DE3022914A1 - Verfahren zurgewinnung eines anaphylatoxin und cocytotaxin enthaltenden leukotaxinpraeparates sowie von anaphylatoxin und cocytotaxin in molekular einheitlicher form - Google Patents

Verfahren zurgewinnung eines anaphylatoxin und cocytotaxin enthaltenden leukotaxinpraeparates sowie von anaphylatoxin und cocytotaxin in molekular einheitlicher form

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Josef Dipl.-Chem. Dr. 6350 Bad Nauheim Wissler
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Description

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Die Zerstörung von körpereigenem Gewebe bei Entzündungen, welche durch nicht-immunologische und/oder durch immunologische Prozesse verursacht werden, führt zur Bildung verschiedener endogener Substanzen (Mediatoren und Hormone). Sie regulieren die komplexen Einzelschritte der Aktivierung
^ des Entzündungs- und des Gewebereparaturprozesses. Die Mediatoren entstehen entweder durch begrenzte und regulierte Proteolyse von Plasma- oder Serumfaktoren als humorale Mediatoren, oder sie werden durch aktive Sekretion und/oder Zellyse aus Zellen und Geweben als zelluläre Mediatoren
^ freigesetzt. Sie sind Teil des Körperabwehrsystems, dessen systemische und lokale Aktivierung sie mitregulieren. Sie tragen dadurch zur Entfernung und Entgiftung der zerstörten körpereigenen Stoffe und/oder der eingedrungenen Fremdkörper bei. Ferner ermöglichen sie durch Regulierung der Zelltei-
2^ lungs- und Gewebewachstumsprozesse bei der Wundheilung die Wiederherstellung der physiologischen Funktionen des Organismus. Wie die klassischen Hormone endokriner Drüsen sind auch die Entzündungsmediatoren Stoffe, die nur in sehr geringer Konzentration als Spuren im Gewebe oder im Blut vorhanden sind.
Bei der Aktivierung des Kinin-, des Koagulations- und des Komplementsystems sowie anderer Blutprotein- und Zellfaktoren entsteht eine Vielzahl von Mediatoren, die für die ver-
schiedenartigsten biologischen Aktivitäten des aktivierten Serums verantwortlich sind, unter anderem für die chemische Anlockung von Leukozyten (Leukotaxis), sowie für Immunadhärenz und Spasmen glatter Muskelgewebe. . zu den Proteinen des Blutes; die durch limitierte Proteolyse von Plasma-
und Serumfaktoren mit der Komplementaktivierung entstehen,
gehören Anaphylatoxin und Cocytotaxin. Sie spielen bei der L J
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chemischen Anlockung von Leukozyten eine wichtige Rolle.
Anaphylatoxin hat darüberhinaus auch pharmakologische Eigenschaften bzw. kardiovaskuläre Wirkungen auf Grund seiner spasmogenen Wirkungen auf Muskelzellen. 5
Anaphylatoxin wurde nach Behandlung von Serum mit Antigen-Antikörper-Komplexen entdeckt; vgl. E. Friedberger, Z. Immunitätsforsch. 4 (1910), S. 636. Es wird als eines der Bruchstücke der Komplementkomponente C5 (C5a) angesehen, mit dem es viele Gemeinsamkeiten hinsichtlich seiner biologischen Aktivitäten hat.; vgl. J. Jensen, Science 155 (1967), S. 1122. Der chemische Beweis dieser Identität steht noch aus. Die Entstehung von Anaphylatoxin und anderen. Mediatoren kann durch Kontaktreaktion von Säugerserum mit verschiedenen hydrophilen, unlöslichen, hochmolekularen Stoffen, wie Dextran und Hefe, sowie insbesondere u.a. auch mit bakteriellen Endotoxinen (Lipopolysacchariden) induziert werden. Die Anwendung solcher modifizierter Sera in vivo und in vitro induziert verschiedenartige biologische Wirkungen. Dazu gehören die typi-
2^ sehen Anaphylatoxinwirkungen und Reaktionen, die ähnlich oder vergleichbar mit bestimmten Immun- und Nichtimmunprozessen in vivo sind, die bei Allergien und Gewebever'letzungen auftreten. Insbesondere gehören zu diesen biologischen Reaktionen die Freisetzung von Histamin, der lethale Anaphylatoxinschock beim Meerschweinchen, die Kontraktion der glatten Muskulatur und die chemotaktische Aktivität für neutrophile und eosinophile Leukozyten.
Ein 10-stufiges Verfahren zur Gewinnung von Anaphylatoxin aus mit Dextran behandeltem Ratten-, Schweine- und Meerschweinchenserum wurde von J.H. Wissler in Eur. J. Immunol. 2 (1972), S. 73 - 96 und in Int. Arch. Allergy 32 (1972), S. 722 bis -747 beschrieben. Nach diesem bekannten Verfahren erfolgt die Abtrennung des Anaphylatoxins von den begleitenden Fremdproteinen durch Chromatographie an Hydroxylapatit. Dabei wird zunächst die Anaphylatoxin enthaltende Proteinfraktion des
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mit Dextran inkubierten Serums mit einem Kationenaustauscher vom Serumüberstand abgetrennt. Das die Proteine enthaltende Eluat des Ionenaustauschers wird mit Ammoniumsulfat konzentriert. Sodann wird ein Teil der Fremdstoffe einschließlich eines geringen Teils der Begleitproteine vor der Chromatographie an Hydroxylapatit durch Behandeln mit Calciumphosphatgel entfernt. An die Chromatographie an Hydroxylapatit schließen sich zur weiteren Reinigung des Produktes in diesem bekannten Verfahren weitere Stufen der Molekular-Siebchromatographie, Ionenaustauscherchromatographie an Hydroxylapatit und Gelpermeationschromatographie an. Das Anaphylatoxin wird schließlich kristallin in molekular homogenem Zustand erhalten.
Das durch Chromatographie an Hydroxylapatit von den übrigen Proteinen des Serums abgetrennte Proteinpräparat wurde bei der weiteren Reinigung nach dem vorstehend genannten Verfahren in zwei Hauptkomponenten aufgetrennt. Das eine der dabei erhaltenen Proteine besitzt die Wirkungen des Anaphylatoxins.
Beispielsweise bewirkt es die Freisetzung von Histamin und die Erzeugung des lethalen Anaphylatoxinschocks durch Kontraktion der glatten Muskulatur. Dieser, nach dem bekannten Verfahren in kristallinem Zustand gewonnene Stoff (Anaphylatoxin) hat jedoch keine nennenswerte chemotakti Aktivität für neutrophile Leukozyten, welche bei der Kontaktaktivierung des Rohserums mit der Anaphylatoxinwirkung zusammen mit anderen Aktivitäten entsteht.
Das zweite erhaltene Protein, das die Bezeichnung "Cocytotaxin11 erhielt, wird nach diesem Verfahren ebenfalls in reinem kristallinem Zustand erhalten; vgl. J.H. Wissler, Eur. J. Immunol. 2 (1972), S. 84 - 89. Cocytotaxin ist in seinen physikalisch-chemischen Eigenschaften dem Anaphylatoxin ähnlich. Es besitzt jedoch keine Anaphylatoxin-Wirksamkeit. Cocytotaxin allein zeigt auch keine nennenswerte chemotaktische Aktivität für neutrophile Leukozyten.
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Die Wiedervereinigung von Anaphylatoxin und Cocytotaxin in verschiedenen Molverhältnissen führt in vitro wieder zu chemotaktischer Aktivität für neutrophile Leukozyten. Anaphylatoxin und Cocytotaxin stellen demnach zusammen ein Leukotaxinpräparat dar. Sowohl die getrennten Proteine Anaphylatoxin und Cocytotaxin als auch.das die beiden Stoffe enthaltende Leukotaxinpräparat sind wertvolle Stoffe mit einem breiten Anwendungsbereich in Pathologie und Immunologie. Beispielsweise können sie zur Erzeugung gewünschter Entzündungen mit selektiver Zusammensetzung der Leukozytenpopulationen z.B. an Tumoren verwendet werden. Ferner können sie zur Erzeugung in statu nascendi der von Leukozyten am Entzündungsort produzierten zellspezifisch wirkenden Zellteilungsanregungs- und -hemmstoffe dienen. Schließlich können sie zur Erhöhung in statu nascendi des Immunstatus am Ort der Gewebsverletzung oder am Ort eines Tumors durch Sekretion von Immunpotentiatoren nach Anlockung und Ansammlung bestimmter Zellpopulationen von Leukozyten verwendet werden.
Allgemein bestehen Reinigungsverfahren für Eiweißkörper (Proteine) und andere Naturstoffe aus einer Sequenz kombinierter Trennungsverfahren, welche Molekülgrößen-, Ladungs-, Form-, Strukturstabilitäts- und Moleküloberflächenbeschaffenheitsunterschiede zwischen dem gesuchten Naturstoff und den begleitenden Fremdstoffen zur Trennung ausnutzen. Dementsprechend können zahlreiche Kombinationen verschiedenster Trennungsverfahren zur Reinigung eines Proteins erarbeitet werden. Für die Handhabungseigenschaften, technische Ausführbarkeit, Automatisierbarkeit und Wirtschaftlichkeit eines Reinigungsverfahrens sowie für die Qualität des gesuchten Naturproduktes ist deshalb nicht allein die Art der verwendeten Trennungsschritte von Bedeutung, sondern insbesondere deren optimierte Gestaltung und deren sinnvolle Kombination in einer Reinigungssequenz innerhalb der Rahmens der Strukturstabilität und der anderen Strukturparameter des gesuchten Stoffes. Das heißt auch, daß selbst die Benutzung glei-
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eher oder ähnlicher Trennungsprinzipien (z.B. Molekularsiebfiltration, Dialyse, Ionenaustauschadsorptionen, usw.), aber in unterschiedlicher Kombination für die Handhabungsfähigkeit und Wirtschaftlichkeit des Reinigungsverfahrens entscheidend sein können. In bestimmten Fällen ist die Benutzung oder Unterlassung einer einzigen Technik (z.B. Hydroxylapatitchromatographie, Zonenpräzipitationschromatographie, usw.) an einer bestimmten Stelle der Reinigungssequenz, oder innerhalb einer begrenzten Teilsequenz, von ausschlaggebender Bedeutung für die Qualität des gesuchten Naturproduktes sowie für die Handhabungsfähigkeit und die Wirtschaftlichkeit seines Reinigungsverfahrens. Klar aufgezeigt werden diese allgemeinen Zusammenhänge und Grundprinzipien der Naturstoffreinigung beispielsweise an der allgemein bekannten Tatsache, daß in einem wirtschaftlich vernünftigen und technisch handhabungsfähigen Naturstoffreinigungsverfahren ein Dialyse- oder Lyophilisierschrit't nicht sinnvoll ist, bevor das Ausgangsvolumen des Naturstoffrohextraktes nicht auf mindestens 1/500 bis 1/1000 durch andere Verfahrensschritte reduziert wurde.
