EP3924363A1 - Chromatographische aufreinigung von wenigstens einem enzym, ausgesucht aus der gruppe bestehend aus kollagenase typ i, kollagenase typ ii, neutrale protease und clostripain - Google Patents

Chromatographische aufreinigung von wenigstens einem enzym, ausgesucht aus der gruppe bestehend aus kollagenase typ i, kollagenase typ ii, neutrale protease und clostripain

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Publication number
EP3924363A1
EP3924363A1 EP19706469.4A EP19706469A EP3924363A1 EP 3924363 A1 EP3924363 A1 EP 3924363A1 EP 19706469 A EP19706469 A EP 19706469A EP 3924363 A1 EP3924363 A1 EP 3924363A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
clostripain
collagenase
neutral protease
collagenase type
interaction chromatography
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19706469.4A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas SCHRÄDER
Jörg LAMBRECHT
Stefan DÖDING
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nordmark Pharma GmbH
Original Assignee
Nordmark Pharma GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nordmark Pharma GmbH filed Critical Nordmark Pharma GmbH
Publication of EP3924363A1 publication Critical patent/EP3924363A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22008—Clostripain (3.4.22.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24003—Microbial collagenase (3.4.24.3)

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying at least one enzyme, selected from the group consisting of collagenase type I, collagenase type II, neutral protease and clostripain, from a mixture of substances, comprising as a method step at least one hydrophobic interaction chromatography, characterized in that in the hydrophobic
  • the stationary phase interaction chromatography comprises a material selected from the group consisting of polypropylene glycol (PPG) and butyl sepharose.
  • PPG polypropylene glycol
  • the present invention further relates to the use of an enzyme purified in this way for pharmaceutical, cosmetic and / or biochemical purposes.
  • Clostridia are gram-positive, obligately anaerobic, spore-forming bacteria from the Clostridiaceae family. The bacteria are widespread and can be found everywhere, especially in soil and in the digestive tract of higher living organisms.
  • Clostridium histolyticum When cultivated on or in suitable nutrient media, Clostridium histolyticum secretes a complex enzyme mixture which contains collagenases, various other proteases and low molecular weight components.
  • the collagenases are subdivided into type I and type II (EC 3.4.24.3) - also collagenase I or collagenase II for short - depending on the converted substrate and have molecular weights between 115 and 125 kDa.
  • Another component of the enzyme mixture secreted by Clostridium histolyticum is the SH protease clostripain (EC 3.4.22.8), which occurs as a heterodimer and has a molecular weight of approx. 59 kDa. Clostripain cleaves the target proteins specifically at arginine residues. Furthermore, the non-specific neutral Protease with a molecular weight of about 34 kDa secreted by Clostridium histolyticum.
  • proteases Since all proteases are secreted into the medium by the bacterium, they can be easily separated from the cells in this way. In the natural environment, the proteases have the task of breaking down tissue or fibrillary collagen and making the released peptides and amino acids available to the bacterium as a source of nutrients.
  • collagenases One of the commercial applications of collagenases is the use as biochemical for in v / 'iro-isolation of cells from the tissue matrix.
  • the other proteases neutral protease and / or clostripain are required in some cases.
  • optimal results are only achieved if the proteases are present in certain proportions, depending on the intended cell isolation. The same applies to the two types of collagenase, depending on the application, in certain proportions in order to achieve optimal results.
  • proteases from Clostridium histolyticum are their use as a biological active ingredient in the production of drugs, including for the treatment of fibrotic cords in the palm and fingers of Dupuytren's disease, but also for various other diseases.
  • Another pharmaceutical field of application of these proteases is their use in ointments for wound healing; For example, collagenases can be used for the enzymatic treatment of cutaneous ulcers.
  • the active ingredient also contains neutral protease and clostripain.
  • Conventional manufacturing processes for this active ingredient for wound treatment only provide for desalination, concentration and drying of the cell-free culture supernatant. The enzymes are not separated. The proportions of the enzymes to one another are thus determined by the fermentation and cannot be influenced in the current processes.
  • Clostridium histolyticum secretes a complex mixture of enzymes into the culture supernatant, there is a need to separate the desired target enzymes and thus also for their purification from the culture supernatant.
  • a method for purifying enzymes from a culture supernatant of Clostridium histolyticum is known from DE 101 34 347 A1.
  • a multi-stage purification process is provided which exclusively provides chromatography materials based on styrene / divinylbenzene or based on ceramic hydroxyapatite.
  • a first chromatography step is necessary, which involves the use of a column filled with ceramic hydroxyapatite.
  • a second chromatography step which consists of anion exchange chromatography with a column matrix based on styrene / divinylbenzene.
  • a third chromatography step in which a styrene / divinylbenzene-based column matrix is also used, this time as part of a cation exchange chromatography.
  • three chromatographic process steps are necessary in this process, which make the purification of the enzymes from the culture supernatant very costly and time-consuming.
  • the purification processes described therefore place a strong focus on the two collagenases (type I and type II). At least three purification steps are required to achieve the required purity of the collagenases. A purification of neutral protease and clostripain is not described in this process.
  • an additional separate chromatographic step is required in the known methods, which must be carried out specifically for this purpose.
  • the material used for this is usually an anion exchanger in the known processes.
  • An economical process for purifying at least one enzyme, selected from the group consisting of collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain should preferably be provided from a mixture of substances.
  • such a method for purifying at least one enzyme, selected from the group consisting of collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain is to be provided from the culture supernatant of Clostridium histolyticum.
  • a material and time-saving purification and separation of the enzymes mentioned should be provided.
  • the separation of the enzymes from one another should preferably take place with high yield and in the required quality.
  • Another task is to reduce the work steps necessary to purify the enzymes from the culture supernatant of Clostridium histolyticum.
  • the above-described object is achieved by a method for purifying at least one enzyme, selected from the group consisting of collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain, from a mixture of substances comprising at least one hydrophobic interaction chromatography (HIC) as a method step, characterized that in hydrophobic interaction chromatography the stationary phase comprises a material which is selected from the group consisting of polypropylene glycol and butyl Sepharose. At all In embodiments of the present invention, it is further preferred that the stationary phase consists of polypropylene glycol or butyl Sepharose.
  • HIC hydrophobic interaction chromatography
  • hydrophobic interaction chromatography is based on the interactions of non-polar surface regions of proteins with a hydrophobic stationary phase. These hydrophobic interactions are reinforced by an increased salt concentration in the solution serving as the mobile phase. The increased salt concentration leads to a partial removal of the hydration shells and thus to exposure of hydrophobic areas of the proteins. These hydrophobic surface regions of the proteins now in turn interact with the hydrophobic residues of the stationary phase.
  • the stationary phase i.e. the column material
  • the stationary phase usually consists of polymers which are or will be chemically modified - that is, hydrophobized - by specifically selected non-polar functional groups.
  • the selectivity and capacity of the stationary phase depend on the selectivity and density of the functional groups used.
  • PPG polypropylene glycol
  • butyl sepharose polypropylene glycol
  • the commercially available grade PPG-600M from Tosoh Bioscience LLC can be used as the column material as the polypropylene glycol.
  • Butyl-Sepharose HP When using Butyl-Sepharose as column material, the commercially available Butyl Sepharose High Performance - butyl Sepharose HP for short - and Butyl Sepharose Fast Flow - butyl Sepharose FF for short - from GE Healthcare can be used. Butyl Sepharose HP is particularly preferred.
  • Butyl-Sepharose (also called “butyl agarose” or “cross-linked butyl agarose”) is a cross-linked agarose in which the hydrogen atoms of some of the OH groups are replaced by 3-n-butoxy-2-hydroxypropyl residues (-CH2- CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3) and the relevant OH groups are thus etherified accordingly.
  • the degree of crosslinking is preferably 1 to 7%, particularly preferably 2 to 6%.
  • the butyl Sepharose is preferably in the form of spherical particles with an average particle size in the range from 20 to 150 ⁇ m, particularly preferably in the range from 30 to 100 ⁇ m.
  • an average particle size of 70 ⁇ m or less is preferred. Is particularly preferred for this an average particle size of 50 miti or less.
  • the number of 3-n-butoxy-2-hydroxypropyl radicals is preferably 10 to 200 mitioI, particularly preferably 20 to 100 mitioI and most preferably 30 to 70 mitioI per milliliter of medium.
  • the purified enzymes can be obtained in great purity by the process according to the invention.
  • the enzymes are very stable to the hydrophobic interactions with the stationary phases polypropylene glycol and butyl sepharose and to the buffer conditions of the mobile phase required for this and are practically not subject to any decomposition. It is particularly advantageous here that there is practically no denaturation of the enzymes to be purified, so that they are obtained in their native form and while maintaining their biological activity.
  • the purified enzymes therefore contain no or only very few denatured enzymes or parts thereof. This is very advantageous, since denatured enzymes can often only be separated from the corresponding undenatured enzymes with great difficulty, since they often have similar retention times in chromatography as the undenatured enzymes.
  • the purified enzymes are therefore obtained in particularly good yield and in high purity.
  • the proteins to be purified thus essentially retain their native form and thus also their enzymatic activity. You can therefore then continue to use such.
  • a method according to the invention is also possible not only to purify the abovementioned enzymes, collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain, from impurities, but also to separate them from one another.
  • a method according to the invention is therefore likewise preferred, which is characterized in that the mixture of substances comprises at least two enzymes selected from the group consisting of collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain.
  • a method according to the invention is also preferred, which is characterized in that the mixture of substances comprises at least two enzymes, at least one enzyme being selected from the group consisting of collagenase I and collagenase II and at least one enzyme is selected from the group consisting of neutral protease and clostripain.
  • a method according to the invention is particularly preferred which is characterized in that the mixture of substances comprises at least three enzymes selected from the group consisting of collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain.
  • a method according to the invention is very particularly preferred, which is characterized in that the mixture of substances comprises the enzymes collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain.
  • the present invention represents a material and time-saving and thus cost-effective method which is able to produce and separate the enzymes with high yield and in the required quality.
  • This has the advantage that the composition of an active ingredient which contains one or more of these enzymes can be varied as desired by targeted mixing of the respective enzymes. This improves the quality of the active ingredient and leads to new active ingredients with a defined composition and better effectiveness.
  • the enzymes collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain are expressed and secreted by the bacterium Clostridium histolyticum. Since Clostridium histolyticum secretes a complex mixture of enzymes into the culture supernatant, there is a need to obtain these desired target enzymes by purifying them and separating them from one another. Most preferred is therefore a method according to the invention which is characterized in that the mixture of substances is the culture supernatant of a culture of the bacterium Clostridium histolyticum.
  • the substance mixture was obtained from the culture supernatant of a culture of the bacterium Clostridium histolyticum and contains at least one enzyme selected from the group consisting of collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain .
  • the mixture of substances particularly preferably contains at least two of the enzymes, very particularly preferably at least three of the enzymes, selected from the group consisting of collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain. Most preferably, the mixture of substances contains all four enzymes.
  • the mixture of substances can for example be obtained from the culture supernatant of a culture of the bacterium Clostridium histolyticum by separating insoluble constituents, for example by centrifugation or by filtering off cells, cell debris and other constituents that are already insoluble. Furthermore, for example, desalination, rebuffering and / or concentration or other method steps can be carried out which are usually used for the preparation of culture supernatants.
  • the method according to the invention makes it possible to purify both a single and multiple target proteins from a mixture of substances and in particular from the culture supernatant.
  • the process according to the invention makes it possible to obtain the desired enzyme (s) from the culture supernatant in ready-to-use purity by just a single chromatographic process step.
  • the process according to the invention preferably does not comprise any further chromatography process.
  • the process according to the invention particularly preferably comprises only a single process step in which a hydrophobic interaction chromatography is carried out with a stationary phase which comprises a material selected from the group consisting of polypropylene glycol and butyl-Sepharose, and no further chromatography process. This embodiment is referred to below as a “one-step process”. If necessary, however, further purification steps can follow or precede the chromatography.
  • the method according to the invention it is possible to purify the above-mentioned enzymes, collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain, in a single chromatographic step and to separate them from one another. Since the developed process can provide the enzymes in the required quality in a one-step process, the production costs are significantly reduced. Firstly, significantly less material and time are required for the implementation, and secondly, the yields are significantly higher compared to the established processes. In addition, the one-step purification and separation also offers a clear advantage with regard to the stability of the various proteases in the purification of enzymes from mixtures of substances, in particular from culture supernatants.
  • a method according to the invention is preferred, which is characterized in that in hydrophobic interaction chromatography at least one aqueous solution is used as the mobile phase which comprises at least one salt selected from the group consisting of ammonium sulfate and potassium chloride.
  • the method can be carried out particularly effectively, and the advantages described herein are particularly evident.
  • the use of these mobile phases allows the four enzymes to be clearly separated from one another.
  • a method according to the invention is particularly preferred, which is characterized in that in the hydrophobic interaction chromatography the stationary phase comprises polypropylene glycol and at least one aqueous solution is used as the mobile phase, which comprises ammonium sulfate.
