DE3039855A1

DE3039855A1 - Verfahren zur abtrennung von (beta)-globulinaggregat mittels membran

Info

Publication number: DE3039855A1
Application number: DE19803039855
Authority: DE
Inventors: Mitsutoshi Shin-nanyo Yamaguchi Fukuda; Kenji Koyama; Syotaro Tokuyama Yamaguchi Ohno
Original assignee: Toyo Soda Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1979-10-22
Filing date: 1980-10-22
Publication date: 1981-04-30
Also published as: GB2061286B; JPS623815B2; DE3039855C2; JPS5659716A; GB2061286A; FR2472576A1; FR2472576B1; US4333870A

Description

1A-3378
TS-188

TOYO SODA MANUFACTURING CO., LTD. Yamaguchi-ken, Japan

Verfahren zur Abtrennung von γ-Globulinaggregat

mittels Membran

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von γ-Globulinaggregat zum Zwecke der Herstellung eines γ-Globulinaggregat-freien γ-Globulinmedikaments. Im einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Abtrennung von γ-Globulinaggregat mittels einer Ultrafiltrationsmembran, wobei ein γ-Globulinmedikament erhalten wird, welches chemisch nicht verändert ist und das sich daher für intravenöse Verabreichung eignet.

Zur Verhinderung und zur Therapie verschiedener Infektionskrankheiten sind γ-Globulinmedikamente, die IgG als eine Hauptkomponente umfassen, eingesetzt worden. Es handelt sich dabei um ein Immunoglobulin, welches eine Komponente der Plasmaproteine darstellt. Aufgrund eines Gehalts an γ-Globulinaggregat verursachen derartige Medikamente Jedoch schwerwiegende anaphylaktische Reaktionen. Folglich war die Anwendung auf intramuskuläre Injektionen

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beschränkt. Im Hinblick auf die medizinische Bedeutung des Medikaments ist seine intravenöse Verabreichung vorgeschlagen worden, da auf diese Weise eine gesteigerte Effektivität der Verabreichung mit einer großen Dosis erreicht werden kann und ein sofortiger Effekt erzielt wird.

Um das γ-Globulinmedikament intravenös verabreichen zu können, ist es notwendig, eine als Folge des Nebeneffekts auftretente, antikomplementäre Aktivität zu reduzieren. Es wurde festgestellt, daß die antikomplementäre Aktivität eine Folge der Aggregation von γ-Globulin ist, welche bei der Abtrennung von γ-Globulinmonomeren auftritt. Einige bekannte Verfahren zur Abtrennung des γ-Globulinaggregats oder zur Verringerung der antikomplementären Aktivität sind beispielsweise folgende:

(1) Enzymische Behandlung [Vox Sang. 1J5, 71(1967)];

(2) chemische Modifikation [Vox Sang.28, 422(1965)] (JA-OS 103723/1973);

(3) Verfahren zur Deaggregation des Aggregats im γ-Globulinmedikament [Acta Chemica Scandinavia 22, 490 (1968)].

Bei dem Verfahren (1) wird Immunoglobulin mit Pepsin behandelt, um die komplement-fixierende Reaktionsstelle zu entfernen. Das Verfahren weist den Nachteil auf, daß die Halbwertszeit der Antikörperaktivität des γ-Globulins im Blut bemerkenswert kurz ist und daß keine Fc-Aktivität erwartet werden kann. Das Verfahren (2) weist den Nachteil auf, daß das Produkt sich von dem unter natürlichen Bedingungen vorliegenden Produkt, wie intaktem γ-Globulinmonomerem, unterscheidet. Das Verfahren (3) stellt das optimale Verfahren dar, um intaktes γ-Globulinmonomeres zu erhalten. Bei dem Produkt tritt jedoch bei der Lagerung die Aggregatbildung auf, wodurch die antikomplementäre Aktivität zunimmt.