Wie bereits erwähnt, handelt es sich bei den Mediatoren, zu denen Anaphylatoxin und Cocytotaxin gehören, um Spurenstoffe, die nur in sehr geringer Menge im Serum vorkommen. 100 Liter kontaktaktiviertes Serum (entsprechend 250 - 300 Liter Blut) enthalten etwa 7 bis 8 kg Protein neben anderen Stoffen. Nur etwa 0,3 bis 1,5 g davon (je nach Spezies und Art der Kontaktreaktion) sind Anaphylatoxin und etwa die 2- bis 3-fache Menge davon Cocytotaxin, wovon maximal je 10 bis 20 % isoliert werden können, da jeder Reinigungsversuch komplex ist und nur in beschränkter Ausbeute verläuft. Voraussetzung für die praktische Verwertung dieser Proteine ist ihre Isolierung in nennenswerten Mengen. Dazu müssen also sehr große Blutvolumina aufgearbeitet werden.
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Das vorstehend erwähnte bekannte Verfahren eignet sich dazu nicht. Zwar ist die Anwendung von Hydroxy!apatit für die strukturschonende Reingewinnung dieser Proteine von entscheidender Bedeutung. Aus technischen und wirtschaftlichen Gründen. ist es aber nicht möglich, größere Proteinvolumina an Hydroxylapatitsäulen zu Chromatographieren. Einerseits neigt nämlich Hydroxylapatit bei größeren Proteinvolumina sehr stark zur Verstopfung und wird dadurch unbrauchbar. Andererseits ist Hydroxylapatit teuer, was
seinem Einsatz in größerem Maßstab entgegensteht. Die im bekannten Verfahren durchgeführte Abtrennung von einem Teil der begleitenden Fremdproteine durch Ad sorption an Calciumphosphatgel bewirkt zwar eine etwa lOprozentige Verminderung des Fremdstoffgehaltes. Diese Verminderung ist jedoch viel zu gering, bzw. das noch verbleibende Proteinvolumen, das auf Hydroxylapatit aufgebracht werden muß, ist noch viel zu groß, um eine Verarbeitung größerer Blutmengen wirtschaftlich zu ermöglichen. Nach dem bekannten Verfahren kann in günstigsten Fällen nur eine Volumenverminderung von 1000 ml Serum auf minimal etwa 25 ml Protein vor dem Aufbringen auf Hydroxylapatit erreicht werden.
Ein weitetes Verfahren zur Gewinnung von Anaphylatoxin wurde von M. Lieflander u. Mitarb, in Hoppe-Seyler·s Z. Physiol.
Chem. 353 (1972), S. 385 - 392 beschrieben. Die Abtrennung des Anaphylatoxins von den Fremdproteinen erfolgt dabei durch wiederholte Kationenaustauscherchromatographie und Molekularsiebfiltration kombiniert mit Lyophilisier- und Dialyseschritten. Ein Teil der Schritte wird in organischen Lösungs-
^Q mitteln und in nicht gepufferter Säurelösung durchgeführt. Eine Modifikation dieses Verfahrens wurde von E.H. Vallota und H.J. Müller-Eberhard in J.Exp. Med. 137 (1973), S. 1109 bis 1123, und H.N. Fernandez u. Mitarb, in J. Immunol. 12O (1978), S. 109 - 115 beschrieben, wobei ein weiterer Kationen- und zusätzlich ein Anionenaustauscher ^Chromatographieschritt durchgeführt werden. Schließlich wurde, von C. Gerard und T.E. Hugli in
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J. Biol. Chem. 251 (1979), S. 6346 - 6351 eine weitere Modifikation dieser Verfahren zur Gewinnung von Anaphylatoxin vorgeschlagen. Dabei wird das aktivierte Rohserum auf den pH-Wert 0 eingestellt (1 η HCl). Es sollen 65 % der Fremdproteine ausgefällt werden (experimentelle Daten sind nicht beschrieben). Die verbleibende Proteinfraktion wird durch eine Molekularsiebfiltration, eine Kationenaustauscherpos it ivadsorptions- und eine Anionenaustauschernegativadsorptionschromatographie weiter gereinigt.
Auch die vorstehend erwähnten bekannten Verfahren eignen sich nicht zur wirtschaftlichen Gewinnung von Anaphylatoxin in Mengen, wie sie für eine praktische Verwertung Voraussetzung sind, da der Einsatz großer Serumvolumina zu große und unhandliche Säulenkapazitäten und kaum zu handhabende Dialyse- und Lyophilisierungsschritte verlangen würde. In der Tat sind diese Verfahren auch nur für den Gebrauch von relativ kleinen Serumausgangsvolumina konzipiert und publiziert (0,5 bis maximal 10 Liter kontaktaktiviertes Serum). Außerdem besitzen diese Verfahren den Nachteil, daß infolge von drastischen, unphysiologischen Bedingungen (organische, nicht wäßrige Lösungsmittel; pH-Wert 0) eine irreversible Schädigung der Proteinstrukturen nicht auszuschließen ist; vgl. J.H. Wissler in Proc. Immunosymposium Wien 1973, Springer Verlag Wien 1975, S. 91 - 105. Die Gewin nung von Cocytotaxin und die Abtrennung verbleibender restli cher Spurenverunreinigungen anderer Fremdproteine, welche elektrophoretisch kaum, aber chromatographisch nachweisbar sind, ist in diesem Verfahren nicht vorgesehen; vgl.
H.N. Fernandez et al. a.a.O. sowie M.C. Conroy et al. in J. Immunol. 116 (1976), S. 1682 - 1687.
Der. Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung eines Anaphylatoxin und Cocytotaxin enthaltenden Leukotaxinpräparates sowie von Anaphylatoxin und Cocytotaxin in molekular einheitlicher Form aus kontaktaktiviertem
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Serum von Säugern zur Verfügung zu stellen, das in einfacher, automatisierbarer und wirtschaftlicher Weise die schonende Aufarbeitung großer Mengen Serum gestattet und damit die Gewinnung nennenswerter Mengen dieser Proteine in natürlicher, nicht geschädigter Struktur ermöglicht. Die Erfindung geht aus von einem Verfahren zur Gewinnung eines Anaphylatoxin und Cocytotaxin enthaltenden Leukotaxinpräparates sowie von Anaphylatoxin und Cocytotaxin in molekular einheitlicher Form aus kontaktaktiviertem Serum von Säugern durch - Abtrennen der Proteine von den anderen Bestandteilen des Serums,
- Abtrennen eines Teils der begleitenden Fremdproteine von Anaphylatoxin und Cocytotaxin in dem erhaltenen Proteinkonzentrat,
- Gewinnen des Leukotaxinpräparates durch Chromotographie an Hydroxylapatit
- und gegebenenfalls weiteres Reinigen und/oder Auftrennen des Leukotaxinpräparates in Anaphylataxin und Cocytotaxin durch chromatographische Methoden.
Die Lösung der der Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe ist dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Verfahren der vorstehend genannten Art vor der Chromatographie an Hydroxylapatit einen Großteil der begleitenden Fremdproteine aus dem erhaltenen Proteinkonzentrat durch fraktioniertes Eluieren und/oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol und/oder mindestens eine Molekularsiebfiltration abtrennt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die schonende Aufarbeitung großer Mengen von Serum und damit die Gewinnung nennenswerter Mengen an Anaphylatoxin und Cocytotaxin in rascher und wirtschaftlicher Weise. Da erfindungsgemäß der weitaus größte Teil der begleitenden Fremdproteine vor der für die Produktqualität kritischen
Chromatographie an Hydroxylapatit abgetrennt wird und somit nur ein kleiner Bruchteil (in bevorzugten Ausführungsformen weniger als etwa 0,09 %) der gesamten Proteinmenge des Serums auf den Hydroxylapatit gebracht werden muß, kann
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ein Ansatz mit beispielsweise mindestens 100 bis 200 Liter kontaktaktiviertem Serum begonnen werden (ca. 300 bis 600 Liter Blut). Ausgehend von beispielsweise 100 Liter kontaktaktiviertem Serum kann das Proteinvolumen, in dem praktisch noch die Gesamtmenge an Anaphylatoxin und Cocytotaxin enthalten ist, vor dem Aufbringen auf den Hydroxy1-apatit auf weniger als etwa 100 bis 200 ml, d.h. um einen Faktor von kleiner als 1/500 bis 1/1000, verringert werden. Außerdem ermöglicht das Verfahren die Gewinnung der gewünschten Mediatoren in ihrer nativen Konformation.
Das Verfahren zur Gewinnung eines Anaphylatoxin und Cocytotaxin enthaltenden Leukotaxinpräparates sowie von Anaphylatoxin und Cocytotaxin wird nachstehend im einzelnen erläutert.
A. Erzeugung von Anaphylatoxin und Cocytotaxin im Serum und Abtrennen der gesamten Proteinfraktion von den übrigen Bestandteilen des Serums
Die Erzeugung von Anaphylatoxin und Cocytotaxin im Serum, beispielsweise durch Kontaktaktivierung, die Abtrennung der gesamten Proteinfraktion von den übrigen Bestandteilen des Serums mit Hilfe eines Kationenaustauschers, die Eluierung der adsorbierten Proteinfraktion aus dem Ionenaustauscher und die Konzentrierung der Proteine im erhaltenen Eluat durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat wird im wesentlichen in bekannter Weise durchgeführt; vgl. J.H. Wissler, Eur. J. Immunol. 2 (1972), S. 73 - 83.
Ausgangsmaterial für die Gewinnung des Anaphylatoxin und Cocytotaxin enthaltenden Leukotaxinpräparates-sowie von Anaphylatoxin und Cocytotaxin (im folgenden werden die zu gewinnenden Stoffe der Kürze halber stets nur . noch mit AT und CT bezeichnet) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist das Serum von Säugern. Der leichten Verfügbarkeit wegen ist das Serum von Mensch, Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Hund,Katze, Kaninchen, Ratte oder Meerschweinchen bevorzugt. Das Serum wird auf übliche Weise durch Koagulieren . ... von Blut und Abtrennen des Blutkuchens, beispielsweise durch Filtration
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und/oder Zentrifugieren, gewonnen und sodann zur Erzeugung von AT und CT beispielsweise mit Dextran, Hefe oder mit einen lirinunkomplex in üblicher Weise inkubiert. Nach ausreichender Inkubationszeit, die bei Verwendung von Dextran z.B. etwa 1 Stunde bei 37°C beträgt, wird das inkubierte Serum zweckmäßigerweise auf eine Temperatur von etwa O bis 80C abgekühlt. Der unlösliche, zur Inkubierung zugesetzte Stoff wird danach vom inkubierten Serum abgetrennt.
Das inkubierte, AT und CT enthaltende Serum wird nun zur Abtrennung der Proteine von den übrigen Serumbestandteilen mit einem Kationenaustauscher behandelt. Als Kationenaustauscher eignen sich hierfür beispielsweise mit Epichlorhydrin vernetzte Dextrane (Sephadex). Bevorzugt wird ein schwach saurer
'^ Kationenaustauscher wie CM-Sephadex C-50 verwendet und die Behandlung bei einem pH-Wert von 4 bis 6 durchgeführt. Das inkubierte Serum kann zur Erleichterung der Beladung vor der Behandlung mit dem Kationenaustauscher mit einer Proteine nicht schädigenden Salzlösung verdünnt werden, die gleichzei-
tig der Einstellung des pH-Wertes dienen kann. Ein spezielles Beispiel für eine derartige Salzlösung ist eine O,001 mol/1 Kaliumphosphat-Acetatpufferlösung mit einem Gehalt von 0,2 mol/1 NaCl und einem pH-Wert von 4,5.