  • This embodiment makes it possible to obtain the four enzymes in three separate fractions, one fraction only containing the mixture of collagenases, i.e. a mixture of collagenase I and collagenase II, a further fraction only the neutral protease and the third fraction only the clostripain . This is advantageous because the mixture of collagenases is used for many applications without their exact mixing ratio being important.
  • this embodiment of the method according to the invention can be carried out simply and in a material-saving manner.
  • the stationary phase consists of polypropylene glycol.
  • a method according to the invention is therefore likewise preferred in which the purified enzymes are obtained as a mixture of collagenase I with collagenase II in one fraction and neutral protease and clostripain are obtained separately in two further fractions.
  • a method according to the invention which is characterized in that in Flydrophobic interaction chromatography the stationary phase comprises butyl sepharose and at least one aqueous solution is used as the mobile phase which comprises at least one salt selected from the group consisting of Ammonium sulfate and potassium chloride.
  • a method according to the invention is very particularly preferred, which is characterized in that in hydrophobic interaction chromatography the stationary phase comprises butyl Sepharose and at least one aqueous solution is used as the mobile phase, which comprises ammonium sulfate.
  • the stationary phase comprises butyl Sepharose and at least one aqueous solution is used as the mobile phase, which comprises potassium chloride.
  • the mobile phase which comprises potassium chloride.
  • concentrations of ammonium sulfate and potassium chloride in the mobile phase have an influence on the hydrophobic interactions and thus on the binding properties to the respective stationary phase.
  • the skilled person can do the for the purification and separation of the necessary amount of these salts can easily be determined by preliminary experiments.
  • a method according to the invention is preferred, which is characterized in that in hydrophobic interaction chromatography at least one mobile phase is used which has a molar concentration of ammonium sulfate in the range from 0.3 to 1.5 mol / l and preferably in the range from 0.5 to 1.0 mol / l.
  • a method according to the invention is likewise preferred, which is characterized in that at least one mobile phase is used in hydrophobic interaction chromatography which has a molar concentration of potassium chloride in the range from 1.0 to 3.0 mol / l and preferably in the range from 1.5 to 2.5 mol / l.
  • the mobile phases used in the method according to the invention can also contain further components usually used in mobile phases, such as, for example, further salts.
  • further salts are sodium chloride and calcium chloride. If the mobile phases contain sodium chloride, they preferably contain this in a molar concentration of 0.2 to 5 mol / l. If the mobile phases contain calcium chloride, they preferably contain this in a molar concentration of up to 50 mmol / l, particularly preferably up to 15 mmol / l.
  • the mobile phases can also contain tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris). If the mobile phases contain Tris, they preferably contain this in a molar concentration of up to 60 mmol / l, particularly preferably up to 30 mmol / l.
  • the mobile phases can also contain organic solvents. These are preferably more polar solvents. They are particularly preferably alcohols, in particular isopropanol and / or polyols. Most preferred among the polyols are glycols, and of these, glycol and propylene glycol are again most preferred. If the mobile phases contain organic solvents, they preferably contain them in proportions of up to 50 percent by weight, preferably up to 40 percent by weight and particularly preferably up to 30 percent by weight.
  • the pH of the mobile phase is preferably in the range from pH 6.0 to 9.5.
  • the mixture of substances to be separated is preferably applied to the stationary phase with the help of a so-called application buffer.
  • application buffer For the composition and the same statements apply to the properties of any job buffers used as to the mobile phases.
  • the hydrophobic interaction chromatography is preferably carried out by means of a step elution, a gradient elution or a combination of these two.
  • a method according to the invention which is characterized in that a step elution, a gradient elution or a combination of these two is carried out in hydrophobic interaction chromatography, is therefore particularly preferred. Step elution is particularly preferred for use on a production scale.
  • a method according to the invention is preferred, which is characterized in that a step elution, a gradient elution or a combination of these two is carried out in hydrophobic interaction chromatography, with at least three elution steps being carried out.
  • Such a method is particularly suitable for separating collagenase I, collagenase II or the mixture of collagenases from the neutral protease and clostripain.
  • a method according to the invention is particularly preferred, which is characterized in that at least three elution steps are carried out in hydrophobic interaction chromatography, the two collagenases, neutral protease and clostripain being separated from one another.
  • a method according to the invention is also particularly preferred, which is characterized in that at least three elution steps are carried out in hydrophobic interaction chromatography, with collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain being separated from one another.
  • a method according to the invention is also preferred, which is characterized in that in hydrophobic interaction chromatography at least three elution steps are carried out in the form of a step elution, a gradient elution or a combination of these two, the two collagenases (type I and type II), neutral protease and Clostripain can be separated from each other or whereby collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain are separated from one another.
  • the additional separation of the two collagenases is preferably carried out by means of a linear gradient or by an additional elution step in the form of an elution stage. The elution with at least three elution steps thus results in a purification and separation of collagenases, neutral protease and clostripain into at least three fractions of value.
  • a method according to the invention which is characterized in that a gradient elution or a combination of gradient and step elution is carried out in Flydrophobic interaction chromatography, with at least three elution steps being carried out.
  • a method according to the invention is particularly preferred, which is characterized in that the two collagenases, neutral protease and clostripain are separated from one another, so that collagenase type I and collagenase type II are mixed in a common fraction, and neutral protease and clostripain in two more Fractions are separate from each other and separate from the collagenases.
  • Such a method according to the invention is particularly preferred which is characterized in that collagenase type I, collagenase type II, neutral protease and clostripain are separated from one another.
  • the first sub-step in hydrophobic interaction chromatography consists in applying the mixture of substances to be separated to the chromatographic column, which is preferably done with the help of a so-called application buffer.
  • the application buffer is usually the specifically modified, highly saline aqueous matrix in which the mixture of substances dissolved therein is obtained for purification and separation, in the present method according to the invention in particular in the context of working up from the culture supernatant of a culture of the bacterium Clostridium histolyticum.
  • the extremely hydrophilic medium of the application buffer there are very strong hydrophobic interactions between the proteins and the stationary phase, so that most proteins are almost completely fixed to the stationary phase.
  • washing step As the second sub-step of hydrophobic interaction chromatography - and thus before the elution of the fractions of value with the target proteins, in the present inventive method with the enzymes collagenase I, collagenase II, neutral protease and / or clostripain - at least one so-called is preferred Washing step made.
  • this washing step the chromatography column including the proteins bound to the stationary phase is washed, with any existing, more polar or hydrophilic and therefore not bound to the stationary phase, often low molecular weight impurities being washed out and thus separated from the target proteins.
  • washing buffer an aqueous buffer solution that is also highly saline is usually used for this purpose.
  • Application and washing buffers can differ in their composition. However, one and the same buffer solution can also be used both as application buffer and as wash buffer.
  • the washing step (s) are followed by the elution steps as further sub-steps.
  • the elution steps are to be understood - in particular also with regard to the present inventive method - those partial steps in which the fractions of value with the by successive adaptation of the composition of the mobile phase (elution buffer), in the case of hydrophobic interaction chromatography, in particular by reducing the salt content of the mobile phase Target proteins are eluted from the column.
  • This elution can be carried out isocratic in stages, i.e. in stages with a constant composition of the mobile phase (step elution), as a gradient, i.e. with continuously changing composition of the mobile phase (gradient elution), or as a combination of step and gradient elution.
  • one of the target proteins may show less strong hydrophobic interactions with the stationary phase than the remaining target proteins of the substance mixture and is therefore not bound to the stationary phase with the same intensity in the application and washing buffer.
  • the washing buffer can serve as the first elution buffer at the same time, so that the same partial step of hydrophobic interaction chromatography represents both the washing step and the first elution step in parallel.
  • the more polar or hydrophilic, often low molecular weight, impurities are then washed out in the same partial step and then the first valuable fraction with the less strongly bound target protein eluted.
  • the quality of the separation of the target protein in question from the remaining target proteins of the substance mixture can be controlled by the volume of the first elution buffer used - regardless of whether this also functions as a washing buffer at the same time.
  • the amount of mobile phase used is then often given as the number of column volumes (column volume, CV).
  • clostripain elution buffer clostripain elution buffer
  • a large volume of the first elution buffer means that clostripain is completely or almost completely eluted in a separate, pure clostripain fraction.
  • the amount of the first elution buffer can thus be used to select whether clostripain should be eluted almost completely in a separate, pure clostripain fraction or whether part of the clostripain should be eluted as a component of the subsequent collagenase fraction and thus also together with collagenase (n ) should arise in a parliamentary group.
  • the choice of suitable salt concentrations of the mobile phase during the elution of the collagenases can control whether the second part of the clostripain is used together with both collagenases (type I and type II) in a common elution fraction (column material polypropylene glycol or butyl Sepharose without additional Separation of the two types of collagenase) or together with only the collagenase II in a common elution fraction (column material butyl-Sepharose with additional separation of the two types of collagenase).
  • the necessary volume of the mobile phase (the first elution buffer), which leads to an almost complete elution of the clostripain in a separate, pure clostripain fraction and thus to an almost complete elution complete separation of the clostripain from the collagenases and the neutral protease depends on the specific combination of various factors (stationary phase, mobile phase, dimensions of the column, etc.).
  • a method according to the invention is preferred for separating the clostripain, which is characterized in that the chromatography column is eluted with at least 10 column volumes, particularly preferably with at least 12 column volumes and most preferably with at least 15 column volumes of the first elution buffer. With such amounts of clostripain elution buffer, the clostripain is usually completely or almost completely eluted from the column.
  • the present method allows collagenase I, collagenase II and mixtures of these two types of collagenase to be obtained in a purity of at least 80%, preferably of at least 90%, the purity of the collagenases by means of analytical anion exchange chromatography (e.g. using a MonoQ column from GE Healthcare with Tris buffer as the mobile phase at room temperature).
  • a method according to the invention in which collagenase I, collagenase II or mixtures of these collagenases are obtained in a purity (determined as stated above) of at least 80%, preferably of at least 90%, is therefore preferred.
  • Neutral protease can be obtained by the method according to the invention in a purity of at least 70%, preferably of at least 80%, the purity of the neutral protease being determined by SDS-PAGE (according to Laemmli UK; Nature 227: 680-685, 1970).
  • a method according to the invention is therefore likewise preferred in which neutral protease is obtained in a purity (determined as stated above) of at least 70%, preferably of at least 80%.
  • Clostripain can be obtained by the method according to the invention in a purity of at least 60%, preferably of at least 70%, the purity of the clostripain being determined by means of SDS-PAGE (according to Laemmli UK; Nature 227: 680-685, 1970).
  • a method according to the invention in which clostripain is obtained in a purity (determined as stated above) of at least 60%, preferably of at least 70%, is therefore likewise preferred. All of these purity claims are degrees of purity that meet the requirements for using these enzymes for most biochemical and medical purposes.
  • a method according to the invention is very particularly preferred in which collagenase I, collagenase II or mixtures of these collagenases in a purity of at least 80% (determined as above indicated), neutral protease in a purity of at least 70% (determined as indicated above) and clostripain in a purity of at least 60% (determined as indicated above).
  • collagenase I, collagenase II or mixtures of these collagenases in a purity of at least 90% (determined as indicated above), neutral protease in a purity of at least 80% (determined as indicated above) and clostripain can be obtained in a purity of at least 70% (determined as indicated above).
  • a method according to the invention is also preferred, which is characterized in that a linear flow rate of 100 to 300 cm / h, in particular 150 to 250 cm / h, is used in hydrophobic interaction chromatography. These flow rates result in optimal purification and separation of the enzymes.
  • the method according to the invention preferably does not include any gel filtration steps and / or protein precipitation steps.
  • Gel filtration is a very time-consuming process, which entails high costs and increases the risk of self-digestion of the enzymes to be separated.
  • Protein precipitation steps such as ammonium sulfate precipitation, can lead to undesirable structural changes in the proteins. It is also not possible by means of protein precipitation to obtain enzymes with the high purity as are made available by the present process.
  • At least one enzyme purified by the method according to the invention is preferably used for pharmaceutical and / or biochemical purposes.
  • Pharmaceutical purposes include any use of one or more of these enzymes as a pharmaceutical active ingredient, whereby the use is not subject to any restrictions with regard to the indication, the drug form / preparation or the type of application.
  • the enzyme or enzymes can for biochemistry, such as are Irish-cell isolation, used in v / '.
  • At least one enzyme purified by the process according to the invention is also preferably used for cosmetic purposes. The use of the enzyme or enzymes thus also extends to use for purely cosmetic purposes, that is to say a cosmetic use as distinct from a therapeutic purpose.
  • the invention also includes an enzyme itself which is obtained with the method according to the invention.
  • the invention also includes compositions which comprise at least one enzyme obtained by the process according to the invention.
  • the present invention further relates to the use of an enzyme purified by the method according to the invention for pharmaceutical, cosmetic and / or biochemical purposes.
