DE3034529C2 - Leukorekrutin: Ein Entzündungsmediatorprotein aus Säugerserum zur Induzierung einer Leukozytosereaktion, Herstellungsverfahren, Gewinnung in molekular einheitlicher, kristallisierbarer und biologisch spezifisch wirkender Form und Leukorekrutin enthaltendes Arzneimittel - Google Patents

Description

Tabelle I

Wellenlänge, nm

] mg. I cm(ll2O. 20°C)

^± 6%

250 (min)

260

277 (max)

280

290

400-1000

0,36

0.42

0,54

0,53

0,32

1,26

45

50

55

2. Verfahren zur Herstellung Gewinnung des Leukozytose induzierenden.Proteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Säugerserum einer regulierten und limitierten Proteolyse durch Kontaktaktivierung unterwirft, anschließend das Protein in Form eines Serumproteinrohkonzentrates von den anderen Bestandteilen und Fremdroteinen des Serums abtrennt, dann das Protein durch Chromatographie an Hydroxylapatit von anderen Serumproteinen abgetrennt und dadurch das Leukorektrutin gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des Serutnproteinrohkonzentrates das kontaktaktivierte, Leukorekrutin enthaltende Säugerserum einem Kationenaustauscheraintopf- oder -chromatographieverfahren unterwirft.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Chromatographie an Hydroxylapatit einen Teil der Leukorekrutin begleitenden Fremdproteine aus dem kontaktaktiviertem Serum oder aus dem erhaltenen Serumproteinrohkonzentrat durch Positivadsorption an Calciumphosphatgel abtrennt.

5. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Chromatographie an Hydroxylapatit einen Teil der Leukorekrutin begleitenden Fremdproteine aus dem kontaktaktiviertem Serum oder dem erhaltenen Serumproteinrohkonzentrat durch Negativadsorption und/oder Ionenaustauscherchromatographie an einem Anionenaustauscher vom positiv adsorbierten Leukorekrutin abtrennt.

6. Verfahren nach Ansprach 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Chromatographie an Hydroxylapatit einen Großteil der das Leukorekrutin begleitenden Fremdproteine aus dem kontaktaktiviertem Serum oder aus dem erhaltenen Serumproteinrohkonzentrat durch fraktioniertes Eluieren und/oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol und/oder mindestens eine Molekularsiebfiltration abtrennt.

7. Verfahren nach Anspruch 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das durch Chromatographie an Hydroxylapatit erhaltene Leukozytose induzierende Protein durch Kreislaufmolekularsieb-, filtration und/oder Rechromatographie an Hydroxylapatit und/oder Zonenpräzipitationschromatographie und/oder analytische Molekularsiebfiltration weiter reinigt.

8. Arzneimittel zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes des Körpers, von Säugern, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Leukozytose induzierenden Protein nach Anspruch 1 und übliche Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffe.

9. Verwendung des Leukozytose induzierenden Proteins nach Anspruch 1 zur Herstellung von anti-Leukorektrutin-Antikörperseium und dessen Immunglobulinfraktionen.

Die Zerstörung von körpereigenem Gewebe bei Entzündungen, welche durch nicht-immunologische und/oder durch immunologische Prozesse verursacht werden, führt zur Bildung verschiedener endogener Substanzen (Mediatoren und Hormone). Sie regulieren die komplexen Einzelschritte der Aktivierung des Entzündungs- und des Gewebereparaturprozesses. Die Mediatoren entstehen entweder durch begrenzte und regulierte Proteolyse von Plasma- oder Serumfaktoren als humorale Mediatoren, oder sie werden durch aktive Sekretion und/oder Zell-Lyse aus Zellen und Geweben als zelluläre Mediatoren freigesetzt. Sie sind Teil des Körperabwehrsystems, dessen systemische und lokale Aktivierung sie mitregulieren. Die Mediatoren tragen dadurch zur Entfernung und Entgiftung der zerstörten körpereigenen Stoffe und/oder der eingedrungenen

Fremdkörper bei. Ferner ermöglichen sie durch Regulierung der Zellteilungs- und Gewebewachstumsprozesse bei der Wundheilung die Wiederherstellung der pyhsiologischen Funktionen des Organismus. Wie die klassischen Hprmone endokriner Drüsen sind auch die Entzündungsmediatoren Stoffe, die nur in sehr geringer Konzentration als Spuren im Gewebe oder im Blut vorhanden sind.

Bei der Aktivierung des Kinin-, des Koagulations- und des Komplementsystems sowie anderer Blutprotein- und Zellfaktoren entsteht eine Vielzahl von Mediatoren, die für die verschiedenartigsten biologischen Aktivitäten des aktivierten Serums verantwortlich sind. Die Leukozytosereaktion (Leukozytenmobilisierung und -rekrutierung aus dem Knochenmark in das Blut) ist eine derartige, durch Mediatorwirkung ausgelöste Reaktion. Die Rekrutierung von Leukozyten aus dem Knochenmark ist ein gemeinsames Merkmal von akuten Entzündungsprozessen, beispielsweise bakteriellen Infektionen oder dem Infarkt des Herzmuskels. Die Leukozytosereaktion ist ein Teil eines Regelkreises des Abwehrsystems des Körpers, welcher die strukturelle und funktionell Bereitschaft des Organismus zur Gewebereparatur aufrechterhält. .

Die Leukozytosereaktion, d. h. die Mobilisierung und Rekrutierung von Leukozyten aus ihren Produktionsund Vorratsstätten ist ein Vorgang, der klar unterschieden werden muß von einer Reaktion, bei welcher die Richtung der Wanderung der Leukozyten bestimmt wird durch chemische Substanzen in ihrer Umgebung (diese Reaktion wird als »Chemotaxis« bezeichnet), sowie auch von einer Reaktion, bei der die statistische Bewegung der Leukozyten beeinflußt (gehemmt oder angeregt) wird (diese Reaktion wird als »Chemokinesis« bezeichnet).

Für den normalen konstanten Bereich der Blutleukozytenkonzentration wurden zwei negative Rückkopplungsmechanismen postuliert. Einer davon soll für die Produktion der Zellen im Knochenmark verantwortlich sein, der andere für die Abgabe der Zellen in das Blut; vgl. D. R. Boggs, Annu. Rev. Physiol., Bd. 28 (1966), S. 39. In diesen Regelkreisen sollten auch humorale Mediatoren eine Rolle spielen; vgl. V. Menkin, Biochemical Mechanisms in Inflammation, 2. Ausgabe, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1956. V. Menkin zeigte dann auch zum ersten Mal, daß lösliche Mediatoren in den Mechanismen ebenfalls mitwirken, welche die Blutleukozytynkonzentration über de;i normalen Bereich erhöhen (Leukozytosereaktion). Er isolierte auch ein kristallisierbares, aber damals nicht näher charakterisiertes Protein aus Entzündungsexudaten, das in vivo eine Leukozytosereaktion auslösen konnte.

In diesen frühen Versuchen, welche ein wertvolles Gedankengut über die Bildung und mögliche Wirkungsweise von Entzüdungsmediatoren lieferten, konnte aber damals einerseits weder ausgeschlossen werden, daß die Verunreinigung mit bakteriellen Endotoxinen die den Proteinpräparaten zugeschriebenen Aktivitäten stimuliert hatten (vgl. D. R. Boggs, a.a.O. [1966]), noch konnte andererseits ausgeschlossen werden, daß Verunreinigungen mit anderen Spurenproteinen Artefaktaktivitäten bewirkten, da damals die heute zur Verfügung stehenden Methoden zur selektiven Reinigung komplizierter Gemische und Analyse der molekularen Einheitlichkeit von Proteinen nicht zur Verfügung standen.

Zahlreiche verschiedene Faktoren können eine Leukozytosereaktion im Organismus auslösen. Dazu

gehören Infektionen, Immunreaktionen, mechanische Gewebeschädigungen, psychischer Stress oder auch die Aufnahme üppiger Mahlzeiten.

Hauptforschungsproblem war deshalb die Entwicklung zuverlässiger in vitro Testsysteme, welche zu in vivo Testsystemen der Leukozytosereaktion korrelierbare Ergebnisse erbrachten. A. S. Gordon und Mitarbeiter (Ann. N. J. Acad. Sei. Bd. 113 [1964], S. 766) entwickelten ein solches aufwendiges in vitro Testsystern. Sie erhielten damit einen Leukozytose induzierenden Plasmafaktor. Seine Natur wurde nicht näher aufgeklärt und seine Funktion muß eher als Teil der Rückkopplungsmechanismen gesehen werden, welche erniedrigte Blutleukozytenkonzentrationen (Leukopenien) zum Normalwert korrigieren helfen können.

K. Rother, Eur. J. Immunol., Bd. 2 (1972), S. 550 bis 558, entwickelte ein anderes, einfacheres in vitro Testsystem zum Nachweis der Leukozytenmobilisierung aus dem Knochenmark. Er hat als erster die Ansicht vertreten, daß ein humoraler Faktor aus der dritten Komponente des Komp'ementsystems bei der Leukozytosereaktion eine Rolle spielt. Als Folge dieser Erke-ntnisse wurden Proteinpräparate hergestellt, die aber entweder nicht näher charakterisiert wurden, molekular nicht einheit-Hch waren und/oder biologisch nicht spezifisch sind. Auch waren die Methoden zu deren Gewinnung ungeeignet, um wägbare Mengen eines Mediators der Leukozytosereaktior. zu erhalten. Neue Erfahrungen mit EntzündungsmeGiatoren zeigen (vgl. j. H. Wissler, Eur. J. Immunol., Bd. 2 [1972], S. 73-96), daß diese Spurenstoffe sind, welche im nanomolekularen Konzentrationsbereich aktiv sind. Zu ihrer Herstellung in molekular einheitlicher Form in wägbaren Mengen sind Reinigungsverfahren notwendig, weiche große Volumina an Ausgangsmaierial leicht handhaben lassen.

Aus kleinen Serumvolumina von Kleintieren wurde beispielsweise eines dieser Proteinpräparate durch Aktvierung des Serumkomplementsystems hergestellt und mit einer fraktionierten Ammoniumsulfatfällung, einer Elektrophorese und einer Molekularsiebchrcmatographie angereichert; vgl. K. Rother, a.a.O. Dieses Proteinpräparat induziert den Austritt von Leukozyten aus einem isolierten Rattenfemur in vitro sowie eine Leukozytosereaktion in vivo. Die Leukozytosereaktion in vivo scheint komplex zu sein. Sie ist zweiphasisch und nur teilweise durch ein Antikörperserumpräparat zur Komplementkomponente C3 inhibierbar; vgl. K. Rother u. Mitarb., Z. Immun.-Forsch.-Immunbiology, Bd. 155 (1978), S. 55.

Ein ähnliches Proteinpräparat (Molekulargewicht 10 000 bis 12 000 Daltons) wurde von B. Ghebrehiwet und J. H. Müller-Eberhardt, J. ImmunoL, Bd. 123 (1979), S.616 bis 62!, durch Spaltung eines Präparates der Komplemcntkomponente C3 mit Trypsin hergestellt. Dieses Präparat wurde durch Elektrophorese oder alternativ über einen lonenaustauscherschritt und eine Elektrophorese gereinigt. Das Proteinpräparst enthält kein Tyrosin als Aminosäure-Sirukturkomponente; vgl. B. Ghebrehiwet und J. H. Müller-Eberhardt, a.a.O (1979). Das Proteinpräparat mobiliert Leukozyten in vitro und induziert eine Leukt zytosereaktion bei Kaninchen in vivo bei einer spezifischen Aktivität von 10μg/kg (I nmol/kg). Darüber hinaus wurde festgestellt, daß dieses Präparat mehr als eine biologische Aktivität besitzt. Es erhöht auch die Kapillarpermeabilität und hat dazu lokale phlogistische Wirkung (Emigration von Leukozyten in das Gewebe), vgl. B. Ghebrehiwet und J. H. Müller-Eberhardt, a.a.O. (1979).

Die Leukozytenmobilisierung aus dem Knochenmark und die Leukozytenrekrutierung in das Blut werden heute einerseits biologisch entweder in vitro nach dem von K. Rother, Eur. J. Immunol., Bd. 2 (1972), S. 550 bis 558, entwickelten Testsystein (Rattenfemur) oder in vivo durch zeitabhängige periodische Zählung und Differenzierung der verschiedenen Leukozytenarten im Blut nach Gabe der zu untersuchenden Substanzlösung gemessen. Andererseits kann man physikalisch-chemisch das Leukorekrutin durch die verschiedenen üblichen Methoden der Immunodiffusion oder Immunelektrophorese gegen ein anti-Leukorekrutin-lmmunoglobulinpräparat messen, das man aus dem erfindungsgemäßen, molekular einheitlichen, gereinigten Leukorekrutin herstellen kann. Mit diesen Testsystemen kann man im Serum oder Plasma nach deren Aktivierung durch Kontaktreaktionen mit zahlreichen hochmolekularen, körperfremden Stoffen (wie Immunkomplexe. Endotoxine oder Schlangengifte), Mikroorganismen (z. B. Pseudorriona?) und prntpnly tischen Fermenten Leukozyten rekrutierende Aktivität auffinden (vgl. K. Rother a.a.O. [1972]; B. Ghebrehiwet und J. H. Müller-Eberhardt a.a.O. [1979]). obwohl in bestimmten Fällen lange Inkubationszeiten (beispielsweise 5 Tage) erforderlich sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein natürliches Leukor.ytose induzierendes (Leukozyten rekrutierendes, mobilisierendes) Protein aus Säugerserum in molekular einheitlicher, kristallisierbarer Form bereitzustellen, das einen biologisch sepzifischen natürlich wirkenden Mediator der Leukozytosereaktion darstellt und sich :iw spezifischen Beeinflussung des Abwehrzusiandes von Säugern, z. B. des Menschen, eignet. Eine weiten; Aufgabe der Erfindung ist es, ein wirtschaftliches sowie labormäßig und technisch handhabbares Verfahren zur Herstellung und Gewinnung dieses Spurenproteins aus Serum zu schaffen, bei dem es in hochgereinigtem, molekular einheitlichem, kristallisierbarem Zustand und in wägbaren Mengen erhalten werden kann. Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft demnach ein natürliches Leukozytose induzierendes (Leukozyten rekrutierendes, mobilisierendes Protein; nachstehend als »Leukorekrutin«, abgekürzt «LR« bezeichnet), das gekennzeichnet ist durch folgende spezifische topobiochemische und biologische Wirkungen:

- Positive Leukozytosereaktion und Leukozytenrekrutierung in das Blut in vivo;

- positive Leukozytenmobilisierung direkt aus dem Knochenmark in vitro;

und folgende physikalisch-chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins: 8500 Daltons;

- das native Protein besteht nur aus einer Peptideinheit;

- elektrophoretisch^ Wanderung bei pH 7,40 in Acryiamidmatrizen: anodisch;

- löslich in wäßrigen Medien einschließlich 20% Äthanol bei einem pH-Wert von 4,0 bis 10;

- konstanter Temperaturkoeffizient der Löslichkeit in Ammoniumsulfatlösungen zwischen — 10⁰C und + 50⁰C;

- es kristallisiert in doppelbrechenden optisch anisotropen Kristallen aus Ammoniumsuifatlösungen mit über 61% Ammoniumsulfatsättigung;

