CN113474355A - 从i型胶原酶、ii型胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶选出的至少一种酶的色谱纯化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种将选自I型胶原酶、II型胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶构成的组的至少一种酶从物质的混合物中纯化出来的方法，作为方法步骤，所述方法包括至少一个疏水作用色谱过程，其特征在于，疏水作用色谱过程中的固定相包括从聚丙二醇和丁基琼脂糖构成的组中选出的材料。本发明还涉及以这种方法纯化的酶用于制药、化妆品和/或生化目的的用途。
Description
摘要
本发明涉及一种将选自I型胶原酶、II型胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶构成的组的至少一种酶从物质的混合物中纯化出来的方法，包括至少一个疏水作用色谱作为工艺步骤，其特征在于，在疏水作用色谱中，固定相包括从聚丙二醇(PPG)和丁基琼脂糖构成的组中选出的材料。本发明还涉及如此纯化的酶用于制药、化妆品和/或生化目的的用途。
现有技术
梭菌是属于梭菌科的革兰氏阳性、专性厌氧、产芽孢细菌。该细菌分布广泛且随处可见，尤其是在土壤和高等生物的消化道中。
当在合适的营养培养基上或合适的营养培养基中培养时，溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)会分泌酶的复杂混合物，包括胶原酶、各种其它蛋白酶以及低分子量成分。根据转化的底物，胶原酶被再分成I型和II型(EC 3.4.24.3)-简言之，也就是胶原酶I和胶原酶II，胶原酶的分子量介于115kDa至125kDa。溶组织梭菌分泌的酶混合物的另一成分是SH蛋白酶梭菌蛋白酶(EC 3.4.22.8)，它以异二聚体的形式存在，分子量大约是59kDa。梭菌蛋白酶(clostripain)在精氨酸残基处特异性裂解目标蛋白质。此外，溶组织梭菌还分泌分子量大约是34kDa的非特异性中性蛋白酶。
因为细菌将所有的蛋白酶分泌至培养基中，所以，用这种方法能够容易地将它们与细胞分开。在自然环境中，蛋白酶的功能是降解组织或纤维状胶原并且使释放的肽和氨基酸可被细菌用作营养来源。
胶原酶的商业应用领域之一是它们用作从组织培养基体外分离细胞的生化试剂。在一些情况下，除了胶原酶之外，该细胞分离还需要其它的蛋白酶中性蛋白酶和/或梭菌蛋白酶。然而，根据各预期的细胞分离，只有蛋白酶以特定比例存在时才会实现最佳结果。根据各应用，两种胶原酶类型还必须以特定比例存在，以便实现最佳结果。
溶组织梭菌产生的蛋白酶的另一应用领域是它们用作生产药物的生物试剂，前述的药物包括治疗掌筋膜挛缩症中手掌和手指的纤维结节(fibrotic cords)的药物，此外还包括治疗各种其它疾病的药物。这些蛋白酶的其它药物应用是它们用于伤口愈合的药膏；例如，胶原酶可用于皮肤溃疡的酶治疗。除胶原酶之外，相应的活性成分还包括中性蛋白酶和梭菌蛋白酶。用于创伤治疗的该活性成分的常用制造方法仅规定了脱盐、浓缩和干燥无细胞培养上清液。该方法中没有分离酶。因此，酶相对于彼此的比例视发酵而定并且不受当前方法的影响。
因为溶组织梭菌将酶的复杂混合物分泌到培养上清液中，所以，有必要分离所期望的目标酶并且因此还有必要将它们从培养上清液中纯化。从DE101 34 347A1中知晓一种从溶组织梭菌的培养上清液中纯化酶的方法。然而，提供的是多级纯化方法，该方法专门使用了基于苯乙烯/二乙烯基苯或陶瓷羟基磷灰石的色谱材料。为了纯化酶，需要进行第一色谱步骤，该步骤规定使用填充陶瓷羟基磷灰石的柱子。其后是第二色谱步骤，该步骤由使用基于苯乙烯/二乙烯基苯的柱基质的阴离子交换色谱组成。其后是第三色谱步骤，该步骤也涉及基于苯乙烯/二乙烯基苯的柱基质，这次是在阳离子交换色谱的情况下进行。因此，该方法总计需要三个色谱步骤，这使得从培养上清液中纯化酶是非常耗费成本和时间的。
US 2011/0070622 A1中描述了另一种从细菌溶组织梭菌的液体培养物中纯化胶原酶的方法。实施的第一步是采用硫酸铵的蛋白质沉淀。其后是疏水作用色谱作为第二步，随后是第三纯化步骤，包括阴离子交换色谱。这种方法同样涉及到材料-消化和时间-消化顺序的几个不同方法步骤，其结果是只能得到纯化的I型胶原酶和II型胶原酶，但是没有中性蛋白酶和梭菌蛋白酶的纯化部分。
因此，描述的纯化方法把重点放在了两种胶原酶(I型和II型)。为了实现胶原酶的所需纯度，在每种情况下都需要至少三个纯化步骤。这些方法没有描述中性蛋白酶和梭菌蛋白酶的纯化。对于胶原酶I和胶原酶II的分离，已知方法中需要额外的分离色谱步骤，为了这一目的而必须进行该步骤。已知方法中用于这一目的的材料通常是阴离子交换剂。
发明目的
因此，本发明的目的在于避免现有技术的缺点。优选地，本发明提供了一种经济的方法，用于从物质的混合物中纯化出至少一种酶，该酶选自胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶构成的组。尤其，本发明提供了这样的方法，用于从溶组织梭菌的培养上清液中纯化出从胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶构成的组中选出的至少一种酶。进一步，本发明提供了所述酶的节省材料和时间的纯化与分离。本发明的目的还在于提供一种方法，借助于该方法，能够将各种酶彼此分开，以便它们随后能够按照规定的比例混合。优选地，以高产量并按照要求的质量将酶彼此分开。本发明的另一个目的是减少从溶组织梭菌的培养上清液中纯化酶所需要的步骤数目。尤其，本发明的目的是减少用于纯化和/或分离酶的色谱方法的步骤数目。
