JP2536749B2 - 細胞分離剤、その製造方法及びそれを使用した細胞分離器並びにそれを使用した免疫抑制性リンパ球、及び／又は免疫抑制因子産生細胞の除去方法 - Google Patents

細胞分離剤、その製造方法及びそれを使用した細胞分離器並びにそれを使用した免疫抑制性リンパ球、及び／又は免疫抑制因子産生細胞の除去方法

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Description

【発明の詳細な説明】 《産業上の利用分野》 本発明は、動物細胞、特に付着性動物細胞群の浮遊液
の中から所定の細胞ポピュレーションを分離するための
細胞分離剤、その製造方法及びそれを使用した細胞分離
器並びにそれを使用した免疫抑制性リンパ球及び／又は
免疫抑制因子産生細胞の除去方法に関する。
《従来の技術》 悪性腫瘍などで免疫機能が低下し生体防御に関して不
利な状態に陥った場合、免疫機能を回復させることが治
療上重要な課題とされている。このように免疫機能が低
下するのは免疫抑制性リンパ球あるいは免疫抑制因子産
生細胞の増加によることが明らかにされ、これらの抑制
因子を除去することが免疫機能回復の鍵とされている。
このような免疫機能に関与している細胞として、マク
ロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞その他の白血球があり、こ
のうち免疫抑制作用をもつ細胞はＴ細胞のサブセットの
一つであるサプレッサーＴ細胞（以下TSとする）である
ことが知られている。従って、この細胞を選択的に除去
することが免疫機能上重要な課題とされていることから
も明らかなように、近年、医学分野においては、臨床検
査、免疫診断及び免疫治療等を目的として、細胞浮遊液
から所定の細胞群を分離する試みが盛んに行われてい
る。例えば、上述した免疫系細胞、特にリンパ球群とそ
のサブセットとを分離するために、サブセット間の細胞
比重、細胞径、裏面陰性荷電密度、免疫額的特異性、異
物への粘着性、表面膜の親水性と疎水性等の性状の差に
基づいて、密度勾配遠心分離法、沈降速度法、細胞電気
泳動法、表面膜法、向流分配法等の細胞分離法が試みら
れているものの、純度、回収率、生物学的活性保持の３
項目を充分に満たす方法は未だ確立されていない。同様
にまた、リンパ球の中からＴ細胞、Ｂ細胞、Ｋ細胞、NK
細胞等を分離する場合、これらの細胞ポピュレーション
を変化させずに分離する方法は知られていない。
特開昭57−204454号公報及び特開昭56−140886号公報
には、有機高分子化合物を利用してＴ細胞を分離回収す
る方法が提案されている。即ち、酸性官能基を有する粒
状体や微細孔を有する疎水性且つ水不溶性の粒状体、具
体的には、エチレン、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビ
ニル、スチレン、ジビニルベンゼン、アクリロニトリ
ル、メタクリル酸メチルの重合体若しくは共重合体又は
ナイロン、ポリカーボネート、ポリエステル等、疎水性
重合体又は共重合体及びこれらにスルホン基、カルボキ
シル基、ホスホン基若しくはフェノール基を導入した有
機高分子化合物を利用してＴ細胞を分離するものであ
る。
又、現在、国際的には架橋デキストラン・セルを用い
るセファデックスG10法が公認されている。この方法の
原理は、十分に解明されているわけではないが、細胞付
着性の差異に依存し、マクロファージやサイズが大きく
付着性を有するアクセサリー細胞が付着によって分離さ
れ、Ｔ細胞やＢ細胞は通過するものと考えられている。
他の具体例として、ナイロンウールを用いる分離カラ
ムが公認されている。この方法は、Ｔ細胞に富む分離細
胞群を得る手段として使用されている。
《発明が解決しようとする問題点》 しかしながら、上記の如き従来の技術によっては、細
胞浮遊液から所定の細胞を、そのポピュレーションを変
化させずに分離することは困難であり、また、免疫抑制
細胞、即ち、免疫抑制性リンパ球及び／又は免疫抑制因
子産生細胞を高純度、高回収率にて分離除去することも
困難であった。
更に、前記した特開昭57−204454号公報及び同56−14
0886号公報にて提案された細胞分離方法は、粒状体の平
均粒径が小さく、カラムが詰まり易いことの他、有機高
分子化合物又は残留低分子化合物が細胞活性に毒作用を
与えるという問題点がある。
また、セファデックスG10法では、非付着性の小型ア
クセサリー細胞は通過し、Ｔ細胞のサブポプュレーショ
ンのあるものは付着してしまうので、Ｔ細胞ポプュレー
ションを完全な形で得ることはできず、免疫診断上の問
題点となっている。