Der Kationenaustauscher wird dem Serum in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, um die Hauptproteinfraktion des Serums zu adsorbieren. Üblicherweise genügt dazu etwa 1 Volumenteil gequollener Ionenaustauscher pro Volumenteil Serum. Sodann wird die überstehende Flüssigkeit von dem mit den Proteinen belade-
nen Kationenaustauscher, beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Der beladene Kationenaustauscher wird durch Waschen, mit Wasser oder einer Salzlösung, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 6 und einer Temperatur von vorzugsweise höchstens etwa 150C von anhaftenden,
nicht adsorbierten Serumbestandteilen befreit. Ein spezielles Beispiel für eine zum Auswaschen geeignete Salzlösung ist die erwähnte Kaliumphosphat-Acetatpufferlösung vom pH-Wert 4,5.
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Der vom Serum befreite, mit den Proteinen beladene Kationenaustauscher wird nun mit einer Proteine nicht schädigenden wäßrigen Salzlösung eluiert. Vorzugsweise wird hierzu eine Salzlösung hoher Ionenstärke mit einem pH-Wert von etwa 4 bis 10 verwendet. Spezielle Beispiele für derartige Salzlösungen sind eine wäßrige 0,5 mol/1 Kaliumphosphatlösung vom pH-Wert 6,5 bis 7,5 oder eine 2 bis 5 mol/1 Natriumchloridlösung vom gleichen pH-Wert.
Das erhaltene, die Serumproteine enthaltende Eluat wird nun zur nachfolgenden Auftrennung der Proteine konzentriert. Dieses Konzentrieren (Abtrennen des Großteils der wäßrigen Salzlösung von den Proteinen) kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise können die Proteine durch Einstellt len des Eluats auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 3,7 mol/1 vollständig ausgefällt werden. Hierzu wird Ammoniumsulfat in einer Menge von etwa 630 g/Liter Eluat zugesetzt (Sättigung etwa 90 %). Der pH-Wert wird dabei vorzugsweise auf etwa 4 bis 9 gehalten. Die ausgefällten Proteine 2^ werden dann beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren von dem praktisch proteinfreien überstand abgetrennt.
Die Konzentrierung des Kationenaustauscher-Eluats kann auch nach einem anderen Verfahren, beispielsweise durch Ultrafiltration oder Lyophilisieren, vorgenommen werden. Diese Verfahren sind jedoch zeitraubender und relativ teuer. In diesem Fall muß aber das erhaltene Proteinkonzentrat zur weiteren Behandlung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3,7 mol/1
^ gebracht werden.
B) Abtrennung des überwiegenden Teils der begleitenden Fremdprοte ine
Nach dem bekannten Verfahren (J.H. Wissler,Eur. J. Immunol. 2 (1972), S. 73 - 83) konnten aus dem in
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^ Stufe Ά erhaltenen Proteinkonzentrat begleitende Fremdproteine neben anderen Stoffen, wie Lipide, von dem zu isolierenden AT und CT nur zu einem sehr geringen Teil (höchstens etwa 5 - 10 %) durch Adsorption an Calciumphosphatgel abgetrennt werden. Das danach verbliebene konzentrierte Proteinvolumen, aus dem die gewünschten Stoffe durch Chromatographie an Hydroxy!apatit gewonnen werden sollten, war deshalb im Verhältnis noch sehr groß, so daß absolut nur eine kleine Menge Serum aufgearbeitet werden konnte. Außerdem war der dazu notwendige Dialyseschritt für größere Volumina schwer zu handhaben und führte leicht zu Produktverlusten .
Ein hervorragendes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht deshalb darin, daß es erstmals gelingt, einen überwiegenden Teil (in bevorzugten Ausführungsfonren mehr als 99,91 %) der begleitenden Fremdproteine von AT und CT vor der Durchführung der für die Reinigung und Produktqualität kritischen Chromatographie an Hydroxylapatit abzutrennen. Dadurch kann vor dieser Verfahrensstufe eine entscheidende Verminderung der zu behandelnden Proteinmenge erreicht werden. Die Abtrennung der Fremdproteine aus dem Proteinkonzentrat erfolgt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durch fraktioniertes Eluieren und/ oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol und/oder mindestens eine Molekularsiebfiltration.
Bereits durch einmalige Durchführung eines der erf in'durigs.gemäßen Reinigungsverfahren kann eine beträchtliche Menge an Begleitproteinen abgetrennt und eine befriedigende Belastungsverminderung der Hydroxylapatitsäule erreicht werden. Beispielsweise werden im physiologischen pH-Bereich durch eine fraktionierte Eluierung etwa 3O %, durch eine Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol etwa 60 bis 70 % oder durch eine Molekularsiebfiltration fcris zu 90 % der begleitenden Fremdproteine abgetrennt. Da jedoch die in dem Konzentrat enthaltenen Proteine trotz ihres verschiedenen Molekularge-
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wichtS häufig sehr stark aneinander haften und deshalb beispielsweise in der Molekularsiebfiltration durch Bestehen nichtidealer Gleichgewichte bei Proteinpolyelektrolyten nicht immer vollständig entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden, empfiehlt es sich, mindestens zwei der genannten Trennverfahren hintereinander durchzuführen. Vorzugsweise wird das Proteinkonzentrat deshalb z.B. zunächst fraktioniert eluiert und danach einer Molekularsiebfiltration unterzogen, oder es wird zunächst eine Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol und danach eine Molekularsiebfiltration durchgeführt. Bevorzugt sind ferner Kombinationen aus fraktioniertem Eluieren und/oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol mit mindestens einer präparativen und einer analytischen Molekularsiebfiltration. Alle diese Kombinationen der erwähn-
^5 ten Trennschritte sind Gegenstand der Erfindung, wobei es zum Kenntnisstand des Fachmanns gehört, daß bestimmte Folgen von Trennschritten weniger sinnvoll sind als andere Kombinationen. Beispielsweise ist dem Fachmann bewußt, daß bei Durchführung einer präparativen Molekularsiebfiltration nach einer analyti-
, Molekularsiebfiltration _ , . _
sehen/neben der unhandlichen Verfahrensweise in Bezug auf die Trennwirkung ein schlechteres Gesamtergebnis erhalten wird als bei umgekehrter Reihenfolge.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen aus folgenden Kombinationen der Trennverfahren:
a) eine fraktionierte Eluierung, gefolgt von zwei präparativen und zuletzt einer analytischen Molekularsiebfiltration;
b) eine fraktionierte Eluierung, gefolgt von einer Fällung
° mit einem wasserlöslichen Alkohol, danach einer präparativen und zuletzt einer analytischen Molekularsiebfiltration;
c) eine Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol, gefolgt
von einer oder- zwei präparativen und zuletzt einer analyti-
sehen Molekularsiebfiltration.
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Die Durchführung der einzelnen Trennverfahren zur Abtrennung des Großteils der begleitenden Fremdproteine von AT und CT nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nachstehend im einzelnen erläutert.
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Bei der fraktionierten Eluierung des Proteinkonzentrates wird - nahezu unabhängig vom Molekulargewicht - der Teil der Fremdproteine aus dem Konzentrat entfernt, der bei höheren Ammoniumsulfatkonzentrationen löslich ist als AT und CT.
Dieses Trennverfahren läßt sich deshalb besonders vorteilhaft in einem schnellen und kapazitätsmäßig nicht beschränkten Eintopfverfahren zusammen mit der Herstellung des Proteinkonzentrates durchführen. Falls mehrere Trennschritte nacheinander angewendet werden, wird die fraktionierte EIuierung aus diesen Gründen bevorzugt als erster durchgeführt.
Vor der fraktionierten Eluierung muß das zu behandelnde Proteingemisch auf eine Ammoniumsulfatkonzentration gebracht werden, die zur Fällung aller Proteine ausreicht. Eine solehe Lösung hat einen Ammoniumsulfatgehalt von etwa 3,7 mol/1, (bei O bis 8°C), d.h. sie ist zu etwa 90 % gesättigt. Die Einstellung auf diesen Ammoniumsulfatgehalt erfolgt beispielsweise am Ende der Abtrennung der gesamten AT und CT enthaltenden Proteinfraktion aus dem Serum.
Die Konzentrierung des Kationenaustauschereluates wird entweder direkt durch Ausfällung der Proteine mit Ammoniumsulfat vorgenommen, oder das Konzentrat wird, falls es nach einem anderem Verfahren, wie Ultrafiltration oder Lyophilisierung, aus dem Eluat erhalten wurde, anschließend mit Ammoniumsulfat bis zur angegebenen Konzentration versetzt.
Für die fraktionierte Eluierung wird die Ammoniumsulfatkonzentration des Proteinkonzentrates sodann durch Zugabe einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit auf etwa 2,6 mol/1 eingestellt. Als Proteine nicht schädigende Flüssigkeit kann Wasser oder vorzugsweise eine gepufferte Salzlösung ver-
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^ wendet v/erden. Vorzugsweise wird dabei ein pH-Wert von. etwa 4 bis 8,5 und eine Temperatur von etwa 0 bis 8°C eingehalten. Ein spezielles Beispiel für eine geeignete Salzlösung ist eine 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,1 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von 6,3 aufweist. Bei Verwendung von Wasser oder einer- (ammoniumsulfatfreien) Salzlösung sind für die gewünschte Erniedrigung der Ammoniumsulf atkonzentration etwa 0,4 Volumenteile pro Volumenteil
Proteinkonzentrat erforderlich.
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Die Ammoniumsuifatkonzentration der erhaltenen Aufschlämmung darf nicht wesentlich unter etwa 2,6 mol/1 eingestellt werden, weil sonst auch AT und CT aufgelöst würden. Andererseits ist aber auch eine Einstellung auf eine höhere Ammoniumsul-
^ fatkonzentratior. als etwa 2,6 mol/1 unzweckmäßig, weil dann weniger Fremdproteine in Lösung gehen und die Wirksamkeit der fraktionierten Eluierung geringer wird. Die Aufschlämmung wird, um eine vollständige Lösung der bei der eingestellten Ammoniumsuifatkonzentration löslichen Fremdproteine zu erreichen, einige Zeit, vorzugsweise etwa 10 bis 24 Stunden, vorzugsweise unter Rühren, bei den angegebenen Temperatur- und pH-Bedingungen gehalten. Anschließend wird der verbliebene Proteinniederschlag vom überstand, beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren, abgetrennt.
Die fraktionierte Eluierung ist im Prinzip eine umgekehrte fraktionierte Fällung. Deshalb ist es grundsätzlich auch möglich, diesen Reinigungsschritt als fraktionierte Fällung durchzuführen. Hierzu wird das Kationenaustauschereluat
statt auf eine Ammoniumsuifatkonzentration von etwa 3,7 mol/1 nur auf eine Ammoniumsuifatkonzentration von etwa 2,6 mol/1 gebracht. Die dabei ausgefallene, AT und CT enthaltende Proteinfraktion wird vom löslichen überstand abgetrennt.
Dem Fachmann auf dem Gebiet der Proteinfraktionierung ist
aber bekannt, daß die fraktionierte Eluierung wegen der Kinetik von Fällungsgleichgewichten häufig ein wesentlich selektiveres Trenn-
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verfahren mib höheren Ausbeuten darstellt als die fraktionierte Fällung. Dies gilt auch für die AT- und CT-Fraktionierung.
