DE2428955B2

DE2428955B2 - Verfahren zur Abtrennung der enzymatischen Komponente mit in vivo antikoagulierender und in vitro koagulierender Wirkung aus dem Gift der Schlange Ancistrodon rhodostoma und daraus hergestellte Mittel

Info

Publication number: DE2428955B2
Application number: DE2428955A
Authority: DE
Inventors: Eraldo Prof. Rom Antonini
Original assignee: LABORATORI BIOCHIMICI FARGAL-PHARMASINT SpA POMEZIA ROM (ITALIEN)
Current assignee: LABORATORI BIOCHIMICI FARGAL-PHARMASINT SpA POMEZIA ROM (ITALIEN)
Priority date: 1973-09-03
Filing date: 1974-06-15
Publication date: 1978-08-03
Also published as: GB1472574A; FR2242110B1; AT335614B; US4027012A; CH626263A5; JPS5049487A; ES447851A1; SE7407341L; FR2242110A1; JPS5637792B2; NL7407948A; DE2428955C3; ATA583374A; DE2428955A1; BE817699A; SE420321B; CA1028948A

Description

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung der enzymatischen Komponente mit in vitro koagulierender und in vivo antikoagulierender Wirkung von der anderen Komponente mit in vivo koagulierender Wirkung und von den Proteinanteilen aus dem Gift der Schlange Ancistrodon rhodostoma.

Es ist allgemein bekannt, daß das Gift dieser Schlange in charakteristischer Weise koagulierende Eigenschjften in vitro besitzt jedoch antikoagulierende Eigenschaften in vivo. Diese Tatsache findet eine Erklärung darin, daß in Schlangengiften neben anderen Protein-Komponenten zwei Typen von Enzymen anwesend sind, welche beide mit in vitro koagulierender Wirkung ausgestattet sind, von denen jedoch eines, wenn es in Tierblut injiziert wird, eine vollständig entgegengesetzte Wirkung zeigt, nämlich eine Ungerinnbarkeit des Blutes.
Daraus geht hervor, daß solche Verfahren außerordentlich wichtig sind, mit denen die Komponente des Schlangengiftes mit in vivo antikoagulierender Wirkung von der Komponente mit in vivo koagulierender Wirkung getrennt und mit hoher Reinheit isoliert werden kann, wobei diese Komponente dann mit außerordentlich guten Resultaten für die Herstellung von Mitteln mit pharmakologischer Wirkung verwendet werden kann.

Bisher wurde die Abtrennung von enzymatischen Komponenten des Schlangengiftes durch Chromatografie mit Ionenaustauscherharzen und/oder mit Fraktionierverfahren durch Ausfällung mit Salzen oder durch geeignete Lösungsmittel durchgeführt. Diese bekannten Methoden besitzen jedoch den Nachteil, daß dafür ein erheblicher Arbeitsaufwand aufgebracht werden muß und trotzdem kein zufriedenstellender Reinheitsgrad erhalten werden kann. Erst mit unvernünftig hohem Aufwand an Zeit und Material ließe sich die Reinheit verbessern.

Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Verfahren zu vermeiden und ein Verfahren zu schaffen, mit dem die Abtrennung der enzymatischen Komponente mit in vivo antikoagulierender Wirkung aus dem Schlangengift relativ einfach und vor allem schneller als bisher möglich ist und wobei das so erhaltene Enzym wesentlich größere Reinheit besitzt.

Die Lösung der Aufgabe besteht darin, daß das Schlangengift, gelöst in einem für die chromatografische Abtrennungsbehandlung geeigneten Medium, eine Säu-Ie passiert, welche mit einem festen nicht im wäßrigen Lösungsmitteln löslichen Träger für die selektive Absorption des in vivo antikoagulierend und in vitro koagulierend wirkenden Enzyms gefüllt ist, wobei der Träger mit einem Substrat oder Hemmkörper für dieses Enzym verbunden ist, und daß ein erstes Eluierungsmittel bei pH 6—7 und mit einer Molarität von weniger oder gleich 0,05 M durch die Füllung der Säule gegeben wird, in die das Gift eingeführt wurde, wobei das Eluat in aufeinander folgenden Portionen gesammelt wird, bis