一方、ナイロンウールを使用する分離方法は、Ｔ細胞
に富む分離細胞群を得る手段としては有用である他、比
較的純度の高いＴ細胞が得られる等の評価がなされ、従
来多く活用されているものの、免疫抑制因子、即ち、免
疫抑制性リンパ球及び／又は免疫抑制因子産性細胞を分
離除去する場合には、純度75％、回収率20〜30％が限界
で、研究目的を別とすれば実用性がなく、分離の前後で
細胞浮遊液中のＴ細胞ポプュレーションが変化するとい
う難点を有している。
更に、この方法においてはナイロンウールの製造ロッ
トの違い、ウールのほぐし方、カラムへの詰め方或いは
洗浄の仕方によって分離能や分離パターンが変動すると
いう点において、有機材料系分離剤に共通の欠点をも有
している。
このように、細胞の付着性を利用する細胞分離方法
は、現在実用化が開始されたばかりであり、一層、高能
率、高速度、高精度の細胞分離方法を実現するための分
離方法及び分離剤の改良、或いは新分離剤の開発が強く
要求されている。
ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチルやナ
イロン、ポリカーボネート、ポリエステル系重合体等の
疎水性重合体やこれらの重合体にスルホン基、カルボキ
シル基、ホスホン基或いはヒドロキシ基等を導入した高
分子等を利用する場合も同様である。更に、これら有機
系の分離材を使用する細胞分離方法は、粒状体の平均粒
径が小さいのでカラムが詰まりやすく、又高分子中の残
留低分子物質が細胞活性に毒作用を及ぼすことがあると
いう問題点がある。
以上説明したように、免疫抑制細胞を高純度、高回収
率で分離除去して免疫機能の回復を達成するなどの実用
化を究極の目的として、この目的を達成し得る分離方法
自体の改良や分離剤の改良、特に新材料の開発が強く望
まれていた。
《発明の目的》 従って本発明の第１の目的は、実用上のレベル（純度
95％以上、回収率70％以上）にて免疫抑制性リンパ球及
び／又は免疫抑制産生細胞を分離除去し得る細胞分離能
及び分離精度が高い細胞分離剤を提供することに有る。
本発明の第２の目的は、再現性の高い細胞分離剤を提
供することにある。
本発明の第３の目的は、細胞分離操作を簡略化するこ
とのできる細胞分離剤を提供することにある。
本発明の第４の目的は、良好な細胞分離能を有し、分
離精度及び分離再現性に優れ、且つ、細胞分離操作を簡
略化することのできる細胞分離剤を製造する方法を提供
することに有る。
本発明の第５の目的は、簡単な操作性にもかかわら
ず、再現性良く、良好な細胞分離能と高い分離精度を発
揮することのできる細胞分離器を提供することに有る。
更に、本発明の第６の目的は、実用上のレベル（純度
95％以上、回収率70％以上）にて免疫抑制性リンパ球及
び／又は免疫抑制因子産生細胞を分離除去し得る免疫抑
制性リンパ球及び／又は免疫抑制因子産生細胞の除去方
法を提供することにある。
《問題を解決するための手段》 本発明者等は、上記の諸目的を達成すべく種々の検討
を行った結果、ハイドロキシ・アパタイト繊維体が免疫
抑制性リンパ球や免疫抑制因子産生細胞等の免疫細胞群
に対して優れた吸着活性を有することを見出し、本発明
に到達した。
《発明の構成》 即ち本発明は、ハイドロキシ・アパタイト繊維体から
なる細胞分離剤及び、水溶性高分子化合物の水溶液にハ
イドロキシ・アパタイトを均一に分散した溶液を紡糸液
とする、上記ハイドロキシ・アパタイト繊維体の製造方
法並びに、少なくとも該ハイドロキシ・アパタイト繊維
体を分離剤として使用する細胞分離器、並びに該細胞分
離器に免疫抑制性リンパ球及び／又は免疫抑制因子産生
細胞を含む細胞浮遊液を注入することにより、前記細胞
分離剤に免疫抑制性リンパ球及び／又は免疫抑制因子産
生細胞を吸着せしめて前記細胞浮遊液から免疫抑制性リ
ンパ球及び／又は免疫抑制因子産生細胞を分離除去す
る、免疫抑制性リンパ球及び／又は免疫抑制因子産生細
胞の除去方法である。
本発明で用いるハイドロキシ・アパタイト繊維体は、
平均繊維径が１μｍ〜100μｍであることが好ましい。
平均繊維径が１μｍ未満では、対象細胞の大きさとの関
係から細胞分離操作時の流れが悪く、詰まりやすいとい
う問題が生じ、平均繊維径が100μｍを超えると、吸着
表面積の低下に起因して分離能が低下するので好ましく
ない。又、ハイドロキシ・アパタイトの中でも、特にハ
イドロキシ・カルシウム・アパタイトが好ましい。
ハイドロキシ・カルシウム・アパタイトのCa/Pの理論
値は約1.66であるが、本発明においては、CaとＰの割合
が1.4≦Ca/P≦1.8の範囲のものを使用することができ
る。Ca/Pが上記範囲を外れると、吸着能が低下し、ひい