- unlöslich in Chloroform, Benzol, Xylol und anderen aDolaren, nicht wäßrigen und mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln;

denaturiert in Chloroform, Benzol und Xylol; Zerstörung der Konformationsstruktur und der biologischen Aktivität;

es enthält unter anderem die Aminosäuren Tyrosin, Tryptophan. Phenylalanin, Alanin, Glycin. Lysin. Serin. Valin, Glutaminsäure, Arginin, Leucin;
es adsorbiert reversibel an Anionen- und Kationenaustauschern, Calci"mphosphatgel und Hydroxylapatit und kann nativ der Volumenverteilungschromatographie unterworfen werden;
Extinktionskoeffzienten gemäß nachstehender Tabelle I:

Tabelle

Wellenlänge, mn	'·! nie. I c	m (HjM. .'irCl — '' "'"
250 (min)	0.36
2Wl	0.42
277 (max)	0.54
280	0.53
20O	0.32
400-1000	0
Η,η,,/Π,,,,	1.26

Das Leukorekrutin zeichnet sich ferner durch folgende biologische Eigenschaften aus:

— Zur positiven Wirkung hinsichtlich der Leukozytosereaktion ist das Blut, das Blutplasma oder das Blutserum im Blutkreislaufsystem nicht erforderlich:

sie wird auch in Kulturlösungen und Blutersaztinitteln verursacht;

— Schwellendosis der Wirksamkeit ist 8 bis 25 nß (1 bis 3 pMol) Leukorekrutin/kg Sauger;

— aktive Schwellenblutkonzentration ist 30 pMol Leukorekrutin/Liter;

— konzentrationsabhängige (ED-abhängige) Phaiiensequenzen der Leukozytosereaktion: Zeitverschiebung von Intensität (Leukozytenzahl) und üahl (einfache, zweifache oder mehrfache) Phasen ier Leukozytenrekrutierung aus dem Knochenmark in Abhängigkeit von der Leukorekrutindosis gemäß den Fig. 3 bis 5;

— neben polymorphkernigen und mononukliiren Leukozyten werden insbesondere auch jugendliche Leukozytenformen aus dem Knochenmark rekrutiert;

— LD50 nicht bestimmbar, da keine letalen Wirkungen, selbst bei mehr als der lOOOOOfachen D^sis der physiologisch aktiven Schwellendosis ersichtlich:

— positive biologische Aktivität (Leukozytosereaktion) vollständig hemmbar durch heterologe, spezifische, anti-Leukorekrutin-Antikörpersenimfraktionen(anti-Leukorekrutin-Immunoglobuline);

— typische Proteineigenschaften und Proteinreaktionen (Folin- und Biuretreaktion);

— Schmelzpunkt: etwa 200⁰C (Zers. unter Luft- und Sauerstoffausschluß).

Als Entzündungsmediator mit spezifischer Wirkung ist das Leukorekrutin frei von anderen biologischen Wirkungen. Dies betrifft insbesondere folgende Eigenschaften bzw. Wirkungen:

— Keine Kapiüarpermeabiütätserhöhung im Hauttest;

- keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

- keine spasmogene Aktivität auf gestreifte (Skelett)-muskulatur;

- keine chemische Anlockung (Chemotaxis) von Leukozyten (reutrophile. eosinophile, Markropha- > gen) in vitro;

- keine positive oder negative chemokinetische Wirkung auf Leukozyten (neutrophile, eosinophile, MArophagcn) in vitro;

- keinr Phagozytose stimulierende Wirkung auf im Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder profanierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

- keine signifikante pyrogene Wirkung in vivo r> (gemäß Fi g. 2);

- kein Endotoxingchait und keine endotoxingleichen oder ähnlichen Wirkungen;

- keine Lysewirktingen auf Erythrozyten, Thrombozylen und Leukozyten in vitro: 2"

- keine Entzündungswirkung in situ.

Das Absorptionsspektrum (L¹V, sichtbarer und naher IR-Bereich) des Leukorekrutin ist in F i g. 1 dargestellt.

Das Leukorekrutin (LR) ist ein Entzündungsmediator .?ϊ mit topobiochemisch und bilogisch speziiischer Wirkung, welche auf vom Entzündungsort entfernte Zielzellen (Knochemark) gerichtet ist. Seine biologische Aufgabe ist die Rekrutierung von Knochemarksleukozyten in das Blut (Leukozytosereaktion). Das Leukore- so krutin ist kein normaler selbständiger Blut- oder Serumbestandteil. Es entsteht bei der regulierten und limitieiten Proteolyse z. B. mit der Kontaktaktivierung des Serum-Komplementsystems neben einer Vielzahl von anderen Mediatoren, die teils noch unbekannt, teils ii aber auch bekannt sind, wie beispielsweise Anaphylatoxin und Cocytotaxin; vgl. J. H. Wissler, Eur. J. Immunol., Bd. 2 (1972), S. 73 bis 96. Der Begriff »regulierte und limitierte Proteolyse« bezeichnet eine Spaltung von wenigen spezifischen Peptidbindungen im Gegensatz to zur Gesamtproteolyse, die zum völligen Abbau des Proteins führt.

Anaphylatoxin besitzt spasmogene Aktivität für glatte Muskulatur, wirkt auf Papillarmuskel und erhöht die Kapillarpermeabilität der Blutgefäße. Auf diesen Wirkungen beruht seine Schockaktivität. Ferner ist dieses Protein ch°motaktisch aktiv für eosinophile Leukozyten. Es hat bei physiologischen Konzentrationen keine signifikante chemotaktische Aktivität für neutrophile und mononukleäre Leukozyten. Ferner hat es auch keine pyrogene, leukozytenaggregierende und leukozytenrekrutierende Wirkung. Das physiochemisch sehr ähnliche Cocytotaxin hat nur eine signifikante chemotaktische Aktivität für eosinophile Leukozyten. Es hat im Gegensatz zum Anaphylatoxin keine Schockaktivität, keine signifikante spasmogene Aktivität für glatte Muskulatur und keine kapiliarpermeabilitätserhöhende Wirkung. Wie das Anaphylatoxin hat auch das Cocytotoxin keine chemotaktische Aktivität für neutrophile und mononukleäre Leukozyten, sowie ^o keine pyrogene, leukozytenaggregierende und leukozytenrekrutierende Wirkung.

Das erfindungsgemäß erstmals isolierte, in hochreinem, molekular einheitlichem, kristallinem Zustand gewönne und charakterisierte Leukorekrutin ist dem Anaphylatoxin und dem Cocytotaxin physikochemisch ähnlich. Es hat aber keine der Aktivitäten des Anaphylatoxins und des Cocytotaxins. Es ist also chemotaktisch inaktiv für alle Leukozytenarten und induziert keine Schockreaktionen oder andere ersichtlichen systemisch abträglichen Reaktionen: Leukorekrutin hat auch keine chemokinetische und Phagozytose stimulierende Aktivität für die verschiedenen Leukozytenarten. Ferner ist es ohne kapillarpermeabilitätserhöhende, ohne pyrogene und ohne spasmogene Wirkung. Von Cycytotaxin unterscheidet sich das Leukorekrutin feiner durch die eleklrophoretische Wanderung und den Temperaturkoeffizienten der Löslichkeit. Die elektrophoretische Wanderung von Cocytotaxin bei pH 7,40 in Acrylamidmatrizen ist kathodisch und sein Temperaturkoeffizient der Löslichkeit in Ammoniumsulfatlösunger zwischen -10T und +50°C ist nicht konstant.

In vielen seiner biologischen und chemischen Eigenschaften unterscheidet sich das Leukorekrutinprotein von strukturellen und funktionellen Eigenschaften der bakteriellen Endotoxine. Dies bedeutet, daß Leukorekrutin als Entzündungsmediatorprotein keine lokale, am Entzündungsort relevante phlogistische Wirkung hat. Leukorekrutin wirkt, ähnlich wie die bekannten Hormone endokriner Drüsen, spezifisch nur auf dem Entzündungsort ferner Zielzellen, das Knochenmark und dessen Leukozyten. Es induziert eine Leukozytosereaktion durch Rekrutierung neuer Knochemarksleukozyten in das Blut in vivo bzw. in die Kulturlösung in vitro. Die durch Leukorekrutin induzierte Leukozytosereaktion ist ähnlich dem von K. Rother, a.a.O. (1972), und K. Rother u. Mitarb., a.a.O. (1978), beschriebenen komplexen Ablauf der Leukozytenrekrutierung aus dem Knochenmark. Die molekularen Eigenschaften des Leukorekrutins, besonders aber seine zur Aktivität notwendigen niedrigen Blutspiegel, weisen auch auf die Hormonähnlichkeit dieses Entzündungsmediators hin. Sie sind vergleichbar mit den wirksamen Blutinsulinkonzentrationen. Die aktive Schwellendosis ist 8 bis 25 ng (1 bis 3 pmol) Leukorekrutin pro kg Versuchsorganismus. Dies entspricht einer berechneten Konzentration von 30 pmol Leukorekrutin/1 Liter Blut. Überträgt man diese Daten auf in vivo Verhältnisse, so bedeutet dies, daß die Umwandlung von schon etwa 200 nl Blutserumprotein pro kg Organismus in Leukorekrutin durch limitierte Proteolyse genügen, um eine Verdoppelung der Leukozytenzahl im Blut zu bewirken. In diesen molekularen Eigenschaften, besonders nämlich der ausgeprägten biologischen Spezifität, dem Gehalt an aromatischen Aminosäuren (Tyrosin) und in einer 300- bis lOOOfachen besseren spezifischen Aktivität unterscheidet sich das durch regulierte und limitierte Proteolyse mittels Kontaktaktivierung von Säug.srserum dargestellte Leukorekrutinprotein von den rnderen in der Literatur beschrieben, Leukozytose induzierenden Proteinpräparaten; vgl. K. Rother, a.a.O. 1972), und B. Ghebrehiwet und H. J. Müller-Eberhardt. a.a.O. (1979).

Das Leukorekrutin kann physikalisch-chemisch durch das erfindungsgemäß mit molekular einheitlichem Leukorekrutin hergestellte spezifische anti-Leukorekrutin-Antikörperserum oder dessen anti-Leukorekrutin-Immunglobulinfraktionen nach den verschiedener üblichen Methoden der Immunodiffusion und Immunelektrophorese quantativ bestimmt werden. Die Aktivität des Leukorekrutins kann in vitro durch den Rattenfemur-Test nach K. Rother, a.a.O. (1972), sowie in vivo nachgewiesen werden. Durch intravenöse Verabreichung von Leukorekrutin beim Meerschweinchen in der niedrigen Dosis von etwa 25 ng/kg (3 pmol/kg —

berechnete Bliitkonzen'ration etwa 30 pmol/Liter) wird mindestens eine Verdoppelung der Zahl der Leukozyten im Blut innerhalb von 60 Minuten erreicht. Der Anstieg der Leukozytenzahl hängt von der Leukorekrutinkonzentration ab. Die F i g. 3 bis 5 zeigen Beispiele der durch verschiedene Leukorekrutinkonzentrationen verursachten Leukozytoserenktionen. Die Leukozytose kann weitere 3 His 5 Stunden dauern, wobei mono-, bi- oder sogar multiphasische Reaktionen auftreten können. Neben r.outrophilen und mononukleären Zellen werden auch jugendliche Leukozytenformen rekrutiert. Bis zur unphysiologischen Konzentration von 100 μηιοΙ/l besitzt das Leukorekrutin weder chemotaktische noch chemokinetische noch Phagozytose stimulierende Aktivität für neutrophile, eosinophile und mononukleäre Leukozyten vom Mensch, Kaninchen, Schwein, Hund, Meerschweinchen oder Ratte, ferner keine Kontraklionswirkung auf die glatte Muskulatur des Meerschweinchenileums, keine kapillarpermeabilitätserhöhende Wirkung im Hauttest beim Meer-

>n kung. Dieses äußerst sensitive Kriterium auf Verunreinigungen mit bakteriellen Endotoxinen und anderen ubiquitären Pyrogenen zeigt die große Wirksamkeit des Reinigungsverfahrens für Leukorekrutin und ein Parameter für die biologische Spezifität.

In den Fig. 3 bis 5 ist die Induzierung der Leukozytosereaktion im Meerschweinchen bei Verabreichung von Leukorekrutin graphisch dargestellt. Die Figuren zeigen die Anzahl der Leukozyten im Blut nach einer bestimmten Zeit (Verabreichung des Leukorekrutins zur Zeit t = 0). In Fig.3 ist der Verlauf der Leukozytosereaktion bei Verabreichung von 100 ng (12,5 pmol), in F i g. 4 der Verlauf der Verabreichung von 500 ng (60 pmol) und in Fig. 5 der Verlauf bei Verabreichung von 500 |ig (60 nmol) Leukorekrutin aus Schweineserum pro kg Meerschweinchen dargestellt. Die Messungen erfolgten in Abständen von etwa 3 bis 30 Minuten durch Auszählen der in einem bestimmte¹¹ Blutvolumen (10 nl) vorhandenen Leukozyten.

Das erfindungsgemäß hergestellte und gewonnene

inhwpinrhpn mit Fvan« Rlaii als intraypnnc inii-riprtpm I piilfnrplfrutin stpllt pinpn u/prtvnllpn

Marker. Schließlich besitzt es auch keine ersichtliche Schockwirkung, selbst bei intravenöser Applikation der 10 000- bis lOOOOOfachen Dosis der biologisch aktiven Menge beim Meerschweinchen oder Kaninchen, sowie 2-> keine pyrogene Wirkung am Kaninchen (standardisierte Methode nach Europ. Pharmacopoe 1975 — rektale Temperaturmessung), noch irgendeine andere sichtbare systemische biologische Reaktion bei intravenöser Verabreichung einer hohen Dosis von 1 mg/kg (etwa in 100 nmol/kg) bei Meerschweinchen und Ratten.

In Fig. 2 ist ein Pyrogen-Standardtest nach Europ. Pharmacopoe 1975 an drei verschiedenen Kaninchen (a, b und c) vom Durchschnittsgewicht von etwa 3 kg dargestellt, der durch intravenöse Verabreichung von i> Schweineleukorekrutin in einer Menge von 1 μΙ (15 μg) in 1 rnl (0,9 Gewicht/Volumen)prozentiger physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt wurde. Dies ist etwa das 200- bis 500fache der biologisch aktiven Schwellendosis. In den Diagrammen der F i g. 2 ist der rektal bestimmte Temperaturverlauf bei den Kaninchen vor (VA), während (*) und kurz nach (P) sowie weiterhin 30 bis 180 Minuten nach der Applikation graphisch dargestellt. Nur beim Kaninchen (a) wird eine Temperaturerhöhung von O₁TC festgestellt.

Das gleiche negative Ergebnis in bezug auf eine pyrogene Wirkung des Schweineleukorekrutins wurde am gesunden Menschen erhalten. Leukorekrutin verursacht eine starke Leukozytosereaktion ohne wahrnehmbare Nebenwirkungen; vgl. St. E. G. Burdach, K.-G. Evers und J. H. Wissler, »Leukorekrutin in der Diagnostik des Morbus Kostman«, Commun. 77th Meeting Deutsche Gesellschaft Kinderheilkunde, Nr. 303, Sept. 1981. Dies stützt die Vorstellung, daß hochreine, definierte Entziindungsmediatoren und -hörmone wertvolle »Arzneistoffe« mit ganz bestimmter Wirkung sind, die synthetischen Arzneistoffen mit ihren zahlreichen Nebenwirkungen weit überlegen sind; vgl. StEG. Burdach, K.-G. Evers und J. H. Wissler, Immun.-Forschung-lmmunbioiogy 159 (1981). (Beide eo Literaturstellennachveröffer.tlichtl).