b5 die Eluierung von mehr als 95% der Proteinanieile des Giftes und der in vitro koagulierend wirkenden Fraktion, welche verschieden ist von der im in der nachstehenden Weise gewonnenen zweiten Eluat

anwesenden Fraktion, erhalten ist, und daß ein zweites Eluierungsmittel bei einem pH größer als 9 und mit einer Molarität von größer oder gleich 0,3 M durch die Säule gegeben wird, wobei das Eluat in aufeinander folgenden Portionen gesammelt wird, bis die Eluierung des in vivo antikoagulierend wirkenden Enzyms, welches in der Säule absorbiert war, zusammen mit weniger als 5% der Proteinanteile erhalten ist

Vorteilhaft ist der Träger zur Füllung der Säule eine Polymersubstanz, welche eine Verbindung mit Aminogruppen eingeht

Zweckmäßig enthält die Polymersubstanz Hydroxyl-Gruppen und wird mit Cyanbromid aktiviert

Für die Herstellung eines in vivo antikoagulierend wirkenden Mittels wird das so erhaltene Enzym mit Wasser auf einen Gehalt von 25 NIH-Einheiten pro ml verdünnt, anschließend durch Filtration durch ein Mikrofilter sterilisiert, Hilfsmittel für die Lyophilisierung zugegeben und nach Abfüllung in Ampullen lyophilisiert

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt vor allem darin, daß das Verfahren zur Abtrennung relativ einfach ist und vor allem unter Verwendung bekannter Substanzen und Stoffe durchgeführt werden kann. So wird vorteilhaft als Träger eine in wäßrigen Lösungsmitteln unlösliche Polymersubstanz, wie z. B. Dextran-Gel oder mit Cyanbromid vorbehandelte Zellulose verwendet, die mit einer Arginin-Lösung versetzt wird, wobei sich eine Verbindung zwischen der festen Matrix und dem Arginin bildet. Trotzdem wird ein Enzym mit sehr hohem Reinheitsgrad erhalten, welches zur Verwendung bei der Herstellung von pharmazeutischen Präparaten noch verdünnt werden kann, aber keiner weiteren Verbesserung der Reinheit mehr unterworfen werden muß.

Als besonders geeignet als Trägermaterial hat sich ein Dextran-Gel herausgestellt, welches aus feuchten Körnern der Größe 40—190 μ besteht und einen Agarose-Anteil von ca. 4% besitzt und Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 2OxIO⁶ ausschließt. Das Produkt ist unter dem Handelsnamen »Sepharose« zu erhalten.

In den nachstehenden Beispielen ist das erfindungsgemäße Verfahren dargestellt, was aber nicht als eine Einschränkung aufgefaßt werden soll. Außerdem wird die Herstellung eines pharmakologischen Präparates mit antikoagulierender Wirkung unter Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Komponente des Schlangengiftes dargestellt.

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Beispiel I

Reinigung des koagulierenden Wirkstoffes
des Giftes der Ancistrodon rhodostoma

Eine chromatografische Säule mit einem Durchmesser von 0,7 cm mit 10 ml eines gepackten Gels, verbunden mit Arginin, wird vorbereitet. Die Säule wird dann mit einem Tris-(hydroxymethylaminomethan)-phosphat 0,05 Puffer bei pH 7 (hiernach für Abkürzung mit Tris-Phosphat bezeichnet) ins Gleichgewicht gebracht.