发明描述
根据本发明，采用将选自胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶构成的组的至少一种酶从物质的混合物中纯化出来的方法来实现上述目的，作为方法步骤，前述方法包括至少一个疏水作用色谱(HIC)，其特征在于，在疏水作用色谱中，固定相包括从聚丙二醇和丁基琼脂糖构成的组中选出的材料。在本发明的所有实施方案中，进一步优选的是固定相由聚丙二醇或丁基琼脂糖构成。
疏水作用色谱法的分离原理是基于蛋白质的非极性表面区域与疏水固定相的相互作用。通过增加作为流动相的溶液中的盐浓度，可增强这些疏水作用。增加的盐浓度从而导致部分去除水合物外壳并且因此导致蛋白质疏水区的暴露。现在，蛋白质的这些疏水表面区域反过来又与固定相的疏水残基相互作用。
在疏水作用色谱法中，固定相(即柱材料)通常由被特别选择的非极性官能团化学改性的(即疏水的)聚合物组成。在此，固定相的选择性和容量取决于使用的官能团的选择性和密度。在本发明中，已经证明了，使用聚丙二醇(PPG)或丁基琼脂糖作为柱材料是特别有利的。例如，从Tosoh Bioscience LLC购买的等级PPG-600M可用作聚丙二醇柱材料。当丁基琼脂糖用作柱材料时，可使用从GE Healthcare购买的高性能丁基琼脂糖-简写为丁基琼脂糖HP-和快速流动丁基琼脂糖-简写为丁基琼脂糖FF。丁基琼脂糖HP是特别优选的。
丁基琼脂糖(butyl sepharose)(也称作“丁基琼脂糖(butyl agarose)”或“交联丁基琼脂糖(cross-linked butyl agarose)”)是一种交联的琼脂糖，其中，一部分OH基团的氢原子被3-n-丁氧基-2-羟丙基残基(-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH3)取代，因此，涉及到的OH基团相应地被醚化。交联度优选是1％～7％，特别优选是2％～6％。丁基琼脂糖优选以平均粒径是20～150μm的球形颗粒的形式存在，平均粒径更优选是30～100μm。为了将胶原酶I和胶原酶II彼此分开，70μm或更小的平均粒径是优选的。50μm或更小的平均粒径特别优选用于该目的。3-n-丁氧基-2-羟丙基残基的数目是每毫升介质(medium)优选10～200μmol，特别优选20～100μmol，最优选30～70μmol。
归因于根据本发明的方法，能够以高纯度得到纯化的酶。就与固定相聚丙二醇和丁基琼脂糖的疏水相互作用而言以及就该目的需要的流动相的缓冲条件而言，酶是非常稳定的并且几乎不会分解。独特的优点是被纯化的酶几乎不会变性，如此，以它们的自然形态获得这些酶并保留了它们的生物活性。因此，纯化的酶不含或只含非常少的变性酶或其部分。这是特别有利的，因为变性的酶通过难以与对应的未变性酶分开，原因是它们在色谱中的保留时间与未变性酶经常是相似的。因为根据本发明的方法，所以能以特别好的产量并以高纯度获得纯化的酶。在根据本发明的方法中，被纯化的蛋白质因此实质上保留了它们的自然形态并且因此也保留了它们的酶活性。因此，它们随后可供进一步使用，诸如用于药物或生化组合物，对于这些用途，酶活性的保留是至关重要的。就活性药物成分和由其制成的药物制剂的可重现的品质而言，这也是非常重要的。
采用根据本发明的方法，不仅可以纯化上述酶，胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶，分离杂质，还可以将它们彼此分开。因此，还优选的是，根据本发明的方法，其特征在于，物质的混合物包括从胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶构成的组中选出的至少两种酶。还优选的是，根据本发明的方法，其特征在于，物质的混合物包括至少两种酶，其中，至少一种酶选自胶原酶I和胶原酶II构成的组，并且，至少一种酶选自中性蛋白酶和梭菌蛋白酶构成的组。特别优选的是，根据本发明的方法，其特征在于，物质的混合物包括从胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶构成的组中选出的至少三种酶。然而，非常特别优选的是，根据本发明的方法，其特征在于，物质的混合物包括胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶。
本发明提供了一种节省材料和时间且因此性价比高的方法，该方法能够以高产量并按照要求的质量生产并分离酶。这具有如下优点：通过将各酶有选择的混合，能够使含有这些酶中的一种或多种酶的活性成分的组成随需要发生改变。这改善了活性成分的品质并且带来了具有限定的组成和更好效力的新活性成分。
胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶由细菌溶组织梭菌表达和分泌。因为溶组织梭菌将酶的复杂混合物分泌至培养上清液中，因此需要通过将它们纯化并将它们彼此分离来获得需要的目标酶。因此，最优选的是，根据本发明的方法，其特征在于，已经从细菌溶组织梭菌的培养物的培养上清液获得了物质的混合物。同样优选的是，根据本发明的方法，其特征在于，已经从细菌溶组织梭菌的培养物的培养上清液获得了物质的混合物并且该物质的混合物含有从胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶构成的组中选出的至少一种酶。最优选地，混合物含有从胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶构成的组中选出的至少两种酶，最优选至少三种酶。最优选地，物质的混合物含有所有的四种酶。