Europ. Pharmacopoe 1975, britische und amerikanische (USP) Standards erlauben die Bezeichnung »pyrogenfrei« für Präparate, welche in drei Versuchskaninchen als Summe aller Abweichungen der rektalen Temperatur den Wert 2,6° C nicht überschreiten. Demnach ist das Leukorekrutinpräparat gemäS diesen Bestimmungen pyrogenfrei und ohne pyrorene WirWirkstoff dar, der zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes des Körpers, z. B. des Immunstatus, verwendet werden kann. Das Leukorekrutin eignet sich zur spezifischen Beeinflussung von Leukozytosereaktionen und Leukozytenfunktionen, beispielsweise bei Entzündungsreaktionen und beim Herzinfarkt. Ferner kann das Leukorekrutin zur Herstellung des Leukorekrutin-Antikörpers verwendet werden, der zur spezifischen Beeinflussung von Leukämien eingesetzt werden kann. Ein weiteres Anwendungsgebiet des Leukorekrutins ist die spezifische Beeinflussung von Anämien und Leukopeniezuständen.

Das Leukorekrutin wird in Form üblicher Arzneimittel parenteral, vorzugsweise intravenös, Säugern, z. B. Menschen, in einer Tagesdosis von 10ng/kg bis 100 μg/kg gegeben.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des Leukorekrutins nach den Ansprüchen 2 — 7.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird nach der Kontaktaktivierung des Serums, bei der das Leukorekrutin gebildet wird, zunächst ein Serumproteinrohkonzentrat von den übrigen Bestandteilen des Serums abgetrennt. Dies kann zweckmäßigerweise durch Kationenaustauscherreaktion erfolgen, wobei CM-Sephadex® C 50 als Kationenaustauschersubstanz bevorzugt ist. Die dabei erhaltene positiv adsorbierende und eluierte Proteinmasse, welche von anderen, negativ adsorbierenden Serumbestandteilen (u. a. Lipide, GIykoproteine usw.) abgetrennt wird, kann dann zur Gewinnung des Leukorekrutins an Hydroxylapatit chromatographiert werden. Aus Gründen, die nachstehend erläutert werden, ist es jedoch im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, vor der Chromatographie an Hydroxylapatit zumindest einen Teil, insbesondere den Großteil der begleitenden Fremdproteine vom Leukorekrutin durch gezielte Trennverfahren abzutrennen. Bei den Mediatoren, zu denen auch das Leukorekrutin gehört, handelt es sich um Spurenstoffe; 100 Liter kontaktaktiviertes Serum (entsprechend 250 bis 300 Liter Blut) enthalten etwa 7 bis 8 kg Protein neben anderen Stoffen. Nur etwa 03 bis 3 g davon (je nach Spezies und Art der Kontaktreaktion) sind Leukorekru tin, wovon maximal 10 bis 20% isoliert werden können, da jeder Reinigungsversuch komplex ist und nur in beschränkter Ausbeute verläuft Voraussetzung für eine praktische Verwertung des Leukorekrutins ist aber

seine Herstellung und Gewinnung in nennenswerten Menge»!. Dafür müssen sehr große Blutvolumina aufgearbeitet werden. Im Prinzip kann als Ausgangsmaterial auch Vollblut oder Blutplasma verwendet und der Kontaktakti.'ierung unterworfen werden. Da aber weder die Blutzellen im Vollblut noch das Fibrinogen im Blutplasma zur Leukorekrutinbildung als him.oraler Mediator notwendig sind, wird der leichteren Handhabbarkeit wegen Blutserum als Ausgangsmaterial bevorzugt.

Die Verwendung von Hydroxylapatit ist für die strukturschonende Reingewinnung von Leukorekrutin von wesentlicher Bedeutung. Aus technischen und wirtschaftlichen Gründen ist es aber mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden, größere Proteinvolumina, d. h. also z. B. das Serumproteinrohkonzentrat großer Serummengeri, an Hydroxylapatitsäulen zu chromatographieren. Einerseits neigt nämlich Hydroxylapatit bei größeren Proteinvolumina sehr stark zur Verstopfung und wird dadurch unbrauchbar. Andererseits ist Hydroxylapatit teuer, was seinem F.insatz in größerem Maßstab entgegensteht. Aus diesen Gründen ist es im erfindungsger: Ißen Verfahren bevorzugt, aus der Proteinfraktion des Serums, in der das Leukorekrutin enthalten ist, bereits vor der Chromatographie an Hydroxylapatit einen Großteil der begleitenden Fremdproteine durch geeignete Verfahrensschritte abzutrennen und dadurch das Proteinvolumen, das auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden muß, entscheidend zu verkleinern. Die Renigung von Proteinen durch Chromatographie an Hydroxylapatit ist an sich bekannt; vgl. G. Bernardi in »Methods in Enzymology«, Vol. XXVII, Part D, S. 471 - 479.

Allgemein bestehen Reinigungsverfahren für Eiweißkörper (Proteine) und andere Naturstoffe aus einer Sequenz kombinierter Trennungsverfahren, welche Molekülgrößen-, Ladungs-, Form-, Strukturstabilitätsund Moleküloberflächenbeschaffenheitsunterschiede zwischen dem gesuchten Naturstoff und den begleitenden Fremdstoffen zur Trennung ausnutzen. Dementsprechend können zahlreiche Kombinationen verschiedenster Trennungsverfahren zur Reinigung eines Proteins erarbeitet werden. Für die Handhabungseigenschaften, technische Ausführbarkeit, Automatisierbarkeit und Wirtschaftlichkeit eines Reinigungsverfahrens sowie für die Qualität des gesuchten Naturproduktes ist deshalb nicht allein die Art der verwendeten Trennungsschritte von Bedeutung, sondern insbesondere deren optimierte Gestaltung und deren sinnvolle Kombination in einer Reinigungssequenz innerhalb des Rahmens der Struksturstabilität und der anderen Strukturpara meter des gesuchten Stoffes. Das heißt auch, daß selbst die Benutzung gleicher oder ähnlicher Trennungsprinzipien (z.B. Molekularsiebfiltration, Dialyse, Ionenaustauschadsorptionen usw.), aber in unterschiedlicher Kombination, für die Handhabui.gsfähigkeit und Wirtschaftlichkeit des Reinigungsverfahrens entscheidend sein können. In bestimmten Fällen ist die Benutzung oder Unterlassung einer einzigen Technik (z. B. Hydroxylapatitchromatographie, Zonenpräzipitationschromatographie usw.) an einer bestimmten Stelle der Reinigungssequenz oder innerhalb einer begrenzten Teilsequenz von ausschlaggebender Bedeutung für die Qualität des gesuchten Naturproduktes sowie für die Handhabungsfähigkeit und die Wirtschaftlichkeit seines Reinigungsverfahrens. Klar aufgezeigt werden diese allgemeinen Zusammenhinge und Grundprinzipien der Naturstoffreinigung beispielsweise an der allgemein bekannten

Tatsache, daß in einen wirtschaftlich vernünftigen und technisch handhabungsfähigen Naturstoffreinigiingsverfahren ein Dialyse-Ultrafiltrations- oder Liyophilisicrungsschritt nicht sinnvoll ist, bevor das Gesamtausgangsvolumen oder die Ausgangskonzentration der begleitenden Fremdbestandteile des Naturstoffrohrextraktes nicht auf mindestens '/soo bis Viooo durch andere Verfahensschritte reduziert wurde.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Teil der begleitenden Fremdproteine durch Positivadsorption an Calciumphosphatgel oder durch Negativadsorption an einen Anionenaustauscher, insbesondere DEAE-Sephadex®- A 50, von der Leukorekrutin enthaltenden Hauptproteinfraktion des Serums abgetrennt. Bei diesen Ausführungsformen kann vor der Chromatographie an Hydroxylapatit im ersten Fall eine etwa lOprozentige, im zweiten Fall eine etwa 30prozentige Verminderung des Gehaltes an Fremdproteinen erreicht werden. Da diese Verminderung des Volumens der Proteinfraktion nur verhältnismäßig gering ist. Has Verfahren ahef andererseits rasch und einfach durchgeführt werden kann, eignen sich diese Ausführungsformen insbesondere für eine Arbeit im Laboratoriums- und halbtechnisehen Maßstab. Zusammen mit der Herstellung der Serumhauptproteinrohfraktion durch Kationenaustauscherverfahren kann damit eine Volumenverminderung von 1000 ml Serum auf etwa 25 ml Protein vor dem Aufbringen auf Hydroxylapatit erreicht werden. Besonders bevorzugt zu diesem Zweck ist eine Ausführungsform, bei welcher mit den LR enthaltenden Serumproteinen erst ein Anionenaustauscherreaktionsschritt und dann ein Calciumphosphat-Adsorptionsschritt durchgeführt wird.

In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Abtrennung eines Großteils der begleitenden F~emdproteine von der Proteinfraktion des Serums durch fraktioniertes Eluieren und/oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol und/oder mindestens eine Molekularsiebfiltration. Besonders bevorzugt ist in dieser Ausführungsform eine Verfahrensweise, bei der mindestens zwei der genannten Trennstufen nacheinander durchgeführt werden. Diese besonders bevorzugte Ausführungsfcrm ermöglicht die schonende Aufarbeitung großer Mengen von Serum und damit die Gewinnung nennenswerter Mengen an Leukorekrutin in rascher und wirtschaftlicher Weise. Da der weitaus größte Teil der begleitenden Fremdproteine vor der für die Produktqualität kritischen Chromatographle an Hydroxylapatit abgetrennt wird und somit nur ein kleiner Bruchteil (in besonder? bevorzugten Ausführungsformen weniger als etv 0,09%) der gesamten Proteinmenge des Serums aui den Hydroxylapatit gebracht werden muß. kann ein Ansatz mit beispielsweise mindestens 100 bis 200 Liter kontaktaktiviertem Serum begonnen werden (ca. 300 bis 600 Liter Blut). Ausgehend von beispielsweise 100 Liter kontaktakiiviertem Serum kann das Proteinvolumen, in dem praktisch noch die Gesamtmenge an Leukorekrutin enthalten ist. vor dem Aufbringen auf den Hydroxylapatit auf weniger als etwa !00 bis 200 ml, d. h. mit einem Faktor von kleiner als '/soo bis '/iooo, verringert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Gewinnung des Leukorekrutins in seiner nativen Konformation.

Das Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des Leukorekrutins wird nachstehend im einzelnen erläutert:

A. Herstellung von Leukorekrutin im Serum.
Regulierte und limitierte Proteolyse des Serums

durch Kontaktaktivierung und Abtrennen
des Leukorekrutin enthaltenden Serumproteinrohkonzentrates von den übrigen Bestandteilen
des Serums und Bereitung eines Leukorekrutin

enthaltender Serumproteinrohkonzentrates

Ausgangsmaterial für die Herstellung und Gewinnung des Leukorekrutins (im folgenden der Kürze halber stets nur noch mit LR bezeichnet) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist wie erwähnt zweckmäßigerweise das Blutserum von Säugern. Der leichten Verfügbarkeit wegen ist das Serum von Mensch, Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Hund, Katze, Kaninchen, Ratte oder Meerschweinchen bevorzugt Das Serum wird auf übliche Weise durch Koagulieren von Blut und Abtrennen des Blutkuchens, beispielsweise durch Filtration und/oder Zentrifugieren, gewonnen und danach zur Bildung von LR beispielsweise mit Dextran, Hefe, bakteriellen Endotoxinen oder mit einem Immunkomplex als Kontaktstoff vorzugsweise unter Rühren inkubiert.

Vorzugsweise wird zur Leukorekrutinbildung eine speziell zubereitete physikalische Form von Dextran oder Bäckerhefe verwendet Diese beiden Kontaktstoffe erfordern für die Leukorektrutinbildung aus seinen Vorstufen eine nur kurze Inkubationszeit (z. B. genügt 1 Stunde bei 37°C, während andere Kontaktstoffe eine .nkubationszeit bis zu 5 Tagen erfordern (vgl. G. Ghebrehiwet und H. J. Müller-Eberhard, a.a.O. [1979]). Durch Kontaktaktivierung des Blutes, des Plasmas oder des Serums werden verschiedene kompliziert zusammengesetzte Blutproteinsysteme aktiviert. Zu diesen Systemen gehören die bekannten Koagulations-, Kinin- und Komplementproteinsysteme. Bei der Aktivierung durch Kontakt mit körperfremden, hochmolekularen Stoffen werden die inaktiven Proteine dieser Systeme zum Teil in proteolytische Fermente umgewandelt, welche wiederum einen anderen Teil der Proteine dieser Systeme in komplexer Weise in Form einer Aktivitätskaskade begrenzt durch Regelkreise spalten. Dabei entstehen die erwähnten humoralen Entzündungsmediatoren. Es hängt dabei oft von der physikalischen Form eines Kontaktstoffes ab, ob und wie diese Aktivitätskaskaden ausgelöst werden. Beispielsweise kann weder nieder- noch hochmolekulares, leicht lösliches Dextran eine solche Aktivitätskaskade des Komplementsystems so auslösen, daß sie mit beobachtbarer Schnelligkeit abläuft. Bringt man jedoch leicht lösliches Dextran in eine andere physikalische Form, so ist die gleiche chemische Substanz zur Aktivierung einer solchen Serumproteinkaskade fähig, wobei man folgendermaßen vorgehen kann:

Als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines kontaktaktiven Dextrans eignen sich alle Dextransorten mit einem Molekulargewicht größer als 100 000 Daltons. Das leicht lösliche kontaktinaktive Dextran wird 7 Tage bei 90 bis 160° C, insbesondere 110 bis 13O⁰C, im trockenen Umluftstrom erhitzt. Nach dem Abkühlen wird es durch Zerklopfen grob zerkleinert und dann zu einem Korn der Durchschnittsgröße von 0,5 bis 3 mm gemahlen (z. B. in einer Kugelmühle oder in einem Mörser). Man erhält ein kontaktaktives, gekörntes, zum Gel quellbares, unlösliches Dextran, das zur Leukorekrutinbildung bei einstündigem Kontakt mit Serum fähig ist.

Bäckerhefe wird vor der Verwendung als Kontakt-

mittel für die Leukorekrutinbildung im bis zu etwa lOfachen Volumen Wasser gekocht Der Zellbruchstückschlamm wird von den im Überstand gelösten Zellbestandlteilen durch Dekantieren oder Zentrifugieren (10 000 xg mindestens 5 Minuten) abgetrennt und erneut mit Wasser gekocht Diesen Vorgang wiederholt man so lange, bis der Überstand eine Extinktion unter 0,1 bei 280 und 260 nm hat Der unlösliche, kontaktaktive Zellwandrückstand der Hefe wird lyophilisiert, getrocknet oder feucht nach Berechnung des Trockensubstanzanteils verwendet

Die Koniaktaktivierung des Serums für die Leukorekrutinbildung ist nach ausreichender Inkubationszeit bei 20 bis 45° C, vorzugsweise bei 37"C, welche bei der Verwendung von Dextran und Hefe z. B. etwa 1 Stunde beträgt, beendet Das inkubierte Serum wird zweckmäßigerweise auf eine Temperatur von etwa 0 bis 8° C abgekühlt Alle folgenden Vorgänge werden in diesem Temperaturbereich durchgeführt, wenn keine anderen Angaben gemacht werden. Ebenso werden im folgenden alle Lösungen mit 0,001 mol/1 Cystein versetzt Der unlösliche, zur Inkubierung zugesetzte Stoff wird danach vom inkubierten Serum in üblicher Weise vollständig abgetrennt, beispielsweise entweder durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren (10 000 χ g mindestens 10 Minuten).