Bei der Fällung begleitender Fremdproteine mit einem wasserlöslichen Alkohol wird zur Abtrennung eines Teils der Fremdproteine von AT und CT die Tatsache ausgenützt, daß ein Teil der Fremdproteine, nicht aber AT und CT, unter bestimmten Bedingungen durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkohols zu der Proteinlösung ausgefällt werden. Da bei der Alkoholfällung ebenso wie bei der fraktionierten Eluierung ein Großteil der Begleitproteine unabhängig von ihrem Molekulargewicht von AT und CT abgetrennt wird, wird dieser Trennschritt vorzugsweise im Anschluß an die fraktionierte Eluierung oder anstelle dieses Reinigungsschrittes durchgeführt. Dadurch v.Tird,- wenn anschließend eine Molekularsiebfiltration durchgeführt wird, die dabei verwendete Säule in beträchtlichem MaS entlastet.
Die Behandlung mit einem Alkohol wird bei einem pH-Wert von etwa 3,5 bis 5,5, vorzugsweise von etwa 4,0 und einer Temperatur von höchstens etwa 80C, vorzugsweise höchstens etwa 50C durchgeführt. Die Einhaltung des angegebenen pH-Bereichs ist von Bedeutung, da bei niedrigeren pH-Werten eine Schädigung der zu isolierenden Proteine eintreten kann ■ und bei höheren pH-Werten die Wirksamkeit der Fällung geringer ist. Durch Einstellung des pH-Wertes im angegebenen Bereich allein wird jedoch noch keine Fällung der Fremdproteine erreicht.
Der wasserlösliche Alkohol wird in einer Menge von etwa 180 bis 250, vorzugsweise etwa 200 Vo lumen teilen, pro 100O Vo Iu:- menteile Proteinlösung zugegeben. Bei geringeren Alkoholmengen kann eine vollständige Fällung nicht erreicht werden, während eine höhere Alkoholkonzentration keine stärkere Fällungswirkung besitzt, aber die Gefahr einer Schädigung der zu isolierenden Mediatoren durch Konformationsumwandlung mit sich bringt. Spezielle Beispiele für geeignete wasserlösliche Alkohole sind Methanol, Äthanol, Propanol und Äthylenglykol.
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bringt. Spezielle Beispiele für geeignete wasserlösliche Alkohole sind Methanol, Äthanol, Propanol und /ithylenglykol. Vorzugsweise wird als wasserlöslicher Alkohol /Ithanol verwendet.
Zur Durchführung der Alkohol fällung wLrd da." (aramoniumsulfathaltige) Proteinkom;entrat aus dem Kationenaustauschereluat oder der Proteinrückstand der fraktionierten Eluierung in einem möglichst kleinen Volumen einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit gelöst. Είη spezielles Beispiel für eine geeignete Lösung ist 0,01 rnol/1 Ammoniumacetatlösung, die 0,2 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von 5,0 aufweist. Danach wird der pH-Wert der Lösung beispielsweise mit Eisessig auf den angegebenen Bereich eingestellt und der Alkohol zugesetzt. Zur Ausfällung der Frerudproteine wird die Lösung sodann,.vorzugsweise unter Rühren, einige Zeit bei den
1^ angegebenen Bedingungen gehalten. Die ausgefällten Fremdproteine werden danach, beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren, von dem AT und CT gelöst enthaltenden Überstand abgetrennt. Der Alkohol kann dann beispielsweise durch Dialyse, Ultrafiltration oder Lyophilisieren aus der verbliebenen Proteinlösung abgetrennt werden. Wird nachfolgend zur weiteren Reinigung von AT und CT ein Molekularsiebfiltrationsschritt angewendet, so wird der Alkohol direkt ohne die vorgenannten Hilfsmethoden aufgrund seines niedrigen Molekulargewichtes (46 Daltons für C„HrOH) von AT und CT (ca. 10 000 Daltons) abgetrennt.
Die Molekularsiebfiltration bewirkt eine Auftrennung der Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht. Da ein überwiegender Teil der Fremdproteine ein höheres Molekularge-ου wicht als AT und CT aufweist, kann ihre Abtrennung auf diese Weise erreicht werden. Für die Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht wird ein hydrophiles, in Wasser quellendes Molekularsieb verwendet. Beispiele für geeignete Molekularsiebe sind mit Epichlorhydrin vernetzte Dextrane (Sephadex), mit Acrylamid vernetzte Agarosen (Ultrogele) und raumvernetzte Acrylamide (Biogele), deren Ausschlußgrenzen größer als die zur Auftrennung verwendeten Separationsgrenzen sind.
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Die Molekularsiebfiltration wird, falls mehrere Trennstufen zur Anwendung kommen, vorzugsweise nach einer fraktionierten Eluierung und/oder Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol durchgeführt. Bei dieser Verfahrensweise wird bereits ein Teil der Fremdproteine aus allen Molekulargewichtsbereichen durch die vorangehenden Trennstufen entfernt und die Menge der durch das Molekularsieb aufzutrennenden Proteine ist deshalb bereits wesentlich geringer. Je nach dem Längen-Durchmeser-Verhältnis der verwendeten Säule und dem Teilchendurchmesser der Gelmatrix wird die Molekularsiebfiltration als "präparativ" oder "analytisch" bezeichnet. Sie wird als "präparativ" bezeichnet, wenn die Chromatographie an Säulen mit einem Dimensionsverhältnis Länge : Durchmesser bis 10:1 und einer Beladung von bis zu 1/3 des Säuleninhalts bzw. unter voller Ausnutzung des gesamten, matrizentypischen Separationsvolumens durchgeführt wird. "Analytisch" bedeutet ein Längen-Durchmesser-Verhäitnis über 10:1, vorzugsweise etwa 50:1 und eine Beladung bis maximal 3 % des Säuieninhaltes.
Bei der präparativen Molekularsiebchromatographie werden Gelmatrizen mit möglichst großer Teilchengröße benutzt, um schnelle Durchflußraten der oft etwas viskosen Proteinlösungen bei möglichst niedrigen Drucken zu erzielen. Bei der analy tischen Molekularsiebfiltration wird die Teilchengröße der Gelmatrix so klein wie möglich gewählt, um eine maximale theoretische Bodenzahl der Säule bei technisch und sicherheitsmäßig vertretbarem Druck und einer Flußgeschwindigkeit der mobilen Phase von 2 bis 4 cm/h zu erreichen. Diese Parameter sind .von der Gelmatrixstruktur abhängig und von Gel zu Gel verschieden.
Falls mehrere präparative Molekularsiebfiltrationen nacheinander' durchgeführt werden, kann die Separationsgrenze abgestuft gewählt werden. Beispielsweise kann in einem ersten
Filtrationsschritt eine Separationsgrenze von 20 000 Daltons und in einem zweiten Schritt eine Separationsgrenze von
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13 000 Daltons eingestellt v/erden. Daran anschließend kann eine analytische Molekularsiebfiltration mit Separationsgrenzen von 11 000 und 6 000 Daltons durchgeführt werden. Die Ausschlußgrenze des verwendeten Gels muß jedenfalls größer als etwa 10 000 Daltons sein, um eine Volumenverteilung von AT (MG etwa 9500) und CT (MG etwa 8500) zwischen der stationären Gelmatrixphase und der mobilen wäßrigen Pufferphase zu ermöglichen. AT vom Meerschweinchen besitzt ein etwas höheres Molekulargewicht von etwa 14 000 Daltons. Separations- und Ausschlußgrenze müssen bei der Aufarbeitung von Meerschweinchenseruu! deshalb entsprechend den VolumenVerteilungen an den Gelmatrizen höher eingestellt werden.
Die "Ausschlußgrenze" bezeichnet den hydrodynamischen Parameter eines gelösten Teilchens, welcher der Porengröße der Gelmatrix entspricht. Teilchen mit größerem hydrodynamischen Parameter können nicht mehr in die Gelmatrix eindringen (VolumenverteiJungskoeffizient K = 0)· Die "Separationsgrenze" bezeichnet einen zur Trennung von gelösten Teilchen zweckmäßigerweise festgesetzten hydrodynamischen Parameter, der zwischen einem Volumenverteilungskoeffizienten K=O und K = 1, liegt.
Zur Molekularsiebfiltration werden die Proteine gelöst in einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit auf das Molekularsieb aufgebracht. Ein spezielles Beispiel für ein geeignetes Lösungsmittel ist 0,01 mol/1 liatriumkaliumphosphatlösung mit einem Gehalt von 0,3 mol/1 NaCl und einem pH-Wert von 6,5. Nach der Filtration werden die AT und CT enthaltenden Fraktionen gesammelt. Die darin enthaltenen Proteine werden. vorzugsweise durch Einstellen auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3,7 mol/1 (90 % Sättigung) konzentriert. Nach dem Abtrennen vom überstand werden sie wieder in einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit gelöst und gegebenenfalls einem weiteren Reinigungsschritt unterzogen.
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Zwischen den vorstehend erläuterten Reinigungsschritten kann die Proteinlösung im Bedarfsfall durch Dialyse oder Ultrafiltration, beispielsweise gegen Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, von unerwünschten Salzen gereinigt werden. Dazu kann auch eine Molekularsiebfiltration durch Wahl der entsprechenden mobilen Phase in üblicher Weise modifiziert angewendet werden. Bei den Molekularsiebfiltrationen wird der Proteinlösung vorzugsweise etwa 0,4 mol/1 Mimoniuiusulfat zugesetzt. Im Gegensatz zu höheren Konzentrationen hat das Ammoniumsulfat in dieser Konzentration einen starken Einsalzeffekt gegenüber Proteinen. Durch diese Maßnahmen werden demnach die Proteine während der Molekularsiebfiltration in Lösung gehalten. Ferner verhindert Ammoniumsulfat das bakterielle Wachstum und hemmt gewisse Enzyme. Dadurch trägt es zur Stabilisierung von AT und CT bei, vor allem wenn die Chromatographie bei höheren Temperaturen (über etwa 200C) und unter nicht sterilen Bedingungen durchgeführt wird. Zur Oxidationsverhinderung wird die Proteinlösung vorzugsweise ferner mit etwa 0,001 mol/1 Cystein versetzt.
Die Temperatur und pH-Bedingungen sind bei der Durchführung der Molekularsiebfiltration nicht besonders kritisch. Wenn die Erhaltung der nativen Konformation der Proteine beabsichtigt ist, empfiehlt sich die Einhaltung einer Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 80C,- vorzugsweise etwa 0 bis 4°C. Der bevorzugte pH-Bereich liegt dabei zwischen 6 und 9.
Durch Anwendung der vorstehend erläuterten Trennverfahren kann erfindungsgemäß ein Großteil der begleitenden Fremdproteine von
den zu isolierenden Mediatoren AT und CT bereits vor der Chromatographie an Hydroxylapatit abgetrennt werden. Beispielsweise kann nach einer der bevorzugten Ausführungsformen durch fraktionierte Eluierung, zweimalige präparative und eine analytische Molekularsiebfiltration das Volumen der aufzutrennenden Proteine ausgehend von 100 Liter Serum = etwa 35 Liter Proteinfeuchtmasse (=7-8 kg Proteintrockenmasse) vor dem
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ersten Trennschritt auf weniger als etwa 100 bis 200 ml verringert werden. Es ist ersichtlich, daß damit erstmals die Möglichkeit geschaffen wird, größere Mengen an AT und CT zu gewinnen, da die an Hydroxylapatit zu chromatographierende Proteinmenge verhältnismäßig klein und bereits stark konzentriert an AT und CT ist. Hydroxylapatitsäulen mit einer Gesamtadsorptionskapazxtat für das so erzielte Produkt aus bis zu 2000 Liter kontaktaktiviertem Serum sind im Laboratorium noch handhabbar.