例如，通过分离不溶性成分，例如通过离心分离或通过过滤掉细胞、细胞碎片和无论如何都不溶的其它成分，能够从细菌溶组织梭菌的培养物的培养上清液获得了物质的混合物。进一步，例如，可以进行脱盐、重缓冲(re-buffering)和/或浓缩或者其它方法步骤，这些常用于制备培养上清液。
归因于根据本发明的方法，能够从物质的混合物(尤其是从培养上清液)纯化单一目标蛋白和多种目标蛋白。
出人意料地，已经显示了，根据本发明的方法只通过单一色谱工艺步骤就能够以即用纯度从培养上清液获得所需要的酶。优选地，除了在作为固定相的聚丙二醇或丁基琼脂糖上的疏水作用色谱之外，根据本发明的方法不包括任何其它色谱过程。特别优选地，根据本发明的方法只包括单一方法步骤，其中，采用固定相实施疏水作用色谱，固定相包括从聚丙二醇和丁基琼脂糖构成的组中选出的材料，除此之外再无其它色谱过程。在下文中将该实施方案称作“一步法”。然而，如有必要，在色谱之后或之前可进行进一步的纯化步骤。
采用根据本发明的方法，能够在单一色谱步骤中将上述酶，胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶，纯化并彼此分开。因为研发的方法能够在一步法中以要求的品质提供酶，所以显著降低了生产成本。首先，实施该方法需要的材料和时间显著减少，其次，与现有的方法相比，产量极大提高。
此外，在从物质的混合物(尤其是从培养上清液)纯化酶时，一步纯化和分离还提供了就各种蛋白酶稳定性而言的显著优势。的确，酶(全部是蛋白酶)的混合物在物质的相同混合物(尤其是相同水溶液)中的时间越长，相互的蛋白水解降解的风险和实际程度就越高，因此造成酶的不可逆失稳和失活。这意味着，蛋白酶尽可能完全地彼此分离的越快，纯化的单个酶的预期产量、可实现的纯度和稳定性就越高。尤其，储存稳定性会提高。就活性药物成分和由其制成的药物制剂的可重现的品质而言，这也是非常重要的。
优选的是根据本发明的方法，其特征在于，在疏水作用色谱法中，将至少一种水溶液用作流动相，其包括从硫酸铵和氯化钾构成的组中选出的至少一种盐。当使用该流动相时，能够特别有效地实施该方法，本文描述的优点变得特别明显。尤其，使用这些流动相使得这四种酶彼此明显分开。
特别优选的是根据本发明的方法，其特征在于，在疏水作用色谱法中，固定相包括聚丙二醇，包括硫酸铵的至少一种水溶液用作流动相。该实施方案使得以三个单独的部分得到四种酶，其中，一个部分只含有胶原酶的混合物，即胶原酶I和胶原酶II的混合物，另一个部分只含有中性蛋白酶，第三部分只含有梭菌蛋白酶。这是有利的，因为对于很多应用来说，胶原酶混合物的使用不需要精确的混合比例。同时，根据本发明的方法的该实施方案能够以简单且节省材料的方式来实施。在本文中，进一步优选的是，固定相由聚丙二醇组成。因此，还优选的是根据本发明的方法，其中，以胶原酶I与胶原酶II的混合物在一个部分中并且中性蛋白酶和梭菌蛋白酶分别在另外两部分中的方式得到纯化的酶。
还特别优选的是根据本发明的方法，其特征在于，在疏水作用色谱中，固定相包括丁基琼脂糖，将至少一种水溶液用作流动相，其包括从硫酸铵和氯化钾构成的组中选出的至少一种盐。非常特别优选的是根据本发明的方法，其特征在于，在疏水作用色谱中，固定相包括丁基琼脂糖，将至少一种水溶液用作流动相，其包括硫酸铵。最优选的是根据本发明的方法，其特征在于，在疏水作用色谱中，固定相包括丁基琼脂糖，将至少一种水溶液用作流动相，其含有氯化钾。这些实施方案使得四种酶，即胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶，彼此分开，分别在四个部分中得到。对于这些实施方案，特别优选的是使用包括丁基琼脂糖的固定相。最优选的固定相由丁基琼脂糖组成。
因此，通过使用本发明的方法，除了纯化酶之外，还能够将胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶彼此分开，除了分离中性蛋白酶和梭菌蛋白酶之外，还能够将两种不同类型的胶原酶(I型和II型)彼此分开。所有这些分离都可在一步法中实现。
流动相中硫酸铵和氯化钾的浓度对疏水相互作用具有影响，因此会影响对各自固定相的结合特性。本领域技术人员通过初步实验能够容易地确定纯化和分离所需的这些盐的量。优选的是根据本发明的方法，其特征在于，在疏水作用色谱中，使用至少一种流动相，其具有范围是0.3至1.5mol/l且优选0.5至1.0mol/l的硫酸铵摩尔浓度。还优选的是根据本发明的方法，其特征在于，在疏水作用色谱中，使用至少一种流动相，其具有范围是1.0至3.0mol/l且优选1.5至2.5mol/l的氯化钾摩尔浓度。
根据本发明的方法使用的流动相还可以进一步含有流动相通常使用的组分，诸如其它的盐。此类盐的实例是氯化钠和氯化钙。在流动相含有氯化钠的情况下，流动相优选以0.2至5mol/l的摩尔浓度含有氯化钠。如果流动相含有氯化钙，流动相优选以至多50mmol/l、特别优选至多15mmol/l的摩尔浓度含有氯化钙。此外，流动相可以含有三(羟甲基)-氨基甲烷(tris)。在流动相含有tris的情况下，流动相优选以至多60mmol/l、特别优选至多30mmol/l的摩尔浓度含有tris。此外，流动相可以含有有机溶剂。这些有机溶剂优选是极性较强的溶剂。特别优选的是醇类，尤其是异丙醇和/或多元醇。在多元醇中，最优选的是二醇类，其中，乙二醇和丙二醇是最优选的。在流动相含有有机溶剂的情况下，流动相优选以至多50％(重量)、优选至多40％(重量)且特别优选至多30％(重量)的比例含有有机溶剂。流动相的pH优选是pH 6.0至9.5。