  • the culture supernatant which contains the enzymes collagenase I, collagenase II, neutral protease and clostripain, can be concentrated in the usual way - before these proteins are purified and separated by flydrophobe interaction chromatography.
  • Flydrophobe interaction chromatography is then carried out to purify and separate the enzymes from the culture supernatant.
  • the cell-free and possibly suitably concentrated culture supernatant z. B. applied to a chromatography column filled with polypropylene glycol (PPG) and / or butyl sepharose, the enzymes - among other components - binding to the column material.
  • PPG polypropylene glycol
  • the initially bound components, including the target proteins are eluted in a buffered system in the pFI range from 6.0 to 9.5 at a linear flow rate of 100 to 300 cm / h by means of step elution, gradient elution or a Combination of these two, whereby the salt content is gradually reduced.
  • the elution of the proteins is preferably carried out in three or more elution steps. There can be three Valuable fractions can be obtained, one fraction containing the collagenases (type I and type II) together, another fraction containing neutral protease and the third fraction containing clostripain (separation on PPG or butyl-Sepharose). When chromatography on butyl-Sepharose, an additional separation of the two collagenases (type I and type II) is possible. This separation is then preferably carried out with a combination of step and gradient elution in at least three elution steps or with a four-step elution.
  • the individual elution fractions can now be desalted and / or concentrated using conventional methods, such as a tangential flow filtration method (TFF). Then the resulting material can also be used by conventional methods, such. B. freeze drying, lyophilized. If necessary, further purification steps can follow.
  • TMF tangential flow filtration method
  • this method can therefore achieve, for example, the following:
  • butyl-Sepharose as a column material with potassium chloride (1.0-3.0 mol / l, especially 1.5-2.5 mol / l) as salt enables an additional separation of the collagenases into collagenase I and collagenase II .
  • potassium chloride 1.0-3.0 mol / l, especially 1.5-2.5 mol / l
  • ammonium sulfate 0.3-1.5 mol / l, in particular 0.5-1.0 mol / l
  • FIG. 1 Chromatogram of the purification and separation of the concentrate of the
  • Fraction F6 in Figure 1 Fraction F6 in Figure 1) after loading the polypropylene glycol (PPG-600M) column in the FLC chromatography with different amounts (measured in volume-specific PZ activity as desired) of the concentrate of the culture supernatant.
  • Polypropylene Glycol (PPG-600M) (equivalent to fraction F6 in Figure 1).
  • Col collagenase value fraction
  • Figure 4 SDS-PAGE of the neutral protease value fraction after separation on polypropylene glycol (PPG-600M) (equivalent to fraction F7 in Figure 1).
  • NPf neutral protease value fraction (F7) after chromatography
  • NPe Neutral protease after concentrating F7 to the lyophilized end product
  • A Collagenase value fraction after separation on polypropylene glycol (PPG-600M) (process variant 1); B: Collagenase type II value fraction after separation on Butyl-Sepharose (Butyl Sepharose HP) (process variant 2); C: Collagenase type I value fraction after separation on Butyl Sepharose (Butyl Sepharose HP) (process variant 2)
  • a culture of Clostridium histolyticum was cultivated to the desired cell density using a suitable nutrient medium in liquid culture according to standard methods. After the cells had been separated off using customary methods, such as centrifugation and / or filtration, flydrophobic interaction chromatography of the method according to the invention was carried out.
  • a chromatography column (bed height approx. 20 cm) filled with polypropylene glycol (PPG-600M, Tosoh Bioscience LLC) was activated by means of a mobile phase (aqueous solution, 0.85 mol / l ammonium sulfate, 20 mmol / l Tris, 7 mmol / l CaCh , pH 7.5) equilibrated.
  • the column was washed with 10 column volumes (CV) of the same mobile phase.
  • the target proteins were eluted with a linear flow rate of 250 cm / h in three elution stages.
  • the first fraction of value was obtained by isocratic elution with the aforementioned mobile phase and contained the clostripain.
  • the second fraction was obtained by isocratic elution with a further mobile phase (aqueous solution, 0.2 mol / l ammonium sulfate, 20 mmol / l Tris, 7 mmol / l CaCh, pH 7.5) and contained the collagenases (collagenase I and Collagenase II).
  • the third fraction was obtained by isocratic elution with a third mobile phase (aqueous solution, 12% (m / m) propylene glycol, 20 mmol Tris, 7 mmol CaCh, pH 7.5) and contained the neutral protease.
  • a third mobile phase aqueous solution, 12% (m / m) propylene glycol, 20 mmol Tris, 7 mmol CaCh, pH 7.5
  • Figure 1 shows a chromatogram of the above-described purification and separation of the cell-free, concentrated culture supernatant by means of hydrophobic interaction chromatography on PPG-600M as column material. The figure shows the value fractions of the three different products with the corresponding elution ranges.
  • Clostripain elutes in the partial fractions F2 to F5, the collagenases in fraction F6 and neutral protease in fraction F7.
  • the collagenase fraction (F6) contains both collagenases (type I and type II) in approximately equal parts.
  • FIG 2 shows the analysis of the collagenase value fraction after separation on PPG-600M (equivalent to fraction F6 in Figure 1) by means of MonoQ chromatograms.
  • the figure shows the quality obtained with different column loads in HIC chromatography (load measured in volume-specific PZ activity according to Wünsch E., Heidrich H.-G .; Z. Physiol. Chem. 333: 149-151, 1963).
  • a sample of the respective collagenase fraction is analyzed using a MonoQ column (column: MonoQ 5/20 GL, GE Healthcare; application buffer: aqueous solution, 10 mmol / l Tris, 2 mmol / l CaCh, pH 7.5; Elution buffer: aqueous solution, 10 mmol / l Tris, 2 mmol / l CaC, 1 mol / l NaCl, pH 7.5; gradient elution).
  • application buffer aqueous solution, 10 mmol / l Tris, 2 mmol / l CaCh, pH 7.5
  • Elution buffer aqueous solution, 10 mmol / l Tris, 2 mmol / l CaC, 1 mol / l NaCl, pH 7.5
  • gradient elution aqueous solution, 10 mmol / l Tris, 2 mmol / l CaC, 1 mol / l NaCl, pH 7.5
  • the collagenase fraction obtained contains only minor impurities in addition to the two types of collagenase, regardless of the load on the PPG column.
  • the process is thus reproducible and robust.
  • a value of> 90% was determined for the purity of the collagenase fraction (see Figures 2 and 3).
  • Figure 3 shows an SDS-PAGE of the collagenase fraction of value after separation on PPG-600M (equivalent to fraction F6 in Figure 1). This was carried out according to the protocol of UK Laemmli with a 14% Tris-Glycine gel (Anamed) and stained with Coomassie (Coomassie R-250, Invitrogen) (Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4; Nature 227: 680-685, 1970). Marker proteins (Novex Markl2, Invitrogen) are applied to the left lane marked M. The middle lane, labeled K, is the cell-free, concentrated culture supernatant before purification and separation.
  • Coomassie Coomassie
  • the figure shows a direct comparison of the purity of the collagenases before and after purification and separation on the PPG column. Although the collagenase proteins were only purified and separated using a chromatography column, the purity of the collagenase value fraction is> 90%.
  • Figure 4 shows a corresponding SDS-PAGE of the neutral protease value fraction after separation on PPG-600M (equivalent to fraction F7 in Figure 1). The marker proteins were again applied to the left lane labeled M.
  • the middle lane, labeled K is again the cell-free, concentrated culture supernatant before purification and separation.
  • the neutral protease value fraction F7 from Figure 1 was applied to the PPG column directly after purification and separation.
  • the two right-hand lanes denoted by NPe shows the neutral protease end product dissolved again for the comparative analysis, which had previously been obtained from F7 by desalination, concentration and lyophilization (freeze-drying). From Figure 4 it can be seen that the neutral protease also has a high purity of significantly> 80% after purification and separation on the PPG column. This is significantly higher than the purity of the neutral protease products currently available on the market.
  • Table 1 shows the respective relative yield of enzymatic activity after purification and separation of the enzymes from the cell-free, concentrated culture supernatant by means of flydrophobic interaction chromatography on PPG-600M as column material.
  • values of> 90% were determined several times.
  • a special feature of the developed process is that the distribution of the clostripain between a separate, pure clostripain fraction (comprising the partial fractions F2 to F5 in Figure 1) and the collagenase fraction (fraction F6 in Figure 1) can be controlled with how much column volume (CV) of the first elution buffer (clostripain elution buffer) the chromatography column is eluted.
  • CV column volume
  • a related volume from approx. 12 CV leads to a yield of approx. 80% of the total clostripain in the separate, pure clostripain fraction with corresponding losses with the waste fraction during the washing step and only a very small clostripain content in the collagenase fraction.
  • a culture of Clostridium histolyticum was cultivated to the desired cell density using a suitable nutrient medium in liquid culture according to standard methods. After the cells had been separated off using customary methods, such as centrifugation and / or filtration, flydrophobic interaction chromatography of the method according to the invention was carried out.
  • a chromatography column (bed height 20 cm) filled with butyl Sepharose (Butyl Sepharose High Performance, short Butyl Sepharose HP, GE Healthcare) using a mobile phase (aqueous solution, 2 mol / l KCl, 20 mmol / l Tris, 7 mmol / l CaCh, pH 9) equilibrated.
  • the column was washed with 4 column volumes (CV) of the same mobile phase and eluted isocratically.
  • the target proteins were eluted with a linear flow rate of 250 cm / h.
  • the subsequent second elution step took place as a gradient over 20 CV with a linearly falling salt concentration starting from the above-mentioned mobile phase to the target buffer (aqueous solution, no KCl (0 mol / l), 20 mmol / l Tris, 7 mmol / l CaCh, pH 9).
  • the first fraction of value obtained thereby contained the clostripain.
  • the second fraction contained collagenase II.
  • the third fraction contained collagenase I.
  • the fourth fraction was eluted in a third elution step by isocratic elution with 5 CV of a further mobile phase (aqueous solution, 25% (m / m) propylene glycol, 20 mmol Tris , 7 mmol CaCh, pH 9) and contained the neutral protease.
  • a further mobile phase aqueous solution, 25% (m / m) propylene glycol, 20 mmol Tris , 7 mmol CaCh, pH 9
  • FIG. 5 shows a chromatogram of the above-described purification and separation of the cell-free, concentrated culture supernatant by means of hydrophobic interaction chromatography on butyl Sepharose HP as column material.
  • the additional separation into collagenase I and collagenase II is shown, the first main peak in this regard corresponding to collagenase II and the second main peak in this regard corresponding to collagenase I.
  • Figure 6 shows the comparative MonoQ analysis of the respective collagenase value fractions after purification and separation of the cell-free, concentrated culture supernatant using different variants of the hydrophobes Interaction chromatography.
  • A shows the collagenase value fraction after separation on PPG-600M as column material (process variant 1).
  • B represents the collagenase type II value fraction after separation on Butyl Sepharose HP as column material (process variant 2).
  • C shows the collagenase type I value fraction after separation on Butyl Sepharose HP as column material (process variant 2).
  • a quality of purity and, if necessary, separation is achieved here in one process step, for which three or more process steps are required in the known processes.
  • Figure 7 shows an SDS-PAGE after silver staining (Argent Quick Silver Staining Kit, Anamed).
  • the marker proteins were again applied to the left lane marked M.
  • a "classic" collagenase (middle path, labeled Ka), which is currently available on the market and purified over several chromatography steps, and a collagenase obtained by means of a variant of the single-stage purification process according to the invention (right path, labeled Kn)
  • Ka a "classic” collagenase obtained by means of a variant of the single-stage purification process according to the invention

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung wenigstens eines Enzyms, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase Typ I, Kollagenase Typ II, Neutrale Protease und Clostripain, aus einem Stoffgemisch, umfassend als Verfahrensschritt wenigstens eine Hydrophobe Interaktionschromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie die stationäre Phase ein Material umfasst, das ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Polypropylenglykol und Butyl-Sepharose. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines so aufgereinigten Enzyms für pharmazeutische, kosmetische und/oder biochemische Zwecke.

Description

Bezeichnung
Chromatographische Aufreinigung von wenigstens einem Enzym, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase Typ I, Kollagenase Typ II, Neutrale Protease und Clostripain.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung wenigstens eines Enzyms, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase Typ I, Kollagenase Typ II, Neutrale Protease und Clostripain, aus einem Stoffgemisch, umfassend als Verfahrensschritt wenigstens eine Hydrophobe Interaktionschromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie die stationäre Phase ein Material umfasst, das ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Polypropylenglykol (PPG) und Butyl-Sepharose. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines so aufgereinigten Enzyms für pharmazeutische, kosmetische und/oder biochemische Zwecke.
Stand der Technik
Clostridien sind grampositive, obligat anaerobe, Sporen bildende Bakterien aus der Familie der Clostridiaceae. Die Bakterien sind weit verbreitet und kommen überall vor, insbesondere in Böden und im Verdauungstrakt höherer Lebewesen.