C) Gewinnung des AT und CT enthaltenden Leukotaxinpräparates durch Chromatographie an Hydroxy!apatit, weitere Reinigung des Präparates und seine Auftrennung in Anaphylatoxin und Cocytotaxin
Nach der Durchführung eines oder einer Kombination der unter B) beschriebenen Trennverfahren wird die erhaltene, AT und CT bereits verhältnismäßig konzentriert enthaltende Proteinlösung zur Abtrennung verbliebener Fremdproteine und zur Gewinnung des AT und CT enthaltenden Leukotaxinpräparates an Hydroxylapatit chromatographiert. Die Chromatographie an Hydroxylapatit erfolgt vorzugsweise in der von Wissler in Eur. J. Immunol. 2 (1972), S. 76, r. Sp. beschriebenen Weise.
Falls die konzentrierte Lösung des letzten vorangegangenen Trennschrittes Ammoniumsulfat und andere Salze, vor allem Phosphate enthält, werden diese, vorzugsweise durch Dialyse, vor dem Aufbringen auf den Hydroxylapatit entfernt. Abgesehen von der Viskositätserhöhung ist aber für das Gelingen der Chromatographie an Hydroxylapatit lediglich die Phosphatkonzentration der Proteinlösung kritisch. Die Eluierung von AT und CT erfolgt durch einen Natriumkaliumphosphat-Konzentratiorisgradienten, der vorzugsweise linear ist. Die AT und CT enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und konzentriert, beispielsweise durch Einstellen auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3,7 mol/1 und Abtrennen der ausgefallenen Proteine.
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Das nach der Chromatographie an Hydroxylapatit erhaltene, bei Verwendung von 100 Liter Serum noch etwa 600 mg Proteine enthaltende Leukotaxinpräparat besitzt im allgemeinen einen Gehalt von etwa 60 bis 70 % der Proteine an AT und CT, stellt also bereits ein verhältnismäßig reines Produkt dar. Es kann jedoch, wenn die vorgesehene Verwendung dies erfordert, durch Anwendung zusätzlicher Reinigungsschritte von den verbliebenen Verunreinigungen weiter gereinigt worden. Als zusätzliche Reinigungsschritte kommen Rechromatographie ^ an Hydroxylapatit, Zonenpräzipitationschromatographie, analytische Molekularsiebfiltration oder Kombinationen dieser Schrirte in Frage.
Die Rechromatographie an Hydroxylapatit kann in der von J.H. Wissler, in Eur. J. Immunol. 2 (1972) S. 77, r.Sp. beschriebenen Weise durchgeführt werden. Hierzu wird das Leukotaxinpräparat, vorzugsweise durch Dialyse, zunächst von gegebenenfalls enthaltenden Fremdsalzen und Ammoniumsulfat befreit. Die erhaltene Lösung des Leukotaxinpräparates wird sodann auf den Hydroxylapatit aufgebracht und mit Hilfe eines Natriumkaliumphosphat-Konzentrationsgradienten eluiert. Die das Leukotaxinpräparat enthaltenden Fraktionen werden in üblicher Weise gesammelt und konzentriert.
Bei der Zonenpräzipitationschromatographie (vgl. J. Porath, Nature 196 (1962), S. 47) werden restliche Proteinverunreinigungen des Leukotaxinpräparates durch Aussalzfraktionierung der Proteine mittels eines Salzkonzentrationsgradienten abgetrennt. Dabei können Temperatur und pH-Wert,
Dimension der Säule, Art des Salzes, Form des Gradienten und Beladung der Säule in einem verhältnismäßig breiten Bereich variiert werden.
Die Temperatur bei der Zonenpräzipitationschromatographie
kann etwa 0 bis 40°C betragen. Bevorzugt ist ein Temperaturbereich von etwa 0 bis 10°C, insbesondere etwa 4 bis 6°C. Der
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pH-Wert kann zwischen etwa 4 und 10 liegen; bevorzugt ist ein pH-Wert im Bereich von 6 bis 8, insbesondere etwa 7. Das Verhältnis von Länge : Durchmesser der verwendeten Säule soll größer als etwa 10:1 sein, bevorzugt ist ein Verhältnis von 30 bis 100 : 1, insbesondere etwa 50:1. Als Salze kommen alle Proteine nicht schädigenden Salze mit Aussalzwirkung in Frage. Beispiele für solche Salze sind Natriumkaliumphosphat, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat. Bevorzugt wird Ammoniumsulfat verwendet.
Der Salzkonzentrationsgradient kann jede beliebige Form haben, so lange die Aussalzpunkte der Proteine laufstreckenmäßig getrennt sind. Bevorzugt sind lineare Konzentrationsgradienten, insbesondere ein ansteigender linearer Konzentra- tionsgradient von 25 bis 80 % AmmoniumsulfatSättigung. Die Beladung der Säule beträgt höchstens etwa 5 %, vorzugsweise etwa 1 %.
Die analytische Molekularsiebfiltration zur zusätzlichen Reinigung des Leukotaxinpräparates kann in der gleichen Weise durchgeführt werden wie die analytische Molekularsiebfiltration, die vor der Chromatographie an Hydroxy!apatit zur Abtrennung der Fremdproteine dient. Es eignen sich die gleichen Molekularsiebe und die gleichen Säulenbedingungen.
Bereits mit einem der genannten zusätzlichen Reinigungsschritte kann eine beträchtliche Abtrennung der neben AT und CT noch in dem Leukotaxinpräparat enthaltenen Fremdproteine erreicht werden. Beispielsweise wird durch Re-Chromatographie an Hydroxylapatit ein Leukotaxinpräparat erhalten, dessen Proteingehalt zu etwa 91 % aus AT und CT besteht. Durch Zonenpräzipitationschromatographie wird der AT- und CT-Anteil der Proteine des Leukotaxinpräparates auf etwa 94 % und durch die analytische Molekularsiebfiltration allein auf etwa 95 % erhöht. Wenn nur ein einziger zusätzlicher Reinigungsschritt durchgeführt wird, ist die Zo-
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nenpräzipitationschromatographie bevorzugt.
Grundprinzip der Proteintrennung mittels der Zonenpräzipitationschromatographie sind unterschiedliche, strukturgegebene reversible Löslichkeitseigenschaften der Proteine. Sie gehören zu den empfindlichsten molekularen Trennparametern und wurden häufig als
Kriterium für den Nachweis der molekularen Einheitlichkeit eines Proteins verwendet. Dies begründet die Bevorzugung der Zonenpräzipitationschromatographie vor den verschiedenen erwähnten Arten der Rechromatographiemethoden, bei welchen die Reinigungseffekte durch bessere Annäherung an ideale Gleichgewichte in nichtidealen Systemen erzielt werden.
Für eine therapeutische Verwendung des Leukotaxinpräparates wird es vorzugsweise durch eine Kombination von mindestens zwei der genannten Reinigungsschritte praktisch vollständig von Fremdproteinen befreit. Bevorzugt ist insbesondere eine Ausführungsform,- bei der das durch Chromatographie an
^Q Hydroxylapatit erhaltene Leukotaxinpräparat zunächst an Hydroxylapatit rechromatographiert, danach einer Zonenpräzipitationschromatographie und abschließend einer analytischen Molekularsiebfiltration unterzogen wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Rechromatographie an Hydroxylapatit auch nach der Zonenpräzipitationschromatographie durchgeführt werden. In diesen bevorzugten Ausführungsformen wird ein Leukotaxinpräparat erhalten, dessen Proteine zu mehr als 99 % aus AT und CT bestehen.
Das durch Chromatographie an Hydroxylapatit gewonnene, AT und CT enthaltende Leukotaxinpräparat kann entweder bereits nach.der ersten Hydroxylapatitchromatographie oder nach einer der vorstehend genannten zusätzlichen Reinigungsstufen durch chromatographische Methoden in die Einzelkomponenten AT und CT aufgetrennt werden. Diese können dann gegebenenfalls getrennt in analoger Weise mit den genannten Reinigungsverfah-
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ren von den noch vorhandenen geringen Mengen an Fremdproteinen befreit werden. Dabei können ΛΤ und CT in kristalliner Form erhalten werden.
Die Auftrennung des Leukotaxinpräparates in AT und CT erfolgt vorzugsweise nach einer Modifikation des von J.H. Wissler in Eur. J. Immunol. 2 (1972), S. 78 beschriebenen Verfahrens durch Kaskaden- und Kreislaufmolekularsiebfiltration. Dabei erfolgt die Auftrennung in die beiden Proteine in der ersten der beiden Trennstufen. Die zweite dient der Abtrennung verbliebener geringer Anteile des jeweils anderen Proteins von AT bzw. CT.
Die Kaskaden- und Kreislaufmolekularsiebfiltrationen können unter den vorstehend für die analytische Molekularsiebfiltration beschriebenen Bedingungen durchgeführt werden. Es können die gleichen Molekularsiebe und die gleichen Säulenbedingungen verwendet werden. Bevorzugt ist Sephadex G 50 bei einem Länge-Durchmesser-Verhältnis der Säule von mindestens 2^ etwa 5 0 :1 und einer Beladung von höchstens etwa 3 % des Säuleninhalts. Als Lösungsmittel und zur Eluierung werden vorzugsweise die bei der analytischen Molekularsiebfiltration benutzten Lösungsmittel eingesetzt.
In der Kaskadenmolekularsiebfiltration wird das Eluat bei einer bestimmten Separationsgrenze auf eine Säulenkaskade aus beispielsweise 2 Säulen der gleichen Spezifikation geleitet. Durch die dadurch wesentlich verlängerte Laufstrecke des Leukotaxinpräparates gelingt die Auftrennung in zwei
ou Hauptfraktionen vom Molekulargewicht 9 500 Daltons (AT) bzw. 8 500 Daltons (CT).
Beide Fraktionen werden nach der Auftrennung getrennt kon-
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zentriert, beispielsweise/mit Hilfe von Ammoniumsulfat. Zur
Abtrennung verbliebener Reste des jeweils anderen Proteins können AT und CT getrennt einer weiteren Kaskaden- oder einer
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! Recyclingmolekularsiebfiltration unterzogen werden. Letztere unterscheidet sich von der erstgenannten dadurch, daß das Eluat bei der festgelegten Separationsgrenze nicht über eine Kaskade weiterer Säulen, sondern im Kreislauf wieder in die gleiche Säule geleitet wird. Auch auf diese Weise wird die Laufstrecke der Proteine verlängert. Die abgetrennten gerin-
gen Mengen des jeweils anderen Proteins können sodann der in der ersten Kaskadenmolekularsiebfiltration gewonnenen entsprechenden Hauptfraktion zugefügt werden.
Die Auftrennung des Leukotaxinpräparates kann, wie bereits erwähnt, unmittelbar nach seiner Gewinnung durch die erste
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Chromatographie an Hydroxylapatit oder nach/der beschriebenen zusätzlichen Reinigungsstufen erfolgen. Wenn die Auftrennung beabsichtigt ist, wird sie bevorzugt bereits nach der ersten Chromatographie an Hydroxy!apatit durchgeführt, um. die erhaltenen Proteine AT und CT danach wirkungsvoll getrennt durch Rechromatographie an Hydroxy !apatit, Zonenprazipitationsch.romatographie und/oder analytische Molekularsiebfiltration zu reinigen.