待分离的物质混合物优选在所谓的应用缓冲液(application buffer)的帮助下应用到固定相。所使用的任何应用缓冲液的组成和性质与流动相相同。
优选采用分步洗脱、梯度洗脱或者这两者的组合来实施疏水作用色谱。因此，根据本发明的方法是特别优选的，特征在于在疏水作用色谱中，实施分步洗脱、梯度洗脱或者这两者的组合。分步洗脱特别优选在规模生产中使用。
还优选的是根据本发明的方法，其特征在于，在疏水作用色谱中，实施分步洗脱、梯度洗脱或者这两者的组合，其中，实施至少三个洗脱步骤。本发明的方法特别适合于将胶原酶I、胶原酶II或胶原酶混合物与中性蛋白酶和梭菌蛋白酶分离。特别优选的是根据本发明的方法，其特征在于，在疏水作用色谱中，实施至少三个洗脱步骤，其中，两种胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶彼此分离。因此，两种胶原酶类型(I型和II型)混合在一个共同的部分中，而中性蛋白酶和梭菌蛋白酶存在于另外两个彼此分开的部分中并且与胶原酶分开。还特别优选的是根据本发明的方法，其特征在于，在疏水作用色谱中，实施至少三个洗脱步骤，其中，胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶彼此分开。
还优选的是根据本发明的方法，特征在于在疏水作用色谱中，以分步洗脱、梯度洗脱或者这两者的组合的形式来实施至少三个洗脱步骤，其中，两种胶原酶(I型和II型)、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶彼此分开，或者，其中，胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶彼此分开。在后一种情况中，优选以洗脱步骤的形式采用线性梯度或采用附加洗脱步骤来实施两种胶原酶的额外的分离。因此，采用至少三个洗脱步骤的洗脱的结果是在至少三个有价值的部分(value fraction)中纯化和分离胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶。
还优选的是根据本发明的方法，其特征在于，在疏水作用色谱中，实施梯度洗脱或者梯度洗脱与分步洗脱的组合，其中，实施至少三个洗脱步骤。特别优选的是根据本发明的该方法，其特征在于，两种胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶彼此分开，如此，I型胶原酶和II型胶原酶混合存在于一个共同的部分中，中性蛋白酶和梭菌蛋白酶存在于另外两个彼此分开的部分中并且与胶原酶分开。特别优选的是根据本发明的该方法，其特征在于，I型胶原酶、II型胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶彼此分开。
疏水作用色谱的第一个子步骤由(优选在所谓的应用缓冲液的帮助下)将待分离的物质混合物施于色谱柱组成。在根据本发明的方法中，特别是在对细菌溶组织梭菌培养物的培养上清进行处理的情况下，应用缓冲液通常是经过特殊改性的高盐水基质，其中，溶解于其中的物质混合物聚集以进行纯化和分离。在应用缓冲液的极度亲水性的介质中，会发生蛋白质与固定相的非常强的疏水相互作用，以便大多数蛋白质几乎完全固定在固定相。
作为疏水作用色谱的第二个子步骤–因此在对具有目标蛋白质的有价值的部分(在根据本发明的方法中，具有胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和/或梭菌蛋白酶的有价值的部分)进行洗脱之前-优选实施至少一个所谓的洗涤步骤。在该洗涤步骤中，对包含了结合至固定相的蛋白质的色谱柱进行洗涤，其中，极性的或亲水的且因此没有结合到固定相的任何杂质和通常是低分子量的任何杂质被洗掉，并且因此与目标蛋白质分开。盐含量高的水性缓冲溶液通常用作所谓的洗涤缓冲液。
应用缓冲液和洗涤缓冲液的组成可以不同。然而，一种同样的缓冲溶液可以既用作应用缓冲液又用作洗涤缓冲液。
在疏水作用色谱中，洗涤步骤之后是作为其它子步骤的洗脱步骤。尤其，关于根据本发明的方法，这些子步骤具有如下特点：在疏水作用色谱中，通过连续调整流动相(洗脱缓冲液)的组成，尤其是通过降低流动相的盐含量，在这些子步骤中洗脱具有目标蛋白质的有价值的部分。该洗脱可以等度逐步进行，即在流动相组成恒定的步骤中进行(分步洗脱)，该洗脱可以梯度逐步进行，即在有针对性地不断改变流动相的组成的步骤中进行(梯度洗脱)，或者，以分步洗脱和梯度洗脱组合的形式进行该洗脱。
在某些疏水作用色谱中，一种目标蛋白质对固定相的疏水作用低于物质混合物中其它目标蛋白质，因此，它不会与应用缓冲液和洗涤缓冲液中已具有相同强度的固定相结合。因此，在这些情况中，洗涤缓冲液在某些情况下可同时用作第一洗脱缓冲液，以便疏水作用色谱法的相同子步骤同时表示洗涤步骤和第一洗脱步骤。在这种情况中，不管是极性的或是亲水的，通常在相同的子步骤中先洗掉低分子量杂质，然后洗脱第一有价值的部分，该第一有价值的部分中具有结合较弱的目标蛋白质。在此类情况中，所使用的第一洗脱缓冲液(不考虑它是否还充当洗涤缓冲液)的体积能够控制被提及的目标蛋白质与混合物中其它目标蛋白质的分离质量。在这种情况中，所使用的流动相的量通常表示成柱体积(CV)。