ては分離能が低下するので好ましくない。
本発明のハイドロキシ・アパタイト繊維体は、所謂溶
液紡糸の技術を使用して実質的にアパタイトのみからな
る不織布の形態で製造することができる。
即ち、本発明においてはバインダーとして機能する高
分子溶液にハイドロキシ・アパタイトを均一に分散せし
めて紡糸液とする。この場合に使用する高分子溶液とし
ては、溶液紡糸が可能な公知のものの中から任意に選択
することができるが、特に細胞分離に悪い影響を与える
ことを避けるという観点から、水溶性高分子を溶解した
水溶液を使用することが好ましい。
従って、本発明で使用するバインダーとしては、分子
中に−OH、−COOH、−CONH2基等を有する水に可溶な線
状高分子化合物が好ましい。このような高分子化合物と
しては、例えばマルトトリオースがα−1,6−グリコキ
シド結合により反復結合した直鎖状グルカンであるプル
ラン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポ
リアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリイタコン酸、ポ
リエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニ
ルメチレンエーテル、ヒドロキシプロピルセルロース、
キサンタンガス、ガーガム、コラーゲン、ヒドロキシエ
チルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を上げ
ることができる。これらの高分子化合物の分子量には特
に制限はないが、２万〜200万のものが好ましく、特に
５万〜100万のものが好ましい。
本発明においては、ポリビニルアルコール、カルボキ
シメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、
コラーゲン及びプルラン等が好ましく特にプルランの如
き多糖類が最適である。これらのバインダーは、２種以
上を混合して使用することもできる。
本発明で使用するハイドロキシ・アパタイトは公知の
方法で合成したもの又は天然のものを粒径50Å〜１μｍ
の微粒子状に粉砕して使用する。この場合、アパタイト
の形状は特に限定されないが、特に棒状のものを使用し
た場合には、焼成後不織布の形状を取ることが容易であ
り好ましい。この理由は必ずしも明らかではないが、棒
状のアパタイトは紡糸工程で配列しやすいためと推定さ
れる。このような棒状のアパタイトは、例えばカルシウ
ムイオンを含むアルカリ性溶液（pH:7〜11）に燐酸水溶
液を徐々に滴下することにより合成することができる。
本発明においては、上記バインダーの水溶液にハイド
ロキシ・アパタイトを分散させた分散液を原料とする
が、この原料液の組成は、水が10重量％〜90重量％、好
ましくは50重量％〜70重量％、更に好ましくは60重量％
〜65重量％、ハイドロキシ・アパタイトが５重量％〜70
重量％、好ましくは15重量％〜30重量％、更に好ましく
は15重量％〜20重量％であり、バインダーが５重量％〜
40重量％、好ましくは15重量％〜30重量％、更に好まし
くは20重量％〜25重量％である。
上記原料液を調製する場合には、必要に応じて可塑剤
又は柔軟剤として、水の他にグリセリン、ソルビトー
ル、マルチトール、エチレングリコール、ポリプロピレ
ングリコール等の多価アルコールを添加することができ
る。又、水溶液中の分散質の分散を良好なものとするた
めに、有機カルボン酸を添加することもできる。
本発明においては、約20℃〜約70℃の温度範囲で上記
の原料液を調製することが好ましい。
本発明の繊維体を製造する方法の１例として、次にそ
の概要を述べる。
まず第１に、ハイドロキシ・アパタイトをバインダー
である水溶性若しくは水分散性高分子化合物の水溶液に
分散せしめた原料液に、更に必要に応じて可塑剤及び又
は柔軟剤を添加して調整した水溶液若しくは水可塑溶融
液を、細孔を有する複数個の溶融体紡糸ノズルを巾方向
に直線的に配列したダイスより押し出すと同時に、該ノ
ズル廻りより流出速度約5m/秒〜約1000m/秒、温度約20
℃〜約60℃の気体、例えば空気を噴出させることによ
り、延伸された極細繊維からなる繊維流を形成せしめ
る。この場合の繊維の径は、上記噴出する気体の流出速
度により、例えば約１μｍ〜約100μｍの範囲に入るよ
うに、任意に調節することができる。
次に、上記の繊維流を、ダイス下に設けられた加熱装
置、例えば遠赤外線ヒーター、赤外線ヒーター又はマイ
クロ波加熱器等により加熱し、繊維中の水分を含水率10
重量％以下、好ましくは約７重量％以下に蒸発除去して