Clostridium histolyticum sekretiert bei Kultivierung auf bzw. in geeigneten Nährmedien ein komplexes Enzymgemisch, welches Kollagenasen, verschiedene andere Proteasen sowie niedermolekulare Bestandteile enthält. Die Kollagenasen werden in Abhängigkeit vom umgesetzten Substrat in Typ I und Typ II (EC 3.4.24.3) - kurz auch Kollagenase I bzw. Kollagenase II - unterteilt und haben Molekulargewichte zwischen 115 und 125 kDa. Weiterer Bestandteil des von Clostridium histolyticum sekretierten Enzymgemisches ist die als Heterodimer vorkommende SH-Protease Clostripain (EC 3.4.22.8) mit einem Molekulargewicht von ca. 59 kDa. Clostripain spaltet die Zielproteine spezifisch bei Arginin-Resten. Des Weiteren wird die unspezifische Neutrale Protease mit einem Molekulargewicht von ca. 34 kDa von Clostridium histolyticum sekretiert.
Da alle Proteasen von dem Bakterium in das Medium ausgeschieden werden, können sie auf diese Weise leicht von den Zellen getrennt werden. In der natürlichen Umgebung haben die Proteasen die Aufgabe, Gewebe bzw. fibrilläres Kollagen abzubauen und die freigesetzten Peptide und Aminosäuren dem Bakterium als Nährstoffquelle zugänglich zu machen.
Eines der gewerblichen Anwendungsgebiete von Kollagenasen ist die Verwendung als Biochemikalie zur in v/'iro-lsolierung von Zellen aus dem Gewebeverband. Bei dieser Zellisolierung werden in einigen Fällen neben den Kollagenasen noch die anderen Proteasen Neutrale Protease und/oder Clostripain benötigt. Optimale Ergebnisse werden aber nur dann erzielt, wenn die Proteasen, abhängig von der jeweils beabsichtigten Zellisolierung, in bestimmten Verhältnissen vorliegen. Auch für die beiden Kollagenase-Typen gilt, dass sie in Abhängigkeit von der jeweiligen Anwendung in bestimmten Verhältnissen vorliegen müssen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
Ein weiteres Anwendungsgebiet der Proteasen aus Clostridium histolyticum ist die Verwendung als biologischer Wirkstoff zur Herstellung von Arzneimitteln, unter anderem zur Behandlung von fibrotischen Strängen in der Hohlhand und an den Fingern beim Morbus Dupuytren, aber auch für verschiedene weitere Erkrankungen. Ein weiteres pharmazeutisches Einsatzgebiet dieser Proteasen ist die Verwendung in Salben für die Wundheilung; so können Kollagenasen zum Beispiel zur enzymatischen Behandlung kutaner Ulcera eingesetzt werden. Der entsprechende Wirkstoff enthält neben den Kollagenasen auch Neutrale Protease und Clostripain. Übliche Herstellungsverfahren für diesen Wirkstoff zur Wundbehandlung sehen lediglich eine Entsalzung, Konzentrierung und Trocknung des zellfreien Kulturüberstands vor. Eine Auftrennung der Enzyme findet hierbei nicht statt. Die Mengenverhältnisse der Enzyme zueinander sind somit durch die Fermentation festgelegt und können bei den aktuellen Verfahren nicht beeinflusst werden.
Da Clostridium histolyticum ein komplexes Enzymgemisch in den Kulturüberstand sekretiert, besteht die Notwendigkeit zur Abtrennung der gewünschten Zielenzyme und damit auch zu deren Aufreinigung aus dem Kulturüberstand. Aus der DE 101 34 347 Al ist ein Verfahren zur Aufreinigung von Enzymen aus einem Kulturüberstand von Clostridium histolyticum bekannt. Hierbei ist jedoch ein mehrstufiges Aufreinigungsverfahren vorgesehen, welches ausschließlich Chromatographiemateria lien auf Styrol/Divinylbenzol-Basis beziehungsweise auf Basis von keramischem Hydroxylapatit vorsieht. Zur Aufreinigung der Enzyme ist dabei ein erster Chromatographieschritt vonnöten, der den Einsatz einer mit keramischem Hydroxylapatit gefüllten Säule vorsieht. Es schließt sich ein zweiter Chromatographieschritt an, welcher in einer Anionenaustauscherchromatographie mit einer Säulenmatrix auf Styrol/Divinylbenzol-Basis besteht. Anschließend erfolgt ein dritter Chromatographieschritt, bei dem ebenfalls eine Styrol/Divinylbenzol-basierte Säulenmatrix, diesmal im Rahmen einer Kationenaustauscherchromatographie, eingesetzt wird. Insgesamt sind bei diesem Verfahren also drei chromatographische Verfahrensschritte notwendig, welche die Aufreinigung der Enzyme aus dem Kulturüberstand sehr kosten- und zeitintensiv machen.
Ein weiteres Verfahren zur Aufreinigung von Kollagenasen aus einer flüssigen Kultur des Bakteriums Clostridium histolyticum ist in der US 2011/0070622 Al beschrieben. Hierbei wird als erster Schritt eine Proteinfällung mittels Ammoniumsulfat durchgeführt. Dieser schließt sich als zweiter Schritt eine Hydrophobe Interaktionschromatographie an, gefolgt von einem dritten Aufreinigungsschritt, welcher eine Anionenaustauscherchromatographie beinhaltet. Auch bei diesem Verfahren liegt wieder eine material- und zeitaufwändige Aneinanderreihung mehrerer unterschiedlicher Verfahrensschritte vor, wobei als Resultat lediglich aufgereinigte Kollagenasen Typ I und Typ II erhalten werden, jedoch keine aufgereinigten Fraktionen von Neutraler Protease und Clostripain.
Die beschriebenen Aufreinigungsverfahren legen daher einen starken Fokus auf die beiden Kollagenasen (Typ I und Typ II). Zur Erzielung der erforderlichen Reinheit der Kollagenasen werden jeweils mindestens drei Aufreinigungsschritte benötigt. Eine Aufreinigung von Neutraler Protease und Clostripain wird bei diesen Verfahren nicht beschrieben. Für die Trennung von Kollagenase I und Kollagenase II wird bei den bekannten Verfahren ein zusätzlicher separater chromatographischer Schritt benötigt, der speziell zu diesem Zweck durchgeführt werden muss. Das hierfür verwendete Material ist bei den bekannten Verfahren in der Regel ein Anionenaustauscher.
Aufgabe der Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt also die Aufgabe zugrunde, die Nachteile aus dem Stand der Technik zu vermeiden. Es soll bevorzugt ein wirtschaftliches Verfahren zur Aufreinigung wenigstens eines Enzyms, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain, aus einem Stoffgemisch bereitgestellt werden. Insbesondere soll ein solches Verfahren zur Aufreinigung wenigstens eines Enzyms, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain, aus dem Kulturüberstand von Clostridium histolyticum bereitgestellt werden. Des Weiteren soll eine material- und zeitsparende Aufreinigung und Trennung der genannten Enzyme bereitgestellt werden. Auch ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mittels dessen sich die verschiedenen Enzyme voneinander trennen lassen, um sie anschließend in definierten Verhältnissen mischen zu können. Die Trennung der Enzyme voneinander soll bevorzugt bei hoher Ausbeute und in der erforderlichen Qualität erfolgen. Eine weitere Aufgabe ist die Reduzierung der notwendigen Arbeitsschritte zur Aufreinigung der Enzyme aus dem Kulturüberstand von Clostridium histolyticum. Es ist insbesondere eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Anzahl der chromatographischen Verfahrensschritte zur Aufreinigung und/oder Trennung der Enzyme zu reduzieren.
Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird die oben geschilderte Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Aufreinigung wenigstens eines Enzyms, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain, aus einem Stoffgemisch, umfassend als Verfahrensschritt wenigstens eine Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie die stationäre Phase ein Material umfasst, das ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Polypropylenglykol und Butyl-Sepharose. Bei allen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist es ferner bevorzugt, dass die stationäre Phase aus Polypropylenglykol oder Butyl-Sepharose besteht.
Das Trennprinzip der Hydrophoben Interaktionschromatographie beruht auf Wechselwirkungen unpolarer Oberflächenregionen von Proteinen mit einer hydrophoben stationären Phase. Diese hydrophoben Wechselwirkungen werden durch eine erhöhte Salzkonzentration in der als mobile Phase dienenden Lösung verstärkt. Die erhöhte Salzkonzentration führt dabei zu einer teilweisen Entfernung der Hydrathüllen und somit zu einem Freilegen hydrophober Bereiche der Proteine. Diese hydrophoben Oberflächenregionen der Proteine treten nun wiederum mit den hydrophoben Resten der stationären Phase in Wechselwirkung.
Bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie besteht die stationäre Phase, das heißt das Säulenmaterial, in der Regel aus Polymeren, welche durch gezielt ausgewählte unpolare funktionelle Gruppen chemisch modifiziert - also hydrophobiert - sind bzw. werden. Dabei hängen Selektivität und Kapazität der stationären Phase von Selektivität und Dichte der verwendeten funktionellen Gruppen ab. Bei der vorliegenden Erfindung hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, als Säulenmaterial Polypropylenglykol (PPG) oder Butyl-Sepharose zu verwenden. So kann als Polypropylenglykol zum Beispiel die kommerziell erhältliche Qualität PPG-600M von Tosoh Bioscience LLC als Säulenmaterial verwendet werden. Bei Verwendung von Butyl-Sepharose als Säulenmaterial können die kommerziell erhältlichen Butyl Sepharose High Performance - kurz Butyl Sepharose HP - und Butyl Sepharose Fast Flow - kurz Butyl Sepharose FF - von GE Healthcare verwendet werden. Besonders bevorzugt ist Butyl Sepharose HP.
Butyl-Sepharose (auch„Butyl-Agarose" oder„quervernetzte Butyl-Agarose" genannt) ist eine quervernetzte Agarose, bei der die Wasserstoffatome eines Teils der OH- Gruppen durch 3-n-Butoxy-2-hydroxypropyl-Reste (-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3) ersetzt und die betreffenden OH-Gruppen damit entsprechend verethert sind. Der Grad der Quervernetzung beträgt bevorzugt 1 bis 7 %, besonders bevorzugt 2 bis 6 %. Die Butyl-Sepharose liegt bevorzugt in Form von sphärischen Teilchen mit einer mittleren Partikelgröße im Bereich von 20 bis 150 pm vor, besonders bevorzugt im Bereich von 30 bis 100 pm. Für die Trennung von Kollagenase I und Kollagenase II voneinander ist eine mittlere Partikelgröße von 70 pm oder weniger bevorzugt. Besonders bevorzugt ist hierfür eine mittlere Partikelgröße von 50 miti oder weniger. Die Anzahl der 3-n-Butoxy- 2-hydroxypropyl-Reste beträgt bevorzugt 10 bis 200 mitioI, besonders bevorzugt 20 bis 100 mitioI und am meisten bevorzugt 30 bis 70 mitioI pro Milliliter Medium.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die aufgereinigten Enzyme in großer Reinheit erhalten werden. Die Enzyme sind gegenüber den hydrophoben Wechselwirkungen mit den stationären Phasen Polypropylenglykol und Butyl-Sepharose sowie gegenüber den hierfür benötigten Pufferbedingungen der mobilen Phase sehr stabil und unterliegen praktisch keinerlei Zersetzung. Besonders vorteilhaft ist hierbei, dass es zu praktisch keiner Denaturierung der aufzureinigenden Enzyme kommt, so dass diese in ihrer nativen Form und unter Erhalt ihrer biologischen Aktivität gewonnen werden. Die aufgereinigten Enzyme enthalten daher keine oder nur sehr wenige denaturierte Enzyme oder Teile davon. Dies ist sehr vorteilhaft, da denaturierte Enzyme oft nur sehr schwer von den entsprechenden nicht denaturierten Enzymen getrennt werden können, da sie oft ähnliche Retentionszeiten in der Chromatographie aufweisen wie die nicht denaturierten Enzyme. Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die aufgereinigten Enzyme daher in besonders guter Ausbeute und in hoher Reinheit erhalten. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren behalten die aufzureinigenden Proteine ihre native Form und damit auch ihre enzymatische Aktivität also im Wesentlichen bei. Sie können daher anschließend ihrer weiteren Verwendung, wie z. B. in einer pharmazeutischen oder biochemischen Zusammensetzung, zugeführt werden, für die der Erhalt der Enzymaktivität unabdingbar ist. Dies ist auch bezüglich der reproduzierbaren Qualität eines pharmazeutischen Wirkstoffs sowie der daraus hergestellten pharmazeutischen Zubereitungen von großer Bedeutung.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es ferner möglich, die oben genannten Enzyme, Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain, nicht nur von Verunreinigungen zu reinigen, sondern sie auch voneinander zu trennen. Bevorzugt ist daher ebenfalls ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Stoffgemisch wenigstens zwei Enzyme umfasst, die ausgesucht sind aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain. Ebenfalls bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Stoffgemisch wenigstens zwei Enzyme umfasst, wobei wenigstens ein Enzym ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase I und Kollagenase II und wenigstens ein Enzym ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Neutrale Protease und Clostripain. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Stoffgemisch wenigstens drei Enzyme umfasst, die ausgesucht sind aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain. Ganz besonders bevorzugt ist jedoch ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Stoffgemisch die Enzyme Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ein material- und zeitsparendes und damit kostengünstiges Verfahren dar, das in der Lage ist, die Enzyme, bei hoher Ausbeute und in der erforderlichen Qualität, herzustellen und voneinander zu trennen. Dies hat den Vorteil, dass die Zusammensetzung eines Wirkstoffs, der eines oder mehrere dieser Enzyme enthält, durch gezieltes Mischen der jeweiligen Enzyme beliebig variiert werden kann. Dies verbessert die Qualität des Wirkstoffs und führt zu neuen Wirkstoffen mit definierter Zusammensetzung und besserer Wirksamkeit.