Zur Herstellung eines LR enthaltenden Serumproteinrohkonüentrates wird das inkubierte, LR enthaltende Serum nun zur Abtrennung von den übrigen unerwünschten Serumbestandteilen mit einem Kationenaustauscher behandelt Als Kationenaustauscher eignen sich hierfür beispielsweise mit Epichlorhydrin vernetzte Dextranmatrizen (Sephadex®), an weiche funktionelle Gruppen mit Kationenaustauscherkapazitat gekoppelt sind. Sie können nach Verwendung durch Regeneration wiederholt gebraucht werden. Bevorzugt wird ein schwach saurer Kationenaustauscher in der Na⁺-Form, wie CM-Sephadex® C-50, verwendet, und die Behandlung bei einem pH-Wert von 4 bis 6 durchgeführt. Das inkubierte Serum kann zur Erleichterung der Einstellung der Beladungsgleichgewichte vor der Behandlung mit dem Kationenaustauscher mit einer Proteine nicht schädigenden Salzlösung im Bereich physiologischer Ionenstärke (nicht höher als 0,2 mol NaCI/Liter) verdünnt werden. Sie kann gleichzeitig der Einstellung des pH-Wertes dienen. Ein spezielles Beispiel für eine derartige Salzlösung ist eine 0,001 mol/1 Kaliumphosphat-Acetatpufferlösung mit einem Gehalt von O^ mol/1 NaCl und einem pH-Wert von 4,5. Diese Kationenaustauscherreaktion kann sowohl als Chromatographieverfahren als auch als technisch leicht handhabbares Eintopfverfahren gestaltet werden.

Der Kationenaustauscher wird dem Serum in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, um die Hauptproteinfraktion des Serums zu adsorbieren. Üblicherweise genügt dazu etwa 1 Volumenteil gequollener Ionenaustauscher pro Volumenteil Serum. Sodann wird die überstehende Flüssigkeit von dem mit den Proteinen beladenen Kationenaustauscher, beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Der beladene Kationenaustauscher wird durch Waschen mi< Wasser oder einer Salzlosung, welche eine in 0,2 ml/1 NaCI äquivalente maximale lonenstärke hat, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 6 und einer Temperatur von vorzugsweise höchstens etwa 15°C von anhaftenden, nicht adsorbierten Serumbestandteilen befreit. Ein spezielles Beispiel für eine zum Auswaschen geeignete Salzlösung ist die erwähnte

Kaliumphosphat-Acetatpufferlösung vom pH-Wert 4,5.

Der von negativ adsorbierten Rohserumbestandteilen befreite, mit den Proteinen beladene Kationenaustauscher wird nun mit einer Proteine nicht schädigenden wäßrigen Salzlösung eluiert Vorzugsweise wird hierzu eine Salzlösung hoher Ionenstärke mit einem pH-Wert von etwa 4 bis 10 verwendet. Spezielle Beispiele für derartige Salzlösungen sind eine wäßrige 0,5 mol/l Kaliumphosphatlösung vom pH-Wert 6,5 bis 7,5 oder eine 2 bis 5 mol/l Natriumchloridlösunp vom gleichen pH-Wert

Die erhaltene, die Hauptserumproteine und LR enthaltende Proteineluatlösung wird sodann zur nachfolgenden Auftrennung der Proteine konzentriert Dieses Konzentrieren (Abtrennen des Großteils der is wäßrigen Salzlösung von den Proteinen) kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise können die Proteine durch Lyophilisieren, Ultrafiltration oder Entwässerungsdialyse an einer Membran mit der AusschluOgrenze 1000 Daltons konzentriert werden. Bevorzugt wird die vollständige Präzipitation des LR und seiner Begleitnroteine durch Aussalzen mittels Einstellen des Eluats auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 3,25 bis 3,7 mol/l (80 bis 90% Ammoniumsulfatsättigung) durchgeführt. Hierzu wird Ammoniumsulfat in einer Menge von etwa 630 g/l Eluat zugesetzt (Sättigung etwa 90%). Der pH-Wert wird dabei vorzugsweise auf etwa 4 bis 9 und die Temperatur zwischen 40° C, vorzugsweise zwischen 0 und 8⁰C, gehalten. Die LR enthaltenden ausgefällten Proteine fallen ah Proteinschlamm an und werden dann beispielsweise durch Filtrieren, Dekantieren oder Zentrifugieren von dem praktisch proteinfreien Überstand abgetrennt. Die Zentrifugation erfolgt zweckmäßigarweise bei mindestens 10 000 χ g während mindestens 45 Minuten, bevorzugt 1 Stunde einstufig; oder zweistufig bei niedrigeren Kraftwirkungen in der ersten Stufe und einer Wiederholung bei höheren Kräften, z. B. 10 000 bis 50 000 χ g. für den Überstand der ersten Stufe durch Durchflußzentrifugation. jo

Die Konzentration des Kationenaustauscher-Eluats kann auch nach einem anderen Verfahren, beispielsweise durch Ultrafiltration oder Lyophilisieren, vorgenommen werden. Diese Verfahren sind jedoch zeitraubender und relativ teuer. In diesem Fall sollte aber π zweckmäßigerweise das erhaltene Proteinkonzentrat zur weiteren Behandlung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3.7 mol/l gebracht werden, wobei auch ein Proteinschlamm entsteht. ->o

B. Grobreinigung des Leukorekrutins:

Abtrennung des überwiegenden Teils

der begleitenden Fremdproteine von LR

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen 5> Verfahrens wird aus dem in Stufe A erhaltenen Serumproteinrolikonzentrat ein Teil der begleitenden Fremdproteine neben anderen Stoffen, wie Lipide, von dein zu gewinnenden LR durch Positivadsorption an Calciumphosphatgcl abgetrennt. Dazu wird das in Stufe m> A erhaltene. LR enthaltende Serumproteinrohkon7.cntr.it beispielsweise in 0.001 mol/l Natnumkaliumphosphatpuffcrlösung gelöst. u<_|chc 0.2 mol/l NaCl und 0.001 mol/l Cystein enthalt und einen pH-Wert von 6.60 hat. Die LR enthaltende Proteiniosung wird bis /.ur t. Ammoniumsulfatfreiheit gegen diesen Puffer an einer Membran mit Her Ausschlutfgrenze 1000 Daltons diaiysiert oder uitrafiltriert oder einer durch entsprechende Ausschlußgrenzen charakterisierten EntsalzungsmoIekularsiebFiltrationschromatographie unterworfen. Die ammoniumsulfatfreie, im angegebenen Puffer äquilibrierte Proteinlösung wird mit 50 ml Calciumphosphatgel (pro Volumen Proteinkonzentratlösung, welche von 1 Liter Serum erhalten wurde) versetzt und etwa 1 Stunde vorzugsweise bei 0 bis 8³C gerührt. Danach wird das Gel durch Zentrifugieren bei 10 000 xg innerhalb 5 Minuten wieder abgetrennt Das Gel wird noch dreimal mit 100 ml der genannten Pufferlösung gewaschen. Die Waschpufferlösungen werden mit der negativ adsorbierten, LR enthaltenden Proteinlösung vereinigt. Diese erhaltene Proteinlösung kann durch Fällung der Proteine durch Zusatz von Ammoniumsulfat wieder in der beschriebenen Weise konzentriert werden. Der anfallende, LR enthaltende Proteinniederschlag kann dann in einem weiteren bevorzugten Verfahren weiter verarbeitet werde:·.

In einer zweiten Ausführungsform wird aus aem LR enthaltenden kontaktaktivierten Serum direkt oder aus dem nach Abschnitt A erhaltenen Serum-Hauptproteinrohkonzentrat oder aus dem nach der Calciumphcsphatgelbehandlung erhaltenen Proteinkonzentrat ein Teil der begleitenden Fremdproteine von dem zu gewinnenden LR durch Negativadsorption und;oder Elutionschromatographie an einem Anionenaustauscher abgetrennt

Dazu wird im Fall der Verwendung des kontaktaktivierten Serums ein Volumenteil Serum mit mindestens 4 Volumenteilen Wasser oder einer Proteine nicht schädigenden Salzlösung versetzt (Erniedrigung des NaCl-Gehaltes auf höchstens 0,03 mol/l, die Mischung auf eine tris-HCl-Konzentration von höchstens 0,01 mol/l gebracht und ein pH-Wert von mindestens 8,0 eingestellt). Danach wird das dem doppelten Serumvolumen entsprechende Volumen eines Anionenaustauschers zugesetzt Als Anionenaustauscher eignen sich hierfür beispielsweise mit Epichlorhydrin vernetzte Dextranmatrizen (Sephadex⁸), an welche funktioneile Gruppen mit Anionenaustauscherkapazität gekoppelt sind. Sie können nach Verwendung durch Regeneration wiederholt gebraucht werden. Bevorzugt wird ein schwacher, in einer Pufferlösung vorgequollener und äquilibrierter Anionenaustauscher in der Cl--Form. wie DEAE-Sephadex®-A 50 verwendet und die Behandlung bei einem pH-Wert von 8 bis 10 durchgeführt. Ein spezielles Beispiel für eine solche Pufferlösung ist 0,01 mol/I tris-HCl, welche 0,03 mol/l NaCl und 0,001 mol/l Cystein enthält und einen pH-Wert von 8,0 hat.

Der Anionenaustauscher wird dem Serum in einer Menge zugesetzt, die zur vollständigen Adsorption des LR und seiner positiv adsorbierbaren Begleitproteine ausreicht. Üblicherweise genügen dazu zwei Volumenteile gequollener Anionenaustauscher pro Scrumvolumen. Die Reaktion kann entweder als Chromatographieverfahren oder als leichter handhabbares Eintopfadsorptionsverfahren gestaltet werden. Im Eintopfverfahren wird die überstehende Flüssigkeit mit den negativ adsorbierten Proteinen von dem mit den positiv adsorbierten LR und anderen Proteinen beladenen Anion !!austauscher, beispielsweise durch Filtrieren, in der Ch.-'imatographiesäule. Dekantieren oder Zentrifugieren (im Eintopfverfahren) abgetrennt. Der beladene Anionenaustauscher wird durch Waschen mit Wasser oder einer Salzlösung, welche eine zu 0,03 mol/l NaCl äquivalente maximale lonenstärke hat, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8 bis 10 und einer Temner;itur

von vorzugsweise höchstens etwa 15° C von anhaftenden, negativ adsorbierten Semmbestandteilen befreit Ein spezielles Beispiel für eine zum Auswaschen geeignete Salzlösung ist die erwähnte tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 8,0.

Der von negativ adsorbierten Serumbestandteilen befreite, mit LR und anderen Proteinen beladene Anionenaustauscher wird nun mit einer Proteine nicht schädigenden wäßrigen Salzlösung eluiert, welche eine größer als 0,1 mol/1 NaCl entsprechende Ionenstärke und einen pH-Wert zwischen 6,0 und 10,0 hat Vorzugsweise wird eine Salzlösung hoher Ionenstärke mit einem pH-Wert von 4,0 bis 10,0 verwendet Ein spezielles Beispiel für eine derartige Salzlösung ist eine 2,0 mol/1 NaCl-Lösung, welche mit 0,01 mol/1 Piperazin-HCl zum pH-Wert 6,5 gepuffert ist und welche 0,001 mol/1 Cystein enthält

Wird die Anionenaustauscherreaktion als Chromatographieverfahren gestaltet, so kann die Elution von LR und anderer Proteine auch durch einen linearen NaCl-Konzentrationsgradienten erfolgen. LR wird eluiert bei emer Ionenstärke von 0,15 mol/1 NaCl beim pH- Wert 6,5.

Die erhaltene, LR enthaltende Proteineluatlösung wird sodann zur nachfolgenden weiteren Abtrennung der Proteine in üblicher Weise, bevorzugt durch Aussalzpräzipitation der Proteine bei einer Ammoniumsulfatsättigung von 90% konzentriert und das erhaltene LR-Proteinkonzentrat in einem weiteren bevorzugten Verfahren weiter verarbeitet. .

Werden für die Anionenaustauscherreaktion des nach der Calciumphosphatgelbehandlung erhaltene Proteinkonzentrat oder das gemäß Abschnitt A erhaltene Serumprotein-Rohkonzeitrat - ".rwendet, welche in Proteinschlammform vorliegen, so werden diese Proteinschlämme erst durch Dialyse tr'-, zur Ammoniumsulfatfreiheit an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Daltons gegen Waser oder eine Proteine nicht schädigende Salzlösung mit niedriger Ionenstärke, vorzugsweise gegen den erwähnten 0,01 mol/1 tris-HCI-Puffer, der 0,03 mol/1 NaCl und 0,001 mol/i Cystein enthält und einen pH-Wert von 8,0 hat, aufgelöst Mit den klaren Proteinlösungen wird dann für die Anionenaustauscherreaktion genau so verfahren, wie für das kontaktaktivierte Serum.

Nach der dritten, besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Abtrennung der Fremdproteine aus dem in Stufe A erhaltenen Proteinkonzentrat durch fraktioniertes Eluieren und/oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol und/oder mindestens eine Molekularsiebfiltration.

Bei dieser Ausführungsform kann bereits durch einmalige Durchführung eines der erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren eine beträchtliche Menge an Begleitproteinen abgetrennt und eine befriedigende Belastungsverminderung der Hydroxylapatitsäule erreicht werden. Beispielsweise werden im physiologischen pH-bereich durch eine fraktionierte Eluierung etwa 30%, durch eine Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol etwa 60 bis 70% oder durch eine Molekularsiebfiltration bis zu 90% der begleitenden Fremdproteine abgetrennt. Jedoch haften die in dem Konzentrat enthaltenen Proteine trotz ihres verschiedenen Molekulargewichtes häufig sehr stark aneinander. Sie werden in der Molekularsiebfiltration beispielsweise durch Bestehen nicht idealer Gleichgewichte bei Proteinpolyelektrolyten oft unvollständig entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt Es empfiehtl sich deshalb, mindestens zwei der genannten Trennverfahren hintereinander durchzuführen. Vorzugsweise wird das LR enthaltende Serumproteinrohkonzentrat dazu z. B. zunächst fraktioniert eluiert und danach einer Molekularsiebfiltration unterzogen oder es wird zunächst eine Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol und danach eine Molekularsiebfiltration durchgeführt Bevorzugt sind ferner Kombinationen aus fraktioniertem Eulieren

ίο und/oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol mit mindestens einer präparativen und einer analytischen Molekularsiebfiltration. Alle diese Kombinationen der erwähnten Trennschritte sind Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dabei gehört es zum Kenntnisstand des Fachmanns, daß bestimmten Folgen von Trennschritten weniger sinnvoll sind als andere Kombinationen. Beispielsweise ist dem Fachmann bewußt, daß bei Durchführung einer präparativen Molekularsiebfiltration nach einer analytischen Molekularsiebfiltration neben der unhandlichen Verfahrensweise auch ein schlechteres Gesamtergebnis in bezug auf die Trennwirkung erhalten wird als bei umgekehrter Reihenfolge.
Besonders bevorzugt sind in dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens folgende Kombinationen der Trennverfahren:

a) Eine fraktionierte Eluierung, gefolgt von zwei präparativen und zuletzt einer analytischen MoIekularsiebfiltration;

b) eine fraktionierte Eluierung, gefolgt von einer Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol, danach einer präparativen und zuletzt einer analytischen Molekularsiebfiltration;

c) eine Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol, gefolgt von einer oder zwei präparativen und zuletzt einer analytischen Molekularsiebfiltration.