固化させる。水分の除去が不十分であると極細繊維体を
得ることができない。この場合、繊維流に対する加熱温
度は、原料液の押し出し量、噴出気体の温度及び風量の
バランス等により選択されるが、通常は約80℃〜約150
℃の範囲である。加熱温度を必要以上に高くした場合に
は、加熱工程においてバインダーの分解が発生する場合
があるために好ましくない。
上記のようにして、延伸され且つ水分が除去された極
細繊維流を、移動する捕集装置、例えばネット型の回転
ドラム、移動ベルト等の上に交絡するように落下させる
ことにより線状の繊維体を得ることができる。この場
合、繊維流を、回転する２個のネット型捕集ドラムの接
点に吹き付け落下させた場合には、交絡した繊維が不織
布の厚さ方向（即ち３次元的に）に配列した崇高の綿状
体が得られる。又、繊維流を上記捕集ドラムの接点以外
の箇所又は平板状の捕集ベルト等に吹き付け落下させた
場合には、繊維が平面に平行（即ち２次元的に）に配列
した線状体が得られる。又、不織布の目付重量は、上記
繊維流の捕集装置の移動速度を変えることにより、例え
ば5g/m2/500g/m2の範囲となるように、任意に調節する
ことができる。
本発明においては、上記の未焼成の繊維体をバインダ
ーの高分子化合物を適宜溶解除去した後そのまま細胞分
離剤として使用することができるが、これは更に焼成し
て用いることもできる。焼成温度は、細胞分離剤として
使用する条件によって、一概に決めることはできない
が、通常、焼成は約200℃〜約1350℃の温度、特に約400
℃〜約1200℃で行うことが好ましい。焼成温度が1200℃
以下ではハイドロキシ・アパタイトの水酸基の消失は極
めて少量であり、焼成時間に多少依存するとは言え、水
酸基の消失は殆ど無視することができる程度である。従
って必要な場合には、焼成温度を約1100℃〜約1250℃に
設定することにより、繊維体の中のハイドロキシ・アパ
タイトの含有量を調節することができる。例えば、ハイ
ドロキシ・カルシウム・アパタイトの一部は焼成により
Ca3（PO4）２に変化するので、これにより細胞に対する
付着能のみならず、得られたアパタイト繊維体の強度等
の物性をも調整することができる。
本発明のハイドロキシ・アパタイトには上記の如くCa
3（PO4）２が含有される場合も包含される。
次に、本発明のハイドロキシ・アパタイト繊維体の製
造方法を第２図に従って説明する。
第２図は、本発明の繊維体の製造装置を例示した側面
略図である。この装置は、原料タンク（２）、モーター
（３）、ギヤポンプ（４）、紡糸ノズル（５）、ブロア
ー（６）、エアノズル（７）、遠赤外線ヒーター
（９）、ネット型捕集ドラム（11）、巻き取り装置（1
3）、リフター（14）及び管路（15）から構成されてい
る。
原料タンク（２）には、原料供給管（１）を通してア
パタイト粒状物を含有する水性懸濁液と特定の水溶性バ
インダーとの混合溶液である粘性液体が供給される。こ
の粘性液体は管路（15）を介して、モーター（３）によ
って駆動するギアポンプ（４）により紡糸ノズル（５）
から押し出されると同時に、紡糸ノズル廻りに設置され
たエアノズル（７）からブロアー（６）で空気を高速度
で吐出させ、下向きに吹き付けられて延伸された繊維流
（８）を形成させる。繊維流（８）はネット型捕集ドラ
ム（11）に落下補集される間に遠赤外線ヒーター（９）
からなる加熱装置で加熱されて繊維中の水が蒸発除去さ
れる。水分の除去された繊維流（10）は２個のネット型
補集ドラム（11）の接点に交絡して落下し綿状の繊維体
を形成する。
以上の如くして得られたハイドロキシ・アパタイト繊
維体が免疫抑制性リンパ球や免疫抑制因子産生細胞等の
免疫細胞群に対して示す吸着性は、この物質が本来脊椎
動物の骨成分と同一物質である事実に由来するものと考
えられる。この物質は、バイオアクチブ・マテリアルで
あり、生きた細胞に対するその特異的吸着性、接着性及
びその制御可能性においてこの右に出得る材料はなく、
付着性細胞分離剤として最適である。
本発明においては、ハイドロキシ・アパタイト繊維体
の表面に、例えば生体由来のヒアルロン酸、コンドロイ
チン硫酸、キチン誘導体、フィブロネクチン、オステオ
ネクチン等の多糖体やムコ多糖体、及び／又はその誘導
体を部分吸着させ、基質表面の物理化学的性質あるいは
免疫学的性質を改質して、対象細胞群のそれぞれに対す
る吸着活性を巧妙に変化させることもできる。これによ
って、カラムの分離特性を効果的に変化させ、シャープ
な溶出パターンを与える分離特性や、分離スペクトラム
の制御を行うことが可能となる。更に、細胞のサブポピ
ュレーションの各々に対する吸着効果が改善されて、特