Die Enzyme Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain werden durch das Bakterium Clostridium histolyticum exprimiert und sekretiert. Da Clostridium histolyticum ein komplexes Enzymgemisch in den Kulturüberstand sekretiert, besteht die Notwendigkeit zur Gewinnung dieser gewünschten Zielenzyme durch Aufreinigung derselben und deren Trennung voneinander. Am meisten bevorzugt ist daher ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Stoffgemisch der Kulturüberstand einer Kultur des Bakteriums Clostridium histolyticum ist. Gleichermaßen bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Stoffgemisch aus dem Kulturüberstand einer Kultur des Bakteriums Clostridium histolyticum gewonnen wurde und wenigstens ein Enzym enthält, das ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain. Besonders bevorzugt enthält das Stoffgemisch wenigstens zwei der Enzyme, ganz besonders bevorzugt wenigstens drei der Enzyme, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain. Am meisten bevorzugt enthält das Stoffgemisch alle vier Enzyme. Das Stoffgemisch kann zum Beispiel dadurch aus dem Kulturüberstand einer Kultur des Bakteriums Clostridium histolyticum gewonnen werden, indem nicht-lösliche Bestandteile abgetrennt werden, zum Beispiel durch Abzentrifugieren oder durch Abfiltrieren von Zellen, Zelldebris und anderen ohnehin nicht-löslichen Bestandteilen. Weiter können zum Beispiel Entsalzung, Umpufferung und/oder Aufkonzentrieren oder andere Verfahrensschritte durchgeführt werden, die üblicherweise zur Aufbereitung von Kulturüberständen verwendet werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, sowohl ein einzelnes als auch mehrere Zielproteine aus einem Stoffgemisch und insbesondere aus dem Kulturüberstand aufzureinigen.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass es durch das erfindungsgemäße Verfahren möglich ist, durch lediglich einen einzigen chromatographischen Verfahrensschritt das gewünschte oder die gewünschten Enzym(e) aus dem Kulturüberstand in gebrauchsfertiger Reinheit zu erhalten. Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren neben der Hydrophoben Interaktionschromatographie an Polypropylenglykol oder Butyl-Sepharose als stationärer Phase kein weiteres Chromatographieverfahren. Besonders bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren nur einen einzigen Verfahrensschritt, in dem eine Hydrophobe Interaktionschromatographie mit einer stationären Phase durchgeführt wird, die ein Material umfasst, das ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Polypropylenglykol und Butyl-Sepharose, und daneben kein weiteres Chromatographieverfahren. Diese Ausführungsform wird im Folgenden als „einstufiges Verfahren" bezeichnet. Bedarfsweise können sich jedoch auch weitere Aufreinigungsschritte an die Chromatographie anschließen oder ihr vorrausgehen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, die oben genannten Enzyme, Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain, in einem einzigen chromatographischen Schritt aufzureinigen und voneinander zu trennen. Da das entwickelte Verfahren die Enzyme in der erforderlichen Qualität in einem einstufigen Verfahren zur Verfügung stellen kann, werden die Produktionskosten deutlich gesenkt. Erstens werden für die Durchführung deutlich weniger Material und Zeit benötigt, und zweitens sind die Ausbeuten im Vergleich zu den etablierten Verfahren wesentlich höher. Darüber hinaus bietet die einstufige Aufreinigung und Trennung auch einen deutlichen Vorteil in Bezug auf die Stabilität der verschiedenen Proteasen bei der Aufreinigung von Enzymen aus Stoffgemischen, insbesondere aus Kulturüberständen. Je länger sich nämlich das Gemisch der Enzyme, die alle Proteasen sind, im selben Stoffgemisch und insbesondere in derselben wässrigen Lösung befindet, desto höher sind Risiko und tatsächliches Ausmaß eines wechselseitigen proteolytischen Abbaus und damit einer irreversiblen Destabilisierung und Inaktivierung der Enzyme. Das heißt je schneller die Proteasen möglichst vollständig voneinander separiert werden, desto höher sind die zu erwartende Ausbeute, die erzielbare Reinheit und die Stabilität der aufgereinigten einzelnen Enzyme. Insbesondere die Lagerstabilität ist erhöht. Dies ist auch bezüglich der reproduzierbaren Qualität eines pharmazeutischen Wirkstoffs sowie der daraus hergestellten pharmazeutischen Zubereitungen von großer Bedeutung.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie wenigstens eine wässrige Lösung als mobile Phase verwendet wird, die wenigstens ein Salz umfasst, das ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Ammoniumsulfat und Kaliumchlorid. Bei Verwendung solcher mobilen Phasen kann das Verfahren besonders effektiv durchgeführt werden, und die hierin beschriebenen Vorteile treten besonders deutlich auf. Insbesondere erlaubt die Verwendung dieser mobilen Phasen eine eindeutige Trennung der vier Enzyme voneinander.
Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie die stationäre Phase Polypropylenglykol umfasst und wenigstens eine wässrige Lösung als mobile Phase verwendet wird, die Ammoniumsulfat umfasst. Diese Ausführungsform ermöglicht es, die vier Enzyme in drei getrennten Fraktionen zu erhalten, wobei eine Fraktion nur das Gemisch der Kollagenasen, also ein Gemisch von Kollagenase I und Kollagenase II, enthält, eine weitere Fraktion nur die Neutrale Protease und die dritte Fraktion nur das Clostripain. Dies ist vorteilhaft, weil für viele Anwendungen das Gemisch der Kollagenasen verwendet wird, ohne dass es auf deren exaktes Mischungsverhältnis ankommt. Gleichzeitig kann diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens einfach und materialsparend durchgeführt werden. Dabei ist es ferner bevorzugt, dass die stationäre Phase aus Polypropylenglykol besteht. Ebenfalls bevorzugt ist daher ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die aufgereinigten Enzyme als ein Gemisch der Kollagenase I mit der Kollagenase II in einer Fraktion sowie Neutrale Protease und Clostripain getrennt in zwei weiteren Fraktionen erhalten werden.
Ebenfalls besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Flydrophoben Interaktionschromatographie die stationäre Phase Butyl-Sepharose umfasst und wenigstens eine wässrige Lösung als mobile Phase verwendet wird, die wenigstens ein Salz umfasst, das ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Ammoniumsulfat und Kaliumchlorid. Ganz besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie die stationäre Phase Butyl- Sepharose umfasst und wenigstens eine wässrige Lösung als mobile Phase verwendet wird, die Ammoniumsulfat umfasst. Am meisten bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie die stationäre Phase Butyl-Sepharose umfasst und wenigstens eine wässrige Lösung als mobile Phase verwendet wird, die Kaliumchlorid umfasst. Diese Ausführungsformen ermöglichen es, die vier Enzyme Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain voneinander getrennt in vier separaten Fraktionen zu erhalten. Für diese Ausführungsformen ist die Verwendung einer stationären Phase, die Butyl-Sepharose umfasst, besonders bevorzugt. Am meisten bevorzugt besteht die stationäre Phase aus Butyl-Sepharose.
Es ist also durch Anwendung des vorliegenden Verfahrens zusätzlich zur Aufreinigung der Enzyme sowohl möglich, Kollagenasen, Neutrale Protease und Clostripain voneinander zu trennen, als auch, zusätzlich zur Trennung von Neutraler Protease und Clostripain, die beiden unterschiedlichen Kollagenase-Typen (Typ I und Typ II) voneinander zu trennen. Alle diese Trennungen sind dabei in einem einstufigen Verfahren möglich.
Die Konzentrationen von Ammoniumsulfat und Kaliumchlorid in der mobilen Phase haben Einfluss auf die hydrophoben Wechselwirkungen und damit auf die Bindungseigenschaften an die jeweilige stationäre Phase. Der Fachmann kann die für die Aufreinigung und Trennung notwendige Menge dieser Salze leicht durch Vorversuche bestimmen. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie wenigstens eine mobile Phase verwendet wird, die eine Stoffmengenkonzentration von Ammoniumsulfat im Bereich von 0,3 bis 1,5 mol/l und bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 1,0 mol/l aufweist. Bevorzugt ist ebenfalls ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie wenigstens eine mobile Phase verwendet wird, die eine Stoffmengenkonzentration von Kaliumchlorid im Bereich von 1,0 bis 3,0 mol/l und bevorzugt im Bereich von 1,5 bis 2,5 mol/l aufweist.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten mobilen Phasen können auch weitere üblicherweise in mobilen Phasen verwendete Bestandteile enthalten, wie zum Beispiel weitere Salze. Als Beispiel für solche Salze seien Natriumchlorid und Calciumchlorid genannt. Soweit die mobilen Phasen Natriumchlorid enthalten, enthalten sie dieses bevorzugt in einer Stoffmengenkonzentration von 0,2 bis 5 mol/l. Soweit die mobilen Phasen Calciumchlorid enthalten, enthalten sie dieses bevorzugt in einer Stoffmengenkonzentration bis zu 50 mmol/l, besonders bevorzugt bis zu 15 mmol/l. Ferner können die mobilen Phasen Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) enthalten. Soweit die mobilen Phasen Tris enthalten, enthalten sie dieses bevorzugt in einer Stoffmengenkonzentration bis zu 60 mmol/l, besonders bevorzugt bis zu 30 mmol/l. Außerdem können die mobilen Phasen organische Lösungsmittel enthalten. Dabei handelt es sich bevorzugt um eher polare Lösungsmittel. Besonders bevorzugt handelt es sich um Alkohole, insbesondere um Isopropanol und/oder Polyole. Unter den Polyolen am meisten bevorzugt sind Glykole, und darunter sind Glykol und Propylenglykol wiederum am meisten bevorzugt. Soweit die mobilen Phasen organische Lösungsmittel enthalten, enthalten sie diese bevorzugt in Anteilen bis zu 50 Gewichtsprozent, bevorzugt bis zu 40 Gewichtsprozent und besonders bevorzugt bis zu 30 Gewichtsprozent. Der pH-Wert der mobilen Phase liegt bevorzugt im Bereich von pH 6,0 bis 9,5.
Das zu trennende Stoffgemisch wird bevorzugt mit Hilfe eines sogenannten Auftragspuffers auf stationäre Phase aufgetragen. Für die Zusammensetzung und die Eigenschaften von etwaig verwendeten Auftragspuffern gelten dieselben Ausführungen wie für die mobilen Phasen.
Die Hydrophobe Interaktionschromatographie wird bevorzugterweise mittels einer Stufenelution, einer Gradientenelution oder einer Kombination dieser beiden durchgeführt. Ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie eine Stufenelution, eine Gradientenelution oder eine Kombination dieser beiden durchgeführt wird, ist daher besonders bevorzugt. Die Stufenelution ist besonders bevorzugt für die Verwendung im Produktionsmaßstab.
Bevorzugt ist ferner ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie eine Stufenelution, eine Gradientenelution oder eine Kombination dieser beiden durchgeführt wird, wobei mindestens drei Elutionsschritte durchgeführt werden. Ein solches Verfahren ist besonders gut geeignet, um Kollagenase I, Kollagenase II oder das Gemisch der Kollagenasen von der Neutralen Protease und Clostripain zu trennen. Besonders bevorzugt ist dabei ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie mindestens drei Elutionsschritte durchgeführt werden, wobei die beiden Kollagenasen, Neutrale Protease und Clostripain voneinander getrennt werden. Hier liegen also die beiden Kollagenase-Typen (Typ I und Typ II) gemischt in einer gemeinsamen Fraktion vor, während Neutrale Protease und Clostripain in zwei weiteren Fraktionen getrennt voneinander und getrennt von den Kollagenasen vorliegen. Ebenfalls besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie mindestens drei Elutionsschritte durchgeführt werden, wobei Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain voneinander getrennt werden.
