来进行。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，层析材料的纯化用3摩尔的氢氧化钠来进行。
15.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，层析阶段以柱层析来进行。
16.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，获得具有13000U/g以上的特异活性的II型胶原酶。
17.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，获得具有18000U/g以上的特异活性的II型胶原酶。
18.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，获得具有3000U/mg以上的特异活性的I型胶原酶。
19.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，获得具有5000U/mg以上的特异活性的I型胶原酶。
20.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，获得具有200U/mg以上的特异活性的梭菌蛋白酶。
21.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，获得具有300U/mg以上的特异活性的梭菌蛋白酶。
22.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，获得具有1200U/mg以上的特异活性的中性蛋白酶。
23.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，获得具有1500U/mg以上的特异活性的中性蛋白酶。
24.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，获得分别具有70％以上的纯度的II型胶原酶和/或I型胶原酶和/或梭菌蛋白酶。
25.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于，获得分别具有80％以上的纯度的II型胶原酶和/或I型胶原酶和/或梭菌蛋白酶。
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