定のサブポピュレーションを選択分離することも可能と
なる。実際の使用に際しては、細胞浮遊液の流出入口を
有するカラムに、細胞分離剤として、少なくともハイド
ロキシ・アパタイトの繊維体を使用することにより、容
易に高性能の細胞分離器を作製することができる。更
に、大量の細胞を処理するカラムに対しては、多段のカ
スケード構造の利用や、吸着特性の不均一分布構造の利
用、あるいはＵ字管方式の利用により、細胞浮遊液の通
過スピードの自在な制御も可能となる。微細な分離パタ
ーンを得るために、無重力下の対流フリー、純拡散のみ
のカラム通過を行うこともできる。
繊維状アパタイトと顆粒状アパタイトを夫々充填し
て、２段充填方式とすることもでき、更にこの場合、繊
維状アパタイトからなる充填層及び顆粒状アパタイトか
らなる充填層のいずれの層を上段又は下段とするかにつ
いても、任意に選定することができるが、特に繊維状ア
パタイトを上段に配することが好ましい。
この場合に使用するハイドロキシ・アパタイトの顆粒
体は、平均粒径約１μｍ〜約2,000μｍのものであり、
好ましくは約50μｍ〜約2,000μｍ以下である。
この顆粒体は焼成されたものであり、その焼成温度は
約600℃〜約1,350℃とすることが好ましい。又、焼成体
のCaとＰの配合比は、1.4≦Ca/P≦1..8とすることが好
ましいが、この粒状体の製造法は特に限定されるもので
はない。
本発明によれば、少なくとも上記ハイドロキシ・アパ
タイト繊維体からなる細胞分離剤を充填した細胞分離器
は免疫抑制性リンパ球や免疫抑制因子産生細胞等の特定
細胞を高純度・高回収率で除去することができるので、
免疫抑制性リンパ球及び／又は免疫抑制因子産生細胞を
除去するのに、本発明は極めて有用である。
《発明の効果》 本発明によれば、細胞を免疫的に刺激することなく、
免疫抑制性リンパ球及び／又は免疫抑制因子産生細胞を
純度95％以上、回収率70％以上にて分離除去することが
できるなど、従来法に比べて極めて安定且つ高い分離能
を持って細胞を分離することができる。又、分離操作は
大きく簡略化され、分離の所要時間は従来法の数分の一
あるいは十数分の一に短縮される。すなわち、分離剤の
保水率が極めて小さいのでワンステップ法が利用でき、
直接細胞浮遊液を流し込むことができる上、目的によっ
ては洗浄も不要である。滅菌されたカラム（小規模の目
的には注射器でよい）と滅菌された分離剤（100℃〜500
℃の任意の温度で加熱滅菌可）を用いることにより、分
離剤のカラムへの装着を極めて容易且つ短時間で使用可
能にセットすることができるので、準備操作の面でも極
めて経済的である。特に本発明で使用する繊維状アパタ
イトは、マイクロファージ混入率が小さいので、純度の
高いＴ細胞のみを回収することができる。又モノサイト
の混入を最小限に押さえることができるので陽性率が高
い。使い捨てカラムに分離剤等を詰めて完全滅菌条件下
で市場に提供することも極めて容易である。
更に本発明に係る細胞分離剤及び細胞分離器は上述し
た性質を有するため、免疫抑制性リンパ球及び／又は免
疫抑制因子産生細胞の有効な除去方法を提供するもので
ある。
《実施例》 以下、本発明をリンパ細胞の分離に適用した実施例を
挙げるが、本発明は他の付着性細胞にも適用可能であ
る。
なお、以下の実施例は、いずれも第１図に示すような
細胞分離器を用いて実施したものである。この細胞分離
器は、細胞浮遊液の入口20及び出口25を有するカラム21
内にフィルター24（プラスチック、ガラス、セラミック
ス等の通気性多孔体や繊維が用いられる）が配置され、
それにハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体か
らなる分離剤２が充填されてできている。
実施例1. 内容積10mlのカラムにガラスウール0.02gを0.8mlにな
るように詰め、これに1,000℃で焼成した平均繊維径10
〜15μｍのハイドロキシ・カルシウム・アパタイト繊維
焼結体（Ca/P＝1.66）0.7gを1.5mlになるようにタップ
しながら充填し、細胞分離器とした。
細胞分離器の洗浄は、初め生理食塩水を流し、次に37
℃に保温した培地（RPMI−1640）を流し、最後に37℃に
保温したウシ胎児血清を10％含む培地（RPMI−1640）を
流すことによって行った。
次に予め比重遠心法により正常人末梢血から分離した
単核細胞をウシ胎児血清を10％含む培地（RPMI−1640）
に浮遊させ、その0.4mlをカラムにのせ、浸透させて37
℃で１時間インキュベートした。その後、培地（RPMI−
1640）で細胞を流出させた。
カラム通過前後の細胞数をヘモサイトメーターを用い