Ebenfalls bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie mindestens drei Elutionsschritte in Form einer Stufenelution, einer Gradientenelution oder einer Kombination dieser beiden durchgeführt werden, wobei die beiden Kollagenasen (Typ I und Typ II), Neutrale Protease und Clostripain voneinander getrennt werden oder wobei Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain voneinander getrennt werden. Im letzteren Fall erfolgt die zusätzliche Trennung der beiden Kollagenasen bevorzugt mittels linearem Gradienten oder durch einen zusätzlichen Elutionsschritt in Form einer Elutionsstufe. Die Elution mit mindestens drei Elutionsschritten resultiert also in einer Aufreinigung und Trennung von Kollagenasen, Neutraler Protease und Clostripain in mindestens drei Wertfraktionen.
Ebenfalls bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Flydrophoben Interaktionschromatographie eine Gradientenelution oder eine Kombination aus Gradienten- und Stufenelution durchgeführt wird, wobei mindestens drei Elutionsschritte durchgeführt werden. Besonders bevorzugt ist ein solches erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die beiden Kollagenasen, Neutrale Protease und Clostripain voneinander getrennt werden, so dass Kollagenase Typ I und Kollagenase Typ II gemischt in einer gemeinsamen Fraktion vorliegen, und Neutrale Protease und Clostripain in zwei weiteren Fraktionen getrennt voneinander und getrennt von den Kollagenasen vorliegen. Besonders bevorzugt ist ein solches erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Kollagenase Typ I, Kollagenase Typ II, Neutrale Protease und Clostripain voneinander getrennt werden.
Der erste Teilschritt bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie besteht im Aufträgen des zu trennenden Stoffgemisches auf die chromatographische Säule, was bevorzugt mit Hilfe eines sogenannten Auftragspuffers geschieht. Beim Auftragspuffer handelt es sich üblicherweise um die gezielt modifizierte, stark salzhaltige wässrige Matrix, in der das darin gelöste Stoffgemisch zur Aufreinigung und Trennung anfällt, im vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere im Rahmen der Aufarbeitung aus dem Kulturüberstand einer Kultur des Bakteriums Clostridium histolyticum. Im extrem hydrophilen Medium des Auftragspuffers kommt es zu sehr starken hydrophoben Interaktionen der Proteine mit der stationären Phase, so dass die meisten Proteine nahezu vollständig an der stationären Phase fixiert sind.
Als zweiter Teilschritt der Hydrophoben Interaktionschromatographie - und damit vor der Elution der Wertfraktionen mit den Zielproteinen, im vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren mit den Enzymen Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und/oder Clostripain - wird bevorzugt wenigstens ein sogenannter Waschschritt vorgenommen. Bei diesem Waschschritt wird die Chromatographiesäule inklusive der an die stationäre Phase gebundenen Proteine gewaschen, wobei eventuell vorhandene, eher polare bzw. hydrophile und daher nicht an die stationäre Phase gebundene, häufig niedermolekulare Verunreinigungen ausgewaschen und so von den Zielproteinen abgetrennt werden. Als sogenannter Waschpuffer wird hierzu üblicherweise eine ebenfalls stark salzhaltige wässrige Pufferlösung eingesetzt.
Auftrags- und Waschpuffer können sich dabei in ihrer Zusammensetzung unterscheiden. Es kann aber auch ein und dieselbe Pufferlösung sowohl als Auftrags- als auch als Waschpuffer verwendet werden.
An den/die Waschschritt(e) schließen sich bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie als weitere Teilschritte nun die Elutionsschritte an. Darunter sind - insbesondere auch in Bezug auf das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren - diejenigen Teilschritte zu verstehen, bei denen durch sukzessive Anpassung der Zusammensetzung der mobilen Phase (Elutionspuffer), im Falle der Hydrophoben Interaktionschromatographie insbesondere durch Reduzierung des Salzgehalts der mobilen Phase, die Wertfraktionen mit den Zielproteinen von der Säule eluiert werden. Dabei kann diese Elution stufenweise isokratisch, also in Stufen mit jeweils konstanter Zusammensetzung der mobilen Phase (Stufenelution), als Gradient, also mit sich kontinuierlich gezielt verändernder Zusammensetzung der mobilen Phase (Gradientenelution), oder als Kombination von Stufen- und Gradientenelution durchgeführt werden.
In bestimmten Konstellationen der Hydrophoben Interaktionschromatographie zeigt gegebenenfalls eines der Zielproteine weniger starke hydrophobe Wechselwirkungen mit der stationären Phase als die restlichen Zielproteine des Stoffgemisches und wird daher bereits im Auftrags- und Waschpuffer nicht mit gleicher Intensität an die stationäre Phase gebunden. In diesen Fällen kann also unter Umständen der Waschpuffer gleichzeitig als erster Elutionspuffer dienen, so dass derselbe Teilschritt der Hydrophoben Interaktionschromatographie parallel sowohl den Waschschritt als auch den ersten Elutionsschritt repräsentiert. Dabei werden dann in demselben Teilschritt zunächst die eher polaren bzw. hydrophilen, häufig niedermolekularen Verunreinigungen ausgewaschen und dann die erste Wertfraktion mit dem weniger stark gebundenen Zielprotein eluiert. In solchen Konstellationen kann durch das eingesetzte Volumen des ersten Elutionspuffers - unabhängig davon, ob dieser gleichzeitig auch als Waschpuffer fungiert - die Qualität der Abtrennung des betreffenden Zielproteins von den restlichen Zielproteinen des Stoffgemisches gesteuert werden. Dabei wird dann die verwendete Menge der mobilen Phase häufig als Anzahl des Säulenvolumens (column volume, CV) angegeben.
Dementsprechend ist es beim vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren möglich, den Gehalt von Clostripain in den entsprechenden eluierten Wertfraktionen (Elutionsfraktionen) über das eingesetzte Volumen des ersten Elutionspuffers (Clostripain-Elutionspuffer) zu steuern, da Clostripain weniger starke hydrophobe Interaktionen mit der stationären Phase zeigt als die restlichen Zielproteine des Stoffgemisches (Kollagenase I, Kollagenase II und Neutrale Protease). So führt ein großes Volumen des ersten Elutionspuffers dazu, dass Clostripain vollständig oder nahezu vollständig in einer separaten, reinen Clostripain-Fraktion eluiert wird. Wird hingegen ein geringeres Volumen des ersten Elutionspuffers verwendet, verschieben sich die Mengenverhältnisse des Clostripains in den jeweiligen Elutionsfraktionen. Dies führt dann dazu, dass nicht mehr das gesamte oder nahezu das gesamte Clostripain in einer separaten Fraktion eluiert wird, sondern dass sich das eluierte Clostripain sowohl auf eine separate, reine Clostripain-Fraktion als auch auf die jeweils nachfolgende Kollagenase-Fraktion verteilt. Damit kann über die Menge des ersten Elutionspuffers ausgewählt werden, ob Clostripain nahezu vollständig in einer separaten, reinen Clostripain-Fraktion eluiert werden soll oder ob ein Teil des Clostripains als Bestandteil der jeweils nachfolgenden Kollagenase-Fraktion eluiert werden und damit auch gemeinsam mit Kollagenase(n) in einer Fraktion anfallen soll. Im letzteren Fall kann durch die Wahl geeigneter Salzkonzentrationen der mobilen Phase bei der Elution der Kollagenasen gesteuert werden, ob der zweite Teil des Clostripains zusammen mit beiden Kollagenasen (Typ I und Typ II) in einer gemeinsamen Elutionsfraktion (Säulenmaterial Polypropylenglykol oder Butyl-Sepharose ohne zusätzliche Trennung der beiden Kollagenasetypen) oder zusammen nur mit der Kollagenase II in einer gemeinsamen Elutionsfraktion (Säulenmaterial Butyl-Sepharose mit zusätzlicher Trennung der beiden Kollagenasetypen) anfällt. Das notwendige Volumen der mobilen Phase (des ersten Elutionspuffers), das zu einer nahezu vollständigen Elution des Clostripains in einer separaten, reinen Clostripain-Fraktion und damit zu einer nahezu vollständigen Trennung des Clostripains von den Kollagenasen und der Neutralen Protease führt, hängt von der spezifischen Kombination verschiedener Faktoren (stationäre Phase, mobile Phase, Dimensionen der Säule, etc.) ab. Bevorzugt zur Separation des Clostripains ist jedoch ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Chromatographiesäule mit wenigstens 10 Säulenvolumen, besonders bevorzugt mit wenigstens 12 Säulenvolumen und am meisten bevorzugt mit wenigstens 15 Säulenvolumen des ersten Elutionspuffers eluiert wird. Bei solchen Mengen an Clostripain-Elutionspuffer wird üblicherweise das Clostripain vollständig oder nahezu vollständig aus der Säule eluiert.
Das vorliegende Verfahren erlaubt es, Kollagenase I, Kollagenase II und Gemische dieser beiden Kollagenase-Typen in einer Reinheit von wenigstens 80 %, bevorzugt von wenigstens 90 % zu erhalten, wobei die Reinheit der Kollagenasen mittels analytischer Anionenaustauscherchromatographie (z. B. unter Verwendung einer MonoQ-Säule von GE Healthcare mit Tris-Puffer als mobiler Phase bei Raumtemperatur) bestimmt wird. Ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem Kollagenase I, Kollagenase II oder Gemische dieser Kollagenasen in einer Reinheit (bestimmt wie vorstehend angegeben) von wenigstens 80 %, bevorzugt von wenigstens 90 % erhalten werden, ist daher bevorzugt. Neutrale Protease kann durch das erfindungsgemäße Verfahren in einer Reinheit von wenigstens 70 %, bevorzugt von wenigstens 80 % erhalten werden, wobei die Reinheit der Neutralen Protease mittels SDS-PAGE (nach Laemmli U. K.; Nature 227: 680-685, 1970) bestimmt wird. Ebenfalls bevorzugt ist daher ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem Neutrale Protease in einer Reinheit (bestimmt wie vorstehend angegeben) von wenigstens 70 %, bevorzugt von wenigstens 80 % erhalten wird. Clostripain kann durch das erfindungsgemäße Verfahren in einer Reinheit von wenigstens 60 %, bevorzugt von wenigstens 70 % erhalten werden, wobei die Reinheit des Clostripains mittels SDS-PAGE (nach Laemmli U. K.; Nature 227: 680-685, 1970) bestimmt wird. Ebenfalls bevorzugt ist daher ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem Clostripain in einer Reinheit (bestimmt wie vorstehend angegeben) von wenigstens 60 %, bevorzugt von wenigstens 70 % erhalten wird. Bei allen diesen Reinheitsangaben handelt es sich um Reinheitsgrade, die den Anforderungen bei Verwendung dieser Enzyme zu den meisten biochemischen und medizinischen Zwecken genügen. Ganz besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem Kollagenase I, Kollagenase II oder Gemische dieser Kollagenasen in einer Reinheit von wenigstens 80 % (bestimmt wie vorstehend angegeben), Neutrale Protease in einer Reinheit von wenigstens 70 % (bestimmt wie vorstehend angegeben) und Clostripain in einer Reinheit von wenigstens 60 % (bestimmt wie vorstehend angegeben) erhalten werden. Am meisten bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem Kollagenase I, Kollagenase II oder Gemische dieser Kollagenasen in einer Reinheit von wenigstens 90 % (bestimmt wie vorstehend angegeben), Neutrale Protease in einer Reinheit von wenigstens 80 % (bestimmt wie vorstehend angegeben) und Clostripain in einer Reinheit von wenigstens 70 % (bestimmt wie vorstehend angegeben) erhalten werden.
Diese Enzyme sind in dieser Reinheit auch in einem einstufigen Verfahren erhältlich.
Bevorzugt ist ferner ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie eine lineare Fließgeschwindigkeit von 100 bis 300 cm/h, insbesondere von 150 bis 250 cm/h verwendet wird. Diese Fließgeschwindigkeiten ergeben eine optimale Aufreinigung und Trennung der Enzyme.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugterweise keine Gelfiltrationsschritte und/oder Proteinfällungsschritte. Die Gelfiltration ist ein sehr zeitaufwändiges Verfahren, welches dadurch hohe Kosten mit sich bringt und das Risiko des Selbstverdaus der zu trennenden Enzyme erhöht. Proteinfällungsschritte, wie zum Beispiel eine Ammoniumsulfat-Fällung, können zu unerwünschten Strukturveränderungen der Proteine führen. Auch ist es durch eine Proteinfällung nicht möglich, Enzyme mit der hohen Reinheit zu erhalten, wie sie durch das vorliegende Verfahren zur Verfügung gestellt werden.
Bevorzugterweise wird mindestens ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigtes Enzym für pharmazeutische und/oder biochemische Zwecke verwendet. Pharmazeutische Zwecke beinhaltet jeglichen Einsatz eines oder mehrerer dieser Enzyme als pharmazeutischer Wirkstoff, wobei die Verwendung keinerlei Einschränkung bezüglich der Indikation, der Arzneiform/Zubereitung oder der Applikationsart unterliegt. Des Weiteren kann das Enzym bzw. können die Enzyme für biochemische Zwecke, wie zum Beispiel die in v/'iro-Zellisolation, eingesetzt werden. Ebenfalls bevorzugterweise wird mindestens ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigtes Enzym für kosmetische Zwecke verwendet. Die Verwendung des Enzyms oder der Enzyme erstreckt sich damit ebenfalls auf die Verwendung zu rein kosmetischen Zwecken, also eine kosmetische Verwendung in Abgrenzung zu einem therapeutischen Zweck.