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■/•Η

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diese unter verschiedenen Gesichtspunkten auftretenden Nachteile zu überwinden und intaktes γ-Globulinmonomeres zu erhalten, was das ideale Medikament darstellt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man ein Verfahren zur Abtrennung von γ-Globulinmonomerem schafft, bei dem dieses relativ einfach und schnell auf selektive Weise mittels einer Ultrafiltrationsmembran abgetrennt wird, und zwar unter Bedingungen, bei denen das γ-Globulinmonomere durch eine Membran hindurchtritt, ohne daß γ-Globulinaggregat gleichfalls durchtritt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 die Beziehung des pH-Wertes der Lösungen in den Beispielen und der prozentualen Permeation von γ-Globulinmonomerem;

Fig. 2, 3 und 5 bei erfindungsgemäßen Beispielen erhaltene Flüssigchromatogramme; und

Fig. 4 das unter anderen Bedingungen erhaltene Flüssigchromatogramm als Vergleich.

Der Porendurchmesser der Membran kann mittels eines Elektronenmikroskops nicht beobachtet werden. Im Falle der Ultrafiltrationsmembran werden gewöhnlich die Eigenschaften einer Membran durch die Porenweite definiert, die ein bestimmtes Molekulargewicht gerade nicht mehr durchläßt (cut-off molecular weight). Dieses sog. cut-off-Molekulargewicht wird gewöhnlich folgendermaßen definiert. Es wird die prozentuale Retention der Membran gemessen, und zwar mit einem sphärischen Protein, das ein bekanntes Molekulargewicht aufweist. Diese Bestimmung erfolgt nach der Beziehung

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-t-f

1 - Konzentration der durch-

felassenen Lösung ^_0n

onzentration der Ausgangslösung

Die Molekulargewichte des gelösten Stoffs und die prozentuale Retention werden gegeneinander aufgetragen, und es wird das Molekulargewicht bei einer prozentalen Retention von 100% berechnet. Je nach dem angewandten Meßverfahren kann das ermittelte cut-off-Molekulargewicht variieren. Beispielsweise wird bei der PM-1O Membran, hergestellt von Amicon Co., angegeben, daß eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 10 000 zurückgehalten wird. Es zeigt sich jedoch, daß die Membran für Myoglobin mit einem Molekulargewicht von 18 000 permeabel ist. Bei der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Ultrafiltrationsmembran liegt das cut-off-Molekulargewicht (Molekulargewicht der zurückgehaltenen Teilchen) gewöhnlich in einem Bereich von 2 χ 10⁵ bis 3,5 x 10^ und vorzugsweise 2,5 x 10⁵ bis 3 χ 10 . Das Molekulargewicht der zurückgehaltenen Teilchen variiert in Abhängigkeit von dem Meßverfahren. Beispielsweise variiert das Molgewicht der zurückgehaltenen Teilchen abhängig von der Veränderung des pH-Wertes der Lösung, obwohl die gleiche Probe und die gleiche Membran verwendet werden. Es wird angenommen, daß diese Veränderung von Ladungen des Proteins und der Verteilung des Proteins in der Lösung abhängt.

In diesem Fall wird das Molekulargewicht der zurückgehaltenen Teilchen dadurch bestimmt, daß man Proteine mit bekanntem Molekulargewicht in einer Phosphatpufferlösung (pH =s 6,8), welche ein Eluat einer wäßrigen Gelpermeationschromatographie (GPC) darstellen, verwendet. Mittels einer G3000SW-Säule, hergestellt von Toyo Soda Mfg.Co., werden die Absorptionsverhältnisse der Probe bei 280 mm bestimmt und gegen die prozentuale Retention der Membran

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aufgetragen. Die bei der Messung verwendeten Proteine umfassen Myoglobin, ß-Lactoglobulin, Albumin, γ-Globulin und Glutamatdehydrogenase. Bei der vorliegenden Erfindung wird das Molekulargewicht der zurückgehaltenen Teilchen bei pH 6,8 angegeben. Das Verfahren zur Bestimmung der prozentualen Retention ist jedoch nicht auf das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren beschränkt.