50 mg des lyophilisierten Giftes der Ancistrodon rhodostoma, geiöst in 1 ml desselben Puffers, wird zum Ausgleich der Säule benutzt. Die in die Säule eingeführte Giftlösung wird danach mit dem Tris-Phosphat-0,05-M-Puffer bei pH 7 eluiert Das Eluat wird in Fraktionen von ungefähr 2 ml gesammelt. Die ersten 30 ml des Eluats enthalten mehr als 90% des gesamten Proteins, welches in dem in die Säule eingefüllten Gifts vorhanden war, und ungefähr 180 Einheiten der »in vitro« koagulierenden Wirkstoffe. (1 willkürliche Einheit des koagulierenden Wirkstoffes ist für die Zwecke der folgenden Experimente so definiert, daß diejenige Menge des Enzyms, welche die beginnende sichtbare Bildung von Fibrinfiebern unter Umrühren in 15 Sekunden bei Raumtemperatur in einer O,5°/oigen Lösung von menschlichem Fibrinogen erzeugen. Diese Einheit unterscheidet sich von den eingangs genannten NIH-Einheiten, welche als Trombinic-Einheit nach dem N.I.H.-Standard definiert sind.) Nach dem Durchlauf der ersten 30 ml des Eluats wird die Lösung gewechselt und mit einem 0,2-M-Tris-HCl-Puffer bei pH 9,3 eluiert Dann wird das Eluat des neuen Puffers ebenfalls in Portionen von 2 ml gesammelt. Weniger als 10% des in den 50 mg des in die Säule eingefüllten Giftes anwesenden Proteins und ungefähr 420 koagulierende Einheiten sind in den ersten 20 ml dieses neuen Eluats enthalten.
Man sollte beachten, daß

a) das zweite Eluat deshalb den größeren Anteil der koagulierenden Wirkstoffe enthält und nur eine kleine Fraktion des Proteins des Ancistrodon rhodostoma-Giftes.

b) Die koagulierenden Wirkstoffe, welche im ersten Eluat anwesend sind, unterscheiden von den im zweiten Eluat vorhandenen koagulierenden Wirkstoffen und sind nicht in diese konvertierbar, was aus dem nachfolgenden Versuch hervorgeht.

Die am stärksten wirkende Fraktion in bezug auf die koagulierende Wirkung des ersten Eluats in Tris-Phosphat-0,05-M-Puffer bei pH 7 wird noch einmal in die in diesem Beispiel bereits beschriebene Säule zurückgegeben und wieder mit 0,05-M-Puffer bei pH 7,0 ausgeglichen. Die Eluierung wird dann mit dem gleichen Puffer durchgeführt. Die gesamten koagulierenden Wirkstoffe, welche in die Säule eingegeben worden sind, werden nunmehr mit den ersten 20 ml eluiert. Das darauffolgende Eluat mit Tris-HCl-0,2-M-Puffer bei pH 9,3 zeigt diesmal keinerlei signifikante koagulierende Wirkung.

Ähnliche Resultate, wie die hier vorbeschriebenen, wurden in einer großen Anzahl von Versuchen erhalten, welche nach derselben Methode durchgeführt worden sind, wie sie vorbeschrieben ist, in denen jedoch die Zusammensetzung des Puffers, welcher für die erste und zweite Eluierung verwendet wurde, variiert worden ist. Für die erste Eluierung, worin der größere Anteil der »in vitro« koagulierenden Wirkstoffe in der Säule zurückgehalten wird, sind Tris-Phosphat-Puffer mit einer Molarität weniger oder gleich 0,05 M und einem pH zwischen 6 und 7 verwendet worden. Für die zweite Eluierung, welche den größeren Anteil der »in vitro« koagulierenden Wirkstoffe aus der Säule entfernt, sind Puffer mit einer Molarität größer oder gleich 0,3 M und einem pH zwischen 6 und 7 oder größer als 9 verwendet worden. Ein spezifisches Beispiel der unterschiedlichen Methoden für die Absorption und Eluierung in bezug auf die vorstehend beschriebenen Versuche sei hiernach wiedergegeben.

Beispiel II

Reinigung eines »in vitro« koagulierenden Wirkstoffes des Giftes der Ancistrodon rhodostoma und Vervollständigung eines Präparates mit »in vivo« antikoagulierender Eigenschaft und geeignet für therapeutische Verwendung.