Die Erfindung schließt auch ein Enzym selbst ein, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird. Darüber hinaus schließt die Erfindung auch Zusammensetzungen ein, die mindestens ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenes Enzym umfassen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigten Enzyms für pharmazeutische, kosmetische und/oder biochemische Zwecke.
Beschreibung von bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren
Nach erfolgter Kultivierung von Clostridium histolyticum in einem geeigneten Fermentationsmedium werden die Zellen und sonstige nicht-lösliche Bestandteile beispielsweise durch Zentrifugieren und/oder Filtration vom Kulturüberstand abgetrennt. Der Kulturüberstand, der die Enzyme Kollagenase I, Kollagenase II, Neutrale Protease und Clostripain enthält, kann - vor der Aufreinigung und Trennung dieser Proteine durch Flydrophobe Interaktionschromatographie - in üblicher Weise aufkonzentriert werden.
Zur Aufreinigung und Trennung der Enzyme aus dem Kulturüberstand wird dann eine Flydrophobe Interaktionschromatographie (H IC) durchgeführt. Dazu wird der zellfreie und gegebenenfalls in geeigneter weise aufkonzentrierte Kulturüberstand z. B. auf eine mit Polypropylenglykol (PPG) und/oder Butyl-Sepharose gefüllte Chromatographiesäule aufgetragen, wobei die Enzyme - neben anderen Komponenten - an das Säulenmaterial binden. Nach Auswaschen nicht gebundener Moleküle erfolgt die Elution der zunächst gebundenen Bestandteile, darunter die Zielproteine, in einem gepufferten System im pFI-Bereich von 6,0 bis 9,5 bei einer linearen Flussrate von 100 bis 300 cm/h mittels Stufenelution, Gradientenelution oder einer Kombination dieser beiden, wobei der Salzgehalt sukzessive reduziert wird. Die Elution der Proteine wird vorzugsweise in drei oder mehr Elutionsschritten durchgeführt. Dabei können drei Wertfraktionen erhalten werden, wobei eine Fraktion die Kollagenasen (Typ I und Typ II) gemeinsam enthält, eine weitere Fraktion Neutrale Protease enthält und die dritte Fraktion Clostripain enthält (Trennung an PPG oder Butyl-Sepharose). Bei Chromatographie an Butyl-Sepharose ist eine zusätzliche Trennung der beiden Kollagenasen (Typ I und Typ II) voneinander möglich. Diese Trennung wird dann bevorzugt mit einer Kombination aus Stufen- und Gradientenenlution in mindestens drei Elutionsschritten oder mit einer vierstufigen Elution durchgeführt. Dementsprechend erhält man vier Wertfraktionen, wobei - wie zuvor - eine Fraktion Neutrale Protease enthält und eine weitere Fraktion Clostripain enthält. Die Kollagenasen werden nun aber getrennt voneinander in einer dritten Fraktion, die Kollagenase I enthält, und einer separaten vierten Fraktion, die Kollagenase II enthält, gewonnen.
Die einzelnen Elutionsfraktionen können nun mittels üblicher Verfahren, wie zum Beispiel einem Tangentialfluss-Filtrationsverfahren (TFF), entsalzt und/oder aufkonzentriert werden. Anschließend kann das anfallende Material mittels ebenfalls üblicher Verfahren, z. B. Gefriertrocknung, lyophilisiert werden. Bedarfsweise können sich auch weitere Aufreinigungsschritte anschließen.
Ein Flussdiagramm des gesamten Prozesses ist im folgenden Schema 1 gezeigt. Je nach verwendeter Variante ergeben sich somit drei oder vier verschiedene Endprodukte, die dann für die gewünschte weitere Verwendung oder Weiterverarbeitung, insbesondere auch eine gezielte und definierte Mischung mehrerer dieser Endprodukte, zur Verfügung stehen.
Konzentrat Kulturüberstand
H IC-Chromatographie
Entsalzung/Aufkonzentrierung
Lyophilisation
Endprodukte Schema 1: Flussdiagramm des entwickelten Aufreinigungsverfahrens
Je nach verwendeter stationärer Phase und mobiler Phase (Art und Menge der Salze in der mobilen Phase) kann mit diesem Verfahren daher beispielsweise Folgendes erreicht werden:
Durch den Einsatz von PPG als Säulenmaterial und Ammoniumsulfat (0,3 - 1,5 mol/l, insbesondere 0,5 - 1,0 mol/l) als Salz wird eine Trennung von Kollagenasen, Neutraler Protease und Clostripain erreicht, wobei die beiden Kollagenase-Typen (Typ I und Typ II) gemischt in einer gemeinsamen Fraktion vorliegen, während Neutrale Protease und Clostripain in zwei weiteren Fraktionen getrennt voneinander und getrennt von den Kollagenasen vorliegen. Durch die Verwendung von Butyl-Sepharose als Säulenmaterial mit Kaliumchlorid (1,0 - 3,0 mol/l, insbesondere 1,5 - 2,5 mol/l) als Salz wird eine zusätzliche Trennung der Kollagenasen in Kollagenase I und Kollagenase II ermöglicht. Das gleiche wird erreicht bei Verwendung von Butyl-Sepharose als Säulenmaterial mit Ammoniumsulfat (0,3 - 1,5 mol/l, insbesondere 0,5 - 1,0 mol/l) als Salz.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Abbildung 1: Chromatogramm der Aufreinigung und Trennung des Konzentrats des
Kulturüberstands an Polypropylenglykol (PPG-600M) mit Darstellung der Fraktionen enthaltend Clostripain (F2 - F5), Kollagenasen (F6) und Neutrale Protease (F7).
Abbildung 2: MonoQ-Chromatogramm der Kollagenase-Wertfraktion (äquivalent zu
Fraktion F6 in Abbildung 1) nach Beladung der Polypropylenglykol (PPG- 600M)-Säule in der FllC-Chromatographie mit unterschiedlichen Mengen (gemessen in volumenspezifischer PZ-Aktivität nach Wünsch) des Konzentrats des Kulturüberstands.
Abbildung 3: SDS-PAGE der Kollagenase-Wertfraktion nach Trennung an
Polypropylenglykol (PPG-600M) (äquivalent zu Fraktion F6 in Abbildung 1).
M: Markerproteine; K: Probenauftrag Konzentrat (vor
Aufreinigung/Trennung); Kol: Kollagenase-Wertfraktion (F6) Abbildung 4: SDS-PAGE der Neutrale Protease-Wertfraktion nach Trennung an Polypropylenglykol (PPG-600M) (äquivalent zu Fraktion F7 in Abbildung 1).
M: Markerproteine; K: Probenauftrag Konzentrat (vor
Aufreinigung/Trennung); NPf: Neutrale Protease-Wertfraktion (F7) nach Chromatographie; NPe: Neutrale Protease nach Aufkonzentrieren von F7 zum lyophilisierten Endprodukt
Abbildung 5: Chromatogramm der Aufreinigung und Trennung des Konzentrats des
Kulturüberstands an Butyl-Sepharose (Butyl Sepharose HP) mit Darstellung der - im Vergleich zu Abbildung 1 - zusätzlichen Auftrennung von Kollagenase I und Kollagenase II.
Abbildung 6: MonoQ-Chromatogramm zur vergleichenden Analyse der jeweiligen
Kollagenase-Wertfraktionen nach Aufreinigung und Trennung des zellfreien, aufkonzentrierten Kulturüberstands mittels HIC- Chromatographie.
A: Kollagenase-Wertfraktion nach Trennung an Polypropylenglykol (PPG- 600M) (Verfahrensvariante 1); B: Kollagenase Typ Il-Wertfraktion nach Trennung an Butyl-Sepharose (Butyl Sepharose HP) (Verfahrensvariante 2); C: Kollagenase Typ I-Wertfraktion nach Trennung an Butyl-Sepharose (Butyl Sepharose HP) (Verfahrensvariante 2)
Abbildung ?: SDS-PAGE zum Vergleich einer derzeit marktüblichen, über mehrere
Chromatographieschritte aufgereinigten Kollagenase (Ka) mit der nach der erfindungsgemäßen Verfahrensvariante 2 in einem Chromato graphieschritt gewonnenen Kollagenase (Kn).
M: Markerproteine
Ausführungsbeispiele
Alle in den Beispielen verwendeten mobilen Phasen, Auftragspuffer, Waschpuffer und Elutionspuffer, sind wässrige Lösungen. Im Folgenden sind jeweils die vollständigen Inhaltsstoffe der verwendeten mobilen Phasen angegeben. Beispiel 1
Eine Kultur von Clostridium histolyticum wurde unter Verwendung eines geeigneten Nährmediums in Flüssigkultur nach Standardmethoden bis zur gewünschten Zelldichte kultiviert. Nach Abtrennung der Zellen mit üblichen Methoden, wie beispielsweise Zentrifugation und/oder Filtration, wurde die Flydrophobe Interaktionschromatographie des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt. Dazu wurde eine mit Polypropylenglykol (PPG-600M, Tosoh Bioscience LLC) gefüllte Chromatographiesäule (Betthöhe ca. 20 cm) mittels einer mobilen Phase (wässrige Lösung, 0,85 mol/l Ammoniumsulfat, 20 mmol/l Tris, 7 mmol/l CaCh, pH 7,5) equilibriert. Nach dem Aufträgen des zellfreien, aufkonzentrierten Kulturüberstands wurde die Säule mit 10 Säulenvolumen (CV) der gleichen mobilen Phase gewaschen. Die Elution der Zielproteine erfolgte mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 250 cm/h in drei Elutionsstufen. Die erste Wertfraktion wurde durch isokratische Elution mit der vorgenannten mobilen Phase erhalten und enthielt das Clostripain. Die zweite Fraktion wurde durch isokratische Elution mit einer weiteren mobilen Phase (wässrige Lösung, 0,2 mol/l Ammoniumsulfat, 20 mmol/l Tris, 7 mmol/l CaCh, pH 7,5) erhalten und enthielt die Kollagenasen (Kollagenase I und Kollagenase II). Die dritte Fraktion wurde durch isokratische Elution mit einer dritten mobilen Phase (wässrige Lösung, 12 % (m/m) Propylenglykol, 20 mmol Tris, 7 mmol CaCh, pH 7,5) erhalten und enthielt die Neutrale Protease.
In Abbildung 1 ist ein Chromatogramm der vorstehend beschriebenen Aufreinigung und Trennung des zellfreien, aufkonzentrierten Kulturüberstands mittels Hydrophober Interaktionschromatographie an PPG-600M als Säulenmaterial gezeigt. In der Abbildung sind die Wertfraktionen der drei verschiedenen Produkte mit den entsprechenden Elutionsbereichen dargestellt. Clostripain eluiert in den Teilfraktionen F2 bis F5, die Kollagenasen in Fraktion F6 und Neutrale Protease in Fraktion F7. Die Kollagenase-Fraktion (F6) enthält beide Kollagenasen (Typ I und Typ II) zu etwa gleichen Teilen.
Abbildung 2 zeigt die Analyse der Kollagenase-Wertfraktion nach Trennung an PPG- 600M (äquivalent zu Fraktion F6 in Abbildung 1) mittels MonoQ-Chromatogrammen. Dargestellt ist die mit verschiedenen Säulenbeladungen in der HIC-Chromatographie erhaltene Qualität (Beladung gemessen in volumenspezifischer PZ-Aktivität nach Wünsch E., Heidrich H.-G.; Z. Physiol. Chem. 333: 149-151, 1963). Hierbei wird eine Probe der jeweiligen Kollagenase-Werfraktion unter Verwendung einer MonoQ-Säule analysiert (Säule: MonoQ 5/20 GL, GE Healthcare; Auftragspuffer: wässrige Lösung, 10 mmol/l Tris, 2 mmol/l CaCh, pH 7,5; Elutionspuffer: wässrige Lösung, 10 mmol/l Tris, 2 mmol/l CaC , 1 mol/l NaCI, pH 7,5; Gradientenelution). Damit können jeweils sowohl die Reinheit als auch der Gehalt der Kollagenase-Typen sowie deren Verhältnis zueinander bestimmt werden. Wie den Chromatogrammen zu entnehmen ist, enthält die erhaltene Kollagenase-Fraktion unabhängig von der Beladung der PPG-Säule neben den beiden Kollagenase-Typen nur geringe Verunreinigungen. Das Verfahren ist somit reproduzierbar und robust. Für die Reinheit der Kollagenase-Fraktion wurde ein Wert von > 90 % bestimmt (siehe Abbildungen 2 und 3).