Die Durchführung der einzelnen Trennverfahren zur Abtrennung des Großteils der begleitenden Freindproteine von LR nach dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nachstehend im einzelnen erläutert.

Bei der fraktionieren Eluierung des Proteinkonzentrats wird — nahezu unabhängig vom Molekulargewicht — der Teil der Fremdproteine aus dem Konzentrat entfernt, der bei höheren Ammoniumsulfatkonzentrationen löslich ist als LR. Dieses Trennverfahren läßt sich deshalb besonders vorteilhaft in einem

so schnellen und kjpazitätsmäßig nicht beschränkten Eintopfverfahren zusammen mit der Herstellung des Proteinkonzentrats durchführen. Falls mehrere Trennschritte nacheinander angewendet werden, wird die fi aktionierte Eluierung aus diesen Gründen bevorzugt als erster Schritt durchgeführt.

Vor der fraktionierten Eluierung muß das zu behandelnde Proteingemisch auf eine Ammoniumsuifatkonzentration gebracht werden, die zur Fällung aller Proteine ausreicht. Eine solche Lösung hat einen Ammoniumsulfatgehalt von etwa 3,7 mol/1 (bei 0 bis 8"C), d. h, sie ist zu etwa 90% gesättigt. Die Einstellung auf diesen Ammoniumsulfatgehalt erfolgt beispielsweise am Ende der Abtrennung der gesamten LR enthaltenden Serumhauptproteinrohfraktion aus dem

μ Serum (Abschnitt A). Die Konzentration des Kationenaustauschereluats wird entweder direkt durch Ausfällung der Proteine mit Ammoniumsulfat vorgenommen oder das Konzentrat wird, falls es nach einem anderen

Verfahren, wie Ultrafiltration oder Lyophilisierung, aus ι dem Eluat erhalten wurde, anschließend mit Ammoni- ; umsulfat bis zur angegebenen Konzentration versetzt. * Für die fraktionierte Eluierung wird die Ammonium-

' Sulfatkonzentration des Proteinkonzentrats sodann : durch Zugabe einer Proteine nicht schädigenden , Flüssigkeit auf etwa 2,6 mol/l ,eingestellt. Als Proteine . nicht schädigende Flüssigkeit kann Wasser oder vorzugsweise eine gepufferte Salzlösung verwendet werden. Vorzugsweise wird dabei ein pH-Wert von ! etwa 4 bis 8,5 und eine Temperatur von etwa 0 bis 8° C ! eingehalten. Ein spezielles Beispiel für eine geeignete gepufferte Salzlösung ist eine 0,001 mol/l Natriumkali-■ umphosphat-Pufferlösung, die 0,1 mol/l NaCl enthält ( und einen pH-Wert von 63 aufweist Bei Verwendung von Wasser oder einer (ammoniumsulfatfreien) Salzlösung sind für die gewünschte Erniedrigung der Ammoniumsulfatkonzentration etwa 0,4 Volumenteile pro Volumenteil Proteinkonzentrat erforderlich.

Die Ammoniumsulfatkonzentration der erhaltenen j Aufschlämmung darf nicht wesentlich unter etwa 2,6 mol/l eingestellt werden, weil sonst auch LR aufgelöst würde. Andererseits ist aber auch eine Einstellung auf eine höhere Ammoniumsulfatkonzentration als etwa 2,6 mol/l unzweckmäßig, weil dann weniger Fremdproteine in Lösung gehen und die Wirksamkeit der fraktionierten Eluierung geringer ; wird. Die Aufschlämmung wird, um eine vollständige ' Lösung der bei der eingestellten Ammoniumsulfatkonzentration löslichen Fremdproteine zu erreichen, einige Zeit, vorzugsweise etwa 10 bis 24 Stunden, vorzugsweise unter Rühren, bei den angegebenen Temperatur- und pH-Bedingungen gehalten. Anschließend wird der verbliebene Proteinniederschlag vom Überstand, beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren, abgetrennt

Die fraktionierte Eluierung ist im Prinzip eine umgekehrte fraktionierte Fällung. Deshalb ist es grundsätzlich auch möglich, diesen Reinigungsschritt als fraktionierte Fällung durchzuführen. Hierzu wird das Kationenaustauschereluat statt auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 3,7 mol/l nur auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 2,6 mol/l gebracht Die dabei ausgefallene, LR enthaltende Proteinfraktion wird vom löslichen Überstand abgetrennt. Dem Fachmann auf dem Gebiet der Proteinfraktionierung ist ] aber bekannt, daß die fraktionierte Eluierung wegen der Kinetik von Fällungsgleichgewichten häufig eh wesentlich selektiveres Trennverfahren mit höheren Ausbeuten darstellt als die fraktionierte Fällung. Dies gilt auch für die LR-Fraktionierung

Bei der Fällung begleitender Fremdproteine mit einem wasserlöslichen Alkohol wird zur Abtrennung eines Teils der Fremdproteine vom LR die Tatsache ausgenützt, daß ein Teil der Fremdproteine, nicht aber LR, unter bestimmten Bedingungen durch Zugabe eines ^ wasserlöslichen Alkohols zur der Proteinlösung ausgefällt werden. Da bei der Alkoholfällung ebenso wie bei der fraktionierten Eluierung ein Großteil der Begleitproteine unabhängig von ihrem Molekulargewicht von LR abgetrennt wird, wird dieser Trennschritt vorzugsweise im Anschluß an die fraktionierte Eluierung oder anstelle dieses Reinigungsschrittes durchgeführt. Dadurch wird, wenn anschließend eine Molekularsiebfiltration durchgeführt wird, die dabei verwendete Säule in beträchtlichem MaSe entlastet.

Die Behandlung mit'einem Alkohol wird bei einem pH-Wert von etwa 3,5 bis 5,5, vorzugsweise von etwa 4,0, und einer Temperatur von höchstens etwa 8°C, vorzugsweise höchstens etwa 5⁰C, durchgeführt Die Einhaltung des angegebenen pH-Bereiches ist von Bedeutung, da bei niedrigeren pH-Werten eine Schädigung der zu isolierenden Proteine eintreten kann und bei höheren pH-Werten die Wirksamkeit der Fällung geringer ist. Durch Einstellung des pH-Wertes im angegebenen Bereich allein wird jedoch noch keine Fällung der Fremdproteine erreicht

ίο Der wasserlösliche Alkohol wird in einer Menge von etwa 180 bis 250, vorzugsweise etwa 200 Volumenteilen, pro 1000 Volumenteile Proteinlösung zugegeben. Bei geringeren Alkoholmengen kann eine vollständige Fällung nicht erreicht werden, während eine höhere Alkoholkonzentration keine stärkere Fällungswirkung besitzt aber die Gefahr einer Schädigung des zu isolierenden Mediators durch Konformationsumwandlung mit sich bringt Spezielle Beispiele für geeignete wasserlösliche Alkohole sind Methanol, Äthanol, Propa-

M nol und Äthylenglykol. Vorzugsweise wird als wasserlöslicher Alkohol Äthanol verwendet

Zur Durchführung der Alkohol'.ilung wird das (ammoniumsulfathaitige) SerumproteinrDhkonzentrat aus dem Kationenaustauschereluat oder der Proteinrückstand der fraktionierten Eluierung in einem möglichst kleinen Volumen einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit gelöst. Ein spezielles Beispiel für eine geeignete Lösung ist 0,01 mol/l Ammoniumacetatlösung, die 0,2 mol/l NaCl enthält und einen pH-Wert von 5,0 hat Danach wird der pH-Wert der Lösung beispielsweise mit Eisessig, vorzugsweise unter Rühren, auf den angegebenen Bereich eingestellt und der Alkohol zugesetzt. Zur Ausfällung der Fremdproteine wird die Lösung sodann, vorzugsweise unter Rühren,

α einige Zeit bei den angegebenen Bedingungen gehalten. Die ausgefällten Fremdproteine werden danach, beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren, in der beschriebenen Weise von dem LR gelöst enthaltenden Überstand abgetrennt. Der Alkohol kann dann beispielsweise durch entweder Dialyse oder Ultrafiltration (vorzugsweise an einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Daltons) oder auch Lyophilisiere.i aus der verbliebenen Proteinlösung abgetrennt werden. Wird nachfolgend zur weiteren Reinigung von LR ein Molekularsiebfiltrationsschritt angewendet, so wird der Alkohol direkt ohne die vorgenannten Hilfsmethoden aufgrund seines niedrigen Molekulargewichtes (46 Daltons für C₅H₅OH) von LR (ca. 8500 Daltons) abgetrennt.

Die Molekularsiebfiltration bewirkt eine Auftrennung der Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht. Da ein überwiegender Teil der LR begleitenden, verbliebenen Fremdproteine ein höheres Molekulargewicht als LR aufweist, kann ihre Abtrennung auf diese Weise erreichI werden. Für die Trennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht wird ein hydrophiles, in Wasser quellendes Molekularsieb verwendet. Beispiele für geeignete Molekularsiebe sind mit Epichlorhydrin vernetzte Dextrer.e (Sephadex®), mit Acrylamid ver-

bo netzte Agarosen (Ultrogele) und raumvernetzte Acrylamide (Biogele), deren Ausschlußgrenzen größer als die zur Auflrennung verwendeten Deparationsgrenzen sind.

Die Molekularsiebfiltration wird, falis mehrere

b) Trennstufen zur Anwendung kommen, vorzugsweise nach einer fraktionierten Eluierung und/oder Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol durchgeführt. Bei dieser Verfahrensweise wird bereits ein Teil der

Fremdproteine aus allen Molekulargewichtsbereichen durch die vorangehenden Trennstufen entfernt, und die Menge der durch das Molekularsieb aufzutrennenden Proteine ist deshalb bereits wesentlich geringer. |e nach dem Längen-Durchmesser-Verhältnis der verwendeten Säule und dem Teilchendurchmesser der Gelmatrix. welche die theoretische Bodenzahl der Säule beeinflussen, wird die Molekularsiebfiltration als »präparativ« r;der »analytisch« bezeichnet. Sie wird als »präparativ« bezeichnet, wenn die Chromatographie an Säulen mit einem Dimensionsverhältnis Länge : Durchmesser bis 10 : 1 und einer Beladung von bis zu Vi des Säiilcnirihalti-s bzw. unter voller Ausnutzung dos gesinnten, matrizen typischen Separat lonsvokimen.s durchgeführt wird. »Analytisch« bedeutet ein l.ängen-Durchrr.esser-Verhältnis über 10 : 1. vorzugsweise etwa 50 : I, und eine Beladung bis maximal 3% des Siinleninhaltes.

Bei der priiparativen Molekularsiebchroniatographie werden Gelmatrizcn mit möglichst großer Teilchengröße benutzt, um schnell»; Durchflußraten der oft etwas viskosen Proteinlösungen bei möglichst niedrigen Drücken zu erzielen. Bei der analytischen Molekularsiebfiltration wird die Teilchengröße der Celmatrix so klein H'ie möglich gewählt, um eine maximale thcorcti-■ ehe Bodcnziihl der Säule bei technisch und sieherhcits-•näß'c vertretbarem Druck und einer FluÜgcschwindig-'--ei' der mobilen Phase von 2 bis 4 cm/h /ι: erreichen. iJ>ese Parameter sind von der Gelmatrixsiruktur .i'ih iügii und von Gel zu Gel verschieden.

Falls mehrere präpara'ive Molekularsiebriltrationen nacheinander durchgeführt werden, kann die Separa- ;i(in-.erenze abgestuft gewählt werden. Beispielsweise \ann in einem ersten f iltrationsscliriit eine Separaiior.sjrenze von 2(1 000 Daltons und in einem zweiten Sehritt _;ne Separationsgrenzc von 13 000 Daltons eingeteilt ■.'.erden. Daran .insehbeßend kann eine analvtischc Molekularsiebfiltration rrü Sena; -at!·'!¹ -ργοπα";.' ■.■·;■:■■ 1 ι "00 und eOOO Dai'ons durcl·^: ü- ■■-;τ Jen. Oie \ussch!i;i3gren~'.e des verwendeten Geh imiP ;ecii"-.fi!W • ■n'Per als etwa 10 000 Daltops sein, um e:r:c ¹ ii'umeri'-erteimng von LR (MG etwa 8500) zwischen der s'.iitionären Gelmatrixphase und der mobilen wäßrigen Pufferohase zu ermöglichen.

Die »Ainschlußgrenze« bezeichnet den hydrodynamischen Parameter eines gelösten Teilchens, welcher der Porengroße der Gelmatrix entsoricht. Teilche ι ir.it Kroßerem hydrodynamischen Parameter können nicht mehr in die Gelmatrix eindringen (Volumenverteilungskoeffizient -Oj = O). Die »Separationsgrenze« bezeichnet einen zur Trennung von gelösten Teilchen zweckmäßigerweise festgesetzten hydrodynamischen P.iram.c-ter, der zwischen einem Volnmenverteilung^koeTizienten AO = O und Kq= 1 liegt.

Zur Molekularsiebfiltration werden die Proteine gelöst in. einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit auf das Molekularsieb aufgebracht. Ein spezielles Beispiel für ein geeignetes Lösungsmittel ist 0,01 mol/1 Nairiumkaiiumphosphatlösung mit einem Gehali von 0.3 mol/1 NaCl und einem pH-Wert von 6,5. Nach der Filtration werden die LR-enthaltenden Fraktionen gesammelt. Die darin enthaltenen Proteine werden vorzugsweise durch Einstellen auf eine Ammoniumsul-■"atkonzentration von 3.7 mo!/l (90% Sättigung) konzentriert. Nach dem Abtrennen vom Überstand werden sie wieder in einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit gelöst und gegebenenfalls einem weiteren Reinigur.gsschritt unterzoeen.

Zwischen den vorstehend erläuterten Reinigungsschritten kann die Proteinlösung im Bedarfsfall durch Dialyse oder Ultrafiliration (vorzugsweise an Membranen mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Daltons).

■■) beispielsweise gegen Natriiimkaliumphosphatpufferlösung, von unerwünschten Salzen gereinigt werden Dazu kann auch eine Molekularsiebfiltration durch Wahl der entsprechenden mobilen Phase in üblicher Weise modifiziert angewendet werden. Bei den

in Molekularsiebfiltrationen wird der Proteinlösung vorzugsweise etwa 0,3 mol/1 Ammoniumsulfat zugesetzt Im Gegensatz zu höheren Konzentrationen hat das Ammoniumsulfat in dieser Konzentration einen starker F.insatzeffekt gegenüber Proteinen. Durch diese Maß-

•-. nahmen werden demnach die Proteine während der Molekularsiebfiltration in Lösung gehalten. Ferner verhindert Ammoniumsulfat das bakterielle Wachstutr und hemmt gewisse Enzyme. Dadurch trägt es zur Stabilisierung von LR bei, vor allem, wenn die

. Chromatographie bei höheren Temperaturen (übei etwa ^O⁰C) und unter nicht sterilen Bedingunger durchgeführt wird. Zur Oxidationsverhinderung wire die Proteinlösung vorzugsweise ferner mit etwa 0,001 mol/1 Cystein versetzt.