Eine chromatografische Säule mit einem Durchmesser von 0,7 cm, welche 10 ml eines Gels wie in Beispiel I enthält, wird wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben, vorbereitet. Die Säule wird dann mit einem 0,01-M-Tris-Phosphat-Puffer bei pH 6,0 ins Gleichgewicht gebracht 500 mg eines lyophilisierten Giftes der Ancistrodon rhodostoma wird in 5 ml desselben Puffers (0,01-M-Tris-Phosphat bei pH 6) gelöst und die Lösung wird anschließend durch die Säule gegeben.

Dann wird die Säule gewaschen, indem man 30 ml eines 0,01-M-Tris-Phosphat-Puffers bei pH 6,0 durch die Säule lauten läßt Das Eluat wird in Fraktionen von 2 ml gesammelt Dann wird die Lösung für die Eluierung gewechselt und ein 0,3-M-Tris-Phosphat-Puffer bei pH 6,0 verwendet. 75 ml dieser letztgenannten Lösung wird dann durch die Säule hindurchgegeben und das Eluat in zwei Fraktionen gesammelt

Das erste Eluat (0,01 M Tris-Phosphat bei pH 6) enthält mehr als 95% des Proteins, welches am Anfang in den 500 mg des Giftes enthalten waren und ungefähr 2200 Einheiten der koagulierenden Wirkstoffe. Das zweite Eluat (0,3 M Tris-Phosphat bei pH 6,0) enthält weniger als 5°/o des Proteins, welches am Anfang in dem Gift enthalten war und enthält außerdem 6000 Einheiten (willkürliche Einheiten) der »in vitro« koagulierenden Wirkstoffe. Man stellt nach Ultra-Filtration fest, daß das darin enthaltene Proteinmaterial im wesentlichen homogen ist, wenn es mit der Ultrazentrifuge oder durch Elektrophorese auf einem Gel analysiert wird.

Das zweite Eluat wird mit Wasser verdünnt, bis es 25 NIH-Einheiten (N.I.H. Trombinic Einheiten) pro ml enthält. Dann wird es sterilisiert durch Filtration über filtergeeigneter Porengröße, mit einem als Hilfsmittel für die Lyophilisierung geeigneten Material versetzt und anschließend lyophilisiert. Es ist üblich, das Material nach Abfüllung in Ampullen in Mengen von 1 oder 2 ml entsprechend 25 oder 50 N.I.H.-Einheiten zu lyophilisieren.

Man stellt fast, daß das so lyophilisierte Material, wenn es durch Zugabe von Wasser wieder aufgelöst wird, eine unveränderte »in vitro« koagulierende Wirkung besitzt, sogar dann, wenn es mehrere Monate bei Raumtemperatur aufbewahrt worden ist. Wird dieses Präparat in Mengen von 1 N.I.H.-Einheit pro kg Körpergewicht intravenös bei Kaninchen injiziert, so ergibt sich ein sehr starker Abfall oder sogar ein völliges Verschwinden des Blut-Fibrinogens innerhalb weniger Stunden, wobei signifikante Nebenerscheinungen und sekundäre Wirkungen völlig fehlen.

Dies wird durch die nachfolgenden Versuche dargestellt:

8 Kaninchen wurden in einen Stall gebracht, gewogen und in vier Gruppen zu zwei Tieren abgeteilt. Jedem Tier wurde nun durch intravenöse Injektion Dosen des gereinigten Materials gegeben, welche 1 N.I.H.-Einheit pro kg Körpergewicht gemäß der vorher festgestellten »in vitro« Wirksamkeit entsprachen. Das den Tieren nach zwei Stunden nach der Injektion entnommene Blut ist nicht mehr gerinnungsfähig. Weitere Blutentnahmen wurden nach 24 h, nach 48 h, nach 72 h und nach 96 h nach dem folgenden Schema durchgeführt

Kaninchen	Zeit	72 h	Kaninchen	Zeit	72 h
Nr.		96 h	Nr.		96 h
1	24 h	72 h	5	24 h	72 h
2	48 h	96 h	6	48 h	96 h
3	24 h	7	24 h
4	48 h	8	48 h

Bei den entnommenen Blutproben wurde die Fibrinogen-Armut bzw. das Fehlen des Fibrinogens durch die gravimetrische Methode bestimmt. Die erhaltenen Werte sind nachfolgend zusammengestellt, und zwar ausgedrückt als mg Fibrinogen pro ml Plasma.