Die Temperatur- und pH-Bedingungen sind, wie an verschiedenen Stellen bereits bemerkt wurde, in den meisten Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht besonders kritisch.
Wenn die Gewinnung des Leukotaxinpräparates bzw. von AT und CT in nativer Konformatxon gewünscht wird, müssen die Trenn- und Reinigungsstufen jedoch unter im wesentlichen physiologischen pH- und Salzbedingungen und vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen von höchstens etwa 1O°C, vorzugsweise höchstens etwa 60C durchgeführt werden. Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die leichte Einhaltung dieser Bedingungen möglich ist.
Das erhaltene Leukotaxinpräparat bzw. die getrennten Proteine AT und CT können in einer physiologischen .gepufferten Salzlösung, beispielsweise in 0,0015 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,15 mol/1 (0,9 %) NaCl und 0,001 mol/1 Cystein
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enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, nach üblicher Filtersterilisation (0,2 μπι Porenweite) nativ auch bei Raumtemperatur (für mindestens 200 Stunden) oder eingefroren bei -25°C (für mindestens 5 Jahre) aufbewahrt werden. Diese Stabilität der Proteinpräparate kann als eines der Kriterien für die molekulare Einheitlichkeit angesehen werden. Die sichere
Aufbewahrungsform bei Temperaturen zwischen -20 und +500C ist die kristalline Form als Kristallsuspension, hergestellt nach dem von J.H. Wissler beschriebenen Verfahren, da sie gegen Infektion durch Mikroorganismen geschützt
ist.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wird die Gewinnung des Leukotaxinpräparates sowie von AT und CT ausgehend von Schweinablut beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Ausführungsform beschränkt.
A. Gewinnung des AT und CT enthaltenden Proteinkonzentrates
Es wird die Erzeugung von AT und CT im Serum und die Abtrennung der gesamten Proteine von den übrigen Bestandteilen des Serums erläutert.
300 Liter Schweineblut werden ohne Zusätze bei Raumtemperatur koagulieren gelassen. Das überstehende Serum wird durch Zentrifugieren vom Blutkuchen abgetrennt. Hierauf wird das klare Serum sofort mit Dextran in einer Menge von 5 mg/ml Serum oder mit Bäckerhefe in einer Menge von 100 mg/ml Serum versetzt und 1 Stunde bei 370C unter Rühren im Wasserbad inkubiert. Danach wird das Gemisch auf 40C abgekühlt,und das Dextran bzw. die Bäckerhefe wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Anwesenheit von Anaphylatoxin und Cocytotaxin in den erhaltenen 12Q Litern kontaktaktiviertes Serum, das etwa 9,2 kg Protein enthält, wird durch einen Aktivitätstest (Chemotaxis) nachgewiesen.
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Ι Folgende Reinigungsarbeiten werden dann in Gegenwart von 0/001 mol/1 Cystein bei Temperaturen von 0 bis 80C ausgeführt, soweit nichts anderes angegeben ist:
120 Liter kontaktaktiviertes Serum werden mit 5 mol/1 Essigsäure auf den pH-Wert 4,5 eingestellt und mit 240 Liter 0,001 mol/1 Kaliumphosphat-Acetat-Pufferlösung versetzt, die 0,2 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von 4,5 aufweist. Die erhaltene Lösung wird sodann unter Rühren mit einem gequollenen, regenerierten Kationenaustauscher (Na als mobiles Austauschion) auf der Basis einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextranmatrix (CM-Sephadex C-5O) in einer Menge von 1 Volumenteil Ionenaustauscher pro 3 Volumenteile Proteinlösung versetzt. Der verwendete Ionenaustauscher wurde mindestens 1 Tag zur Oberflächeninaktivierung mit Schweineserum vorbehandelt, vor der Verwendung regeneriert und in der Phosphat-Acetat-Pufferlösung von pH-Wert 4,5 äquilibriert.
Das erhaltene Gemisch wird etwa 24 Stunden gerührt. Danach wird das Ionenaustauschergel absitzen gelassen und durch Absaugen im Büchnertrichter vom überstand abgetrennt. Das Gel wird sodann dreimal mit je 120 Liter 0,001 mol/1 Kaliumhydrogenphosphat-Acetat-Pufferlösung, die 0,2 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, gewaschen, bis die Extinktion des Filtrates bei 280 nm und E = 1,0 liegt.
Zur Eluierung der adsorbierten Proteine wird das beladene Ionenaustauschergel dreimal in einem dem Gelvolumen entsprechenden Volumen 0,5 mol/1 Kaliumphosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 suspendiert. Das Ionenaustauschergel wird von den Lösungen jeweils durch Zentrifugieren abgetrennt. Die erhaltenen Proteinlösungen werden vereinigt (360 Liter),
Die vereinigten Eluate des KationenaustauschergeIs werden durch Zugabe von 63Og Ammoniumsulfat pro Liter Eluatlösung auf eine Ammoniumsulfat-Sättigungskonzenträtion von 90 % eingestellt. Während der Zugabe wird der pH-Wert der Protein-
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lösung laufend kontrolliert und durch Zusatz von 2 η Ammoniak auf 6,5 bis 7,0 gehalten. AT und CT fallen zusammen mit sämtlichen Serumproteinen aus der Lösung aus. Der Proteinniederschlag wird durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom nahezu proteinfreien überstand abgetrennt. Es werden 49 Liter ammoniumsulfathaltiger Proteinschlamm erhalten, der etwa 3,5 kg Protein enthält.
B. Abtrennen des Großteils der begleitenden Fremdproteine von AT und CT
Beispiel B1
49 Liter des vorstehend unter A) erhaltenen Proteinniederschlags, der eine Anmoniumsulfatkonzentration von etwa 3,7 mol/1 aufweist, werden zur fraktionierten Eluierung mit 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,1 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von 6,3 aufweist, in einer Menge von 0,4 Volumenteilen pro Volumenteil Proteinschlammkonzentrat versetzt und etwa 24 Stunden gerührt. Danach wird der ungelöst gebliebene Proteinniederschlag, der praktisch das gesamte AT und CT enthält, durch Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom überstehenden Eluat getrennt. Es verbleiben etwa 70 % (2,7 kg Protein) des eingesetzten Proteinkonzentrates, das immer noch die Form eines Schlammes hat (Volumen etwa 14 Liter). Dieses wird gegen 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,1 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, an einer Membran mit der Ausschlußgrenzs von 1000 Daltons dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen. Es werden 40 Liter ammoniumsulfatfreie Proteinlösung erhalten, die gemäß C) auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden.
Beispiel B2
49 Liter des vorstehend unter A) erhaltenen Proteinkonzentrates werden zur fraktionierten Fällung in einem möglichst kleinen Volumen 0,01 mol/1 Ammoniumacetat-Pufferlösung, die
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0,2 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von 5,0 aufweist, gelöst. Sodann wird die erhaltene Lösung unter leichtem Rühren mit Eisessig auf den pH-Wert 4,0 eingestellt und bei einer Temperatur von O0C mit 0,2 Volumenteilen 96prozentigem Äthanol pro Volumenteil Proteinlösung versetzt. Während der Äthanolzugabe werden Temperatur und pH-Wert konstant gehalten. Das erhaltene Gemisch wird 1 Stunde bei O0C gerührt. Es fallen 70 % (2,45 kg) der Fremdproteine aus, die durch einstündiges Zentrifugieren bei mindestens 16 000 χ g vom AT und CT enthaltenden überstand abgetrennt werden. Der abgetrennte Proteinniederschlag (10 Liter) wird viermal mit dem gleichen Volumen 0,01 mol/1 Ammoniumacetat-Pufferlösung, die 0,2 mol/1 NaCl und 200 ml Äthanol pro Liter Puffer enthält und einen pH-Wert von 4,0 aufweist, bei einer Temperatur von O0C gewaschen. ° Die Waschlösungen werden mit dem überstand der Zentrifugierung vereinigt und mit 2 mol/1 Ammoniak auf den pH-Wert 5,0 eingestellt. Anschließend wird das Äthanol durch Lyophilisierung, Molekularsiebfiltration oder Dialyse (Ausschlußgrenze 1000 Daltons) gegen den Ammoniumacetatpuffer abgetrennt. Im Falle der Dialyse und Molekularsiebfiltration werden aus der erhaltenen alkoholfreien Lösung die Proteine durch Zugabe von Ammoniumsulfat (90 % Sättigung) gefällt und durch Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom proteinfreien überstand abgetrennt. Der durch Lyophilisieren oder Fällung erhaltene Proteinrückstand (1,05 kg Protein) wird gemäß Beispiel 1 von Ammoniumsulfat durch Dialyse befreit und kann dann als ammoniumsulfatfreie Lösung (Volumen 16 Liter) gemäß C) auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden.
Beispiel B3 49 Liter des gemäß A) erhaltenen Proteinniederschlags werden in 0,01 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,7 aufweist, in einer Menge von 2 Volumenteilen Pufferlösung pro Volumenteil Proteinkonzentrat gelöst und zur Abtrennung einer kleinen Menge ungelösten Rückstandes 30 Minuten bei 40C und
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10 000 χ g zentrifugiert. Sodann wird die klare Lösung (147 Liter) einer präparativen Molekularsiebfiltration unterzogen, in dem sie auf eine mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex G-50; 50 bis 150 μΐη Teilchengröße) gefüllte Säule aufgetragen wird. Die Säule hat das 10-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge zu Durchmesser) von 10:1 aufweist. Danach wird die Säule mit einem dem Säulenvolumen entsprechenden Volumen 0,01 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält und einen pH-Wert von 6,7 aufweist, bei aufwärts gerichtetem Fluß (3 cm/h) eluiert. Das Eluat wird in zwei Fraktionen mit einer Separationsgrenze von 20 000 aufgeteilt. Die Fraktion mit dem Molekulargewicht >20 000 Dalton enthält 35 % der eingesetzten Proteinmasse. Die AT und CT enthaltende Fraktion (0,5 kg Protein) mit dem Molekulargewicht <20 000 Daltons wird gesammelt. Die Proteine dieser Fraktion v/erden gemäß Beispiel B 2 durch Fällen mit Ammoniumsulfat konzentriert und danach durch Dialyse vom Ammoniumsulfat befreit. Die erhaltene Lösung, die nur noch 15 % der ursprünglichen Proteinmasse (7,5 Liter) enthält und ein Volumen von 22,5 Liter aufweist, kann gemäß C) auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden.
Beispiel B4 49 Liter des gemäß A) erhaltenen Proteinniederschlags werden gemäß Beispiel B 1 fraktioniert eluiert. Die erhaltenen, AT und CT enthaltenden 14 Liter Proteinschlamm werden gemäß Beispiel B 3 in der dort genannten Natriumkaiiumphosphat-Pufferlösung gelöst und an Sephadex G-50 chromatographiert. Die Fraktion mit einem Molekulargewicht <20 000 Daltons wird gesammelt, mit Ammoniumsulfat konzentriert und anschließend dialysiert. Es werden 6,0 Liter ammoniumsulfatfreie Proteinlösung mit einem Gehalt von 0,4 kg Protein erhalten.
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— "ί fi —
Beispiel B5 49 Liter des gemäß A) erhaltenen Proteinniederschlags werden gemäß Beispiel B 2 mit Äthanol behandelt. Der erhaltene Proteinrückstand (1,05 kg Protein) wird danach gemäß Beispiel B 3 aufgelöst und chromatographiert. Es werden 2,3 Liter ammoniumsulfatfreie Proteinlösung mit einem Gehalt von 160 g Protein erhalten.