て数え、細胞の回収率を調べた所75％の回収率を得た。
本発明で使用したハイドロキシ・カルシウム・アパタ
イト繊維焼結体のかわりにナイロンウールを使用した従
来の細胞分離器の場合の細胞回収率約30％と比較する
と、本発明の場合が極めて良好であることは明らかであ
る。
実施例2. 内容積5mlのカラムにガラスウール0.02gを0.8mlにな
るように詰め、これに1,100℃で焼成した平均繊維径５
〜10μｍのハイドロキシ・カルシウム・アパタイト繊維
焼結体（Ca/P＝1.66）0.2gを0.7mlになるようにタップ
しながら充填し、細胞分離器として実施例１と同様の試
験を行い、82％という高い細胞回収率を得た。
実施例3. 内容積5mlのカラムにガラスウール0.02gを0.8mlにな
るように詰め、これに100℃で焼成した平均繊維径５〜1
0μｍのハイドロキシ・カルシウム・アパタイト繊維焼
結体（Ca/P＝1.66）0.15gを0.5mlになるようにタップし
ながら充填し、細胞分離器として実施例１と同様の試験
を行った。細胞回収率は74％であった。
実施例4. 内容積5mlのカラムにガラスウール0.02gを0.8mlにな
るように詰め、これに700℃で焼成した平均粒径400〜50
0μｍのハイドロキシ・カルシウム・アパタイト顆粒焼
結体（Ca/P＝1.67）0.35gを0.4mlになるようにタップし
ながら充填し、更にその上部に、1,000℃で焼成した平
均繊維径５〜10μｍのハイドロキシ・カルシウム・アパ
タイ繊維焼結体（Ca/P＝1.66）0.15gを0.4mlになるよう
にタップしながら充填し、細胞分離器として（第１
図）、実施例１と同様の試験を行い80％の細胞回収率を
得た。
実施例5. 内容積5mlのカラムにガラスウール0.02gを0.8mlにな
るように詰め、これに700℃で焼成した平均粒径400〜50
0μｍのハイドロキシ・カルシウム・アパタイト顆粒焼
結体（Ca/P＝1.67）0.35gを0.4mlになるようにタップし
ながら充填し、更にその上部に1,000℃で焼成した平均
繊維径５〜10μｍのハイドロキシ・カルシウム・アパタ
イト繊維焼結体（Ca/P＝1.66）0.1gを0.4mlになるよう
にタップしながら充填した他は実施例４と同様にして、
細胞分離器とし、実施例１と同様の試験を行った。細胞
回収率は84％であった。
実施例6. 実施例１〜５の細胞分離器を用いて、Ｔ細胞、Ｂ細胞
及びモノサイトの陽性率（％）を測定した結果、各々の
場合について表１の結果を得た。
測定は、カラム通過後の細胞を螢光標識抗体Leu1,Leu
12,LeuM3でラベルし、活性細胞螢光検知器（Flourescen
ce Activated Cell Sorter）を用いて行った。
比較例1. 内容積5mlのカラムにガラスウール0.02gを0.8mlにな
るように詰め、これに700℃で焼成した平均粒径400〜50
0μｍのハイドロキシ・カルシウム・アパタイト顆粒焼
結体（Ca/P＝1.67）0.8gを0.8mlになるようにタップし
ながら充填し、細胞分離器として実施例６と同様に試験
を行った。結果は表１に示した通りである。
比較例2. 比較例１のハイドロキシ・カルシウム・アパタイト顆
粒焼結体の替わりにナイロンウールを使用した結果は表
１に示す通りである。
表１の結果からアパタイト繊維体を使用した場合に
は、モノサイトを極めて低く押さえられることが実証さ
れた。
実施例７〜９ 内容積1mlのツベルクリン注射筒をカラムに用い、細
孔部と接続されたカラム底部に、フィルターとしてガラ
スウール（10〜20μｍ）0.02gを0.02mlになるように詰
め、次いで700℃で焼成したアパタイト顆粒体（400〜60
0μｍ）0.4gを0.4mlになるように充填し、その上部に1,
100℃で焼成したアパタイト繊維体（５〜20μｍ）0.2g
を0.4mlになるように充填し、細胞分離器を形成した。
細胞分離器を使用する前に予め実施例の場合と同様の
洗浄を行った。
次に、正常人末梢血からFicll−Isopaque比重遠心法
によりリンパ球を分離し、分離した細胞２×107個をウ
シ胎児血清を10％含む培地（RPMI−1640）0.2mlに浮遊
させて、細胞浮遊液を調製した。
調整細胞浮遊液を前記カラムに重層し、浸透させた後
培地（RPMI−1640）5mlを流し、細胞を流出させた。流
出してきた細胞を用い、螢光標識抗体法で解析した。使
用した螢光標識抗体は、Leu2及びLeu15（藤沢薬品）
で、two color染色を行った。
表２に細胞分離器通過前と通過後におけの免疫抑制細
胞の含有百分率を示す。
実施例10〜12. 実施例７で使用した正常人末梢血から分離したリンパ