Unter den Ultrafiltrationsmembranen mit den gleichen Eigenschaften hinsichtlich des Molekulargewichts der zurückgehaltenen Teilchen sind Membranen, die aus einem Polyamid, einem Polyäthylenterephthalat, einem Polycarbonat, Cellulose oder Celluloseacetat bestehen, manchmal sowohl für Aggregate als auch Monomere permeabel und weisen daher eine schlechte Trennfähigkeit auf. Falls beispielsweise eine Cellulosemembran verwendet wird, wird γ-Globulin auf der Membran adsorbiert, und man erhält eine bemerkenswert geringe Ultrafiltrationsrate. Andererseits kann bei Verwendung einer Polysulfonharzmembran eine Ultrafiltrationsmembran erhalten werden, die eine bemerkenswert enge Verteilung des Porendurchmessers aufweist und eine konstante Ultrafiltrationsrate ergibt, ohne daß irgendeine Adsorption von γ-Globulin auf der Membran stattfindet. Diese Membran eignet sich optimal zur Abtrennung von γ-Globulinmonomerem. Das wesentliche Merkmal der Ultrafiltrationsmembran besteht daher darin, die Komponenten aufgrund ihrer Größenunterschiede voneinander zu trennen. Folglich kann die Abtrennung des γ-Globulinmonomeren von der wäßrigen Lösung, die γ-Globulinaggregat enthält, abhängig von den Größenunterschieden des γ-Globulinmonomeren und des γ-Globulinaggregats mittels der Membran in einem einfachen und schnellen Verfahren erreicht werden.

Die Polysulfonharze weisen die folgenden Struktureinheiten auf:

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oder

(n = 50 bis 250)

Die Membran kann dadurch hergestellt werden, daß man das Polysulfon in einem Lösungsmittel auflöst und anschließend die Lösung in Form eines Films ausbreitet und in ein Wicht-Lösungsmittel eintaucht.

Bei der mit der Membran durchgeführten Abtrennung liegt der pH der wäßrigen Lösung vorzugsweise in einem Bereich von 6 bis 8 und speziell in einem Bereich von 6,5 bis 7,5. Die prozentuale Permeation des γ-Globulinmonomeren (Konzentration der durchgetretenen Lösung/Konzentration der Ausgangslösung χ 100) verändert sich, abhängig vom pH-Wert, in bemerkenswerter Weise. Falls eine Membran mit einer höheren prozentualen Permeation des γ-Globulinmonomeren verwendet wird, ist die für die Membrantrennung erforderliche Zeit kürzer. Im Hinblick auf diesen wirtschaftlichen Faktor liegt der optimale pH bei der Abtrennung mittels der Membran vorzugsweise in einem Bereich von 6 bis 8 und speziell 6,5 bis 7,5. Die Konzentration der Lösung ist gewöhnlich geringer als 5% (Gew./Vol.) und vorzugsweise geringer als 2% (Gew./Vol.). Bei einer höheren Konzentration ist die Ultrafiltrationsrate niedriger, und die prozentuale Permeation des γ-Globulinmonomeren ist ebenfalls niedriger, und zwar aufgrund einer höheren Konzentrationspolarisation des gelösten Stoffs auf der Oberfläche der Membran.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der pH der γ-GIobulinaggregat enthaltenden, wäßrigen Lösung in einem Bereich von 6 bis 8 eingestellt. Es wird eine Ultrafiltra-

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tion der Lösung durch die Membran durchgeführt. Dabei bleibt γ-Globulinaggregat auf der Membran zurück, und γ-Globulinmonomeres geht durch die Membran hindurch. Anschließend wird die durchgelassene γ-Globulinmonomerlösung konzentriert, und zwar mit einer Membran mit einem cut-off-Molekulargewicht von unter 10 . Das erfindungsgemäße Verfahren kann nicht nur auf die aus menschlichem γ-Globulin erhaltene γ-Globulinlösung mit einem Gehalt an γ-Globulinaggregat angewendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch für γ-Globulin aggregat enthaltende Lösungen, die von Tieren, wie Rindern, Pferden und Schafen, erhalten wurden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und •Vergleichsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Polysulfonharz P-1700, hergestellt von UCC, wird in N-Methyl-2-pyrrolidon aufgelöst, um eine 15%ige Lösung herzustellen. Die Lösung wird mittels einer Rakel auf einem Polyäthylenvliesmaterial mit den Abmessungen 30 cm χ 30 cm ausgebreitet, und zwar in einer Dicke von 100/um. Durch Eintauchen in Wasser wird eine Membran erhalten. Die Eigenschaften der Membran hinsichtlich des Molekulargewichts der von ihr zurückgehaltenen Teilchen wird folgendermaßen bestimmt. Es wird ein Stück Membran mit einem Durchmesser von 43 mm ausgeschnitten und in einer Ultrafiltrationsvorrichtung angeordnet. Dann werden die prozentualen Retentionen der Proteine Myoglobin (18 000), Albumin (68 000), γ-Globulin (160 000) und Glutamatdehydrogenäse (36o 000) bestimmt. Das Molekulargewicht der zurückgehaltenen Teilchen beträgt etwa 3 x 105. Eine wäßrige Lösung von γ-Globulin, enthaltend γ-Globulinaggregat, die vom Menschen gewonnen wurde, wird in einer Phosphatpufferlösung mit einem pH von 6,8 aufgelöst, und es wird eine 1&Lge