Da für die Kollagenase I derzeit kein aussagekräftiger Aktivitätsassay verfügbar ist, wurden deren Qualität und Quantität mittels MonoQ-Analytik bewertet. Wie Abbildung 2 ausweist, sind bei der MonoQ-Analytik der Kollagenase I-Fraktion keine signifikanten Abbauprodukte zu erkennen, und das Enzym entspricht somit der Qualität der auf dem Markt verfügbaren Produkte.
Abbildung 3 zeigt eine SDS-PAGE der Kollagenase-Wertfraktion nach Trennung an PPG- 600M (äquivalent zu Fraktion F6 in Abbildung 1). Diese wurde nach dem Protokoll von U. K. Laemmli mit einem 14 %igen Tris-Glycin-Gel (Anamed) durchgeführt und mit Coomassie (Coomassie R-250, Invitrogen) gefärbt (Laemmli U. K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4; Nature 227: 680-685, 1970). In der linken, mit M bezeichneten Bahn sind Markerproteine (Novex Markl2, Invitrogen) aufgetragen. Bei der mittleren, mit K bezeichneten Bahn handelt es sich um den zellfreien, aufkonzentrierten Kulturüberstand vor Aufreinigung und Trennung. In der rechten Bahn (Kol) wurde die Kollagenase-Wertfraktion F6 aus Abbildung 1, enthaltend Kollagenase I und Kollagenase II, aufgetragen. Die Abbildung zeigt somit einen direkten Vergleich der Reinheit der Kollagenasen vor und nach Aufreinigung und Trennung an der PPG-Säule. Obwohl die Kollagenase-Proteine nur über eine Chromatographiesäule aufgereinigt und separiert wurden, liegt die Reinheit der Kollagenase-Wertfraktion bei > 90 %. Abbildung 4 zeigt eine entsprechende SDS-PAGE der Neutrale Protease-Wertfraktion nach Trennung an PPG-600M (äquivalent zu Fraktion F7 in Abbildung 1). Auf die linke, mit M bezeichnete Bahn wurden wieder die Markerproteine aufgetragen. Bei der mittleren, mit K bezeichneten Bahn handelt es sich erneut um den zellfreien, aufkonzentrierten Kulturüberstand vor Aufreinigung und Trennung. In der mit NPf bezeichneten der beiden rechten Bahnen wurde die Neutrale Protease-Wertfraktion F7 aus Abbildung 1 direkt nach Aufeinigung und Trennung an der PPG-Säule aufgetragen. Die mit NPe bezeichnete der beiden rechten Bahnen zeigt das für die vergleichende Analytik wieder gelöste Neutrale Protease-Endprodukt, das zuvor aus F7 durch Entsalzen, Aufkonzentrieren und Lyophilisieren (Gefriertrocknung) erhalten worden war. Aus Abbildung 4 ist ersichtlich, dass auch die Neutrale Protease nach Aufreinigung und Trennung an der PPG-Säule eine hohe Reinheit von deutlich > 80 % aufweist. Dies ist wesentlich höher als die Reinheit der aktuell auf dem Markt verfügbaren Neutrale Protease-Produkte.
Tabelle 1 zeigt die jeweilige relative Ausbeute an enzymatischer Aktivität nach Aufreinigung und Trennung der Enzyme aus dem zellfreien, aufkonzentrierten Kulturüberstand mittels Flydrophober Interaktionschromatographie an PPG-600M als Säulenmaterial. Für die entsprechende Ausbeute der Kollagenase II wurden mehrfach Werte von > 90 % bestimmt.
Tabelle 1: Relative Ausbeute an enzymatischer Aktivität nach Aufreinigung und Trennung der Enzyme (Ergebnisse aus mehreren Versuchen)
a: bestimmt nach Wünsch E., Heidrich H.-G.; Z. Physiol. Chem. 333, 149-151, 1963 b: bestimmt nach Mitchell W. M., Harrington W. F.; Methods Enzymol. 19: 635-642,
1970
c: bestimmt nach Moore S., Stein W. H.; J. Biol. Chem. 176: 367-388, 1948
d: Ein Anteil geht beim Waschschritt mit der Waste-Fraktion verloren.
Eine besondere Eigenschaft des entwickelten Prozesses ist, dass sich die Verteilung des Clostripains zwischen einer separaten, reinen Clostripain-Fraktion (umfassend die Teilfraktionen F2 bis F5 in Abbildung 1) und der Kollagenase-Fraktion (Fraktion F6 in Abbildung 1) darüber steuern lässt, mit wie viel Säulenvolumen (CV) des ersten Elutionspuffers (Clostripain-Elutionspuffer) die Chromatographiesäule eluiert wird. Ein diesbezügliches Volumen ab ca. 12 CV führt bis zu ca. 80 % Ausbeute des gesamten Clostripains in der separaten, reinen Clostripain-Fraktion bei entsprechenden Verlusten mit der Abfallfraktion beim Waschschritt und nur noch sehr geringem Clostripain-Anteil in der Kollagenase-Fraktion. Ein diesbezügliches Volumen von ca. 4 CV führt hingegen zu einer Verteilung des gesamten Clostripains zu ca. 40 % in die separate, reine Clostripain- Fraktion und ca. 40 % in die nachfolgende Kollagenase-Fraktion, wiederum bei entsprechenden Verlusten mit der Abfallfraktion beim Waschschritt (siehe Tabellen 1 und 2).
Tabelle 2: Abhängigkeit des Anteils an Clostripain in der Kollagenase-Wertfraktion vom Volumen des ersten Elutionspuffers (Clostripain-Elutionspuffer)
Beispiel 2
Eine Kultur von Clostridium histolyticum wurde unter Verwendung eines geeigneten Nährmediums in Flüssigkultur nach Standardmethoden bis zur gewünschten Zelldichte kultiviert. Nach Abtrennung der Zellen mit üblichen Methoden, wie beispielsweise Zentrifugation und/oder Filtration, wurde die Flydrophobe Interaktionschromatographie des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt. Dazu wurde eine mit Butyl-Sepharose (Butyl Sepharose High Performance, kurz Butyl Sepharose HP, GE Healthcare) gefüllte Chromatographiesäule (Betthöhe 20 cm) mittels einer mobilen Phase (wässrige Lösung, 2 mol/l KCl, 20 mmol/l Tris, 7 mmol/l CaCh, pH 9) equilibriert. Nach dem Aufträgen des zellfreien, aufkonzentrierten Kulturüberstands wurde die Säule mit 4 Säulenvolumen (CV) der gleichen mobilen Phase gewaschen und isokratisch eluiert. Die Elution der Zielproteine erfolgte dabei mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 250 cm/h. Der sich anschließende zweite Elutionsschritt erfolgte als Gradient über 20 CV mit linear fallender Salzkonzentration ausgehend von der vorstehend genannten mobilen Phase bis zum Zielpuffer (wässrige Lösung, kein KCl (0 mol/l), 20 mmol/l Tris, 7 mmol/l CaCh, pH 9). Die dabei erhaltene erste Wertfraktion enthielt das Clostripain. Die zweite Fraktion enthielt die Kollagenase II. Die dritte Fraktion enthielt die Kollagenase I. Die vierte Fraktion wurde durch einen dritten Elutionsschritt durch isokratische Elution mit 5 CV einer weiteren mobilen Phase (wässrige Lösung, 25 % (m/m) Propylenglykol, 20 mmol Tris, 7 mmol CaCh, pH 9) erhalten und enthielt die Neutrale Protease.
In Abbildung 5 ist ein Chromatogramm der vorstehend beschriebenen Aufreinigung und Trennung des zellfreien, aufkonzentrierten Kulturüberstands mittels Hydrophober Interaktionschromatographie an Butyl Sepharose HP als Säulenmaterial gezeigt. Dargestellt ist - im Vergleich zu Abbildung 1 - die zusätzliche Auftrennung in Kollagenase I und Kollagenase II, wobei der erste diesbezügliche Hauptpeak Kollagenase II und der zweite diesbezügliche Hauptpeak Kollagenase I entspricht.
Abbildung 6 zeigt die vergleichende MonoQ-Analyse der jeweiligen Kollagenase- Wertfraktionen nach Aufreinigung und Trennung des zellfreien, aufkonzentrierten Kulturüberstands mittels unterschiedlicher Varianten der Hydrophoben Interaktionschromatographie. A zeigt die Kollagenase-Wertfraktion nach Trennung an PPG-600M als Säulenmaterial (Verfahrensvariante 1). B stellt die Kollagenase Typ II- Wertfraktion nach Trennung an Butyl Sepharose HP als Säulenmaterial dar (Verfahrensvariante 2). C zeigt die Kollagenase Typ I-Wertfraktion nach Trennung an Butyl Sepharose HP als Säulenmaterial (Verfahrensvariante 2). Man erreicht hier also in einem Verfahrensschritt eine Qualität an Reinheit und ggf. Trennung, wofür bei den bekannten Verfahren drei und mehr Verfahrensschritte benötigt werden.
Abbildung 7 zeigt eine SDS-PAGE nach Silberfärbung (Argent Quick Silver Staining Kit, Anamed). Auf der linken, mit M bezeichneten Bahn wurden wieder die Markerproteine aufgetragen. Daneben sind zum direkten Vergleich eine derzeit marktübliche, über mehrere Chromatographieschritte aufgereinigte„klassische" Kollagenase (mittlere, mit Ka bezeichnete Bahn) und eine Kollagenase, welche mittels einer Variante des erfindungsgemäßen einstufigen Aufreinigungsverfahrens gewonnen wurde (rechte, mit Kn bezeichnete Bahn), dargestellt. Aus der Abbildung ist ersichtlich, dass die Reinheit der mit dem erfindungsgemäßen einstufigen Verfahren gewonnenen Kollagenasen mindestens genauso hoch ist wie die der „klassischen", derzeit marktüblichen Kollagenase. Bedingt durch das einstufige Verfahren liegt zudem die Ausbeute mit > 80 % deutlich über der Ausbeute der etablierten Verfahren.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Aufreinigung wenigstens eines Enzyms, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase Typ I, Kollagenase Typ II, Neutrale Protease und Clostripain, aus einem Stoffgemisch, umfassend als Verfahrensschritt wenigstens eine Hydrophobe Interaktionschromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie die stationäre Phase ein Material umfasst, das ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Polypropylenglykol und Butyl-Sepharose.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie wenigstens eine wässrige Lösung als mobile Phase verwendet wird, die wenigstens ein Salz umfasst, das ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Ammoniumsulfat und Kaliumchlorid.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie die stationäre Phase Polypropylenglykol umfasst.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine wässrige Lösung als mobile Phase verwendet wird, die Ammoniumsulfat umfasst.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, insbesondere nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie die stationäre Phase Butyl-Sepharose umfasst.
6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Stoffgemisch wenigstens zwei Enzyme umfasst, die ausgesucht sind aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase Typ I, Kollagenase Typ II, Neutrale Protease und Clostripain.
7. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Stoffgemisch ein Kulturüberstand von Clostridium histolyticum ist.
8. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie wenigstens eine mobile Phase verwendet wird, die eine Stoffmengenkonzentration von Ammoniumsulfat im Bereich von 0,3 bis 1,5 mol/l aufweist.
9. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie wenigstens eine mobile Phase verwendet wird, die eine Stoffmengenkonzentration von Kaliumchlorid im Bereich von 1,0 bis 3,0 mol/l aufweist.
10. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie eine Stufenelution, eine Gradientenelution oder eine Kombination dieser beiden durchgeführt wird.
11. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie eine Stufenelution durchgeführt wird, wobei mindestens drei Elutionsschritte durchgeführt werden.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Kollagenasen, Neutrale Protease und Clostripain voneinander getrennt werden, so dass Kollagenase Typ I und Kollagenase Typ II gemischt in einer gemeinsamen Fraktion vorliegen und Neutrale Protease und Clostripain in zwei weiteren Fraktionen getrennt voneinander und getrennt von den Kollagenasen vorliegen.
13. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Kollagenase Typ I, Kollagenase Typ II, Neutrale Protease und Clostripain voneinander getrennt werden.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie eine Gradientenelution oder eine Kombination aus Gradienten- und Stufenelution durchgeführt wird, wobei mindestens drei Elutionsschritte durchgeführt werden.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Kollagenasen, Neutrale Protease und Clostripain voneinander getrennt werden, so dass Kollagenase Typ I und Kollagenase Typ II gemischt in einer gemeinsamen Fraktion vorliegen und Neutrale Protease und Clostripain in zwei weiteren Fraktionen getrennt voneinander und getrennt von den Kollagenasen vorliegen.
16. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Kollagenase Typ I, Kollagenase Typ II, Neutrale Protease und Clostripain voneinander getrennt werden.
17. Verwendung mindestens eines nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 aufgereinigten Enzyms für pharmazeutische Zwecke.
18. Verwendung mindestens eines nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 aufgereinigten Enzyms für kosmetische und/oder biochemische Zwecke.
19. Enzym, erhalten gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
20. Zusammensetzung umfassend mindestens ein Enzym gemäß Anspruch 19.
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