Beispiel B6
ig 49 Liter des gemäß A) erhaltenen Proteinniederschlags werden gemäß Beispiel B 4 fraktioniert eluiert und danach einer präparativen Molekularsiebfiltration unterzogen.
Nach dem Konzentrieren der Fraktion mit einem Molekulargewicht <20 000 Daltons mit Ammoniumsulfat wird der erhaltene, AT und CT enthaltende Proteinniederschlag in 0,01 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die O,3 mol/1 NaCl" und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,7 aufweist, in einer Menge von 1,5 Volumenteile Pufferlösung pro Volumenteil Proteinniederschlag gelöst. Nach dem Abzentrifugieren von wenig ungelöst gebliebenem Rückstand wird die Lösung zur zweiten präparativen Molekularsiebfiltration auf eine mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex G-50; 50 bis 150 μΐη Teilchengröße) gefüllte Säule aufgetragen, die das 10-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 10:1 aufweist. Hierauf wird die Säule bei aufwärts gerichtetem Fluß (3 cm/h) mit 0,01 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält und einen pH-Wert von 6,7 aufweist, eluiert. Das erhaltene Eluat wird in drei Fraktionen mit den Separationsgrenzen 20 000 und 13 000 Daltons aufgetrennt. Die AT und CT enthaltende Proteinfraktion mit einem Molekulargewicht ^13 000 Daltons enthält 130 g Protein. Sie wird auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3,7 mol/1 eingestellt.
Der ausgefallene Proteinniederschlag wird durch Zentrifugieren
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vom überstand abgetrennt.
Der erhaltene, AT und CT enthaltende Proteinniederschlag wird in 1,5 Volumenteilen der in der vorangehenden Molekularsiebfiltration verwendeten Pufferlösung (ohne Ammoniumsulfat) gelöst und zur Entfernung von wenig ungelöstem Rückstand
I Stunde bei 10 000 χ g zentrifugiert.
Die erhaltene klare Lösung wird zur analytischen Molekularsiebfiltration auf eine Säule aufgebracht, die mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex G-50) mit einer Teilchengröße von 20 bis 80 μΐη gefüllt ist. Die verwendete Säule besitzt das 50-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 50:1. Zur Eluierung beim Aufwärtsfluß (3 cm/h) wird eine 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält, verwendet. Das Eluat wird in mehrere Fraktionen aufgeteilt, deren Chemotaxis- und Anaphylatoxin-Aktivität geprüft wird. Die Fraktion mit dem Molekulargewichtsbereich von
II 000 bis 6 000 Daltons, die im wesentlichen das gesamte AT und CT enthält, wird abgetrennt. Sodann wird diese Fraktion auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3,7 mol/1 eingestellt und der ausgefallene Proteinniederschlag durch Zentrifugieren vom überstand getrennt. Ausbeute: 180 ml Proteinkonzentrat mit einem Gehalt von 9,0 g Protein.
In den Fig. 1 bis 3 ist der Verlauf der Abtrennung des Leukotaxinpräparates von den Begleitproteinen durch Molekularsiebfiltration in Form von Chromatogrammen wiedergegeben.
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· Beispiel B7 49 Liter des gemäß A) erhaltenen Proteinniederschlags werden gemäß Beispiel B 1 fraktioniert eluiert. Die erhaltenen 14 Liter Proteinschlamm werden sodann gemäß Beispiel B 2 mit Äthanol behandelt. Der erhaltene Proteinrückstand (1,05 kg Protein) wird gemäß Beispiel B 6 der zweiten der dort beschriebenen präparativen MolekularSiebfiltrationen und anschließend der analytischen Molekularsiebfiltration ebenfalls gemäß Beispiel B 6 unterzogen. Es wird das gleiche Ergebnis wie in Beispiel B 6 erhalten.
Beispiel B8
49 Liter des gemäß A) erhaltenen Proteinniederschlags werden zunächst gemäß Beispiel B 5 mit Äthanol behandelt und einer präparativen Molekularsiebfiltration unterzogen. Danach wird der erhaltene Proteinrückstand (160 g Protein) gemäß Beispiel B 6 der zweiten präparativen und anschließend der analytischen Molekularsiebfiltration unterzogen. Es wird das
gleiche Ergebnis wie in Beispiel B 6 erhalten. 20
C. Gewinnung des AT und CT enthaltenden Leukotaxinpräpa rates durch Chromatographie an Hydroxy!apatit/ weitere Reinigung des Präparates und seine Auftrennung in AT und CT und Überführung der beiden Proteine in molekular einheitlichen Zustand.
Beispiel C1 Der gemäß Beispiel B 6 erhaltene Proteinniederschlag wird in möglichst wenig 0,0015 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,15 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält, gelöst und gegen 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,1 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1
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Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, dialysiert, ultrafiltriert oder durch Molekularsiebfiltration entsalzt (Ausschlußgrenze 1000 Daltons) bis in der Dialysen-Pufferlösung kein Sulfat mehr nachzuweisen ist. Sodann wird ein kleiner Anteil an unlöslichen Proteinen durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g entfernt.
Die erhaltene klare AT und CT enthaltende Proteinlösung (200 ml; 9,0 g Proteingehalt) wird auf eine mit Hydroxylapatit gefüllte Säule aufgetragen. Die Säule besitzt ein Verhältnis Länge zu Durchmesser von 10 :1 und das dreifache Volumen des aufzutragenden Proteinvolumens (45 mg Protein/ml) , Die Säule wurde vorher mit dem fünffachen ihres Volumens 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,001 mol/1 Cystein enthält, äquilibriert (Fluß 3 cm/h).
Die negativ adsorbierten Proteine werden durch Eluieren mit der zum Äquilibrieren der Säule verwendeten Pufferlösung ausgewaschen. Sodann wird die Eluierung der AT und CT enthaltenden Fraktion mit einem linearen Phosphatkonzentrationsgradienten von 0,001 mol/1 bis 0,5 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7,4 unter Konstanthaltung des angegebenen NaCl und Cysteinzusatzes über einen Zeitraum von 4 Tagen durchgeführt. Der Elutionsgradient wird mit Hilfe der Leitfähigkeitsmessung verfolgt und kontrolliert. Nach üblicher Konzentrierung der aktiven Fraktionen werden 14 ml mit 650 mg Produkt erhalten, das ein Leukotaxinpräparat mit einem Gehalt von etwa 70 % der Proteine an AT und CT darstellt. Als Lösungspuffer wird zweckmäßigerweise 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, welche 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, verwendet. Dadurch wird es möglich, jede andere SaIz-
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konzentration durch Hinzufügen eines kleinen Volumens einer konzentrierten Salzlösung einzustellen. Beispielsweise ergibt die Zugabe von 0,05 Volumenteilen einer 2 mol/1 NaCl-Lösung vom pH-Wert 7,2 bei Bedarf eine Pufferlösung mit 0,1 mol/1 NaCl.
Die Gewinnung des Leukotaxinpräparates durch Chromatographie an Hydroxylapatit gemäß Beispiel C 1 zeigt das Chromatogramm der Fig. 4.
10
Beispiel C2
Beispiel C 1 wird mit dem gemäß Beispiel B 2 erhaltenen Proteinniederschlag wiederholt. Nach der Dialyse und der Entfernung eines kleinen Anteils unlöslicher Proteine werden
16 Liter klare Lösung erhalten, die auf eine mit Hydroxylapatit gefüllte Säule mit den in Beispiel C 1 angegebenen Säulencharakteristika (Volumen 3 χ 16 Liter, Verhältnis Länge zu Durchmesser 10:1) also einem Durchmesser von 18 cm und einer Länge von 180 cm aufgetragen wird. Nach der
Eluierung werden etwa 700 mg Produkt erhalten, das ein Leukotaxinpräparat mit einem Gehalt von etwa 65 % Anaphylatoxin und Cocytotaxin darstellt.
Beispiel C3
Das gemäß Beispiel C 1 erhaltene Leukotaxinpräparat wird in
0,1 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,1 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 1 mol/1 Ammoniumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, zu einer Proteinkonzentration von etwa 45 mg/ml gelöst. Die erhaltene Lösung (14 ml) 30
wird bei einer Temperatur von 40C auf eine Säule aufgebracht, die mit einer, mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex G-50) gefüllt ist. Die Matrix be-
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findet sich in einem ansteigenden linearen Ammoniumsulfat-Konzentrationsgradienten von 1,0 bis 3,2 mol/1 Ammoniumsulfat (25 bis 80 % Sättigung). Die Steigung des Gradienten beträgt + 2 % Ammoniumsulfatsättigung/cm Säulenhöhe, wobei der Bereich des Gradienten über die halbe Säulenlänge reicht. Das Verhältnis Läng,e : Durchmesser der Säule beträgt 50 :1> das Säulenvolumen ist 100 mal größer als das Auftragsvolumen. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 2 cm/h.
Die Eluierung erfolgt mit der vorstehend genannten Natriumkaliumphosphatlösung die 1 mol/1 Ammoniumsulfat enthält. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und die Proteine in üblicher Weise konzentriert. Es werden 460 mg (10 ml) gereinigtes Leukotaxinpräparat erhalten, das zu etwa 94 % aus AT und CT besteht.
Als Lösungspuffer wird zweckmäßigerweise wie in Beispiel C 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, verwendet.
Beispiel C 4
Das gemäß Beispiel C 1 erhaltene Leukotaxinpräparat (650 mg; etwa 14 ml) wird gegen 0,001 mol/1 Natriumkaiiumphosphat-Pufferlösung, die 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, dialysiert, ultrafiltriert oder durch Molekularsiebfiltration entsalzt (Ausschlußgrenze 1000 Daltons). Anschließend wird ein kleiner Anteil an unlöslichen Proteinen durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 32 000 χ g entfernt. Hierauf wird die erhaltene klare Lösung an einer mit Hydroxylapatit gefüllten Säule, welche im angegebenen Puffersystem äquilibriert ist und ein Verhältnis Länge zu Durchmesser von 20 :1 und mindestens das 5fache Volumen des aufzutragenden Proteinlösungsvolumens (etwa 45 mg Protein/ml) hat, im obengenannten Puffersystem rechromatographiert und mit dem in Beispiel C 1 genannten Phosphat-
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konzentrationsgraduenten eluiert. Es werden 410 mg gereinigtes Leukotaxinpräparat erhalten, dessen Proteinanteil zu etwa 91 % aus AT und CT besteht.
Das vorstehend erhaltene Leukotaxinpräparat wird nun gemäß Beispiel C 3 einer -Zonenpräzipitationschromatographie unterzogen. Es werden 395 mg (10 ml) weiter gereinigtes Leukotaxinpräparat erhalten, dessen Proteinanteil zu etwa 96 %
aus AT und CT besteht. 10
Abschließend wird das vorstehend durch Zonenpräzipitationschromatographie gereinigte Leukotaxinpräparat einer analytischen Molekularsiebfiltration unterzogen. Das Leukotaxinpräparat wird in 0,0015 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, zu einem Gesamtvolumen von 10 ml mit einer Proteinkonzentration von etwa 35 bis 40 mg/ml gelöst. Die erhaltene klare Losung wird auf eine Säule aufgebracht, die mit Sephadex G-50 mit einer Teilchengröße von 20 bis 80 μΐη gefüllt ist. Die verwendete Säule besitzt mindestens das 50-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 50:1. Zur Eluierung wird eine 0,03 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat ent-
^ hält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, verwendet (Fluß: 3 cm/h). Nach üblicher Konzentrierung werden 370 mg (10 ml) Leukotaxinpräparat erhalten, dessen Proteinanteil zu mehr als 99 % aus AT und CT besteht (Ausbeute: etwa 12 %).