因此，在根据本发明的方法中，借助所使用的第一洗脱缓冲液(梭菌蛋白酶洗脱缓冲液)的体积，能够控制相应洗脱的有价值部分(洗脱部分)中梭菌蛋白酶的含量，原因是与物质混合物中其它目标蛋白质(胶原酶I、胶原酶II和中性蛋白酶)相比，梭菌蛋白酶显示了与固定相的较弱的疏水作用。因此，大体积的第一洗脱缓冲液的结果是梭菌蛋白酶完全洗脱或接近完全洗脱于单独的、纯的梭菌蛋白部分中。另一方面，如果使用较小体积的第一洗脱缓冲液，各洗脱部分中梭菌蛋白酶的定量比率会发生变化。然后，这会导致如下事实：并不是全部的或几乎全部的梭菌蛋白酶都洗脱至一个单独的部分，而是洗脱的梭菌蛋白酶分散在单独的、纯的梭菌蛋白酶部分和随后的胶原酶部分。因此，第一洗脱缓冲液的量能够用来进行如下选择：是应该将梭菌蛋白酶几乎完全洗脱到单独的纯的梭菌蛋白部分中，还是应该将一部分梭菌蛋白酶洗脱为随后的胶原酶部分的组分且因此该部分梭菌蛋白酶与胶原酶存在于一个部分中。在后者中，在洗脱胶原酶的过程中选择合适的流动相盐浓度能够控制第二部分梭菌蛋白酶是与两种胶原酶(I型和II型)一起积聚在一个共同的洗脱部分中(柱材料聚丙二醇或丁基琼脂糖，两种胶原酶类型没有进一步分开)还是只与胶原酶II积聚在一个共同的洗脱部分中(柱材料丁基琼脂糖，两种胶原酶类型进一步分开)。使梭菌蛋白酶几乎完全洗脱至一个单独的纯的梭菌蛋白酶部分中且因此使梭菌蛋白酶几乎完全与胶原酶和中性蛋白酶分离所必需的(第一洗脱缓冲液的)流动相体积取决于不同因素(固定相、流动相、柱尺寸等)的特定组合。然而，根据本发明用于分离梭菌蛋白酶的优选方法的特征在于：使用至少10倍柱体积的第一洗脱缓冲液、更优选使用至少12倍柱体积的第一洗脱缓冲液、最优选使用15倍柱体积的第一洗脱缓冲液对色谱柱进行洗脱。采用这样体积的梭菌蛋白酶洗脱缓冲液，梭菌蛋白酶通常能完全地或几乎完全地从柱子洗脱。
本发明的方法能够以至少80％、优选至少90％的纯度获得胶原酶I、胶原酶II和这两种类型胶原酶的混合物，其中，采用分析阴离子交换色谱法(例如，使用GE HealthcareMonoQ柱，采用tris缓冲液作为流动相，室温条件)检测胶原酶的纯度。因此，优选的是根据本发明的方法，其中，以至少80％、优选至少90％的纯度(如上所述测定)获得胶原酶I、胶原酶II或者这些胶原酶的混合物。中性蛋白酶能够采用根据本发明的方法以至少70％、优选至少80％的纯度而获得，其中，采用SDS-PAGE(按照Laemmli U.K.；Nature 227:680-685,1970)检测中性蛋白酶的纯度。因此，还优选的是根据本发明的方法，其中，以至少70％、优选至少80％的纯度(如上所述测定)获得中性蛋白酶。梭菌蛋白酶能够采用根据本发明的方法以至少60％、优选至少70％的纯度而获得，其中，采用SDS-PAGE(按照Laemmli U.K.；Nature 227:680-685,1970)检测梭菌蛋白酶的纯度。因此，还优选的是根据本发明的方法，其中，以至少60％、优选至少70％的纯度(如上所述测定)获得梭菌蛋白酶。这些纯度值都是当这些酶用于大多数生化和医疗目的时能满足要求的纯度水平。最优选的是根据本发明的方法，其中，以至少80％的纯度(如上所述测定)获得胶原酶I、胶原酶II或这些胶原酶的混合物，以至少70％的纯度(如上所述测定)获得中性蛋白酶并且以至少60％的纯度(如上所述测定)获得梭菌蛋白酶。最优选的是根据本发明的方法，其中，以至少90％的纯度(如上所述测定)获得胶原酶I、胶原酶II或这些胶原酶的混合物，以至少80％的纯度(如上所述测定)获得中性蛋白酶并且以至少70％的纯度(如上所述测定)获得梭菌蛋白酶。
还可以采用一步法以这样的纯度得到这些酶。
此外，根据本发明的工艺是优选的，其特征在于，在疏水作用色谱中使用的线性流速是100至300cm/h，尤其是150至250cm/h。这些流速的结果是酶的最佳纯化和分离。
优选地，根据本发明的方法不包括凝胶过滤步骤和/或蛋白质沉淀步骤。凝胶过滤是一种非常耗费时间的方法，因此其需要高昂的成本并且增加了待分离的酶的自我消化风险。蛋白质沉淀步骤，诸如硫酸铵沉淀，会造成不良的蛋白质结构变化。此外，蛋白质沉淀无法得到本发明的方法提供的高纯度酶。
优选地，将根据本发明的方法纯化的至少一种酶用于制药和/或生化目的。制药目的包括所述酶作为活性药物成分的任意一种或多种用途，其中，该用途不受症状、剂型/制剂或应用方式的任何限制。此外，酶可用于生化目的，诸如体外细胞分离。
还优选地，采用根据本发明的方法纯化的至少一种酶用于化妆品目的。因此，酶(enzyme)或酶(enzymes)的用途也可扩展至用于纯粹的化妆品目的，即，区别于治疗目的的化妆品用途。
本发明还包括采用根据本发明的方法得到的酶本身。此外，本发明还包括组合物，其包括采用根据本发明的方法得到的至少一种酶。本发明还涉及采用根据本发明的方法纯化的酶用于制药、化妆品和/或生化目的。
根据本发明的优选方法的描述
在合适的发酵培养基中培养溶组织梭菌之后，从培养上清液分离细胞和其它不溶组分，例如采用离心分离和/或过滤。培养上清液含有胶原酶I、胶原酶II、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶，在采用疏水作用色谱纯化与分离这些蛋白质之前以常用方法浓缩培养上清液。
然后，进行疏水作用色谱(HIC)以便从培养上清液中纯化并分离酶。为了该目的，例如，将无细胞的并且必要时还进行了适当浓缩的培养上清液加到填充了聚丙二醇(PPG)和/或丁基琼脂糖的色谱柱，其中，酶–和其他组分–结合到柱材料。在洗掉未结合的分子之后，采用分步洗脱、梯度洗脱或者这二者的组合，以100至300cm/h的线性流速，在pH范围是6.0至9.5的缓冲体系中对最初结合的组分(包括目标蛋白质)进行洗脱，其中，不断降低盐浓度。优选地，以三步或更多的洗脱步骤进行蛋白质的洗脱。此时，得到三个有价值的部分，其中，第一部分含有混在一起的胶原酶(I型和II型)，另一部分含有中性蛋白酶，第三部分含有梭菌蛋白酶(在PPG或丁基琼脂糖上分离)。在丁基琼脂糖色谱的情况下，能够使两种胶原酶(I型和II型)进一步彼此分离。优选地，该分离采用分步洗脱和梯度洗脱的组合在至少三个洗脱步骤中或以四步洗脱来实施。相应地，得到四个有价值的部分，其中–如前–一个部分含有中性蛋白酶，另一部分含有梭菌蛋白酶。然而，现在是在包含胶原酶I的第三部分和包含胶原酶II的第四个单独的部分中分别得到胶原酶。