球の代わりに、聴神経腫瘍患者、上顎癌患者、結腸癌患
者の各々の末梢血から分離したリンパ球を使用した他は
実施例７と同様にして、表２に示す結果を得た。
実施例13. 実施例10で使用したリンパ球の代わりに、正常人の末
梢血（ヘパリン入り）を生理食塩水で２倍に希釈し、そ
の5mlを上記洗浄後の細胞分離器に注入し、流出してき
た緩衝塩化アンモニウム溶液で赤血球を溶血して、リン
パ球を分離した他は実施例７と同様にして表２に示す結
果を得た。
表２の結果から明らかなように、本発明に係る細胞分
離器は免疫抑制性リンパ球、免疫抑制因子産生細胞の除
去性能に優れていることが実証された。又、本発明の細
胞分離器の細胞回収率も70％程度と良好であった。
実施例14 ８週令のラット10匹にラットの癌であるWalker256細
胞を各１×107個移入した。移入３日後に右大腿部静脈
から血液を取り出し、実施例１と同様の細胞分離器に通
し、左大腿部静脈に戻す循環を１時間継続した。この時
ヘパリンを使用し、血液が途中でかたまらないように注
意した。循環４日目にヒツジ赤血球（SRBC）を使用し足
蹠試験を行い、循環したラットと循環していないラット
の免疫機能と遅延型過敏症を調べた。この後、ラットが
いつまで生き続けるか調べた。
表３から明らかなように、循環を行うことにより免疫
機能抑制因子を除去し免疫機能を正常にするばかりでな
く、生存日数も1.5倍延長できたことから、本発明にか
かる細胞分離剤及びそれを使用した細胞分離器の効果が
証明された。
尚、このような免疫抑制リンパ球を特異的に吸着する
性質を有する本発明の細胞分離器に血液を流し循環させ
る方法により、免疫機能の回復が可能となり、又、血液
循環を行いながら制癌剤を投与することにより制癌効果
も期待することができるという２次的効果もある。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の細胞分離器の１例である。図中、符号
21はカラム、22はハイドロキシ・アパタイト繊維、23は
ハイドロキシ・アパタイト顆粒、24はガラスフィルター
である。 第２図は、本発明のハイドロキシ・アパタイト繊維体を
製造するための装置の１例を示す側面略図である。図に
おいて、符号１は原料供給管、２は原料タンク、３はモ
ーター、４はギアーポンプ、５は紡糸ノズル、６はブロ
アー、７はエアノズル、８は脱水前の繊維流、９は遠赤
外線ヒーター、10は脱水後の繊維流、11はネット型捕集
ドラム、12は繊維体、13は巻き取り装置、14はリフタ
ー、15は管路である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−31621（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−198458（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−235752（ＪＰ，Ａ)

Claims (21)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ハイドロキシ・アパタイト繊維体からなる
    ことを特徴とする細胞分離剤。
  2. 【請求項２】ハイドロキシ・アパタイト繊維体がハイド
    ロキシ・カルシウム・アパタイト繊維体である特許請求
    の範囲第１項に記載の細胞分離剤。
  3. 【請求項３】ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト繊
    維体が平均繊維径１μｍ〜100μｍである特許請求の範
    囲第２項に記載の細胞分離剤。
  4. 【請求項４】ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト繊
    維体に含有されるカルシウムとリンの比（Ca/P）が1.4
    〜1.8である特許請求の範囲第２項に記載の細胞分離
    剤。
  5. 【請求項５】水溶性高分子化合物の水溶液にハイドロキ
    シ・アパタイトを均一に分散せしめ、得られた分散液を
    細孔を有する紡糸ノズルを配列したダイスより押し出す
    と同時に、該ノズル廻りより圧縮気体を噴出せしめるこ
    とにより、延伸された繊維からなる繊維流を形成せし
    め、次いで該繊維流を100℃以上に加熱して繊維中の水
    分を除去し、捕集装置の上に交絡するように落下せしめ
    ることを特徴とするハイドロキシ・アパタイト繊維体か
    らなる細胞分離剤の製造方法。
  6. 【請求項６】水溶性高分子化合物の水溶液にハイドロキ