Nach Entsalzen durch Dialyse, Ultrafiltration oder Molekularsiebfiltration mit einer Ausschlußgrenze von 1000 DaltonS gegen eine physiologische Salzlösung (z.B. 0,0015 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, welche 0,15 mol/1 (= 0,9 %) NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist) kann das Leukotaxinpräparat nach Filtersterilisation (0,2 μπι Porenweite) für biologische, physiologische,
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pharmakologische und biochemische Zwecke verwendet werden.
Beispiel C5
Das gemäß Beispiel C 1 erhaltene Leukotaxinpräparat (14 ml; 650 mg Protein; Konzentration: 46 mg/ml) wird zur 0,003 mol/1 Natriumkaliumphospha,t-Puff er lösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, gemäß Beispiel C 1 umgepuffert (Endvolumen: 16 ml) . Nach dem Abzentrifugieren von wenig ungelöst gebliebenem Rückstand bei 10 000 χ g wird die erhaltene Lösung bei einer Temperatur von 40C auf eine mit Sephadex G-50 mit einer Teilchengröße von 20 bis 80 um gefüllte Säule aufgebracht, die das 50-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 50:1 besitzt. Die Eluierung erfolgt mit einer 0,003 mol/1 Natriumkaliuraphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält.
Bei einer Separationsgrenze von 11 000 wird das Eluat auf eine dreifache analytische Molekulargewichtsfiltrationskaskade aus zwei Säulen gleicher Spezifikation geleitet. Es werden zwei Hauptfraktionen mit den Molekulargewichten 9 500 Daltons (130 mg AT) und 8 500 Daltons (325 mg CT) erhalten.
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Beide Proteinfraktionen werden hierauf getrennt erhalten und durch Zugabe von Ammoniumsulfat konzentriert. Danach werden die Proteine getrennt in der vorstehend angegebenen Pufferlösung gelöst und getrennt und den vorstehend angegebenen Bedingungen einer analytischen Kreislaufmolekulargewichtsfiltrationschromatographie unterzogen. Die Eluate werden bei einer Separationsgrenze von 10 000 Daltons (für AT) bzw. 9000 Daltons (für CT) unter den für die Kaskadenchromatographie genannten Bedingungen dreimal im Kreislauf geführt. 35
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In der AT-Recycling-Chromatographie werden 113 mg Produkt mit einem Molekulargewicht von 9 500 Daltons (AT) und 10 mg mit einem Molekulargewicht von 8 500 Daltons (CT) erhalten. In der CT-Recycling-Chromatographie werden 312 mg Produkt mit einem Molekulargewicht von 8 500 Daltons (CT) und 15 mg mit einem Molekulargewicht von 9 500 Daltons (AT) erhalten. Die geringe Restmenge des jeweils anderen Proteins wird mit dessen Hauptmenge vereinigt. Anschließend werden beide Proteine .getrennt konzentriert (durch Zugabe von Ammoniumsulfat) und danach gemäß Beispiel- C 1 aufgelöst.
Beide Fraktionen werden hierauf getrennt gemäß Beispiel C einer dreistufigen Endreinigung unterzogen; und zwar unter den gleichen für die gemeinsame AT- und CT-Reinigung im ^5 Leukotaxinpräparat angegebenen Bedingungen, bestehend aus einer Rechromatographie an Hydroxylapatit, einer Zonenpräzipitationschromatographie und einer analytischen Molekulargewichts filtrationschromatographie für jedes der beiden
Proteine (AT und CT).
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Im Fall des Anaphylatoxin werden 100 mg Protein erhalten (etwa 10 % Ausbeute), die zu mehr als 99 % aus AT bestehen. Proteinverunreinigungen sind durch elektrophoretische, chromatographische und Löslichkeitskriterien nicht nachzuweisen und das AT-Präparat kann als molekulareinheitlich bezeichnet werden.
Im Fall des Cocytotaxins werden 250 mg Protein erhalten (etwa 11 % Ausbeute), die zu mehr als 99 % aus Cocytotaxin
bestehen. Proteinverunreinigungen sind durch elektrophoretische, chromatographische und Löslichkeitskriterien nicht nachzuweisen ,und das CT-Präparat kann als molekulareinheitlich bezeichnet werden.
Die Auftrennung des Leukotaxinpräparates in die Proteine AT und CT und ihre weitere Reinigung gemäß Beispiel C 5 ist in den Chromatogrammen der Fig. 5 bis 13 dargestellt.
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1 Wie bereits erwähnt, können die absoluten Mengen und das Men genverhältnis der erhaltenen Proteine AT und CT mit der Tierspezies, von welcher das Blut stammt, und der Inkubationsmethode etwas variieren.
Nach der in Beispiel C 4 beschriebenen getrennten Überbringung der beiden Proteine AT und CT in eine physiologische Salzlösung und nach Sterilisation können die beiden Proteine
einem entsprechenden Verwendungszweck
10 zugeführt oder nach J.H. Wissler a.a.O. kristallisiert werden.
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VOSSIUS -VOSSIUS TA UCHN hi R · HE U hi EM AN N- RAU H SIEBERTSTRASSE 4 · 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 4 7 4O 75 CABLE: BENZOLPATENT MÜNCHEN · TELEX 5-29 453 VOPAT D u.Z.: P 604 (Ra/kä) Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen, Bunsenstraße 10 10 " Verfahren zur Gewinnung eines Anaphylatoxin und Cocytotaxin enthaltenden Leukotaxinpräparates sowie von Anaphylatoxin und Cocytotaxin in molekular einheitlicher Form " Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung eines Anaphylatoxin und Cocytotaxin enthaltenden ißukotaxinpräparates sowie von Anaphylatoxin und Cocytotaxin in molekular einheitlicher Form aus kontaktaktiviertem Serum von Säugern durch
- Abtrennen der Proteine von den anderen Bestandteilen des Serums,
- Abtrennen eines Teils der begleitenden Fremdproteine von Anaphylatoxin und Cocytotaxin in dem erhaltenen Proteinkonzentrat,
- Gewinnen des Leukotaxinpräparates durch Chromotographie an Hydroxylapatit
- und gegebenenfalls weiteres Reinigen und/oder Auftrennen des Leukotaxinpräparates in Anaphylataxin und Cocytotaxin durch chromatographische Methoden,
dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Chromatographie an Hydroxylapatit einen Großteil der begleitenden Freradproteine aus dem erhaltenen Proteinkonzentrat durch fraktioniertes Eluieren und/oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol und/oder mindestens eine Molekularsiebfiltration abtrennt.
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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei der genannten Trennstufen nacheinander durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Proteinkonzentrat zunächst fraktioniert eluiert und danach den restlichen, Anaphylatoxin und Cocytotaxin enthaltenden Proteinniederschlag einer Molekularsiebfiltration unterwirft.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Proteinkonzentrat zunächst in einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit löst, aus der erhaltenen Lösung einen Teil der Fremdproteine mit einem wasserlöslichen Alkohol fällt und danach den dabei erhaltenen, Anaphylatoxin und Cocytotaxin enthaltenden überstand einer Molekularsiebfiltration unterwirft.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Proteinkonzentrat zunächst fraktioniert eluiert und danach den restlichen, Anaphylatoxin und Cocytotaxin enthaltenden Niederschlag in Wasser oder einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit zweimal einer präparativen und sodann einer analytischen Molekularsiebfiltration unterwirft.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man statt der ersten präparativen Molekularsiebfiltration eine Begleitproteinfällung mit einem wasserlöslichen Alkohol durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man .den nach der Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol erhaltenen überstand mindestens einmal einer präparativen und sodann einer analytischen Molekularsiebfiltration unterwirft .
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8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Proteinkonzentrat zur fraktionierten Eluierung mit einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 2,6 mol/1 einstellt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Proteine nicht schädigende Flüssigkeit eine 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung verwendet, die etwa 0,1 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von etwa 6,3 aufweist.
10. Verfahren nach Anspruch 5 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste präparative Molekularsiebfiltration bei einer ^5 Temperatur von 0 bis 8°C und einem pH-Wert von 6 bis 8 an einem hydrophilen, in Wasser quellenden Molekularsieb bei einer Separationsgrenze von 20 000 Daltons durchführt.
11· Verfahren nach Anspruch 5 bis 7,. dadurch gekennzeichnet, daß man die zweite präparative Molekularsiebfiltration bei einer Temperatur von 0 bis 80C und einem pH-Wert von 6 bis 8 an einem hydrophilen, in Wasser quellenden Molekularsieb bei einer Separationsgrenze von 13 000 Daltons durchführt.
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12. Verfahren nach Anspruch 5 bis lt dadurch gekennzeichnet, daß man die analytische Molekularsiebfiltration bei einer Temperatur von 0 bis 80C und einem pH-Wert von 6 bis 8 an einem hydrophilen, in Wasser quellenden Molekularsieb bei Separationsgrenzen von 11 000 und 6 000 Daltons durchführt .
13. ··Verfahren nach Anspruch 4 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol bei einem pH-Wert von etwa 4,0 und einer Temperatur von höchstens etwa 50C mit einer Menge von etwa 0,2 1 Alkohol pro Liter Proteinlösung durchführt.
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14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als wasserlöslichen Alkohol Äthanol verwendet.
15. Verfahren nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Molekularsiebfiltrationen in Anwesenheit von Ammoniumsulfat in einer Konzentration bis etwa 0,6 mol/1 durchführt.
16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Molekularsiebfiltrationen in Anwesenheit von Cystein in einer Konzentration bis etwa 0,001 mol/1 durchführt.
17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man das durch Chromatographie an Hydroxylapatit erhaltene Leukotaxinpräparat durch Rechromatographie an Hydroxy lapatit und/oder Zonenpräzipitationschromatographie und/ oder analytische Molekularsiebfiltration weiter reinigt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man das Leukotaxinpräparat zur weiteren Reinigung einer Zonenpräzipitationschromatographie unterwirft.
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man das Leukotaxinpräparat zur weiteren Reinigung zunächst an Hydroxylapatit rechromatographiert, danach einer ZonenpräzipitationsChromatographie und schließlich einer analytischen Molekularsiebfiltration unterwirft.
20. Verfahren nach Anspruch 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man das durch Chromatographie·an Hydroxylapatit erhaltene und gegebenenfalls weiter gereinigte Leukotaxinpräparat durch Kaskaden- und/oder Kreislaufmolekularsiebfiltration in Anaphylatoxin und Cocytotaxin auftrennt und die erhaltenen Proteine gegebenenfalls getrennt durch Rechromatographie an Hydroxylapatit und/oder Zonenpräzipitationschromatographie und/ oder analytische Molekularsiebfiltration weiter reinigt.
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DE19803022914 1980-06-19 1980-06-19 Verfahren zurgewinnung eines anaphylatoxin und cocytotaxin enthaltenden leukotaxinpraeparates sowie von anaphylatoxin und cocytotaxin in molekular einheitlicher form Withdrawn DE3022914A1 (de)

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