现在可以采用常规方法，诸如切向流过滤(TFF)工艺，对单个洗脱部分进行脱盐和/或浓缩。随后，可以采用类似的惯常方法，例如冷冻干燥，对得到的材料进行冻干。如有必要，可以随后进行进一步纯化。
下面的方案1显示了整个工艺方法的流程图。取决于所使用的变型方案，其带来三种或四种不同的最终产物，这些最终产物然后用于所需的进一步用途或进一步加工，尤其，还可以用于这些最终产物中的几种的特定且限定的混合物。
方案1：研发的纯化工艺的流程图
根据使用的固定相和流动相(流动相中盐的类型和量)，该方法能够实现如下结果，例如：
通过使用PPG作为柱材料、硫酸铵(0.3-1.5mol/l，尤其0.5-1.0mol/l)作为盐，实现胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶的分离，其中，两种类型的胶原酶(I型和II型)混合存在于一个共同的部分中，而中性蛋白酶和梭菌蛋白酶存在于另外两个彼此分开的部分中并且与胶原酶分开。丁基琼脂糖用作柱材料、氯化钾(1.0-3.0mol/l，尤其1.5-2.5mol/l)用作盐，这使胶原酶被再分成胶原酶I和胶原酶II。当丁基琼脂糖用作柱材料、硫酸铵(0.3-1.5mol/l，尤其0.5-1.0mol/l)用作盐，也能实现同样效果。
附图说明
图1：在聚丙二醇(PPG-600M)上对培养上清液的浓缩物进行纯化和分离的色谱图，显示了含有梭菌蛋白酶(F2-F5)、胶原酶(F6)和中性蛋白酶(F7)的部分。
图2：采用不同量(按照Wünsch以比容PZ活性测量)的培养上清液浓缩液装载HIC色谱的聚丙二醇(PPG-600M)柱之后的胶原酶价值部分(相当于图1的部分F6)的MonoQ色谱图。
图3：在聚丙二醇(PPG-600M)上分离之后胶原酶价值部分(相当于图1的部分F6)的SDS-PAGE。M：标志物蛋白质；K：样本应用浓缩液(纯化/分离之前)；Kol：胶原酶价值部分(F6)。
图4：在聚丙二醇(PPG-600M)上分离之后中性蛋白酶价值部分(相当于图1的部分F7)的SDS-PAGE。M：标志物蛋白质；K：样本应用浓缩液(纯化/分离之前)；NPf：色谱分析之后中性蛋白酶价值部分(F7)；NPe：F7浓缩成冻干的最终产物之后的中性蛋白酶。
图5：培养上清液的浓缩液在丁基琼脂糖(丁基琼脂糖HP)上纯化和分离的色谱图–与图1相比–显示了胶原酶I和胶原酶II的进一步分离。
图6：采用HIC色谱在无细胞、浓缩培养上清液纯化与分离之后对各胶原酶价值部分的比较分析的MonoQ色谱图。
A：在聚丙二醇(PPG-600M)上分离之后胶原酶价值部分(过程变型1)；B：在丁基琼脂糖(丁基琼脂糖HP)上分离之后胶原酶II价值部分(过程变型2)；C：在丁基琼脂糖(丁基琼脂糖HP)上分离之后胶原酶I价值部分(过程变型2)。
图7：采用几个色谱步骤的目前市售胶原酶(Ka)与按照本发明方法变型2在一个色谱步骤中获得的胶原酶(Kn)之间进行比较的SDS-PAGE。
M：标志物蛋白质。
实施例
实施例中使用的所有流动相、应用缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液都是水溶液。每种情况下所用流动相的完整成分如下所示。
实施例1
按照标准方法，使用合适的营养培养基，在液体培养中将溶组织梭菌的培养物培养至所需的细胞密度。采用标准方法(诸如离心分离和/或过滤)分离细胞之后，执行根据本发明的方法的疏水作用色谱。为了这个目的，采用流动相(水溶液，0.85mol/l硫酸铵、20mmol/l tris、7mmol/l CaCl2、pH 7.5)平衡填充有聚丙二醇(PPG-600M，TosohBioscience LLC)的色谱柱(床高大约20cm)。装载无细胞浓缩培养上清液之后，用10倍柱体积(CV)的相同流动相洗涤色谱柱。在三个洗脱步骤中以250cm/h的线性流速洗脱目标蛋白质。使用前述流动相采用等度洗脱得到第一个有价值的部分，其含有梭菌蛋白酶。使用另一流动相(水溶液，0.2mol/l硫酸铵、20mmol/l tris、7mmol/lCaCl2、pH 7.5)采用等度洗脱得到第二部分，其含有胶原酶(胶原酶I和胶原酶II)。使用第三流动相(水溶液，12％(m/m)丙二醇,20mmol tris,7mmol CaCl2、pH 7.5)采用等度洗脱得到第三部分，其含有中性蛋白酶。
图1显示了PPG-600M作为柱材料采用疏水作用色谱对无细胞浓缩培养上清液进行上述纯化和分离的色谱图。图显示了具有相应洗脱范围的三种不同产物的价值部分。梭菌蛋白酶洗脱于子部分F2至F5中，胶原酶在部分F6中，中性蛋白酶在部分F7中。胶原酶部分(F6)以近似相等的比例含有两种胶原酶(I型和II型)。