Kaninchen
Nr.

Zeit

mg Fibrinogen/ml Plasma

1	24 h	fehlt
25 3	24 h	fehlt
5	24 h	Beginn der Fibrinogen
		Bildung nicht meßbar
7	24 h	Beginn der Fibrinogen
		Bildung nicht meßbar
30 2	48 h	6,2
4	48 h	/
6	48 h	4,1
8	48 h	4,3

Kaninchen
Nr.

Zeit

mg Fibrinogen/ml Plasma

1	72 h	8,1
3	72 h	I
40 5	72 h	7,7
7	72 h	I
2	96 h	10,5
4	96 h	15,6
6	96 h	83
45 8	96h	I

Blutproben wurden zur Bestimmung der Fibrinogenarmut auch den unbehandelten Kaninchen entnommen, wobei folgende Resultate erhalten wurden:

Kaninchen
Nr.

mg Fibrinogen/ml Plasma

1	10
2	16
3	8,4

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung der enzymatischen Komponente mit in vitro koagulierender und in vivo antikoagulierender Wirknng von der anderen Komponente mit in vivo koagulierender Wirkung und von den Protcinanteilen aus dem Gift der Schlange Ancistrodon rhodostoma, dadurch gekennzeichnet, daß das Schlangengift, gelöst in einem für die chromatografische Abtrennungsbehandlung geeigneten Medium, eine Säule passiert, welche mit einem festen nicht im wäßrigen Lösungsmitteln löslichen Träger für die selektive Absorption des in vivo antikoagulierend und in vitro koagulierend wirkenden Enzyms gefüllt ist, wobei der Träger mit einem Substrat oder Hemmkörper für dieses Enzym verbunden ist, und daß ein erstes Eluierungsmittel bei pH 6—7 und mit einer Molarität von weniger oder gleich 0,05 M durch die Füllung der Säule gegeben wird, in die das Gift eingeführt wurde, wobei das Eiuat in aufeinander folgenden Portionen gesammelt wird, bis die Eluierung von mehr als 95% der Proteinanteile des Giftes und der in vitro koagulierend wirkenden Fraktion, welche verschieden ist von der im in der nachstehenden Weise gewonnenen zweiten Eluat anwesenden Fraktion, erhalten ist, und daß ein zweites Eluierungsmittel bei einem pH größer als 9 und mit einer Molarität von größer oder gleich 0,3 M durch die Säule gegeben wird, wobei das Eluat in aufeinander folgenden Portionen gesammelt wird, bis die Eluierung des in vivo antikoagulierend und in vitro koagulierend wirkenden Enzyms, welches in der Säule absorbiert war, zusammen mit weniger als 5% der Proteinanteile erhalten ist

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger zur Füllung der Säule eine Polymersubstanz ist, welche eine Verbindung mit Aminogruppen eingeht

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymersubstanz Hydroxyl-Gruppen enthält und mit Cyanbromid aktiviert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymersubstanz ein Dextran oder ein Zellulose-Gel verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat oder der Hemmkörper für das in vivo antikoagulierend und in vitro koagulierend wirkende Enzym eine Aminosäure bzw. ein Derivat davon ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Aminosäure Arginin verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gift der Ancistrodon rhodostoma lyophilisiert und gelöst ist in dem gleichen flüssigen Medium wie es für die Eluierung der Säule verwendet wird.

8. In vivo antikoagulierend wirkendes Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es dadurch erhalten wurde, daß das Enzym nach Anspruch 1 bis 7 mit Wasser auf einen Gehalt von 25 NIH-Einheiten pro ml verdünnt, anschließend diese Flüssigkeit durch Filtration durch Mikrofilter sterilisiert wurde, anschließend Hilfsmittel für die Lyophilisierung zugegeben wurden und das Material nach der Abfüllung in Ampullen in Mengen von 1 oder 2 ml pro Ampulle (25 oder 50 NIH-Einheiten) lyophilisiert wurde.