Die Temperatur und pH-Bedingungen sind bei dei Durchführung der Molekularsiebfiltration nicht beson ders kritisch. Wenn die Erhaltung der nativer Konformation der Proteine beabsichtigt ist, empfiehl! sich J'c Einhaltung einer Temperatur im Bereich vor etwa 0 bis 8°C. vorzugsweise etwa 0 bis 4°C. Der bevorzugte pH-Bereich liegt dabei zwischen 6 und 9.

Durch Anwendung der vorstehend erläuterter Trennverfahren kann nach dieser besonders bevorzugter, Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah

, rens ein Großteil der begleitenden Fremdproteine vor LR bereits vor der Chromatographie an Hydroxylapatil abgetrennt werden. Beispielsweise kann durch fraktionierte Eluierung, zweimalige präparative und eine analytische Molekularsiebfiltration das Volumen der

: ;,-!'V'!ir.-nncnden Proteine, ausgehend von 100 Liter kont.kiakiiviertes Serum = etwa 35 Liter Proteinfeuehtrnasse ( — 7 -8 kg Proteintrockenmasse) vor derr ersten Trennschritt auf weniger als etwa 100 bis 200 m. verringert werden. Damit wird auch die Möglichkeil

r, geschaffen, größere Mengen an LR zu gewinnen, da die an Hydroxylapatit zu chromatographierende ^proteinmenge verhältnismäßig klein und bereits stark konzentriert an LR ist. Hydroxylapatitsäulen mit einer Gesamtadsorptionskapazität für das so erzielte Produki

-:.. aus bis zu 2000 Liter kontaktaktiviertem Serum sind irr Laboratorium noch handhabbar.

C. Feinreinigung des Leukorekrutin zur

molekularen Homogenität:
Gewinnung von LR durch Chromatographie an
^D1 Hydroxylapatit, weitere Reinigung und

Kristallisation des LR

Nach der Durchführung eines oder einer Kombination der vorstehend unter B) beschriebenen Trennver-

to fahren wie die erhaltene, LR bereits verhältnismäßig konzentriert enthaltende Proteinlösung zur Abtrennung verbliebener Fremdproteine und Gewinnung von LR ar Hydroxylapatit Chromatographien.

Falls die konzentrierte Lösung des letzten vorange

r5 gangenen Trennschrittes Ammoniumsulfat und andere Salze, vor allem Phosphate enthält, werden diese vorzugsweise durch Dialyse an einer Membran mi einer Ausschlußgrenze von 1000 Daltons, vor derr

Aufbringen auf den Hydroxylapatit entfernt. Abgesehen von der Viskositätserhöhung durch Fremdzusätze ist aber für das Gelingen der Chromatographie an Hydroxylapatit lediglich die Phosphatkonzentration der Proteinlösung krüsch. Darüber hinaus begünstigt der Zusatz von NaCI, vorzugsweise 0,1 mol/l NaCI. die Trennung der eluiertcn Proteine (Ri-Wert-Beeinflussung) ohne Veränderung ihrer Elutionscharakteristik. Die F.'.ierung von LR erfolgt durch einen Natriumkaliumphosphat-Kon/.entrationgsgradienten, der vorzugsweise linear ist. Die LR enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und dann konzentriert, 'jeispielsweise durch [Einstellen auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3.7 mol/l und Abtrennen der ausgefallenen Proteine in der beschriebenen Weise.

Das nach der Chromatographie an Hydroxylapalil erhaltene, bei Verwendung von 100 Liter Serum noch etwa 900 mg Proteine enthaltende Leukorekiutinpräparat bi'it/t im allgemeinen einen Gehalt von etwa 5 bis einem verhältnismäßig breiten Bereich variiert werden.

Die Temperatur bei der Zonenpräzipitationschromatographie kann etwa 0 bis 4O⁰C betragen. Bevorzugt ist ein Temperaturbereich von etwa 0 bis 10'C, insbesondere etwa 4 bis 6"C. Der pH-Wert kann zwischen etwa 4 und 10 liegen; bevorzugt ist ein pH-Wert im Bereich von 6 bis 8, insbesondere etwa 7. Das Verhältnis von Länge : Durchmesser der verwendeten Säule soll größer als etwa 10 : 1 sein, bevorzugt ist ein Verhältnis von 30 bis 100 : 1, insbesondere etwa 50 : 1. Als Salze kommen alle Proteine nicht schädigenden Salze mit Alissalzwirkung in Frage. Beispiele für solche Salze sind Natriumkaliumphosphat, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat. Bevorzugt wird Ammoniumsulfat verwendet.

Der Salzkonzentrationsgradient kann jede beliebige Form habc'i, solange die Aussalzpunkte der Proteine laufstreckenmäßig getrennt sind. Bevorzugt sind lineare Konzentiationsgradienten, insbesondere ein ansteigender linearer Konzentratioiisgradient von 25 bis 80%

Prnt^ ι πρ jt η Ι_Ρ ti f*\\\ j I er» bs TSIiS ClM -'■ ,^\ *"*1 ϊ1"ΪΟΓΪΪί!ί1ΐϋυ ίΓϋΐΕΐϋΐ! ^ΪΤί1Π2Γ. DlS BcliidVJD

verhältnismäßig reines Produkt dar. Es kann jedoch, wenn die vorgesehene Verwendung dies erfordert, durch Anwendung zusätzlicher Rünigungsschritte von den verbliebenen Verunreinigungen weiter gereinigt werden. Als zusätzliche Reinigungsschritte kommen Kreislauf- oder Kaskadermolekularsiebfiltration. Rechromatographie an Hydroxylapatit. Zonenpräzipitationschromatographie, analytische Molekularsiebfiltration oder Kombinationen dieser Schritte in Frage.

Die Kreislauf- oder Kaskadenmolekularsiebfiltraiion kann unter den Bedingungen durchgeführt werden, die vorstf lend für die analytische Molekularsiebfiltration, welche vor der Chromatographie an Hydroxylapatit /ur Abtrennung der Frenidproteine dient, beschrieben sind. F.s können die !.''eichen Molekularsiebe und die gleichen Säulenbedingungen verwendet werden. Bevorzugt ist Sephadex®G 50 bei einem Länge-Durchmesser-Verhältnis der Säule von mindestens etwa 50 : 1 und einer Beladung von höchstens etwa 3^c/o des Säuleninhalies. Als Lösungsmittel und zur Eiuieaing werden vorzugsweise die bei der analytischer, Molekularsiebfiltration benutzten Lösungsmittel eingesetzt.

Bei der Kreislaufmolekularsiebfiltration wird das Eiuat bei den festgelegten Separationsgrenzen im Kreislauf wieder in die gleiche Säule geleitet. Auf diese Weise wird die Laufstrecke der Proteine differentiell verlängert. Bei einer anderen Ausfiihrungsform der Kaskadenmolekularsiebfiltration wird das Eluat bei den festgelegten Separationsgrenzen aut eine neue Säule mit gleichen oder ähnlich definierten Parametern geleitet.

Zur Rechromatographie an Hydroxylapatii wird das LR-Präparat, vorzugsweise durch Dialyse an einer Membran mit einer Ausschiuligrenze von 1000 Daltons, zunächst von gegebenenfalls enthaltenen Fremdsalzen und Ammoniumsulfat befreit. Die erhaltene Lösung des LR-Präparats wird sodann auf den Hydroxylapatit aufgebracht und mit Hilfe eines Natriumkaliumphosphat-Konzentrationsgradienten eluiert. Die das LR enthaltenden Fraktionen werden in üblicher Weise gesammelt und konzentriert.

Bei der Zonenpräzipitationschromatographie (vgl. J. Porath, Nature, Bd. 196 [1962], S. 47) werden restliche Proteinverunreinigungen des LR-Präparats durch Aussalzfraktionierung der Proteine mittels eines Salzkonzentrationsgradienten abgetrennt. Dabei können Temperatur und pH-Wert, Dimension der Säule, Art des Salzes, Form des Gradienten und Beladung der Säule in

der Säule beträgt höchstens etwa 5%, vorzugsweise etwa 1%.

Die analytische Molekularsiebfiltration zur zusätzlichen Reinigung des LR-Präparats kann in der gleichen Weise durchgeführt werden wie die analytische Molekularsiebfiltration, die vor der Chromatographie an Hydroxylapatit zur Abtrennung der Fremdproteine dient. Es eignen sich die gleichen Molekularsiebe und die gleichen Säulenbedingungen.

Bereits mit einem der genannten zusätzlichen Reinigungsschritte kann eine beträchtliche Abtrennung der neben ',R noch ;n dem LR-Präparat enthaltenen Frenidproteine erreicht werden. Beispielsweise wird durch Rechromatographie an Hydroxylapatit ein LR-Präparai erhalten, dessen Proteingehalt zu etwa 50 bis 70% aus LR besteht. Durch Zonenpräzipitationschromatographie wird der LR-Anteil der Proteine des LR-Präparats auf mehr als 98% und durch analytische Molekularsiebfiltration auf etwa >99% erhöht. Wenn nur ein einziger zusätzlicher Reinigungsschritt durchgeführt wird, ist die Zonenpräzipitationschromalographie bevorzugt.

Grundprinzip der Proteintrennung mittels der Zonenpräzipitationschromatographie sind unterschiedliche, strukturgegebene reversible Löslichkeitseigen.ichaften der Proteine. Sie gehören zu den empfindlichsten molekularen Trennparametern und wurden häufig als Kriterium für den Nachweis der molekularen Einheitlichkeit eines Proteins verwendet. Dies begründet die Bevorzugung der Zonenpräzipitationschromalographie vor den verschiedenen erwähnten Arten der Rechromatographiemethoden, bei welchen die Reinigungseffekte durch bessere Annäherung an ideale Gleichgewichte in nichι idealen Systemen erzielt werden.

Für eine therapeutische Verwendung wird das LR vorzugsweise durch eine Kombination von mindestens zwei der genannten Reinigungsschritte praktisch vollständig von Fremdproteinen befreit. Bevorzugt ist insbesondere eine Ausführungsform, bei der das durch Chromatographie an Hydroxylapatit erhaltene LR-Präparat zunächst einer Kreislaufmolekularsiebfütration unterzogen, dann an Hydroxylapatit rechromatographiert, danach einer Zonenpräzipitationschromatographie und abschließend einer analytischen Molekularsiebfiltration unterzogen und dann kristallisiert wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Rechromatographie an Hydroxylapatit auch nach der Zonenpräzipitationschromatographie durchgeführt werden. In diesen bevorzugten Ausführungsformen

2b

wird ein l.R-Präparat erhalten, dessen Proteingehalt zu mehr als 99% aus LR-Protein besteht. Danach ist das Leukorekrutinpräparat in molekular einheitlichem Zustand nach allen zur Verfügung stehenden chromatographischen, elektrophoretischen und Lösungskriterien, welche durch Molekülgröße, -Stabilität, -ladung und Oberflächenbeschaffenheit charakterisiert sind, d. h.. die Leukorekrutir.lösung besteht aus einer homogenen monodispersen Proteinphasc.

Die Temperatur- und pH-Bedingungen sind, wie vorstehend an verschiedenen Stellen bereits bemerkt wurde, in den meisten Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht besonders kritisch. Wenn die Gewinnung von LR in nativer Konformation gewünscht wird, müssen die Trenn- und Reinigungsstufen jedoch unter im wesentlichen physiologischen pH- und Salzbedingungen und vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen von höchstens etwa 10⁰C, vorzugsweise höchstens etwa 6°C, durchgeführt werden. Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die iuMdiiung uicSCT uCuingüngC

erstmals iciCiii

Das erhaltene LR kann in einer gepufferten physiologischen Salzlösung, beispielsweise in 0,0015 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,15mol/l (0,9%) NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, nach üblicher Filtersterilisation (0,2 μηι Porenwoite) nativ und biologisch aktiv auch bei Raumtemperatur (für mindestens 200 Stunden) oder eingefroren bei -25° C (für mindestens 5 Jahre) aufbewahrt werden. Diese Stabilität des Proteins kann unter anderem als eines der Kriterien für die molekulare Einheitlichkeit angesehen werden. Die sichere Aufbewahrungsform bei Temperaturen /.wischen -20 und +50⁰C ist die kristalline Form als Kristallsuspension, da sie infolge des hohen osmotischen Drucks gegen Infektion durch Mikroorganismen und deren Wachstum geschützt ist.

Zur Kristallisation des Leukorckrutins wird die steril filtrierte Proteinlör,ung, welche 0,2 mol/1 Natriumkaliumphosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5, 10% Glycerin. 0,2 mol/1 NaCl, 0.001 mol/1 Cystein, 0,1 mol/1 KCl und 20 mg/ml I.eukorekrutinproben enthält, so lange mit festem, feinpulverisiertem Ammoniumsulfat (Suprapur) bei 20° C versetzt, bis ein leichter Schleier einer Trübung durch Proteinaussalzpräzipitation erscheint. Diese geringe Proteinfällung wir durch rasches Zentrifugieren entfernt (10 000 χ g; 5 Minuten). Durch Zugabe einer sehr kleinen Menge Ammoniumsulfatlösung (gesättigt) wird in der klaren Proteinlösung °in sndenglänzendes Präzipitat doppelbrechender, optisch anisotroper Leukorekrutinkristalle erzeugt, welcne innerhalb eines Mons'.s beim Stehen bei 0 bis 2ⁿ°C größer werden durch langsames Wachstum. Durch langsame Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration kann dieses Umfällwachstum begünstigt werden. Die Lösungen der Kristalle haben die gleichen molekularen Eigenschaften wie die zur Kristallisation eingesetzte Leukorekrutinlösung.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wird die Gewinnung von LR ausgehend von Schweineblut beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Ausführungsform beschränkt. Es kann auch Blut anderer Sauger verwendet werden.

Beispiel A

Herstellung von Leukorekrutin im Serum. Regulierte und limitierte Proteolyse des Serums durch Kontaktaktivierung und Abtrennen der Leukorekrutin enthaltenden Serumproteinrohfraktion von den übrigen Bestandteilen des Serums und Bereitung eines Leukorekrutin

enthaltenden Serumproteinrohkonzentrats

Es wird die Herstellung von LR im Serum durch Kontaktaktivierung, die Abtrennung der Serumproteinrohfraktion von den übrigen Bestandteilen des Serums und die Bereitung eines Leukorekrutin enthaltenden Serumproteinrohkonzentrats erläutert. Sämtliche Arbeitsschritte werden boi 0 bis 8°C durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Zentrifugationen erfolgen wie beschrieben, entweder einstufig oder zweistufig (als Durchflußzentrifugation).

300 Liter Schweineblut werden ohne Zusätze bei Raumtemperatur koagulieren gelassen. Der Blutkuchen wird durch Filtrieren oder Dekantieren vom Rohserum getrennt. Das überstehende Serum wird durch Zentrifugieren von restlichen Blutkuchenrückständen abgetrennt. Hierauf wird das klare Serum sofort mit gekörntem, unlöslichem, gelq jellbaren Dextran in einer Menge von 5 mg/m! Serum oder mit gekochter und gewaschener Bäckerhefe in einer Menge von 100 mg/ml Serum versetzt und 1 Stunde bei 37°C unter Rühren im Wasserbad inkubierL Danach wird das Gemisch au? 4°C abgekühlt, und das Dextran bzw. die Bäckerhefe wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Anwesenheit von LR in den erhaltenen 120 Litern kontaktaktivierte? Serum, das etwa 9.2 kg Protein enthält, kann durch eines der beschriebenen Testverfahren nachgewiesen werden (biologisch: Leukozytosereaktion in vivo; Mobilisierung der Knochenmarkleukozyten in vitro; physikalisch-chemisch: durch Immunodiffusion und Immunelektrophorese mit anti-Leukoreknitin-Immunglobulinfraktionen).