图2显示了使用MonoQ色谱图对在PPG-600M上分离之后的胶原酶价值部分的分析。显示了HIC色谱中采用不同柱载量(按照Wünsch E.,Heidrich H.-G.；Z.Physiol.Chem.333:149-151,1963，以比容PZ活性(volume-specific PZ activity)测量的载量)得到的量。为了这个目的，使用MonoQ柱(柱子：MonoQ 5/20GL,GE Healthcare；应用缓冲液：水溶液，10mmol/l tris、2mmol/lCaCl2、pH 7.5；洗脱缓冲液：水溶液，10mmol/ltris、2mmol/l CaCl2、1mol/l NaCl、pH 7.5；梯度洗脱)分析各胶原酶价值部分的样本。因此，在每种情况下，能够测定胶原酶类型的纯度和含量以及它们相对于彼此的比例。从色谱图能够看出，不考虑PPG柱的装载，得到的胶原酶部分除了两种胶原酶类型之外仅含有微量杂质。因此，该方法是可重现且稳定的。测得胶原酶部分纯度的值>90％(参见图2和图3)。
因为目前没有可用于胶原酶I的有意义的活性分析方法，因此使用MonoQ分析法评价胶原酶I的品质和数量。如图2所示，在胶原酶I部分的MonoQ分析中没能检测到显著量的降解产物，因此，该酶与市场上现有产品的品质相当。
图3显示了在PPG-600M上分离之后胶原酶价值部分(相当于图1的部分F6)的SDS-PAGE。使用14％tris甘氨酸凝胶按照U.K.Laemmli的方案实施SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝(考马斯亮蓝R-250，Invitrogen)染色(Laemmli U.K.:Cleavage of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophage T4；Nature 227:680-685,1970)。左侧条带，标记为M，绘出了标志物蛋白质(Novex Mark12，Invitrogen)。中间的条带，标记为K，是纯化和分离之前的无细胞、浓缩的培养上清液。右侧条带(Kol)，绘出的是图1的胶原酶价值部分F6，其含有胶原酶I和胶原酶II。因此，图显示了在PPG柱上纯化和分离之前和之后的胶原酶纯度的直接比较。虽然只使用一根色谱柱对胶原酶蛋白质进行纯化和分离，但是胶原酶价值部分的纯度>90％。
图4显示了在PPG-600M上分离之后中性蛋白酶价值部分(相当于图1的部分F7)的对应SDS-PAGE。标志物蛋白质仍是左侧条带，标记为M。中间的条带，标记为K，仍是纯化和分离之前的无细胞、浓缩的培养上清液。右侧的两个条带中标记为NPf的条带(图1的中性蛋白酶价值部分F7)是在PPG柱上纯化与分离之后直接应用的。右侧的两个条带中标记为NPe的条带显示了为了进行比较分析而再次溶解的中性蛋白酶终产物，之前，通过脱盐、浓缩和冻干(冷冻干燥)从F7已经得到该中性蛋白酶终产物。从图4能够看出，在PPG柱上纯化与分离之后，中性蛋白酶还展示了大于80％的高纯度。这显著高于目前市售中性蛋白酶产品的纯度。
表1显示了PPG-600M作为柱材料采用疏水作用色谱从无细胞浓缩培养上清液纯化与分离酶之后酶活性的各相对产率。几次检测到胶原酶II的相应产率的值>90％。
表1：酶纯化与分离之后酶活性的相对产率(几次实验的结果)
a：按照Wünsch E.,Heidrich H.-G.；Z.Physiol.Chem.333,149-151,1963测定
b：按照Mitchell W.M.,Harrington W.F.；Methods Enzymol.19:635-642,1970测定
c：按照Moore S.,Stein W.H.；J.Biol.Chem.176:367-388,1948测定
d：洗涤步骤中废弃物部分损失掉一部分
研发的工艺的一个特殊特征是：用于洗脱色谱柱的第一洗脱缓冲液的柱体积(CV)的多少能够控制分离、纯化的梭菌蛋白酶(包括图1的子部分F2至F5)和胶原酶部分(图1的部分F6)之间梭菌蛋白酶的分布。从大约12CV开始的各体积的结果是分离、纯化的梭菌蛋白酶部分中总梭菌蛋白酶产率至多约80％，洗涤步骤中废弃物部分有相应损失，胶原酶部分中仅有非常低的梭菌蛋白酶含量。相反，大约4CV的各体积却造成总梭菌蛋白酶的分布是分离、纯化的梭菌蛋白酶部分中有大约40％并且随后的胶原酶部分中有大约40％，洗涤步骤中废弃物部分有相应损失(参见表1和表2)。
表2：胶原酶价值部分中梭菌蛋白酶的量对第一洗脱缓冲液(梭菌蛋白酶洗脱缓冲液)体积的依赖性
实施例2
按照标准方法，使用合适的营养培养基，在液体培养中将溶组织梭菌的培养物培养至所需的细胞密度。采用标准方法(诸如离心分离和/或过滤)分离细胞之后，执行根据本发明的方法的疏水作用色谱。为了这个目的，采用流动相(水溶液，2mol/l KCl、20mmol/ltris、7mmol/l CaCl2、pH 9)平衡填充有丁基琼脂糖(高性能丁基琼脂糖，简写为丁基琼脂糖HP，GE Healthcare)的色谱柱(床高大约20cm)。在应用无细胞浓缩培养上清液之后，用4倍柱体积(CV)的相同流动相洗涤柱子并等度洗脱。以250cm/h的线性流速洗脱目标蛋白质。从前述流动相开始至目标缓冲液(水溶液，无KCl(0mol/l),20mmol/l tris,7mmol/lCaCl2,pH 9)线性减少盐浓度，以超过20CV的梯度执行随后的第二洗脱步骤。从而得到含有梭菌蛋白酶的第一有价值的部分。第二部分含有胶原酶II。第三部分含有胶原酶I。采用5CV的另一流动相(水溶液，25％(m/m)丙二醇,20mmol tris,7mmol CaCl2,pH 9)由第三洗脱步骤得到第四部分，其含有中性蛋白酶。
图5显示了采用疏水作用色谱以丁基琼脂糖HP作为柱材料对无细胞、浓缩培养上清液进行上述纯化和分离的色谱图。显示的是–与图1相比–进一步分离为胶原酶I和胶原酶II，其中，这方面的第一主峰对应于胶原酶II，这方面的第二主峰对应于胶原酶I。