    シ・アパタイトを均一に分散せしめ、得られた分散液を
    細孔を有する紡糸ノズルを配列したダイスより押し出す
    と同時に、該ノズル廻りより圧縮気体を噴出せしめるこ
    とにより、延伸された繊維からなる繊維流を形成せし
    め、次いで該繊維流を100℃以上に加熱して繊維中の水
    分を除去し、捕集装置の上に交絡するように落下せしめ
    て得られた細胞分離剤を、更に200℃〜1,350℃で焼成す
    る、特許請求の範囲第５項に記載のハイドロキシ・アパ
    タイト繊維体からなる細胞分離剤の製造方法。
  7. 【請求項７】焼成温度が400℃〜1,200℃である特許請求
    の範囲第６項に記載のハイドロキシ・アパタイト繊維体
    からなる細胞分離剤の製造方法。
  8. 【請求項８】細胞浮遊液の流出入口を有するカラムに、
    分離剤として、ハイドロキシ・アパタイト繊維体を充填
    したことを特徴とする細胞分離器。
  9. 【請求項９】ハイドロキシ・アパタイト繊維体がハイド
    ロキシ・カルシウム・アパタイト繊維体である特許請求
    の範囲第８項に記載の細胞分離器。
  10. 【請求項１０】ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト
    繊維体の平均繊維径が１μｍ〜100μｍである特許請求
    の範囲第９項に記載の細胞分離器。
  11. 【請求項１１】分離剤として、ハイドロキシ・アパタイ
    ト繊維体の他にハイドロキシ・アパタイトの顆粒を併用
    する特許請求の範囲第８項乃至第10項の何れかに記載の
    細胞分離器。
  12. 【請求項１２】分離剤として、ハイドロキシ・アパタイ
    ト繊維体の下部にハイドロキシ・アパタイトの顆粒を充
    填した特許請求の範囲第11項に記載の細胞分離器。
  13. 【請求項１３】ハイドロキシ・アパタイトの顆粒が平均
    粒径１μｍ〜2,000μｍである特許請求の範囲第11項又
    は第12項に記載の細胞分離器。
  14. 【請求項１４】ハイドロキシ・アパタイトの顆粒が平均
    粒径50μｍ〜2,000μｍである特許請求の範囲第13項に
    記載の細胞分離器。
  15. 【請求項１５】細胞浮遊液の流出入口を有するカラム
    に、細胞分離剤として、ハイドロキシ・アパタイト繊維
    体を充填した細胞分離器に、免疫抑制性リンパ球及び／
    又は免疫抑制因子産生細胞を含む細胞浮遊液を注入する
    ことにより、前記細胞分離剤に免疫抑制性リンパ球及び
    免疫抑制因子産生細胞を吸着せしめ、前記細胞浮遊液か
    ら免疫抑制性リンパ球及び／又は免疫抑制因子産生細胞
    を分離除去することを特徴とする、免疫抑制性リンパ球
    及び／又は免疫抑制因子産生細胞の除去方法。
  16. 【請求項１６】ハイドロキシ・アパタイト繊維体がハイ
    ドロキシ・カルシウム・アパタイト繊維体である特許請
    求の範囲第15項に記載の免疫抑制性リンパ球及び／又は
    免疫抑制因子産生細胞の除去方法。
  17. 【請求項１７】ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト
    繊維体の平均繊維径が１μｍ〜100μｍである特許請求
    の範囲第16項に記載の免疫抑制性リンパ球及び／又は免
    疫抑制因子産生細胞の除去方法。
  18. 【請求項１８】分離剤として、ハイドロキシ・アパタイ
    ト繊維体の他にハイドロキシ・アパタイトの顆粒を併用
    する特許請求の範囲第15項乃至第17項の何れかに記載の
    免疫抑制性リンパ球及び／又は免疫抑制因子産生細胞の
    除去方法。
  19. 【請求項１９】分離剤として、ハイドロキシ・アパタイ
    ト繊維体の下部にハイドロキシ・アパタイトの顆粒を充
    填した特許請求の範囲第18項に記載の免疫抑制性リンパ
    球及び／又は免疫抑制因子産生細胞の除去方法。
  20. 【請求項２０】ハイドロキシ・アパタイトの顆粒が平均
    粒径１μｍ〜2,000μｍである特許請求の範囲第18項又
    は第19項に記載の免疫抑制性リンパ球及び／又は免疫抑
    制因子産生細胞の除去方法。
  21. 【請求項２１】ハイドロキシ・アパタイトの顆粒が平均
    径50μｍ〜2,000μｍである特許請求の範囲第20項に記
    載の免疫抑制性リンパ球及び／又は免疫抑制因子産生細
    胞の除去方法。
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