Folgende Reinigungsarbeiten werden darn in Gegenwart von 0,001 mol/1 Cystein bei Temperaturen von 0 bis

4(i 8°C ausgeführt, soweit nichts anderes angegeber ist:

120 Liter kontaktaktiviertes Serum werden mit 5 mol/1 Essigsäure auf den pH-Wert 4,5 eingestellt und mit 240 Liter 0,001 mol/1 Kaliumphosphi't-Acetat-Pufferlösung versetzt, die 0,2 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 4,5 aufweist. Die erhaltene Lösung wird sodann unter Rühren mit einem gequollenen, regenerierten Kationenaustauscher (Na ⁺ als mobiles Austauschion) auf der Basis einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextranmatrix (CM-Sephadex C-50) in einer Menge von 1 Volumenteil Ionenaustauscher pro 3 Volumenteile Proteinlösung versetzt. Der verwendete Ionenaustauscher wird mindestens 1 Tag zur Oberflächenaktivierung mit Schweineserum vorbehandelt, vor der Verwendung

5=> regeneriert und in der Phosphai-Acetat-Pufferlösung vom pH-Wert 4,5 äquilibriert.

Das erhaltene Gemisch wird etwa 24 Stunden gerührt Danach wird das Ionenaustauschergei absetzen gelassen und durch Absaugen im Büchnertrichter vom

Überstand abgetrennt Das Ge! wird sodann dreimal mit je 120 Liter 0,001 mol/1 Kaliumhydrogenphosphat-Acetat-Pufferlösung, die 0,2 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 4,5 aufweist, gewaschen, bis die Extinktion E des Filtrats bei

6-: 280 nm< 1,0 ist.

Zur Eluierung der adsorbierten Proteine wird das beiadene Ionenaustauschergel dreimal in einem dem Gelvolumen entsprechenden Volumen 0,5 mol/1 Kali-

umphosphatpufferlösung, welche 0,001 mol/l Cysstein enthäl* und einen pH-Wert 6.5 hat, suspendiert. Das Ionenaustauschergel wird von Jen Lösungen jeweils durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt Die erhaltenen Proteinlösungen werden vereinigt (360 Liter).

Die vereinigten Eluatc des Kationenaustausv.hergels werden durch Zugabe von 630 g Ammoniumsulfat pro Liter Eluatlösung auf eine Ammoniumsulfat-Sättigungskonzentration von 90% eingestellt. Während der Zugabe wird der pH-Wert der Proteinlösung laufend kontrolliert und durch Zusatz von 2 η Ammoniak auf 6,5 bis 7,0 gehalten. LR fällt zusammen mit sämtlichen Serumproteinen aus der Lösung aus. Der Proteinniederschlag wird durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 xg vom nahezu proteinfreien Überstand abgetrennt. Es werden 49 Liter Serumproteinrohkonzentrat als ammoniumsulfathaltiger Proteinschlamm erhalten, der etwa 3,5 kg Protein enthält.

Grobreinigung des Leukorekrutin:

Abi.-ennung des überwiegenden Teils

der begleitenden Fremdproteine von LR

Beispiel Bl

49 Liter des vorstehend unter Beispiel A) erhaltenen Proteinniederschlags, der eine Ammoniunisulfatkonzentration von etwa 3,7 mol/1 aufweist, werden zur fraktionierten Eluierung mit 0,001 mol/l Nairiumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,1 mol/1 NaCI und 0,001 mol/1 Cystein enthält und ein^n pH-Wert von 6,3 hat, in einer Menge von 0,4 Volumenteüen pro Volumenteil Proteinschlammkonzentrat versetzt und etwa 24 Stunden gerührt. Danach wird der ungelöst gebliebene Proteinniederschlag, der praktisch das gesamte LR enthält, durch Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom überstehenden Eluat getrennt. Es verbleiben etwa 70% (2,7 kg Protein) des eingesetzten Proteinkonzentrats, das immer noch die Form eines Schlamms hat (Volumen etwa 14 Liter). Dieses wird gegen 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,1 mol/l NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7.4 aufweist, an einer Membran mit der Ausschlußgrenze von 1000 Daltons dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen. Es werden 40 Liter ammoniumsulfatfreie Proteinlösung erhalten, die gemäß C) auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden.

Beispiel B2

49 Liter des vorstehend unter Beispiel A) erhaltenen Proteinrohkonzentrats werden zur fraktionierten Fällung in einem möglichst kleinen Volumen 0.01 mol/1 Ammoniumacetat-Pufferlösung, die 0,2 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 5,0 aufweist, gelöst Sodann wird die erhaltene Lösung mit Eisessig unter leichtem Rühren auf den pH-Wert 4,0 eingestellt und bei einer Temperatur von 0⁰C mit 0,2 Volumenteüen 96prozentigem Äthanol pro Volumenteii Proteinlösung versetzt Während der Äthanolzugabe werden Temperatur und pH-Wert konstant gehalten. Das erhaltene Gemisch wird 1 Stunde bei 0⁰C gerührt. Es fallen 70% (2,45 kg) der Fremdproteine aus, die durch einstündiges Zentrifugieren bei mindestens 16 000xg vom LR enthaltenden Überstand abgetrennt werden. Der abgetrennte Proteinniederschlag (10 Liter) wird viermal mit dem gleichen Volumen 0,01 mol/l Ammoniumacetat-Pufferlösung, die 0,2 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 200 ml Äthanol pro Liter Puffer enthält und einen pH-Wert von 4,0 aufweist, bei einer 'Temperatur von O⁰C gewaschen. Die Waschlösungen werden mit dem Überstand der Zentrifugierung vereinigt und mit

-, 2 mol/l Ammoniak auf den pH-Wert 5,0 eingestellt. Anschließend wird das Äthanol durch Lyophilisieiung, Molekularsiebfiltration, Ultrafiltration oder Dialyse (Ausschlußgrenze 1000 Daltons) gegen den Ammoniumacetatpuffer abgetrennt. Im Falle der Ultrafiltration,

m Dialyse und Molekularsiebfiltration werden aus der erhaltenen alkoholfreien Lösung die Proteine durch Zugabe vom Ammoniumsulfat (90% Sättigung) gefällt und durch Zentrifugieren bei 10 00 χ g vom proteinfreieii Überstand abgetrennt. Der durch Lyophilisieren

i) oder Fällung erhaltene Proteinrückstand (1,05kg Protein) wird gemäß Beispiel 1 von Ammoniumsulfat durch Ultrafiltration oder Dialyse befreit und kann dann als ammoniumsulfatfreie Lösung (Volumen 16 Lif~r) gemäß C) auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht

:<) werden.

Beispiel B3

49 Liter des gemäß Beispiel A) erhaltenen Proteinniederschlags werden in 0,01 mol/1 Natriumkaliumphos-

;■> phatlösung, die 0,3 mol/l NaCl und 0,001 mol/l Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,7 aufweist, in einer Menge von 2 Volumenteüen Pufferlösung pro Volumenteil Proteinkonzentrat gelöst und zur Abtrennung einer kleinen Menge ungelösten Rückstandes 30 Minuten bei

in 4° C und 10 000 xg zentrifugiert. Sodann wird die klare Lösung (147 Liter) einer präparativen Molekularsiebfiltration unterzogen, indem sie auf eine mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex" G-50; 50 bis 150μιη Teilchengröße)

J^ gefüllte Säule aufgetragen wird. Die Säule hat das lOfache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge zu Durchmesser) von 10 : 1. Danach wird die Säule mit einem dem Säulenvolumen entsprechenden Volumen 0,01 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Puf-

4(1 ferlösung die 0,3 mol/l NaCI, 0,001 mol/l Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält und einen pH-Wert von 6,7 aufweist, bei aufwärts gerichtetem Fluß (3 cm/h) eluiert. Das Eiuat wird in zwei Fraktionen mit einer Separationsgrenze von 20 000 aufgeteilt. Die Fraktion

4i mit dem Molekulargewicht > 20 000 Daltons enthält 85% der eingesetzten Proteinmasse. Die LR enthaltende Fraktion (0,5 kg Protein) mit dem Molekulargewicht <20 000 Daltons wird gesammelt. Die Proteine dieser Fraktion werden gemäß Beispiel B2 lyophilisiert oder

Vi durch Fällen mit Ammoniumsulfat konzentriert und danach durch Dialyse oder Ultrafih-ation an einer Membran mil der Ausschlußgrenze ; 10 Daltons vom AnimoniumsiiUat befreit. Die erhaltene Lösung, die nur noch 15°/o der ursprünglichen Proteinmasse (7.5 Liter)

■·) enthält und ein Volumen von 22,5 Liter aufweist, kann gemäß C) auf die Hydroxyiapatitsäule aufgebracht werden.

Beispiel B4

co 49 Liter des gemäß Beispiel A) erhaltener. Proteinniederschiags werden gemäß Beispiel Bi fraktioniert eiuieri. Die erhaltenen, LR enthaltenden !4 Liter Proteinschlamm werden gemäß Beispiel B3 in der dort genannten Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung gelöst

p5 und an Sephadex® G-50 Chromatographien. Die Fraktion mit einem Molekulargewicht 20 000 Daltons wird gesammelt, lyophilisiert oder mit Ammoniumsulfat konzentriert und anschließend dialysiert oder ultrafü-

triert an einer Membran mit einer AusschiuQgrenze von 1000 Dalton. Es werden 6,0 Liter ammoniumsulfatfreie Proteinlösung mit einem Gehalt von 0,4 kg Protein erhalten.

Beispiel B5

49 Liter des gemäß Beispiel A) erhaltenen Proteinniederschlags werden gemäß Beispiel B2 mit Äthanol behandelt Der erhaltene Proteinrückstand (1,05 kg Protein) wird danach gemäß Beispiel B3 aufgelöst und Chromatographien. Es werden 2,3 Liter ammoniumsulfatfreie Proteinlösung mit einem Gehalt von 160 g Protein erhalten.

Beispiel B6

49 Liter des gemäß Beispiel A) erhaltenen Proteinniederschlags werden gemäß Beispiel B4 fraktioniert eluiert und danach einer präparativen Molekularsiebfiltration unterzogen.

Nach dem Konzentrieren der Proteine der Fraktion mit einem Molekulargewicht 20 000 Daltons durch Lyophiüsieren, Ultrafiltration an einer Membran mit einer AusschiuQgrenze von 1000 Daltons oder durch Fällen mit Ammoniumsulfat wird der erhaltene, LR enthaltende Proteinniederschlag in 0,01 mol/l Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0_r3 mol/l NaCl und 0,001 mol/l Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,7 lufweist, in einer Menge von 1,5 Volumenteile Pufferlösung pro Volumenteil Proteinniederschlag gelost. Nach dem Abzentrifugieren von wenig ungelöst gebliebenem Rückstand wird die Lösung zur zweiten präparativen Molekularsiebfiltration auf eine mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex® G-50; 50 bis 150 μπι Teilchengröße) gefüllte Säule aufgetragen, die das lOfache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 10 :1 aufweist. Hierauf wird die Säule bei aufwärts gerichtetem Fluß (3 cm/h) mit 0,01 moS'l Natiiumkaliumphosphat-Pufferlösung, u,e 0,3 mol/! NaCl, 0,001 mol/l Cystein und 0,4 mol/l Ammoniumsiilfat enthält und einen pH-Wert von f>,7 aufweist, eluiert. Das erhaltene Eluat wird in drei Fraktionen mit den Separationsgrenzen 20 000 und 13 000 Daltons aufgetrennt. Die LR enthaltende Proteinfraktion mit einem Molekulargewicht 13 000 Daltons enthält 130 g Protein. Sie wird zur Proteinkonzer.trierung lyophilisiert, ultrafiltriert an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Daltons oder auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3,7 mol/l eingestellt. Der ausgefallene Proteinniederschlag wird durch Zentrifugieren vom Überstand abgetrennt.

Der erhaltene, LR enthaltende Proteinniederschlag wird in. 1.5 Volumenteilen der in der vorangehenden Molekularsiebfiltration verwendeten Pufferlösung (ohne Ammoniumsulfat) gelöst und zur Entfernung von wenig ungelöstem Rückstand I Stunde bei lOOOOxg zentrifugiert.

Die erhaltene klare Lösung wird zur analytischen Molekularsiebfiltration auf eine Säule aufgebracht, die mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex® G-50) mit einer Teilchengröße von 20 bis 80 um gefüllt ist. Die verwendete Säule besitzt das 50fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 50 : 1. Zur Eluierung beim Aufwärtsfluß (3 cm/h) wird eine 0,003 mol/l Natriumkaliumphosphat-Puffcrlösung, die 0.3 mol/l NaCI, 0,001 mol/l Cystein und 0.4 mol/l Ammoniumsulfat enthält, verwendet. Das Eluat wird in mehrere Fraktionen aufgeteilt, in welchen die LR-Anwesenheit wie beschrieben nachgewiesen wird. Die Fraktion mit dem Molekulargewichtsbereich von 11 000 bis 6000 Daltons, die im wesentlichen das gesamte LR enthält, wird abgetrennt. Sodann wird diese Fraktion auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3,7 mol/l eingestellt und der ausgefallene Proteinniederschlag durch Zentrifugieren vom Überstand getrennt. Ausbeute: 180 ml Proteinkonzentrat mit einem Gehalt von 9,0 g ίο Protein.

In den F i g. 6 bis 8 ist der Verlauf der Abtrennung des LR von den Begleitproteinen durch Molekularsiebfiltration gemäß Beispiel B6 in Form von Chromatogrammen wiedergegeben.

Beispiel B7

49 Liter des gemäß A) erhaltenen Proteinniederschlags werden gemäß Beispiel Bl fraktioniert eluiert Die erhaltenen 14 Liter Proteinschlamm werden sodann gemäß Beispiel B2 mit Äthanol behandelt Der erhaltene Proteinrückstand (1,05 kg Protein) wird gemäß Beispie! B6 der zweiten der dort beschriebenen präparativen Molekularsiebfiltration und anschließend der analytischen Molekularsiebfiltration ebenfalls ge-

maß Beispiel B6 unterzogen. Es wird das gleiche Ergebnis wie in Beispiel B6 erhalten.

Beispiel B8

49 Liter des gemäß A) erhaltenen Proteinniederjo schlags werden zunächst gemäß Beispiel B5 mit Äthanol behandelt und einer präparativen Molekularsiebfiltration unterzogen. Danach wird der erhaltene Proteinrückstand (160g Protein) gemäß Beispiel B6 der /weiten präparativen und anschließend der analytischen Molekularsiebfiltration unterzogen. Es wird das gleiche Ergebnis wie in Beispiel B6 erhalten.