图6显示了采用疏水作用色谱的不同变型，对无细胞、浓缩培养上清液进行纯化和分离之后，各胶原酶价值部分的比较MonoQ分析。A显示在作为柱材料的PPG-600M上分离之后的胶原酶价值部分(方法变型1)。B代表在作为柱材料的丁基琼脂糖HP上分离之后的II型胶原酶价值部分(方法变型2)。C显示在作为柱材料的丁基琼脂糖HP上分离之后的I型胶原酶价值部分(方法变型2)。因此，在一步法中实现了纯净品质(如果必要，进行分离)，而这在已知方法中需要三个或更多个方法步骤。
图7显示了银染色(银快速银染试剂盒，Anamed)之后的SDS-PAGE。左侧条带，标记为M，再次应用了标志物蛋白质。它旁边，用于直接比较，显示的是经过几个色谱步骤纯化的目前市售的“经典”胶原酶(中间条带，标记为Ka)和根据本发明一步纯化方法的变型得到的胶原酶(右侧条带，标记为Kn)。从图能够看出，采用根据本发明的一步法得到的胶原酶的纯度至少是与目前市售“经典”胶原酶一样高。因为一步法，≥80％的产率也是显著高于已有方法的产率的。
Claims (20)
1.一种将I型胶原酶、II型胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶中的至少一种酶从物质的混合物中纯化出来的方法，作为方法步骤，包括至少一个疏水作用色谱，
其特征在于，
在所述疏水作用色谱中，固定相包括从聚丙二醇和丁基琼脂糖构成的组中选出的材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述疏水作用色谱中，将至少一种水溶液用作流动相，其包括从硫酸铵和氯化钾构成的组中选出的至少一种盐。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述疏水作用色谱中，所述固定相包括聚丙二醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将包括硫酸铵的至少一种水溶液用作流动相。
5.根据权利要求1或2所述的方法，尤其是根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述疏水作用色谱中，所述固定相包括丁基琼脂糖。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述物质的混合物包括从I型胶原酶、II型胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶构成的组中选出的至少两种酶。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述物质的混合物是溶组织梭菌的培养上清液。
8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，在所述疏水作用色谱中，使用硫酸铵摩尔浓度是0.3至1.5mol/l的至少一种流动相。
9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，在所述疏水作用色谱中，使用氯化钾摩尔浓度是1.0至3.0mol/l的至少一种流动相。
10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，在所述疏水作用色谱中，实施分步洗脱、梯度洗脱或这两者的组合。
11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，在所述疏水作用色谱中，实施分步洗脱，其中实施至少三个洗脱步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，将两种胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶彼此分开，以便I型胶原酶和II型胶原酶混合存在于共同的部分中，中性蛋白酶和梭菌蛋白酶存在于彼此分开的另外两个部分中并且与胶原酶分开。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，I型胶原酶、II型胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶彼此分开。
14.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其特征在于，在所述疏水作用色谱中，实施梯度洗脱或者梯度洗脱和分步洗脱的组合，其中实施至少三个洗脱步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，将两种胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶彼此分开，以便I型胶原酶和II型胶原酶混合存在于共同的部分中，中性蛋白酶和梭菌蛋白酶存在于彼此分开的另外两个部分中并且与胶原酶分开。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，I型胶原酶、II型胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶彼此分开。
17.权利要求1至16任一项所述的方法纯化的至少一种酶用于制药目的的用途。
18.权利要求1至16任一项所述的方法纯化的至少一种酶用于化妆品和/或生化目的的用途。
19.一种酶，采用权利要求1至16任一项所述的方法得到。
20.一种组合物，包括权利要求19所述的至少一种酶。
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