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Lösung hergestellt. Die Lösung wird der Membrantrennung unterworfen, und zwar in der mit der erfindungsgemäßen Membran ausgerüsteten Ultrafiltrationsvorrichtung. In der Fig. 2 sind die Ergebnisse dargestellt. Aus dem gezeigten Chromatogramm wird deutlich, daß lediglich γ-Globulinmonomeres durch die Membran hindurchgegangen ist. Die prozentuale Permeation des γ-Globulinmonomeren beträgt etwa 40%. Das Chromatogramm wurde mittels der Vorrichtung gemessen, die auch zur Bestimmung des Molekulargewichts der zurückgehaltenen Teilchen verwendet wurde. In der Fig. 2 bezeichnet das Bezugszeichen 1 das Polymere; 2 das Dimere und 3 das Monomere. Auf der linken Seite ist das' Chromatogramm der Ausgangslösung dargestellt und auf der rechten Seite ist das Chromatogramm der Lösung gezeigt, die durch die Membran hindurchgegangen ist.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, und es wird eine Membrantrennung einer wäßrigen Lösung von Rinderserum-γ-Globulin bei einem pH der Lösung von 7,5 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Es tritt lediglich γ-Globulinmonomeres durch die Membran hindurch. Die prozentuale Permeation des γ- Globulinraonomeren beträgt etwa 30%.

Vergleichsbeispiel 1

Gemäß dem Verfahren von Bsispiel 1 wird Polysulfonharz P-1700, hergestellt von UCC, in N-Methyl-2-pyrrolidon aufgelöst, eine 10%ige Lösung hergestellt, eine Membran hergestellt und das Molekulargewicht der zurückgehaltenen Teilchen bestimmt. Das Molekulargewicht der von der Membran zurückgehaltenen Teilchen beträgt etwa 5 χ 10 . Vom Menschen gewonnenes γ-Globulinaggregat wird in einer Phosphatpufferlösung mit einem pH von 6,8 aufgelöst und es wird eine 1%ige Lösung hergestellt. Gemäß dem Verfahren von

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Beispiel 1 wird eine Membrantrennung der Lösung durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Aus dem Chromatogramm geht hervor, daß eine relativ große Menge des γ-Globulinaggregats durchgelassen wird.

Vergleichsbeispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt. Die Membrantrennung der Lösung wird jedoch bei einem pH von 4 durchgeführt. Als Ergebnis findet man eine ausgesprochen geringe prozentuale Permeation des γ-Glohulinmonomeren von ca.5%.

Beispiel 3
Polysulfonharz der Formel

(n = 200)

wird in N-Methyl-2-pyrrolidon aufgelöst, und es wird eine 15%ige Lösung hergestellt. Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 wird eine Membran hergestellt und das Molekulargewicht der von der Membran gerade noch zurückgehaltenen Teilchen bestimmt. Dieses Molekulargewicht beträgt etwa 2,5 x 10 . Gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 wird eine Membrantrennung einer wäßrigen Lösung von Rinderserum-γ-Globulin bei einem pH von 7,0 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Es wird deutlich_s daß lediglich γ-Globulinmonomeres durch die Membran durchgelassen wird. Die prozentuale Permeation des γ-Globulinmonomeren beträgt etwa 30%.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Abtrennung von γ-Globulinaggregat mittels einer Membran, dadurch gekennzeichnet, daß man γ-Globulinaggregat aus einer wäßrigen γ-Globulinlösung mittels einer Ultrafiltrationsmembran abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Ultrafiltrationsmembran um eine Membran handelt, die aus einem Polysulfonharz besteht, welches eine der folgenden Formeln aufweist:

oder

(n = 50 bis 250).

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung einen pH-Wert im Bereich von 6 bis .8 aufweist.

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