Beispiel B9

sii 0,49 Liter des vorstehend unter A) erhaltenen Proteinniederschlags werden in einem möglichst kleinen Volumen 0,001 mol/l Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,2 mol/l NaCl und 0,001 mol/l Cystein enthält, und einen pH-Wert von 6,6 aufweist, gelöst und zur

■π Abtrennung einer kleinen Menge ungelösten Rückstandes 30 Minuten bei 16 000 χ g zentrifugiert Danach wird die Lösung 24 Stunden gegen 0,001 mol/l Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,2 mol/l NaCl und 0,001 mol/! Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,e

in aufweist, an einer Membran mit der Ausschlußgrenzt 1000 Daltons dialysiert, bis keine Sulfationen mehl nachweisbar sind. Sodann werden 60 ml Calciumphos phatgel, äquilibriert mit der genannten Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, in die Proteinlösung eingerührt

r- Das erhaltene Gemisch wird 1 Stunde geiUhrt Danacr wird das Gel zur Abtrennung 5 Minuten bei lOOOOxg zentrifugiert und dreimal mit der genannten Natriumka liumphosphat-Pufferiösung vom pH-Wert 6,6 gewä sehen. Dazu wird das Gel in einer möglichst kleiner

M) Menge der Pufferlösung suspendiert und durch Zentrif gieren wieder abgetrennt. Alle proteinhaltigen Lösun gen werden sodann vereinigt und durch Zusatz vor Ammoniumsulfat ausgefällt und konzentriert. Dei erhaltene Proteinniederschlag (etwa 30 g Protein) wire

hi gemäß Beispiel Bl durch Dialyse von Ammoniumsulfa befreit und kann dann als ammoniumsulfetfreie Lösung gemäß C) auf die Hycroxylapatitsäule aufgebrach werden.

Beispiel BIO

0,49 Liter des vorstehend unter Beispie! A erhaltenen Proteinniederschlags werden in einem möglichst kleinen Volumen 0,01 mol/1 tris-HCI-Lösung, die 0,03 mol/I NaCl und 0,001 mol/I Cystein enthält und einen pH-Wert von 8,0 hat, gelöst. Die etwas trübe Lösung wird an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Daltons so lange gegen den Lösungspuffer dialysiert, bis keine Sulfationen mehr nachweisbar sind. Sodann werden in ein Volumentei! dieser erhaltenen klären Lösung unter Rühren 2 Volumenteile eines gequollenen regenerierten und im oben genannten Puffersystem äquilibrierten Anionenaustauschers (Cl" als mobiles Austauschion) auf der Basis einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextranmatrix (DEAE-Sephadex^e-A 50) zugesetzt.

Das erhaltene Gemisch wird 5 Stunden gerührt. Danach wird das lonenaustauschergel absetzen gelassen und durch Absaugen im Büchner-Trichter vom Überstand abgetrennt. Das Gel wird sodann dreimal mit 4 Liter der obengenannten Absorptionspufferlösung gewaschen, bis die Extinktion des Filtrats bei 280 nm< 1,0 ist.

Zur Elution des LR und der adsorbierten Proteine wird das beladene lonenaustauschergel dreimal mit einem dem doppelten Gelvolumen entsprechenden Volumen 0,01 mol/1 Piperazin-HCI-Puffer, der 2,0 mol/I NaCI und 0,001 mol/I Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,5 hat, unter Rühren suspendiert. Das Ionenaustauschergel wird von den Lösungen jeweils durch Dekantieren, Filtrieren (im Büchner-Trichter) oder Zentrifugieren abgetrennt. Die erhaltenen Proteinlösungen werden vereinigt (6 Liter) und das darin enthsUene LR und die anderen Proteine in üblicher, beschriebener Weise vorzugsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat konzentriert. Der erhaltene Proteinniederschlag (etwa 25 g Protein) wird gemäß Beispiel B1 durch Dialyse von Ammoniumsulfat befreit und kann als ammoniumsulfatfreie Lösung gemäß Beispiel C auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden.

Beispiele C

Feinreinigung des Leukorekrutin zur molekularen
Homogenität: Gewinnung von LR durch

Chromatographie an Hydroxylapatit.
weitere Reinigung und Kristallisation des LR

Beispiel Cl

Der gemäß Beispiel B6 erhaltene Proteinniederschlag wird in möglichst wenig 0,0015 mol/I Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0.15 mol/1 NaCI und 0.001 mol/I Cystein enthält, gelöst und gegen 0.001 mol/I Natriumkaliumphosphat-Puffcrlösung, die 0,1 mol/1 NaCI und 0.001 mol/I Cystein enthält und einen pH-Wert von 7.4 aufweist durch Molekularsiehfiltration, Ultrafiltration oder Dialyse entsalzt (Ausschlußgrenze 1000 Daltons). bis in der Dialysen-Pufferlösung kein Sulfat mehr nachzuweisen ist. Sodann wird ein kleiner Anteil an unlöslichen Proteinen durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g entfernt.

Die erhaltene klare I,R enthaltende Proteinlösung (200 ml; ^Q.O g Proteingeh.ilt) wird auf eine mit llvdroxylapatit gefüllte Säule aufgetragen. Die Säule l>e<.i(/t ein Verhältnis Länge /u Durchmesser von 10 : 1 u"d (Ins (IrcifiK'hc Volumen des aufzutragenden !'•-'■teinvolumens (45 mg Protcin/ml). Die Säule wurde μ ihcr mit dem ' iinffachen ihres Volumens 0.001 mol/I

Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,001 mol/I Cystein enthält, äquilibriert (Fluß 3 cm/h).

Die negativ adsorbierten Proteine werden durch Eluieren mit der zum Äquilibrieren der Säule verwendeten Pufferlösung ausgewaschen. Sodann wird die Eluierung der LR enthaltenden Fraktion mit einem linearen Phosphatkonzentrationsgradienten von 0,001 mol/1 bis 0,5 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7,4 unter Konstanthaltung des

ίο angegebenen NaCl und Cysteinzusatzes über einen Zeitraum von 4 Tagen durchgeführt LR wird bei einer mittleren Phosphatkonzentration von 0,04 mol/1 eluiert und so auch von anderen Proteinen getrennt. Der Elutionsgradient wird mit Hilfe der Leitfähigkeitsmessung verfolgt und kontrolliert Nach üblicher Konzentrierung der LR enthaltenden Fraktionen werden 20 ml mit 900 mg Produkt erhalten, das ein Leukokrutinpräparat mit einem Gehalt von etwa 5 bis 40% der Proteine an LR darstellt Als Lösungspuffer wird zweck.ftäßigerweise 0,00] mol/l Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, welche 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, verwendet. Dadurch wird es möglich, jede andere Salzkonzentration durch Hinzufügen eines kleinen Volumens einer konzentrierten Salzlösung einzustellen. Beispielsweise ergibt die Zugabe von 0,05 Volumenteilen einer 2 mol/1 NaCI-Lösung vom pH-Wert 7.2 bei Bedarf eine Pufferlösung mit 0,1 mol/1 NaCI.

Die Gewinnung des Leukorekrutinpräparates durch

in Chromatographie an Hydroxylapatit gemäß Beispiel Cl zeigt das Chromatogramm der F i g. 9

B e i s ρ i e I C2

Beispiel Cl wird mit dem gemäß Beispiel B2 r, erhaltenen Proteinniederschlag wiederholt. Nach der Ultrafiltration oder Dialyse und der Entfernung eines kleinen Anteils unlöslicher Proteine werden 16 Liter klare Lösung erhalten, die auf eine mit Hydroxylapatit gefüllte Säule mit den \r. Beispiel Cl angegebenen Säulencharakteristika (Volumen 3x16 Liter. Verhältnis Länge zu Durchmesser 10:1), also einem Durchmesser von 18 cm und einer Länge von 180 cm aufgetragen wird. Nach der Eluierung werden etwa 1200 mg Produk; erhalten, das ein Leukorekrutinpräparat mit einem 4> Gehalt von etwa 5 bis 10% LR darstellt.

Beispiel C3

Das gemäß Beispiel CI erhaltene LR-Präparat wird in 0.1 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0.1 mol/1 NaCI. 0.001 mol/1 Cystein und 1 mol/1 Ammoniumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, zu einer Proteinkonzentration von etwa 45 mg/ml gelöst. Die erhaltene Lösung (20 ml) wird bei einer Temperatur von 4⁰C auf eine Säule aufgebracht, die mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex®G-50) gefüllt ist. Die Matrix befindet sich in einem ansteigenden linearen Ammoniumsulfat-Konzentrationsgradienten von 1,0 bis 3,2 mol/1 Ammoniumsulfat (25 bis 80% Sättigung). Die Steigung des Gradienten beträgt +2% Ammoniumsulfatsättigung/cm Säulenhöhe (0,08 mol/I (NH₄J₂S(VCm), wobei der Rereich des Gradienten über etwa die halbe Säuler.länge reicht. Das Verhältnis Länge : Durchmesser der Säule beträgt 50 : 1. das Säulen volumen ist lOOmal größer als diis Auftragsvolumen. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 2 cm/h.

Die Eluierung erfolgt mit der vorstehend genannten Natriumkaliumphosphatlösiing. die 1 mol/I Ammonium-

sulfat enthält. Die LR enthaltenden Fraktionen, welche bei 61% Ammoniumsulfatsättigung eluieren, werden gesammelt und die Proteine in üblicher Weise konzentriert, Es werden 340 mg (8 ml) gereinigtes Leukorekruiinpräparat erhalten, das zu etwa 70% aus ϊ LR besteht.

Als Lösungspuffer wird zweckmäßigerweise wie in Beispiel Cl 0,00t mol/1 Natriumkaliumphosphitt-Pufferlösung, die 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, verwendet

Beispiel C4

Das gemäß Beispiel Cl nach Proteinkonzentrierung durch Ammoniumsulfatfällung, Ultrafiltration oder Lyophilisieren erhaltene LR-Präparat (900 mg; etwa 20 ml) wird in 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, aufgelöst. Anschließend wird ein kleiner Anteil an unlöslichen Proteinen durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 48 000 χ g entfernt.

Hierauf wird die erhaltene klare Lösung einer analytischen Kreislaufmolekulargewichtsfiitrationschromatographie unterzogen. Dazu wird die Lösung bei einer Temperatur von 4° C auf eine mit Sephadex® G-50 mit einer Teilchengröße von 20 bis 80 μπι gefüllte Säule aufgebracht, die das 50fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhäitnis (Länge · Durchmesser) von 50 :1 besitzt. Die Eluierung erfolgt mit einer 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 03 mol/1 m NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält. Die Eluate werden bei einer Separationsgrenze von 9000 Daltons dreimal im Kreislauf geführt

Nach üblicher Proteinkonzentrierung werden 810 mg LR enthaltendes Produkt mit einem Molekulargewicht von 8500 Daltons erhalten, welche in einem kleinstmöglichen Volumen von 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung mit 0,001 mol/I Cystein und einem pH-Wert von 7,20 aufgelöst werden.

Das vorstehend erhaltene Produkt wird anschließend ίο an einer mit Hydroxylapatit gefüllten Säule, welche im angegebenen Puffersystem äquilibriert ist und ein Verhältnis Länge zu Durchmesser von 20:1 und mindestens das 5fache Volumen des aufzutragenden Proteinlösungsvolumens (etwa 45 mg Protein/ml) hat, im obengenannten Puffersystem Chromatographien und mit einem Phosphatkonzentrationsgradienten, der unter Beibehaltung des pH-Wertes und der Cysteinkonzentration im Konzentrationsbereich von 0,001 bis 0,1 mol/1 Natriumkaliumphosphat flach linear ist, über 6 Tage eluiert. Es werden 405 mg gereinigtes Leukorekrutinpräparat erhalten, dessen Proteinanteil zu etwa 50 bis 70% als LR besteht

Das vorstehend erhaltene LR-Präparat wird nun gemäß Beispiel C3 einer Zonenpräzipitationschromatographie unterzogen. Es werden 205 mg (5 ml) weiter gereinigtes Leukorekrutinpräparat erhalten, dessen Proteinanteil zu mehr als 98% aus LR besteht.

Abschließend wird das vorstehend durch Zonenpräzipitationschromatographie gereinigte LR-Präparat einer analytischen Molekularsiebfiltration unterzogen. Das LR-Präparat wird in 0,0015 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCI enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, zu einem Gesamtvolumen Vi .n 5 ml mit einer Proteinkonzentration von etwa 35 bis 45 mg/ml gelöst Die erhaltene klare Lösung wird auf eine Säule aufgebracht die mit Sephadex® G-50 mit einer Teilchengröße von 20 bis 80 μπι gefüllt ist Die verwendete Säule besitzt mindestens das 50fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge: Durchmesser) von mindestens 50:!. Zur Eluierung wird eine 0,03 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 03 mol/1 NaCI, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, verwendet (Fluß: 3 cm/h). Nach üblicher Konzentrierung werden 200 mg (5 ml) Leukorekrutinpräparat erharten, dessen Proteinanteil zu mehr als 99% aus LR besteht (Ausbeute: etv/a 10%).

Die Endreinigung des Leukorekrutins gemäß Beispiel C4 ist in den Chromatogrammen der Fig. 10 bis 13 dargestellt.

Nach Entsalzen durch Dialyse, Ultrafiltration oder Molekularsiebfiltration mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Daltons gegen eine pyrogenfreie physiologische Salzlösung (z. B. 0,0015 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Puffferlösung, welche 0,15 mol/1 ( = 0,9%) NaCl und 0,001 mol/I Cystein enthält und einen pH-Wert vor. 7,4 aufweist) kann das LR-Präparat nach Filtersterilisation (0,2 μπι Porenweite) für biologisch..., physiologische, pharmakologische oder biochemische Zwecke direkt verwendet oder kristallisiert werden. Die Kristalle können umgekehrt durch Dialyse gegen die genannte physiologische Kochsalzlösung an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Daltons wieder in eine verwendbare Lösungsform gebracht werden.

Hierzu 10 Blatt Zeichnuncen

Claims (1)

Patentansprüche;

1. Leukozytose induzierendes Protein (Leukorekrutin), gekennzeichnet durch folgende spezifische topobiochemische und bilogische Wirkungen:

— positive Leukozytosereaktion und Leukozytenrekrutierung in das Blut in vivo;

— positive Leukozytenmobilisierung direkt aus dem Knochenmark in vitro;

und folgende physikalisch-chemische Eigenschaften:

— Molekulargewicht des nativen Proteins: 8500 Daltons;

— das native Protein besteht nur aus einer Peptideinheit;

— elektrophoretische Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamidmatrizen: anodisch;

— löslich in wäßrigen Medien einschließlich 20% Äthanol bei einem pH-Wert von 4,0 bis 10;

— konstanter Temperaturkoeffizient der Löslichkeit 311 Ammoniumsulfatlösungen zwischen -10° C und+50⁰C;

— es kristallisiert in doppelbrechenden optisch anisotropen Kristallen aus Ammoniumsuifatlösungen mit über 61% Ammoniumsulfatsättigung;

— unlöslich in Chloroform, Benzol, Xylol und anderen apolaren, nicht wäßrigen und mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln;

— denaturiert in Chloroform, Benzol und Xylol; Zerstörung der Konformationsstruktur und der biologischen Aktivität:

— es enthält unter ander'm die Aminosäuren Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, Alanin, Glycin, Lysin, Serin, Va'^:n, Glatuaminsäure, Arginin, Leucin;

— es adsorbierte reversibel an Anionen- und Kationenaustauschern, Calciumphosphatgel und Hydroxylapatit und kann nativ der Volumenverteilungschromatographie unterworfen werden;

— Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle I: