JP7273142B2 - タンパク質の精製方法 - Google Patents

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Description

本発明は、精製タンパク質を回収する方法、及びタンパク質中に含まれるタンパク質凝集体を除去する方法に関する。また、本発明はタンパク質の精製方法に関する。
タンパク質は食品から医薬品に至るまで産業上重要な生体高分子である。近年、医薬品開発においてタンパク質を応用したバイオ医薬品が注目されている。その中でも特に注目されているのが免疫グロブリン（抗体）であり、医薬品、診断薬あるいは対応する抗原タンパク質の分離精製材料等の用途において、その利用価値が高まっている。抗体は免疫反応を司る生理活性物質であり、免疫した動物の血液あるいは抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から取得される。ただし、それらの抗体を含有する血液や培養液は、抗体以外のタンパク質、又は細胞培養に用いた原料液に由来する複雑な夾雑成分を包含し、その溶液中に抗体の二量体及びより高次の凝集体を含有することがある。
タンパク質凝集体を除去する方法として、超遠心により除去する方法や限外ろ過膜を用いた手法（例えば、特許文献１参照。）、プロテインＡカラム、イオン交換カラム、及びサイズ排除カラムを組み合わせた手法（例えば、特許文献２参照。）、並びに疎水ゲルを用いた手法（例えば、非特許文献１参照。）などがある。超遠心法は研究分野では用いることが可能であるが、大量生産プロセスには向かない。限外ろ過膜による手法は、分画精度が低いため、精製度が不十分であり得る。また、従来のカラムやゲルを用いた手法は、高価なカラムの使用におけるコストの問題、グラジエント溶出などの操作が煩雑であり得るという問題、継続使用により劣化し得るという問題、精製タンパク質が希釈されることによる精製後の濃縮又は乾燥工程への負担が大きいという問題などがある。さらに、カラムやゲルを用いた手法は、タンパク質の精製に時間がかかり、タンパク質が変性し得るという問題がある。
ところで、パラジウム又はニッケルを触媒として一酸化炭素とオレフィンとを重合させることにより得られる、一酸化炭素とオレフィンとが完全交互共重合した脂肪族ポリケトン（以下、「ポリケトン」と呼ばれることがある。）が知られている。ポリケトンは高い結晶性を有するため、例えばポリケトンから形成された繊維又はフィルムは、高力学物性、高融点、耐有機溶媒性、及び耐薬品性等の特性を有する。ポリケトンは、主に水処理、気体除塵、ガス分離、及び電池用のセパレータなどに用いられている（例えば、特許文献３、４参照。）。タンパク質凝集体を除去することができる媒体の素材としては、ナイロンが知られている（例えば特許文献５参照。）。
バイオ医薬品において、ウイルス安全性を向上させる対策が必要となっている。医薬品メーカーにおいては製造工程中にウイルス除去／不活化工程を導入する検討を行っている。中でも、ウイルス除去フィルターを用いたろ過によるウイルス除去法は、有用なタンパク質を変性させることなく、ウイルスを低減することができる有効な方法である。
ウイルスのなかでも、特にパルボウイルスは、血漿分画製剤分野において、ヒトパルボウイルスＢ１９による感染の事例やバイオ医薬品分野でマウスのパルボウイルスのＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞への汚染の事例が報告されてきている。また、例えばＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｅｃｉｅｓなどの微小バクテリアがバイオ医薬に残存する事例も報告されている。
小ウイルスであるパルボウイルスはエンベロープを持たないことから、物理化学的に安定で、医薬品の製造プロセス中で一般的に行われている不活化工程である加熱、低ｐＨ、化学薬品処理に対して耐性がある。そのため、不活化法とは異なる作用機序のウイルス除去方法として、ウイルス除去膜によるウイルス除去及びバクテリア除去のニーズが高まっている。
ウイルス除去用のろ過膜としては、セルロースのような天然素材よりなる膜、あるいはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）のような合成高分子素材よりなるウイルス除去膜が知られている（例えば、特許文献６、７、又は非特許文献２から５参照。）。
特開昭５６－５９７１６号公報 特許第２６３８６８０号公報 特開２０１５－２０３０４８号公報 国際公開２０１３／０３５７４７号公報 特開２００５－１４５８５２号公報 米国特許出願公開第２０１６／０１７６９２１号公報 国際公開２０１６／０３１８３４号公報 特開２０１４－１５１２７２号公報 国際公開第２００３／０５５９３４号 国際公開２０１６／０３１８３４号公報
ＨＬＣ ＭＡＩＬＧＲＡＭ，東ソー株式会社，２００３年８月２５日，第９７巻，第３号，ｐ．１０ Manabe.S、Removal of virus through novel membrane filtration method.、Dev. Biol. Stand.、(1996)88: 81-90. Brandwein Hら.、Membrane filtration for virus removal.、Dev Biol (Basel).、(2000)102: 157-63. Aranha-Creadoら、Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter.、Biologicals. (1998) Jun; 26(2):167-72. L. Moce-Llivinaら、Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions、Journal of Virological Methods 、(2003) April、 Vol.109, Issue 1,Pages 99-101.
本発明が解決しようとする課題は、精製タンパク質を回収する方法を提供することにある。また別の課題は、タンパク質中に含まれるタンパク質凝集体を除去する方法を提供することにある。
また、本発明者らは、ナイロンを含む媒体にタンパク質溶液を通過させる途中で、タンパク質凝集体が初期濃度よりも濃いフラクションが発生し、精製プロセスの制御が難しいという課題を見出した。そこで、本発明が解決しようとする別の課題は、精製プロセスの制御がしやすいタンパク質の精製方法を提供することにある。さらに別の課題は、各方法に適した新たな媒体を提供することにある。
また、バイオ医薬品の製剤製造プロセスにおいて、ウイルス除去膜がしばしば製剤製造プロセスの最終工程で用いられる。ウイルス除去膜を用いた工程において、その前工程（プレフィルター工程等）で圧力損失が発生すると、単位時間当たりの処理量が小さくなるため、プレフィルター工程における圧力損失が小さく、効率的にタンパク凝集体等を除去することが可能な精製方法が好ましい。さらに、ウイルス除去膜はしばしば製剤製造プロセスの最終工程で用いられるが、タンパク質製剤のウイルス除去膜によるろ過は、短時間でより多くの量のタンパク質を処理でき、かつ充分に高いウイルス除去性能をもってウイルスを除去できることが好ましい。しかし、タンパク質製剤には、ウイルス除去膜の目詰まり原因となる物質である生体高分子をしばしば含み、ウイルス除去膜を閉塞させる原因となり得る。したがって、本発明が解決しようとする別の課題は、ウイルス除去膜によるタンパク質精製の際に、ウイルス除去膜の目詰まり（閉塞）が低減されたタンパク質の精製方法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決する為に鋭意研究を行った結果、ポリケトンを含む媒体によりタンパク質を精製、回収する方法を見出した。また、ポリケトンを含む媒体によりタンパク質凝集体を除去することが可能であることを見出した。さらに、本発明者らは鋭意検討を行った結果、ポリケトンを含む媒体を用いた場合には、ナイロンを含む媒体を用いた場合にみられるタンパク質凝集体が初期濃度よりも濃いフラクションが生ずる現象が見られず、精製プロセスの制御がしやすいことを見出した。
加えて、本発明者らは、ウイルス除去膜によりタンパク質溶液をろ過する前に特定の多孔質媒体に目的のタンパク質溶液を接触させることにより、ウイルス除去膜の目詰まりを低減することができ、かつ効率的にタンパク質を精製できることを見出した。
すなわち、本発明としては以下のものが挙げられる。
〔Ａ１〕 目的タンパク質を含むタンパク質含有溶液の精製方法であって、以下の工程を含む方法；
（α１）タンパク質含有溶液を、ポリケトンを含む多孔質媒体に接触させる工程、及び
（α２）ポリケトンを含む多孔質媒体に接触させたタンパク質含有溶液をウイルス除去膜に通過させる工程。
〔Ａ１－２〕 ポリケトンが１－オキソトリメチレン繰り返し単位を７０モル％以上含むポリケトンである、〔Ａ１〕に記載の方法。
〔Ａ２〕 目的タンパク質を含むタンパク質含有溶液の精製方法であって、以下の工程を含む方法；
（β１）タンパク質含有溶液を、比表面積が４．０ｍ２／ｍＬ以上であり、かつ空隙率が５０％以上である多孔質媒体に接触させる工程、及び
（β２）多孔質媒体に接触させたタンパク質含有溶液をウイルス除去膜に通過させる工程。
〔Ａ３〕 多孔質媒体が膜状である、〔Ａ１〕、〔Ａ１－２〕、又は〔Ａ２〕に記載の方法。
〔Ａ４〕 多孔質媒体とウイルス除去膜とが直接接続されている、〔Ａ１〕から〔Ａ３〕のいずれかに記載の方法。
なお、上記〔Ａ１〕から〔Ａ３〕のように引用する項番号が範囲で示され、その範囲内に〔Ａ１－２〕等の枝番号を有する項が配置されている場合には、〔Ａ１－２〕等の枝番号を有する項も引用されることを意味する。以下においても同様である。
〔Ａ５〕 工程（α１）又は（β１）で用いる多孔質体にかかる圧力が、工程（α２）又は（β２）で用いるウイルス除去膜にかかる圧力の１／４０から１／２である、〔Ａ４〕に記載の方法。
〔Ａ６〕 一定圧力でろ過される、〔Ａ１〕から〔Ａ５〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ７〕 タンパク質含有溶液におけるウイルスの除去率が、少なくとも９９．９％である、〔Ａ１〕から〔Ａ６〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ８〕 目的タンパク質がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、〔Ａ１〕から〔Ａ７〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ９〕 タンパク質含有溶液中のタンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬ以下である、〔Ａ１〕から〔Ａ８〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ１０〕 ウイルス除去膜で除去されるウイルスがパルボウイルスである、〔Ａ１〕から〔Ａ９〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ１１〕 ポリケトンの比表面積（ポリケトン表面積（ｍ２）／ポリケトン体積（ｍＬ））が１２ｍ２／ｍＬ以上である、〔Ａ１〕、又は〔Ａ３〕から〔Ａ１０〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ１２〕 〔Ａ１〕から〔Ａ１１〕のいずれかに記載の方法により、実質的にウイルスを含まないタンパク質含有溶液を製造する方法。
〔Ａ１３〕 ポリケトンを含む多孔質媒体を備える、ウイルス除去膜用プレフィルター。
〔Ａ１３－２〕 ポリケトンが１－オキソトリメチレン繰り返し単位を７０モル％以上含むポリケトンである、〔Ａ１３〕に記載のウイルス除去膜用プレフィルター。
〔Ａ１４〕 ウイルス除去膜用プレフィルターのためのポリケトンの使用。
〔Ａ１５〕 ウイルス除去膜用プレフィルター製造のためのポリケトンの使用。
〔Ａ１６〕 ポリケトンが１－オキソトリメチレン繰り返し単位を７０モル％以上含むポリケトンである、〔Ａ１４〕又は〔Ａ１５〕に記載の使用。
〔Ｂ１〕タンパク質含有溶液から精製タンパク質を回収する方法であって、以下の工程を含む方法；
（ａ１）タンパク質含有溶液を、ポリケトンを含む媒体に接触させる工程；及び
（ａ２）ポリケトンを含む媒体に接触させたタンパク質含有溶液から精製タンパク質を回収する工程。
〔Ｂ１－２〕ポリケトンが１－オキソトリメチレン繰り返し単位を７０モル％以上含むポリケトンである、〔Ｂ１〕に記載の方法。
〔Ｂ２〕タンパク質含有溶液からタンパク質含有溶液中に含まれるタンパク質凝集体を選択的に除去する方法であって、以下の工程を含む方法；
（ｂ１）タンパク質含有溶液を、ポリケトンを含む媒体に接触させる工程。
〔Ｂ３〕タンパク質が抗体である〔Ｂ１〕、〔Ｂ１－２〕、又は〔Ｂ２〕に記載の方法。
〔Ｂ４〕抗体が血漿生成物又は細胞培養液由来の抗体である〔Ｂ３〕に記載の方法。
〔Ｂ５〕抗体がモノクローナル抗体である〔Ｂ３〕に記載の方法。
〔Ｂ６〕タンパク質凝集体が、タンパク質の二量体、三量体、及び／又は多量体である〔Ｂ２〕から〔Ｂ５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔Ｂ７〕（ａ１）又は（ｂ１）の工程が、タンパク質含有溶液を、ポリケトンを含む媒体に通過させる工程である、〔Ｂ１〕から〔Ｂ６〕のいずれかに１項に記載の方法。
〔Ｂ８〕タンパク質含有溶液のｐＨが４以上１０以下である〔Ｂ１〕から〔Ｂ７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔Ｂ９〕タンパク質含有溶液の電気伝導度が０ｍＳ／ｃｍ以上１００ｍＳ／ｃｍ以下である〔Ｂ１〕から〔Ｂ８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔Ｂ１０〕タンパク質含有溶液を、ポリケトンを含む媒体に通過させる流速がポリケトンを含む媒体の膜体積１ｍＬに対して０．１ｍＬ／ｍｉｎ以上である〔Ｂ１〕から〔Ｂ９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔Ｂ１１〕ポリケトンを含む媒体の表面積が少なくとも、精製対象のタンパク質１．０ｇに対して０．０００１ｍ２以上である〔Ｂ１〕から〔Ｂ１０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔Ｂ１２〕ポリケトンを含む媒体が多孔質成形体である〔Ｂ１〕から〔Ｂ１１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔Ｂ１３〕多孔質成形体が、微多孔膜、不織布、織布、モノリス、ゲル、又は粒子床である〔Ｂ１２〕に記載の方法。
〔Ｂ１４〕多孔質成形体が、三次元的に均一な膜孔径を有する〔Ｂ１２〕又は〔Ｂ１３〕に記載の方法。
〔Ｂ１５〕多孔質成形体の孔径が、５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である〔Ｂ１２〕から〔Ｂ１４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔Ｂ１６〕タンパク質含有溶液からタンパク質の凝集体を選択的に除去するための媒体であって、ポリケトンを含む媒体。
〔Ｂ１６－２〕ポリケトンが１－オキソトリメチレン繰り返し単位を７０モル％以上含むポリケトンである、〔Ｂ１６〕に記載の媒体。
〔Ｂ１７〕タンパク質が抗体である〔Ｂ１６〕又は〔Ｂ１６－２〕に記載の媒体。
〔Ｂ１８〕抗体が血漿生成物又は細胞培養液由来の抗体である〔Ｂ１７〕に記載の媒体。
〔Ｂ１９〕抗体がモノクローナル抗体である〔Ｂ１７〕に記載の媒体。
〔Ｂ２０〕タンパク質凝集体が、タンパク質の二量体、三量体、及び／又は多量体である〔Ｂ１６〕から〔Ｂ１９〕のいずれか１項に記載の媒体。
〔Ｂ２１〕ポリケトンを含む媒体が多孔質成形体である〔Ｂ１６〕から〔Ｂ２０〕のいずれか１項に記載の媒体。
〔Ｂ２２〕多孔質成形体が、微多孔膜、不織布、織布、モノリス、ゲル、又は粒子床である〔Ｂ２１〕に記載の媒体。
〔Ｂ２３〕多孔質成形体が、三次元的に均一な膜孔径を有する〔Ｂ２１〕又は〔Ｂ２２〕に記載の媒体。
〔Ｂ２４〕多孔質成形体の孔径が、５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である〔Ｂ２１〕から〔Ｂ２３〕のいずれか１項に記載の媒体。
〔Ｂ２５〕タンパク質含有溶液からタンパク質の凝集体を選択的に除去するためのポリケトンの使用。
〔Ｂ２５－２〕ポリケトンが１－オキソトリメチレン繰り返し単位を７０モル％以上含むポリケトンである、〔Ｂ２５〕に記載の使用。
本発明により、精製された目的タンパク質を効率的に回収することができる。また、本発明により、目的タンパク質中に含まれるタンパク質凝集体を効率的に除去することができる。さらに、本発明により、目的タンパク質精製（凝集体除去）の制御を比較的容易に行うことができる。またさらに、本発明により、上記タンパク質の精製に適した媒体を提供可能である。さらに、ウイルス除去膜によるタンパク質精製の際に、ウイルス除去膜の目詰まり（閉塞）が低減されたタンパク質の精製方法を提供可能である。
実施例Ｂ１に係るクロマトチャートである。 図１に示したクロマトチャートの一部の拡大図である。 実施例Ｂ１に係る各フラクションに含まれる凝集体及び単量体の含有重量を示す表である。 実施例Ｂ１に係る、評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値と、評価対象に通液する前の単量体又は凝集体の濃度に対するフラクションにおける単量体又は凝集体の濃度の割合と、の関係を示すグラフである。 実施例Ｂ２に係る、評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値と、評価対象に通液する前の単量体又は凝集体の濃度に対するフラクションにおける単量体又は凝集体の濃度の割合と、の関係を示すグラフである。 実施例Ｂ３に係る、評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値と、評価対象に通液する前の単量体又は凝集体の濃度に対するフラクションにおける単量体又は凝集体の濃度の割合と、の関係を示すグラフである。 実施例Ｂ４に係る、評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値と、評価対象に通液する前の単量体又は凝集体の濃度に対するフラクションにおける単量体又は凝集体の濃度の割合と、の関係を示すグラフである。 実施例Ｂ５に係る、評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値と、評価対象に通液する前の単量体又は凝集体の濃度に対するフラクションにおける単量体又は凝集体の濃度の割合と、の関係を示すグラフである。 実施例Ｂ６に係る、評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値と、評価対象に通液する前の単量体又は凝集体の濃度に対するフラクションにおける単量体又は凝集体の濃度の割合と、の関係を示すグラフである。 実施例Ｂ７に係る、評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値と、評価対象に通液する前の単量体又は凝集体の濃度に対するフラクションにおける単量体又は凝集体の濃度の割合と、の関係を示すグラフである。 実施例Ｂ８に係る、評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値と、評価対象に通液する前の単量体又は凝集体の濃度に対するフラクションにおける単量体又は凝集体の濃度の割合と、の関係を示すグラフである。 実施例Ｂ９に係る、評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値と、評価対象に通液する前の単量体又は凝集体の濃度に対するフラクションにおける単量体又は凝集体の濃度の割合と、の関係を示すグラフである。 実施例Ｂ１０に係る、評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値と、評価対象に通液する前の単量体又は凝集体の濃度に対するフラクションにおける単量体又は凝集体の濃度の割合と、の関係を示すグラフである。 比較例Ｂ１に係る、評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値と、評価対象に通液する前の単量体又は凝集体の濃度に対するフラクションにおける単量体又は凝集体の濃度の割合と、の関係を示すグラフである。
以下、本発明の形態（以下、本明細書において「実施形態」と略すことがある。）について具体的に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための方法等を例示するものであって、これらの例示に限定されるものではない。
１．精製タンパク質を回収する方法
実施形態に係るタンパク質含有溶液から精製タンパク質を回収する方法は、（ａ１）タンパク質含有溶液をポリケトンを含む媒体に接触させる工程と、（ａ２）ポリケトンを含む媒体に接触させたタンパク質含有溶液から精製タンパク質を回収する工程と、を含む。
一つの実施形態において、ポリケトンは一酸化炭素と１種類以上のオレフィンとの共重合体である。ポリケトンとしては、下記式（１）で示されるポリマーが例示される。
Figure 0007273142000001
ポリケトンとしては、カルボニル基に置換されてもよいＲ１基を含む繰り返し単位が交互に配列されているポリマーが例示される。式（１）中、Ｒ１としては炭素数２以上２０以下のアルキレン基が例示される。Ｒ１基における置換基は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、エーテル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アンモニウム基、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、リン酸基、リン酸エステル基、チオール基、スルフィド基、アルコキシシリル基、及びシラノール基からなる群から選ばれる１つ以上を含むことができる。当該ポリマー中には、繰り返し単位以外の単位が含まれていてもよい。繰り返し単位以外の単位の含量としては、上限値としてはポリケトン中１０重量％未満が例示され、別の態様として９重量％未満が例示され、別の態様として８重量％未満が例示され、別の態様として７重量％未満が例示され、別の態様として６重量％未満が例示され、別の態様として５重量％未満が例示され、別の態様として４重量％未満が例示され、別の態様として３重量％未満が例示され、別の態様として２重量％未満が例示され、別の態様として１重量％未満が例示され、さらに別の態様として０．５重量％未満が例示される。また、繰り返し単位以外の単位の含量の下限値としては、０重量％以上が例示され、別の態様として０．１重量％以上が例示され、別の態様として０．２重量％以上が例示され、別の態様として０．３重量％以上が例示され、別の態様として０．４重量％以上が例示され、さらに別の態様として０．５重量％以上が例示される。当該ポリマー中において、部分的にカルボニル基同士、又はアルキレン基同士が結合していてもよい。Ｒ１の次にカルボニル基が結合し、当該カルボニル基の次にはＲ１が結合する交互共重合体を完全交互共重合体という。ポリケトン中の完全交互共重合した部分の含量としては、下限値としては、９５重量％以上が例示され、別の態様として９６重量％以上が例示され、さらに別の態様として９７重量％以上が例示され、別の態様として９８重量％以上が例示され、さらに別の態様として９９重量％以上が例示される。ポリケトン中の完全交互共重合した部分の含量としては、上限値として１００重量％以下が例示され、別の態様としては９９重量％以下が例示され、さらに別の態様としては９８重量％以下が例示され、さらに別の態様としては９７重量％以下が例示される。ポリケトン中の完全交互共重合体の含量が９５重量％以上である態様は、耐熱性又は耐光性を向上させる観点から好ましい。
上記式（１）のＲ１基の炭素数は２以上８以下が例示され、別の態様として２以上３以下が例示され、さらに別の態様として２が例示される。ポリケトンを構成する繰り返し単位は、特に、下記式（２）で表される１－オキソトリメチレン繰り返し単位を多く含むことが好ましい。また、上記式（１）のＲ１基中には芳香環が含まれていてもよく、含まれていなくてもよい。
Figure 0007273142000002
ポリケトンを含む媒体の強度を確保する点から、ポリケトンを構成する繰り返し単位中の１－オキソトリメチレン繰り返し単位の割合は、７０モル％以上であることが好ましく、９０モル％以上であることがより好ましく、９５モル％以上であることがさらに好ましい。１－オキソトリメチレン繰り返し単位の割合は１００モル％でもよい。ここで「１００モル％」とは、元素分析、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ガスクロマトグラフィーなどの公知の分析方法において、ポリマー末端基を除いて１－オキソトリメチレン以外の繰り返し単位が観測されないことを意味する。典型的には、ポリケトンを構成する繰り返し単位の構造及び各構造の量は、ＮＭＲによって確認することができる。
一つの実施形態において、ポリケトンを含む媒体（以下、「ポリケトン媒体」ともいう。）の形状としては、タンパク質を精製できる形状であれば特に限定されないが、ビーズ、ゲル、スポンジ、又は粉末等の形状が例示され、別の態様としては繊維、又は膜（平膜又は中空糸膜）が例示される。ポリケトン媒体の形状の別の態様としては、平膜又は中空糸膜が例示され、さらに別の態様としては平膜が例示され、さらに別の態様としては中空糸膜が例示される。ポリケトン媒体は多孔質成形体であってもよい。多孔質成形体が、微多孔膜、不織布、織布、モノリス、ゲル、又は粒子床であってもよい。
一つの実施形態において、ポリケトン媒体が膜である場合、膜体積としてはタンパク質を精製できる膜体積であれば特に限定されない。膜体積の下限値としては、精製対象のタンパク質１．０ｇに対して０．１０ｍＬ以上が例示され、別の態様として０．５０ｍＬ以上が例示され、別の態様として１．０ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として１．５ｍＬ以上が例示される。膜体積の上限値としては、精製対象のタンパク質１．０ｇに対して１０００００ｍＬ以下が例示され、別の態様として１００００ｍＬ以下が例示され、別の態様として１０００ｍＬ以下が例示され、別の態様として１００ｍＬ以下が例示され、さらに別の態様として１０ｍＬ以下が例示される。
一つの実施形態において、ポリケトン媒体の表面積としては、タンパク質を精製できる表面積であれば特に限定されない。表面積の下限値としては、精製対象のタンパク質１．０ｇに対して０．０００１ｍ２以上が例示され、別の態様として０．００１ｍ２以上が例示され、別の態様として０．０１ｍ２以上が例示され、別の態様として０．１ｍ２以上が例示され、別の態様として１．０ｍ２以上が例示され、さらに別の態様として５．０ｍ２以上が例示される。表面積の上限値としては、精製対象のタンパク質１．０ｇに対して１００００００ｍ２以下が例示され、別の態様として１０００００ｍ２以下が例示され、別の態様として１００００ｍ２以下が例示され、別の態様として１０００ｍ２以下が例示され、別の態様として１００ｍ２以下が例示され、さらに別の態様として３０ｍ２以下が例示される。表面積は比表面積から算出される。比表面積とは、ポリケトン媒体の体積に対するポリケトンの表面積を意味する。表面積は比表面積から算出され、比表面積とポリケトン媒体の体積の積となる。
ポリケトン媒体が多孔質成形体である場合、ポリケトン媒体の孔径としては、タンパク質を精製できる孔径であれば特に限定されない。孔径の上限値としては、１０００ｎｍ以下が例示され、別の態様として９００ｎｍ以下が例示され、別の態様として８００ｎｍ以下が例示され、別の態様として７００ｎｍ以下が例示され、別の態様として６００ｎｍ以下が例示され、別の態様として５００ｎｍ以下が例示され、さらに別の態様として４００ｎｍ以下が例示される。孔径の下限値としては、５０ｎｍ以上が例示され、別の態様として６０ｎｍ以上が例示され、別の態様として７０ｎｍ以上が例示され、別の態様として８０ｎｍ以上が例示され、別の態様として９０ｎｍ以上が例示され、さらに別の態様として１００ｎｍ以上が例示される。
ポリケトン媒体の孔径分布は三次元的に均一であっても不均一であってもよい。三次元的に均一な膜孔径とは、膜の三次元走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像によって確認できる。ＳＥＭの測定には、例えばＦＩＢ－ＳＥＭ ＦＥＩ Ｈｅｌｉｏｓ ＮａｎｏＬａｂ ６００（ＦＥＩ社製）を用いることができ、測定手法としては特許文献８の［００３２］に記載された方法が例として挙げられる。
多孔膜の原料となるポリケトンの製造方法としては特に制限はなく、例えば特許文献９に記載されるような公知の方法を用いて製造することができる。一つの実施形態において、ポリケトンは液状媒体の中で、触媒の存在下、エチレン性不飽和化合物と一酸化炭素とを懸濁重合して得られる。液状媒体としては、ポリケトンの懸濁重合に使用可能な液体であればどのようなものであってもよく、重合活性、流動性及び取り扱い性の観点から水溶性有機溶媒が好ましい。液状媒体としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、エチレングリコール等のアルコール類、ｍ－クレゾール等のフェノール類、アニリン等のアミン類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、テトラヒドロフラン、ジグライム等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、酢酸、酢酸メチル等のエステル類等を挙げることができ、これらの中から単独又は複数種の混合溶媒として用いてもよい。
一つの実施形態において、精製対象となるタンパク質としては、ポリケトン媒体により、タンパク質単量体とタンパク質凝集体とが分離可能なタンパク質であれば特に限定されない。例えば、精製対象となるタンパク質としては、アルブミン、グロブリン、又はフィブリノゲンが挙げられる。また、精製対象となるタンパク質としては、別の態様として抗体が例示される。
一つの実施形態において、生理活性物質の一例である抗体としては、生化学における一般的な定義のとおり、脊椎動物の感染防禦機構としてＢリンパ球が産生する糖タンパク質分子（ガンマグロブリン又は免疫グロブリンともいう）が挙げられる。例えば、実施形態で精製される抗体は、ヒトの医薬品として使用され、投与対象であるヒトの体内にある抗体と実質的に同一の構造を有する。
抗体は、ヒト抗体であってもよく、ヒト以外のウシ及びマウス等の哺乳動物由来抗体タンパク質であってもよい。あるいは、抗体は、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質、及びヒト化抗体であってもよい。ヒトＩｇＧとのキメラ抗体とは、可変領域がマウスなどのヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域がヒト由来の免疫グロブリンに置換された抗体である。また、ヒト化抗体とは、可変領域のうち、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）がヒト以外の生物由来であるが、その他のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）がヒト由来である抗体である。ヒト化は、キメラ抗体よりも免疫原性がさらに低減される。
抗体のクラス（アイソタイプ）及びサブクラスは特に限定されない。例えば、抗体は、定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，及びＩｇＥの５種類のクラスに分類される。しかし、実施形態に係るろ過方法が精製対象とする抗体は、５種類のクラスの何れであってもよい。また、ヒト抗体においては、ＩｇＧにはＩｇＧ１からＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがある。しかし、実施の形態に係るろ過方法が精製対象とする抗体のサブクラスは、いずれであってもよい。なお、Ｆｃ領域にタンパク質を結合したＦｃ融合タンパク質等の抗体関連タンパク質も、実施の形態に係るろ過方法が精製対象とする抗体に含まれ得る。
さらに、抗体は、由来によっても分類することができる。しかし、実施の形態に係るろ過方法が精製対象とする抗体は、天然のヒト抗体、遺伝子組換え技術により製造された組換えヒト抗体、モノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体の中でも、実施の形態に係るろ過方法が精製対象とする抗体としては、抗体医薬としての需要や重要性の観点から、モノクローナル抗体が好適であるが、これに限定されない。
抗体としては、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥのいずれかを含むモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体が例示される。また、抗体は例えば、血漿生成物由来であってもよく、あるいは細胞培養液由来であってもよい。細胞培養によって抗体を得る場合は細胞として動物細胞もしくは微生物を使用することができる。動物細胞としては、種類は特に限定されないが、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞などが挙げられる。微生物としては、種類は特に限定されないが、大腸菌や酵母などが挙げられる。
一つの実施形態において、ポリケトン媒体によるろ過前のタンパク質は、目的タンパク質の単量体以外に、生体高分子を含みうる。生体高分子としては、ウイルス除去フィルターの目詰まりの原因となる物質であれば特に限定されないが、目的タンパク質の凝集体、別の態様として目的タンパク質と目的タンパク質以外のタンパク質の凝集体が例示される。一つの実施形態においてタンパク質の凝集体は、その単量体が複数凝集して形成されたものが例示される。生体高分子は生体高分子集合体と呼ばれることもある。
一つの実施形態において、ポリケトン媒体により、タンパク質単量体とタンパク質凝集体とが分離可能なタンパク質であれば含まれるタンパク質単量体の分子量は特に限定されない。含まれるタンパク質単量体の分子量の下限値としては、０．１ｋＤａ以上が例示され、別の態様として１ｋＤａ以上が例示され、別の態様として１０ｋＤａ以上が例示され、別の態様として５０ｋＤａ以上が例示され、さらに別の態様として１００ｋＤａ以上が例示される。分子量の上限値としては、１００００ｋＤａ以下が例示され別の態様として５０００ｋＤａ以下が例示され、別の態様として１０００ｋＤａ以下が例示され、別の態様として５００ｋＤａ以下が例示され、さらに別の態様として２００ｋＤａ以下が例示される。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液としては、タンパク質が溶液に溶解されていれば特に限定されない。溶液として使用できる緩衝液の種類は特に限定されないが、例えばｔｒｉｓ塩、酢酸塩、Ｔｗｅｅｎ、ソルビトール、マルトース、グリシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、スルホン酸塩、リン酸塩、クエン酸、又は塩化ナトリウムが溶解した緩衝液が例示される。
一つの実施形態において、タンパク質溶液の濃度としては、タンパク質が溶液に溶解されていれば特に限定されない。タンパク質溶液濃度の下限値としては、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上が例示され、別の態様として０．０５ｍｇ／ｍＬ以上が例示され、別の態様として０．１ｍｇ／ｍＬ以上が例示され、別の態様として０．５ｍｇ／ｍＬ以上が例示され、別の態様として１．０ｍｇ／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として５．０ｍｇ／ｍＬ以上が例示される。タンパク質溶液濃度の上限値としては、１００ｍｇ／ｍＬ以下が例示され、別の態様として９０ｍｇ／ｍＬ以下が例示され、別の態様として８０ｍｇ／ｍＬ以下が例示され、別の態様として７０ｍｇ／ｍＬ以下が例示され、別の態様として６０ｍｇ／ｍＬ以下が例示され、別の態様として５０ｍｇ／ｍＬ以下が例示され、別の態様として４０ｍｇ／ｍＬ以下が例示され、別の態様として３０ｍｇ／ｍＬ以下が例示され、別の態様として２５ｍｇ／ｍＬ以下が例示され、さらに別の態様として２０ｍｇ／ｍＬ以下が例示される。
一つの実施形態において、緩衝液の濃度は、上述した溶解物が溶解していれば特に限定されない。緩衝液の濃度の下限値としては、０ｍｍｏｌ／Ｌ以上が例示され、別の態様として０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上が例示され、別の態様として１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上が例示され、別の態様として５ｍｍｏｌ／Ｌ以上が例示され、別の態様として１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上が例示され、別の態様として１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上が例示され、さらに別の態様として２５ｍｍｏｌ／Ｌ以上が例示される。
一つの実施形態において、タンパク質溶液又は緩衝液のｐＨは、ポリケトン媒体により、タンパク質単量体とタンパク質凝集体とが分離可能なｐＨであれば特に限定されない。ｐＨの下限値としては４．０以上が例示され、別の態様として４．５以上が例示され、さらに別の態様として５．０以上が例示され、さらに別の態様として５．５以上が例示され、さらに別の態様として、６．０以上が例示される。ｐＨの上限値としては、１０．０以下が例示され、別の態様として９．０以下が例示され、さらに別の態様として８．０以下が例示され、さらに別の態様として８．５以下が例示され、さらに別の態様として８．０以下が例示され、さらに別の態様として７．５以下が例示され、さらに別の態様として７．０以下が例示される。ｐＨの測定方法としては特に限定されないが、例えば水素電極、キンヒドロン電極、アンチモン電極、ガラス電極を使用した方法が挙げられる。中でもガラス電極を用いた方法が好ましい。
タンパク質溶液又は緩衝液の電気伝導度は、ポリケトン媒体により、タンパク質単量体とタンパク質凝集体とが分離可能な電気伝導度であれば特に限定されない。電気伝導度の下限値としては、０ｍＳ／ｃｍ以上が例示され、別の態様として１ｍＳ／ｃｍ以上が例示され、別の態様として２ｍＳ／ｃｍ以上が例示され、別の態様として３ｍＳ／ｃｍ以上が例示され、別の態様として４ｍＳ／ｃｍ以上が例示され、さらに別の態様として５ｍＳ／ｃｍ以上が例示される。電気伝導度の上限値としては、１００ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、別の態様として９０ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、さらに別の態様として８０ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、さらに別の態様として７０ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、さらに別の態様として６０ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、さらに別の態様として５０ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、さらに別の態様として４０ｍＳ／ｃｍ以下が例示される。電気伝導度の測定方法は特に限定されないが、例えばＪＩＳ Ｋ０１３０「電気伝導率測定法通則」に定められた方法が利用可能である。例えば、交流２電極方式、交流４電極方式、又は電磁誘導方式が挙げられる。中でも交流２電極方式であることが好ましい。
一つの実施形態において、精製タンパク質としては、精製タンパク質中の目的タンパク質の凝集体（二量体又は多量体）含量が、精製前、すなわちポリケトンに接触させる前のタンパク質含有溶液中のタンパク質中の目的タンパク質の凝集体含量よりも低減したタンパク質であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、タンパク質の凝集体としては、目的タンパク質の単量体が２つ会合した二量体、目的タンパク質の単量体が３つ会合した三量体、又は目的タンパク質の単量体が４つ以上会合した多量体、或いはその混合物が例示される。なお、多量体は二量体及び三量体を含める場合がある。タンパク質の凝集体には、目的タンパク質以外のタンパク質が含まれる場合もある。また、タンパク質の凝集体は、不可逆的な会合体であってもよく、可逆的な会合体であってもよい。
一つの実施形態において、精製タンパク質を回収することとしては、精製タンパク質を取得することができれば特に限定されないが、精製タンパク質が溶解したままの溶液の状態で回収することもできるし、凍結乾燥の状態で回収することもできる。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液をポリケトンに接触させることとしては、タンパク質含有溶液をポリケトンに接触させることができれば特に限定されないが、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させること、又はタンパク質含有溶液中にポリケトン媒体を浸漬することなどがあげられる。目的タンパク質精製の制御を比較的容易に行う観点からは、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させることが好ましい。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させることとしては、シリンジ又はポンプなどによりタンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させることが例示される。タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させる方法としては、ポリケトン媒体中のある部分に向けて流したタンパク質含有溶液がポリケトン媒体を通過し、ポリケトン媒体の別の部分からタンパク質含有溶液が回収できればよい。また、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させる前後において、タンパク質含有溶液とは別に緩衝液をポリケトン媒体に通過させてもよい。タンパク質含有溶液回収の際、ポリケトン媒体に通過させるタンパク質含有溶液をすべて回収してもよく、一定体積ごとにフラクションを取得してもよい。当該精製タンパク質を含有するフラクションを収集して一つにすることにより、精製タンパク質を回収することができる。また、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させる流速としては特に限定されないが、下限値としてポリケトン媒体１ｍＬに対して０．１ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、別の態様として０．５ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、別の態様として１．０ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、さらに別の態様としては５ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示される。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に浸漬することとしては、タンパク質含有溶液中にポリケトン媒体を投入することが例示される。この際、ポリケトン媒体が投入されたタンパク質含有溶液に対し、シェーカー等による振盪や攪拌子などによる攪拌を行ってもよいし、溶液を静置してもよい。浸漬後、ポリケトン媒体をタンパク質含有溶液から除去することにより精製タンパク質を回収することができる。ポリケトン媒体の除去方法としては、遠心分離、ろ過などが例示される。
２．タンパク質凝集体を除去する方法
実施形態に係るタンパク質含有溶液からタンパク質含有溶液中に含まれるタンパク質凝集体を選択的に除去する方法は、（ｂ１）タンパク質含有溶液を、ポリケトンを含む媒体に接触させる工程を含む。
一つの実施形態において、ポリケトンとしては、上述したポリケトンであれば特に限定されない。
一つの実施形態において、ポリケトン媒体の形状としては、上述した形状であれば特に限定されない。
ポリケトン媒体が多孔質成形体である場合、ポリケトン媒体の孔径としては、上述した孔径であれば特に限定されない。
ポリケトン媒体の孔径分布は三次元的に均一であっても不均一であってもよい。三次元的に均一な膜孔径とは、膜の三次元ＳＥＭ画像などによって確認することができる。
一つの実施形態において、精製対象となるタンパク質としては、上述した精製対象のタンパク質であれば特に限定されない。また、その精製対象のタンパク質の分子量も、上述した分子量であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液としては、上述したタンパク質含有溶液であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、タンパク質溶液又は緩衝液の濃度は、上述した濃度であれば特に限定されない。
タンパク質溶液又は緩衝液のｐＨは、上述したｐＨであれば特に限定されない。ｐＨの測定方法は、上述した方法であれば特に限定されない。
タンパク質溶液又は緩衝液の電気伝導度は、上述した電気伝導度であれば特に限定されない。電気伝導度の測定方法は、上述した方法であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、タンパク質の凝集体は特に限定されないが、上述したタンパク質凝集体が例示される。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に接触させることとしては、上述した接触方法であれば特に限定されない。凝集体除去の制御を比較的容易に行う観点からは、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させることが好ましい。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させることとしては、上述した通過させる方法であれば特に限定されない。上述したように、シリンジ又はポンプなどによりタンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させることが例示される。タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させる方法としては、ポリケトン媒体中のある部分に対して流したタンパク質含有溶液がポリケトン媒体を通過し、ポリケトン媒体の別の部分からタンパク質含有溶液が回収できればよい。また、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させる前後において、タンパク質含有溶液とは別に緩衝液をポリケトン媒体に通過させてもよい。また、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させる流速としては特に限定されないが、下限値としてポリケトン媒体１ｍＬに対して０．１ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、別の態様として０．５ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、別の態様として１．０ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、さらに別の態様としては５ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示される。
一つの実施形態において、ポリケトン媒体が膜である場合、膜体積としては上述した膜体積であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、ポリケトン媒体の表面積としては、上述した表面積であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に浸漬することとしては、タンパク質含有溶液中にポリケトン媒体を投入することが例示される。この際、ポリケトン媒体を含むタンパク質含有溶液に対し、シェーカー等による振盪や攪拌子などによる攪拌を行ってもよいし、溶液を静置してもよい。浸漬後、ポリケトン媒体をタンパク質含有溶液から除去することにより精製タンパク質を回収することができる。ポリケトン担持体の除去方法としては、遠心分離、ろ過などが例示される。
一つの実施形態において、タンパク質凝集体を除去することとしては、上述したように、タンパク質含有溶液をポリケトンに接触させることにより、ポリケトンに接触させる前のタンパク質含有溶液中の目的タンパク質の凝集体含量よりもタンパク質凝集体含量を選択的に低減させることができれば特に限定されない。接触方法の例として、タンパク質含有溶液をポリケトン媒体に通過させること、又はタンパク質含有溶液中にポリケトンを浸漬、振盪、攪拌、若しくは静置することなどがあげられる。選択的に低減することとしては、目的タンパク質単量体の量に比してタンパク質凝集体の量が少なくなることが例示される。
３．タンパク質凝集体除去用の媒体
実施形態に係るタンパク質の凝集体を選択的に除去するための媒体は、ポリケトンを含む媒体であれば特に限定されない。媒体は、実質的に、ポリケトンからなっていてもよい。
一つの実施形態において、ポリケトンとしては、上述したポリケトンであれば特に限定されない。
一つの実施形態において、ポリケトン媒体の形状としては、上述した形状であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、ポリケトン媒体が膜である場合、膜体積としては上述した膜体積であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、ポリケトン媒体の表面積としては、上述した表面積であれば特に限定されない。
ポリケトン媒体が多孔質体である場合、ポリケトン媒体の孔径としては、上述した孔径であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、ポリケトン媒体の孔径分布は三次元的に均一であっても不均一であってもよい。三次元的に均一な膜孔径とは、膜の三次元ＳＥＭ画像によって確認することができる。
一つの実施形態において、精製対象となるタンパク質としては、上述した精製対象のタンパク質であれば特に限定されない。また、その精製対象のタンパク質の分子量も、上述した分子量であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、タンパク質の凝集体は特に限定されないが、上述したタンパク質凝集体、又はその他のタンパク質凝集体が例示される。
実施形態に係るポリケトンを含む媒体は、上記１．又は２．に記載のとおりに使用することができる。これにより、目的タンパク質の凝集体を効率的に除去することができる。
４．タンパク質の精製方法
実施形態に係るタンパク質の精製方法は、（α１）タンパク質含有溶液を、ポリケトンを含む多孔質媒体（以下、「ポリケトン多孔質媒体」と呼ぶことがある。）に接触させる工程と、（α２）ポリケトンを含む多孔質媒体に接触させたタンパク質含有溶液をウイルス除去膜に通過させる工程、とを含む。
また、実施形態に係るタンパク質の精製方法は、（β１）タンパク質含有溶液を、比表面積が４．０ｍ２／ｍＬ以上であり、かつ空隙率５０％以上である多孔質媒体に接触させる工程と、（β２）多孔質媒体に接触させたタンパク質含有溶液をウイルス除去膜に通過させる工程、とを含む。
一つの実施形態において、ポリケトンとしては、上述したポリケトンであれば特に限定されない。
一つの実施形態において、多孔質媒体の形状は、上述したポリケトン媒体と同様の形状であれば特に限定されない。
多孔質媒体の孔径としては、上述したポリケトン媒体が多孔質成形体である場合のポリケトン媒体の孔径と同様であれば特に限定されない。
多孔質媒体の孔径分布は三次元的に均一であっても不均一であってもよい。三次元的に均一な膜孔径とは、膜の三次元ＳＥＭ画像によって確認することができる。
一つの実施形態において、多孔質媒体の形状としては、タンパク質を精製できる形状であれば特に限定されないが、ビーズ、ゲル、スポンジ、又は粉末等の形状が例示され、別の態様としては繊維、又は膜（平膜又は中空糸膜）が例示される。多孔質媒体の形状の別の態様としては、平膜又は中空糸膜が例示され、さらに別の態様としては平膜が例示され、さらに別の態様としては中空糸膜が例示される。多孔質媒体は多孔質成形体であってもよい。多孔質成形体が、微多孔膜、不織布、織布、モノリス、ゲル、又は粒子床であってもよい。
一つの実施形態において、比表面積が４．０ｍ２／ｍＬ以上であり、かつ空隙率５０％以上である多孔質媒体の素材としては、ポリケトン又はナイロンが例示され、別の態様としてポリケトンが例示される。ポリケトンは、例えば特許文献４に記載された方法で製造することができる。ナイロンは公知の方法で製造することができる。
一つの実施形態において、多孔質媒体が膜である場合、膜体積としてはタンパク質を精製できる膜体積であれば特に限定されない。膜体積の下限値としては、精製対象のタンパク質１．０ｇに対して０．１０ｍＬ以上が例示され、別の態様として０．５０ｍＬ以上が例示され、別の態様として１．０ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として１．５ｍＬ以上が例示される。膜体積の上限値としては、精製対象のタンパク質１．０ｇに対して１０００００ｍＬ以下が例示され、別の態様として１００００ｍＬ以下が例示され、別の態様として１０００ｍＬ以下が例示され、別の態様として１００ｍＬ以下が例示され、さらに別の態様として１０ｍＬ以下が例示される。
一つの実施形態において、多孔質媒体の表面積としては、タンパク質を精製できる表面積であれば特に限定されない。表面積の下限値としては、精製対象のタンパク質１．０ｇに対して０．０００１ｍ２以上が例示され、別の態様として０．００１ｍ２以上が例示され、別の態様として０．０１ｍ２以上が例示され、別の態様として０．１ｍ２以上が例示され、別の態様として１．０ｍ２以上が例示され、さらに別の態様として５．０ｍ２以上が例示される。表面積の上限値としては、精製対象のタンパク質１．０ｇに対して１００００００ｍ２以下が例示され、別の態様として１０００００ｍ２以下が例示され、別の態様として１００００ｍ２以下が例示され、別の態様として１０００ｍ２以下が例示され、別の態様として１００ｍ２以下が例示され、さらに別の態様として３０ｍ２以下が例示される。表面積は比表面積から算出される。比表面積とは、ポリケトン媒体の体積に対するポリケトンの表面積を意味する。表面積は比表面積から算出され、比表面積とポリケトン媒体の体積の積となる。
一つの実施形態において、多孔質媒体の体積に対する多孔質媒体の比表面積は４．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として５．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として６．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として７．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として８．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として９．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として１０．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として１１．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として１２．０ｍ２／ｍＬ以上が例示される。さらに、多孔質媒体の比表面積は５０ｍ２／ｍＬ以下が例示され、さらに別の態様として４９．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として４８．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として４７．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として４６．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として４５．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として４４．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として４３．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として４２．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として４１．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として４０．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として３９．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として３８．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として３７．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として３６．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として３５．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として３４．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として３３．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として３２．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として３１．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として３０．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として２９．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として２８．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として２７．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として２６．０ｍ２／ｍＬ以上が例示され、さらに別の態様として２５ｍ２／ｍＬ以下が例示され、さらに別の様態として２４ｍ２／ｍＬ以下が例示され、さらに別の様態として２３ｍ２／ｍＬ以下が例示され、さらに別の様態として２２ｍ２／ｍＬ以下が例示され、さらに別の様態として２１ｍ２／ｍＬ以下が例示される。
上記比表面積を有する多孔質媒体の空隙率が５０％以上、さらに別の様態として５５％以上、さらに別の様態として６０％以上、さらに別の様態として６５％以上、さらに別の様態として６８％以上、さらに別の様態として６９％以上、さらに別の様態として７０％以上、さらに別の様態として７１％以上、さらに別の様態として７２％以上、さらに別の様態として７３％以上、さらに別の様態として７４％以上、さらに別の様態として７５％以上、さらに別の様態として７６％以上が例示される。さらに、多孔質媒体の空隙率は９９％以下が例示され、さらに別の様態として９５％以下が例示され、さらに別の様態として９０％以下が例示される。
一つの実施形態において、精製対象となるタンパク質としては、直接ウイルス除去膜に適用するとウイルス除去膜の目詰まりの原因となる物質（生体高分子）を含むタンパク質であって、多孔質媒体に接触させた結果ウイルス除去膜の目詰まりが低減されるようなタンパク質であれば特に限定されない。例えば、精製対象となるタンパク質としては、アルブミン、グロブリン、又はフィブリノゲンが挙げられる。抗体としては、上述した抗体であれば特に限定されないが、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥのいずれかを含むモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体が例示される。抗体は、例えば、血漿生成物由来であってもよく、あるいは細胞培養液由来であってもよい。細胞培養によって抗体を得る場合は細胞として動物細胞もしくは微生物を使用することができる。動物細胞としては、種類は特に限定されないが、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞などが挙げられる。微生物としては、種類は特に限定されないが、大腸菌や酵母などが挙げられる。
一つの実施形態において、ウイルス除去膜の目詰まり原因物質（生体高分子）を含みウイルス除去膜の目詰まりを起こすタンパク質であって、多孔質媒体に接触させた結果ウイルス除去膜の目詰まりが低減されるようなタンパク質であればその分子量は特に限定されない。分子量の下限値としては、０．１ｋＤａ以上が例示され、別の態様として１ｋＤａ以上が例示され、別の態様として１０ｋＤａ以上が例示され、別の態様として５０ｋＤａ以上が例示され、さらに別の態様として１００ｋＤａ以上が例示される。分子量の上限値としては、１００００ｋＤａ以下が例示され別の態様として５０００ｋＤａ以下が例示され、別の態様として１０００ｋＤａ以下が例示され、別の態様として５００ｋＤａ以下が例示され、さらに別の態様として２００ｋＤａ以下が例示される。
一つの実施形態において、タンパク質溶液又は緩衝液のｐＨは、多孔質媒体により、目的タンパク質とウイルス除去膜目詰まり原因物質（生体高分子）とが分離可能なｐＨであれば特に限定されない。ｐＨの下限値としては４．０以上が例示され、別の態様として４．５以上が例示され、さらに別の態様として５．０以上が例示され、さらに別の態様として５．５以上が例示され、さらに別の態様として、６．０以上が例示される。ｐＨの上限値としては、１０．０以下が例示され、別の態様として９．０以下が例示され、さらに別の態様として８．０以下が例示され、さらに別の態様として８．５以下が例示され、さらに別の態様として８．０以下が例示され、さらに別の態様として７．５以下が例示され、さらに別の態様として７．０以下が例示される。ｐＨの測定方法としては特に限定されないが、例えば水素電極、キンヒドロン電極、アンチモン電極、ガラス電極を使用した方法が挙げられる。中でもガラス電極を用いた方法が好ましい。
タンパク質溶液又は緩衝液の電気伝導度は、多孔質媒体により、目的タンパク質単量体とウイルス除去膜目詰まり原因物質（生体高分子）とが分離可能な電気伝導度であれば特に限定されない。電気伝導度の下限値としては、０ｍＳ／ｃｍ以上が例示され、別の態様として１ｍＳ／ｃｍ以上が例示され、別の態様として２ｍＳ／ｃｍ以上が例示され、別の態様として３ｍＳ／ｃｍ以上が例示され、別の態様として４ｍＳ／ｃｍ以上が例示され、さらに別の態様として５ｍＳ／ｃｍ以上が例示される。電気伝導度の上限値としては、１００ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、別の態様として９０ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、さらに別の態様として８０ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、さらに別の態様として７０ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、さらに別の態様として６０ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、さらに別の態様として５０ｍＳ／ｃｍ以下が例示され、さらに別の態様として４０ｍＳ／ｃｍ以下が例示される。電気伝導度の測定方法は特に限定されないが、例えばＪＩＳ Ｋ０１３０「電気伝導率測定法通則」に定められた方法が利用可能である。例えば、交流２電極方式、交流４電極方式、又は電磁誘導方式が挙げられる。中でも交流２電極方式であることが好ましい。
一つの実施形態において、精製タンパク質としては、精製タンパク質中のウイルス除去膜目詰まり原因物質（生体高分子）含量が、精製前、すなわち多孔質媒体に接触させる前のタンパク質含有溶液中のタンパク質中のウイルス除去膜目詰まり原因物質（生体高分子）よりも低減したタンパク質であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液を多孔質媒体に接触させることとしては、タンパク質含有溶液を多孔質媒体に接触させることができれば特に限定されないが、タンパク質含有溶液を多孔質媒体に通過させること、又はタンパク質含有溶液中に多孔質媒体を浸漬することなどがあげられる。目的タンパク質精製の制御を比較的容易に行う観点からは、タンパク質含有溶液を多孔質媒体に通過させることが好ましい。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液を多孔質媒体に通過させることとしては、シリンジ又はポンプなどによりタンパク質含有溶液を多孔質媒体に通過させることが例示される。タンパク質含有溶液を多孔質媒体に通過させる方法としては、多孔質媒体中のある部分に向けて流したタンパク質含有溶液が多孔質媒体を通過し、多孔質媒体の別の部分からタンパク質含有溶液が回収できればよい。また、タンパク質含有溶液を多孔質媒体に通過させる前後において、タンパク質含有溶液とは別に緩衝液を多孔質媒体に通過させてもよい。タンパク質含有溶液回収の際、多孔質媒体に通過させるタンパク質含有溶液をすべて回収してもよく、一定体積ごとにフラクションを取得してもよい。当該精製タンパク質を含有するフラクションを収集して一つにすることにより、精製タンパク質を回収することができる。また、タンパク質含有溶液を多孔質媒体に通過させる流速としては特に限定されないが、下限値としてポリケトン媒体１ｍＬに対して０．１ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、別の態様として０．５ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、別の態様として１．０ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、さらに別の態様としては５ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示される。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液を多孔質媒体に浸漬することとしては、タンパク質含有溶液中に多孔質媒体を投入することが例示される。この際、多孔質媒体が投入されたタンパク質含有溶液に対し、シェーカー等による振盪や攪拌子などによる攪拌を行ってもよいし、溶液を静置してもよい。浸漬後、多孔質媒体をタンパク質含有溶液から除去することにより精製タンパク質を回収することができる。多孔質媒体の除去方法としては、遠心分離、ろ過などが例示される。
一つの実施形態において、精製対象となるタンパク質としては、上述した精製対象のタンパク質であれば特に限定されない。また、その精製対象のタンパク質の分子量も、上述した分子量であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、多孔質媒体によるろ過前のタンパク質は、目的タンパク質の単量体以外に、生体高分子を含み得る。生体高分子としては、ウイルス除去フィルターの目詰まりの原因となる物質であれば特に限定されないが、目的タンパク質の凝集体、別の態様として目的タンパク質と目的タンパク質以外のタンパク質の凝集体が例示される。一つの実施形態においてタンパク質の凝集体は、その単量体が複数凝集して形成されたものが例示される。
一つの実施形態において、タンパク質含有溶液としては、上述したタンパク質含有溶液であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、タンパク質溶液又は緩衝液の濃度は、上述した濃度であれば特に限定されない。
タンパク質溶液又は緩衝液のｐＨは、上述したｐＨであれば特に限定されない。ｐＨの測定方法は、上述した方法であれば特に限定されない。
タンパク質溶液又は緩衝液の電気伝導度は、上述した電気伝導度であれば特に限定されない。電気伝導度の測定方法は、上述した方法であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、タンパク質の凝集体としては、上述したタンパク質凝集体であれば特に限定されない。
一つの実施形態において、ウイルス除去膜は実質的にウイルスが除去できるものであれば特に限定されないが、例として約１５ｎｍ以上約７５ｎｍ以下の公称孔サイズを有する。例えば、公称孔サイズ２０ｎｍの膜では、例えばパルボウイルス（直径１８ｎｍ以上２６ｎｍ以下）を除去することが可能であり、一方、１６０ｋＤ（約８ｎｍ）といった大きさであるタンパク質、例えばモノクローナル抗体の通過を可能にする。例えば公称孔サイズ３５ｎｍ以上の膜を用いて、例えばレトロウイルス（直径８０ｎｍ以上１００ｎｍ以下）を除去し得る。
一つの実施形態において、ウイルス除去膜は１００ｋＤ～１０００ｋＤの分画分子量を有する。これに関連して、膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）は、その９０％が膜を通過できる分子及び粒子の公称分画分子量（ｎｏｍｉｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）を指す。
一つの実施形態において、ウイルス除去膜の素材としては、ウイルスを除去することができる膜であれば特に限定されないが、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、セルロース、セルロース誘導体又はそれらの混合物が挙げられる。それぞれ公知の方法で製造することができる（特許文献６、７、又は非特許文献２から５参照。）
一つの実施形態において、工程（α１）で用いるポリケトン多孔質媒体又は工程（β１）で用いる多孔質媒体と、工程（α２）又は工程（β２）で用いるウイルス除去膜と、を連結する場合、両者を直接接続してもよいし、間に別のろ過工程が存在してもよい。
一つの実施形態において、工程（α１）で用いるポリケトン多孔質媒体又は工程（β１）で用いる多孔質媒体と、工程（α２）又は工程（β２）で用いるウイルス除去膜と、を連結する場合、工程（α１）で用いるポリケトン多孔質媒体又は工程（β１）で用いる多孔質媒体に加えられる圧力は、上限としてウイルス除去膜にかかる圧力の１／２以下が例示され、また別の様態として１／２．５以下が例示され、また別の様態として１／３以下が例示され、また別の様態として１／３．５以下が例示され、また別の様態として１／４以下が例示される。さらに下限として、１／４０以上が例示され、また別の様態として１／３５以上が例示され、また別の様態として１／３０以上が例示され、また別の様態として１／２５以上が例示され、１／２０以上が例示される。
一つの実施形態において、多孔質媒体と接触させた後にウイルス除去膜で処理される任意の時間当たりのタンパク質が、多孔質媒体と接触させずにウイルス除去膜で処理される任意の時間当たりのタンパク質の１．０５倍以上、別の様態として１．１倍以上が例示され、別の様態として１．２倍以上が例示され、別の様態として１．５倍以上が例示され、別の様態として２．０倍以上が例示され、別の様態として２．５倍以上が例示され、別の様態として３．０倍以上が例示され、別の様態として３．５倍以上が例示され、別の様態として４．０倍以上が例示され、別の様態として４．５倍以上が例示され、別の様態として５．０倍以上が例示される。
ウイルス除去膜で処理した後のタンパク質含有溶液におけるウイルスの除去率は、少なくとも９９．９％である。
一つの実施形態において、プレフィルターとは、ウイルス除去膜の前に設置される膜であり、ウイルス除去膜を通過させるタンパク質含有溶液に含まれるウイルス除去膜の目詰まり原因物質を低減させることにより、目的タンパク質の処理量やＦｌｕｘを向上させることができる。
以下に、実施形態の実施例を説明するが、これらは実施形態を何ら限定するものではない。
〔実施例Ａ１〕
（１）ポリケトンを含む多孔質媒体の作製
特許文献４の［００６２］から［００７１］に記載されている方法により、ポリケトンを含む多孔質媒体として、表１に記載した特性を有するポリケトン多孔質膜ＰＫ１を作製した。
（２）ポリケトン多孔質膜の比表面積
評価対象のポリケトン多孔質膜ＰＫ１の比表面積をＢＥＴ比表面積測定装置（Ｍａｃｓｏｒｂ ＨＭｍｏｄｅｌ－１２０１，Ｍｏｕｔｅｃｈ社製）にて測定した。結果を表１に示す。
（３）抗体溶液の調製
ＣＲＬ１２４４５抗体生産細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名 ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標） ＭＦ－ＳＬ）を用いてろ過し、不純物と０．７４ｇ／Ｌのモノクローナル抗体を含む抗体溶液（培養上澄）を取得した。
（４）抗体タンパクモノマー溶液の調製
商業的に典型的な方法において、（３）で得られた抗体溶液を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法で精製し、塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０、５ｍＳ／ｃｍ）にバッファー交換して、抗体タンパクモノマー溶液を調製した。溶液の電気伝導度は、電気伝導率計ＣＭ－４０Ｓ（東亜ディーケーケー社製）で測定した。
（５）抗体タンパク凝集体溶液の調製
（４）で得られた抗体タンパクモノマー溶液の一部に塩酸を加え、ｐＨ２．５に調整し、一時間維持した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和した後、塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０、５ｍＳ／ｃｍ）にバッファー交換し、多量の抗体タンパク凝集体を含む抗体タンパク凝集体溶液を調製した。
（６）凝集体を含む抗体溶液の調製
（４）で得られた抗体タンパクモノマー溶液と、（５）で得られた抗体タンパク凝集体溶液を混合し、４％の抗体タンパク凝集体を含む溶液を調製した。ここでいう４％とは、溶液に含まれる抗体タンパク中の二量体、及びそれ以上の凝集体の割合を示す。（７）で説明するように、凝集体量は、サイズ排除クロマトグラフィーで測定した。
（７）凝集体量の測定
（６）で作製した抗体タンパク凝集体を含む溶液について、下記の条件により、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）装置を用いて凝集体量を測定した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）カラム温度：３０℃ システム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ ＣＬＡＳＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム＋０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｌ（＋）－アルギニン水溶液（塩酸でｐＨ６．７に調整）
（８）ポリケトン多孔質膜モジュールの作製
（１）で得られたポリケトン多孔質膜ＰＫ１を直径２．５ｃｍの円形状に切り出し、３枚重ねた状態で、有効膜面積が３．８ｃｍ２となるシリンジホルダー（アドバンテック ＫＳ－２５ ステンレスシリンジホルダー）に挟み、実施例Ａ１に係るポリケトン多孔質膜モジュールとした。実施例Ａ１に係るポリケトン多孔質膜モジュールにおけるポリケトン多孔質膜ＰＫ１の使用膜体積を表１に示した。
（９）ウイルス除去膜の作製
特許文献１０の［００６６］～［００８８］に記載されている方法により作製した中空糸膜を有効膜面積が２．８ｃｍ２となるように組み立てたフィルターをウイルス除去膜として使用した。なお、有効膜面積は中空糸膜の内径と有効長より算出した。
（１０）圧力比の測定
（８）で作製した実施例Ａ１に係るポリケトン多孔質膜モジュールとウイルス除去膜とを間に液体圧力計を設置した状態で連結し、１９６ｋＰａの圧力にて水を通液し、ウイルス除去膜にかかる圧力（ｋＰａ）を測定した。１９６ｋＰａからウイルス除去膜にかかる圧力値を差し引いた値をポリケトン多孔質膜にかかる圧力とし、ウイルス除去膜にかかる圧力でポリケトン多孔質膜にかかる圧力を除した数値を圧力比として表１に記載した。
（１１）抗体処理量１の測定
（８）で作製した実施例Ａ１に係るポリケトン多孔質膜モジュールと（９）で得られたウイルス除去膜を連結し、（６）で作製した凝集体を含む抗体溶液をデッドエンドで、１９６ｋＰａの一定圧力で通液させた。その際にウイルス除去膜単位面積あたりにおける単位時間当たりの抗体溶液処理速度（ＬＭＨ＝処理液量（Ｌ）／ウイルス除去膜面積（ｍ２）／時間）が２０ＬＭＨを下回った時点までにろ過した液量を処理液量（Ｌ）とし、得られた抗体溶液の濃度と処理液量の積から抗体処理量を算出した。抗体処理量を、使用したウイルス除去膜面積で除した値を抗体処理量１として表１に記載した。
（１２）抗体処理量２の測定
抗体処理量２として、実施例Ａ１に係るポリケトン多孔質膜モジュールの単位体積（Ｌ）当たりにおける、実施例Ａ１に係るポリケトン多孔質膜モジュールを用いずにウイルス除去膜のみで処理した場合の処理量に対する、実施例Ａ１に係るポリケトン多孔質膜モジュールを用いた場合のウイルス除去膜の処理量の向上量（ｋｇ）を算出した。まず（１１）と同様に、ウイルス除去膜単位面積あたりにおける単位時間当たりの抗体溶液処理速度（ＬＭＨ＝処理液量（Ｌ）／ウイルス除去膜面積（ｍ２）／時間）が２０ＬＭＨを下回った時点までに濾過した液量を処理液量（Ｌ）とし、得られた抗体溶液の濃度と処理液量の積から抗体処理量（ｋｇ／ｍ２）を算出した。この値から、実施例Ａ１に係るポリケトン多孔質膜モジュールを用いずにウイルス除去膜のみで処理可能な抗体量を差し引き、表１に記載の使用膜体積（Ｌ）で除した値を抗体処理量２（ｋｇ／Ｌ）として表１に記載した。結果より、実施例Ａ１に係るポリケトン多孔質膜モジュールは比表面積が大きいため、ウイルス除去膜の抗体処理量を大きく向上させたことが分かる。
〔実施例Ａ２〕
表１に記載した特性を有するポリケトン多孔質膜ＰＫ２を用いて作製した実施例Ａ２に係るポリケトン多孔質膜モジュールを用いた以外は実施例Ａ１と同様の操作を行い、結果を表１に記載した。ＰＫ１と比較し、ＰＫ２の孔径が大きいことから、比表面積が小さくなり、抗体処理の向上量はやや小さくなったが、圧力損失はさらに小さくなったことが示されている。
〔実施例Ａ３〕
特許文献４の［００７４］～［００７７］に記載されている方法により、表１に記載した特性を有するポリケトン多孔質中空糸膜（内径５２０μｍ、外径８４０μｍ）ＰＫ３からなる有効膜体積が０．１２ｍＬの実施例Ａ３に係るポリケトン多孔質膜モジュールを作製した。それ以外は実施例Ａ１と同様の操作を行い、結果を表１に記載した。結果より、実施例Ａ３に係るポリケトン多孔質膜モジュールは中空糸構造により圧力損失を抑えつつ、かつ比表面積が大きいため高い抗体処理量を示したことが分かる。
〔比較例Ａ１〕
工程（α１）又は（β１）に該当する工程を実施せず、工程（α２）又は工程（β２）に該当するウイルス除去膜だけを使用した以外は、実施例Ａ１と同様の操作を行い、結果を表１に記載した。結果から、実施例Ａ１からＡ３と比較して、ウイルス除去膜での抗体処理量が小さいことが分かる。
〔比較例Ａ２〕
工程（α１）又は工程（β１）に該当する工程として、ナイロン１（ナイロンメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）：７４０２－００２）、ＧＥヘルスケア社製、孔径０．２μｍ、膜体積０．１２ｍＬ）を用い、それ以外は実施例Ａ１と同様の操作を行い、結果を表１に記載した。結果から、実施例Ａ１からＡ３と比較して媒体の材料の違いのため、もしくは比表面積が小さいため、ウイルス除去膜での抗体処理量における、多孔質媒体の単位体積当たりの処理向上量が小さいことが分かる。
〔比較例Ａ３〕
工程（α１）又は工程（β１）に該当する工程として、ナイロン２（ナイロンメンブレン（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標） Ｓｙｒｉｎｇ Ｆｉｌｔｅｒ：ＰＮ４９０６）、ポール社製、孔径０．２μｍ、膜体積０．０４ｍＬ）を用い、それ以外は実施例Ａ１と同様の操作を行い、結果を表１に記載した。結果から、実施例Ａ１からＡ３と比較して媒体の材料の違いのため、もしくは比表面積が小さいため、ウイルス除去膜での抗体処理量における、多孔質媒体の単位体積当たりの処理向上量が小さいことが分かる。
Figure 0007273142000003
〔実施例Ｂ１〕
（１）ポリケトンを含む媒体の作製
特許文献４の［００６２］から［００７１］に記載されている方法により、ポリケトンを含む媒体として表２に記載の特性を有するポリケトン膜１（孔径０．２μｍ）を作製した。作製したポリケトン膜１を直径２．５ｃｍの円状に切り抜き、デジマチックインジケータＩＤ-Ｃ１１２ＸＢＳ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ社製）で膜厚を測定した結果、１００μｍであった。切り抜いた膜をステンレスホルダーＫＳ－２５（Ａｄｖａｎｔｅｃｈ社製、有効膜面積３．８ｃｍ２）に２枚セットした。ホルダー中のポリケトン膜の有効膜体積は０．０８ｍＬと算出された。
（２）ポリケトン膜の表面積
ポリケトン膜１の比表面積をＢＥＴ比表面積測定装置（Ｍａｃｓｏｒｂ ＨＭｍｏｄｅｌ－１２０１，Ｍｏｕｔｅｃｈ社製）で測定した。この測定結果から、ポリケトン膜１の表面積は０．６５ｍ２と算出された。
（３）抗体溶液の調製
ＣＲＬ１２４４５抗体生産細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名 ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標） ＭＦ－ＳＬ）を用いてろ過し、不純物と０．７４ｇ／Ｌのモノクローナル抗体を含む抗体溶液（培養上澄）を取得した。
（４）アフィニティーカラムによる抗体タンパク質の精製
リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ（ｐＨ８．０））で平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅを充填したカラム）に、（３）で用意した抗体溶液を添加し、プロテインＡに抗体タンパク質を吸着させた。次に、カラムにリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））を通液して洗浄した後、カラムに溶出緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．６））を通液して、プロテインＡカラムから抗体タンパク質を溶出させて、不純物がある程度低減された抗体含有溶液を回収した。なお、本抗体タンパク質を以下の（８）に記載の方法で測定したところ、単量体としての抗体タンパク質のピーク（下記（８）における（３）のピーク）のみ確認され、凝集体（１）、凝集体（２）のピークは確認できなかった。なお、緩衝液のｐＨの測定にはｐＨメータＨＭ－３０Ｒ（東亜ディーケーケー社製）を使用した。下記の緩衝液のｐＨの測定も同様である。
（５）凝集体の調製
（４）で得られた抗体溶液の一部に塩酸を加え、ｐＨ２．５に調整し、一時間維持した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和し、多量の抗体凝集体を含む抗体溶液を調製した。
（６）凝集体を含む抗体溶液の調製
（４）で得られた抗体溶液を、任意の量の塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０、５ｍＳ／ｃｍ）にバッファー交換した溶液と、（５）で得られた多量の凝集体を含む抗体溶液を任意の量の塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０、５ｍＳ／ｃｍ）にバッファー交換した溶液と、を任意の割合で混合し、抗体タンパク凝集体を含む抗体溶液（以降、「ＳＭ」と略すことがある。）を調製した。抗体溶液の電気伝導度は、電気伝導率計ＣＭ－４０Ｓ（東亜ディーケーケー社製）で測定した。
（７）ポリケトン膜への抗体含有溶液の通液
（１）でホルダーにセットしたポリケトン膜１に、（６）で作製した抗体凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を通過させた。抗体溶液の通過にはＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）を用い、通過させる抗体溶液の総量の１／１０体積ずつフラクションを回収した。加えた量は９ｍＬ（５．１０ｍｇ／ｍＬの濃度、抗体タンパク質の総量４５．９ｍｇ）、流速は０．４５ｍＬ／分であった。
（８）凝集体量の測定
（６）で作製した凝集体を含む抗体溶液及び（７）で回収した各フラクションに含まれるタンパク質を下記の条件により、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）装置を用いて測定した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）カラム温度：３０℃ システム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ ＣＬＡＳＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム＋０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｌ（＋）－アルギニン水溶液（塩酸でｐＨ６．７に調整）
（７）で得られた最後のフラクションを測定した結果、図１に例示するクロマトチャートが得られ、図１を拡大した図が図２である。溶液中に含まれるタンパク質がほとんどＣＨＯ細胞ＣＲＬ１２４４５が産生した抗体由来であることから、図２の（１）及び（２）のピークで現れるものは抗体の凝集体であり、（３）で現れるピークは単量体であると判断できる。クロマトチャートのピークの面積から算出される凝集体（１）の割合は１．１８％であり、凝集体（２）の割合は１．８３％、単量体の割合は９６．９９％であった。同様にこの操作を他のフラクション及び抗体タンパク凝集体を含む抗体溶液に対しても行い、凝集体及び単量体の割合を測定した。なお、以下の実施例及び比較例においても、最初に現れる凝集体のピークを凝集体（１）、２番目に現れる凝集体のピークを凝集体（２）という。
（９）凝集体除去性能の評価
各フラクションの抗体濃度を分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイスジャパン社製）にて測定した。抗体濃度と（８）で測定した凝集体及び単量体割合から、抗体タンパク凝集体を含む抗体溶液ＳＭ及び各フラクションＦＴ１からＦＴ１０に含まれる凝集体及び単量体の含有重量を算出した。その結果を図３に示した。
各フラクションの凝集体及び単量体の含有重量から、図４に示すチャートが得られた。横軸のＭ／Ｖは評価対象に通液した抗体の累積重量を、評価対象の膜体積で割った値である。縦軸のＣ／Ｃ０は、各フラクションに含まれる凝集体・単量体の濃度が、初めに作製した凝集体を含む抗体溶液に対してどの程度の割合かを示す値である。縦軸のＣは各フラクションの単量体又は凝集体（１）、（２）の濃度を示し、Ｃ０は評価対象に通液する前の単量体又は凝集体（１）、（２）の濃度を示す。
図４において、特にＭ／Ｖが４００ｍｇ／ｍＬ以下のフラクションにおいて単量体に比べ凝集体（１）及び凝集体（２）の割合が減少していることから、この条件で抗体凝集体が除去されたことが確認された。
〔実施例Ｂ２〕
緩衝溶液だけ変更し、実施例Ｂ１と同様の操作を行った。酢酸と酢酸ナトリウムを混合し、酢酸緩衝液（１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液、ｐＨ５．５、電気伝導度１５ｍＳ／ｃｍ）を作製した。酢酸緩衝液にバッファー交換した抗体溶液（抗体濃度５．０６ｍｇ／ｍＬ）をポリケトン膜１に通液後、実施例Ｂ１の（９）と同様の方法で凝集体除去性能を評価した。結果を図５に示す。図５において、特にＭ／Ｖが４００ｍｇ／ｍＬ以下のフラクションにおいて単量体に比べ凝集体（１）及び凝集体（２）の割合が減少していることから、この条件で抗体凝集体が除去されたことが確認された。
〔実施例Ｂ３〕
膜の孔径だけ変更し、実施例Ｂ１と同様の操作を行った。ポリケトン膜２（孔径０．１μｍ、膜厚１１２μｍ、２枚重ね、有効膜体積０．０９ｍＬ、表面積１．３７ｍ２）に、抗体溶液を１０ｍＬ（５．１２ｍｇ／ｍＬの濃度、抗体タンパク質の総量５１．２ｍｇ）、流速０．５０ｍＬ／分で通液し、実施例Ｂ１の（９）と同様の方法で凝集体除去性能を評価した。結果を図６に示す。図６において、特にＭ／Ｖが５００ｍｇ／ｍＬ以下のフラクションにおいて単量体に比べ凝集体（１）及び凝集体（２）の割合が減少していることから、この条件で抗体凝集体が除去されたことが確認された。
〔実施例Ｂ４〕
膜の孔径だけ変更し、実施例Ｂ１と同様の操作を行った。ポリケトン膜３（孔径０．４μｍ、膜厚８５μｍ、３枚重ね、膜体積０．１０ｍＬ、表面積０．４０ｍ２）に、抗体溶液を１２ｍＬ（５．０８ｍｇ／ｍＬの濃度、抗体タンパク質の総量６１．０ｍｇ）、流速０．６０ｍＬ／分で通液し、実施例Ｂ１の（９）と同様の方法で凝集体除去性能を評価した。結果を図７に示す。図７において、特にＭ／Ｖが３００ｍｇ／ｍＬ以下のフラクションにおいて単量体に比べ凝集体（１）及び凝集体（２）の割合が減少していることから、この条件で抗体凝集体が除去されたことが確認された。
〔実施例Ｂ５〕
緩衝液の電気伝導度だけ変更し、実施例Ｂ１と同様の操作を行った。ポリケトン膜１に、抗体溶液を９ｍＬ（抗体濃度５．２１ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｍｏｌ／Ｌ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０、電気伝導度３５ｍＳ／ｃｍ））、流速０．４５ｍＬ／分で通液し、実施例Ｂ１の（９）と同様の方法で凝集体除去性能を評価した。結果を図８に示す。図８において特にＭ／Ｖが５００ｍｇ／ｍＬ以下のフラクションにおいて単量体に比べ凝集体（１）及び凝集体（２）の割合が減少していることから、この条件で抗体凝集体が除去されていることが確認された。
〔実施例Ｂ６〕
抗体の種類及び膜の種類を変更して実施例Ｂ１と同様の操作を行った。ポリケトン膜４（孔径０．１μｍ、膜厚１０１μｍ、２枚重ね、膜体積０．０８ｍＬ、表面積０．９４ｍ２）に、ヒトモノクローナル抗体ＡＥ６Ｆ４を含む溶液を１０ｍＬ（抗体濃度４．５２ｍｇ／ｍＬ）、流速は０．５０ｍＬ／分で通液し、凝集体除去性能を評価した。結果を図９に示す。図９において、特にＭ／Ｖが４００ｍｇ／ｍＬ以下のフラクションにおいて単量体に比べ凝集体（１）及び凝集体（２）の割合が減少していることから、この条件で抗体凝集体が除去されたことが確認された。
〔実施例Ｂ７〕
通液流速のみを変更して実施例Ｂ３と同様の操作を行った。ポリケトン膜２に抗体溶液を１０ｍＬ（抗体濃度５．０７ｍｇ／ｍＬ）、流速は３．０ ｍＬ／分で通液し、凝集体除去性能を評価した。結果を図１０に示す。図１０において、特にＭ／Ｖが５００ｍｇ／ｍＬ以下のフラクションにおいて単量体に比べ凝集体（１）及び凝集体（２）の割合が減少していることから、この条件で抗体凝集体が除去されたことが確認された。
〔実施例Ｂ８〕
通液する溶液の抗体濃度のみを変更して実施例Ｂ３と同様の操作を行った。ポリケトン膜２に、抗体溶液１０ｍＬ（抗体濃度１４．５７ｍｇ／ｍＬ）、流速は０．５０ｍＬ／分で通液し、凝集体除去性能を評価した。結果を図１１に示す。図１１において、特にＭ／Ｖが５００ｍｇ／ｍＬ以下のフラクションにおいて単量体に比べ凝集体（１）及び凝集体（２）の割合が減少していることから、この条件で抗体凝集体が除去されたことが確認された。
〔実施例Ｂ９〕
膜の形状を変更して実施例Ｂ１と同様の操作を行った。特許文献４の［００７４］～［００７７］に記載されている方法により、表２に記載したポリケトン中空糸膜１（内径２８２μｍ、外径５６３μｍ）を作製し、有効膜体積が０．１５ｍＬとなるようにモジュールを作製した。抗体溶液を２４ｍＬ（抗体濃度５．０５ｍｇ／ｍＬ）、流速は２．５ｍＬ／分で通液し、凝集体除去性能を評価した。結果を図１２に示す。図１２において、特にＭ／Ｖが６００ｍｇ／ｍＬ以下のフラクションにおいて単量体に比べ凝集体（１）及び凝集体（２）の割合が減少していることから、この条件で抗体凝集体が除去されたことが確認された。
〔実施例Ｂ１０〕
抗体とポリケトンの接触方法、凝集体除去性能の評価方法のみを変更して実施例Ｂ１と同様の操作を行った。抗体溶液５ｍＬ（抗体濃度０．９０ｍｇ／ｍＬ）に、ポリケトン中空糸膜１を凍結粉砕して得たポリケトン粉末（重量０．０３６ｇ、表面積０．１０ｍ２）を浸漬し、溶液の振盪を行った。５時間後に溶液を採取し、遠心分離によって粉末を除去した後、実施例Ｂ１の（８）及び（９）に記載の方法で凝集体量と抗体濃度の測定を行った。採取液の単量体、凝集体の重量を測定し、Ｃ／Ｃ０を求めた。結果を図１３に示す。単量体に比べ凝集体（１）及び凝集体（２）の割合が減少していることから、この条件で抗体凝集体が除去されたことが確認された。
（比較例Ｂ１）
使用する膜のみ変更し、実施例Ｂ１と同様の操作を行った。ナイロンメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）：７４０２－００２、ＧＥヘルスケア社製、孔径０．２μｍ、直径２．５ｃｍ、膜厚１６０μｍ、２枚重ね、有効膜体積０．１２ｍＬ、表面積０．５２ｍ２）に、抗体溶液１３ｍＬ（抗体濃度４．８７ｍｇ／ｍＬ）、流速０．６５ｍＬ／分で通液し、実施例Ｂ１の（９）と同様の方法で凝集体除去性能を評価した。結果を図１４に示す。図１４においてＭ／Ｖが４００ｍｇ／ｍＬ付近のフラクションにおいて単量体に比べ凝集体（２）が当初の濃度を超えており、精製プロセス制御が難しくなることが示唆された。
実施例Ｂ１からＢ９及び比較例Ｂ１で用いた条件を表２に示す。
Figure 0007273142000004

Claims (15)

  1. 目的タンパク質を含むタンパク質含有溶液の精製方法であって、以下の工程を含む方法；
    （α１）前記タンパク質含有溶液を、比表面積が８．０ｍ2／ｍＬ以上であり、ポリケトンを含む多孔質媒体に接触させる工程、及び
    （α２）前記ポリケトンを含む多孔質媒体に接触させたタンパク質含有溶液をウイルス除去膜に通過させる工程。
  2. 前記多孔質媒体の空隙率が５０％以上である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記多孔質媒体が膜状である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記多孔質媒体と前記ウイルス除去膜とが直接接続されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記工程（α１）で用いる前記多孔質媒体に加えられる圧力が、工程（α２）で用いる前記ウイルス除去膜に加えられる圧力の１／４０以上１／２以下である、請求項４に記載の方法。
  6. 一定圧力をかけてろ過される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記タンパク質含有溶液におけるウイルスの除去率が、少なくとも９９．９％である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記目的タンパク質がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記タンパク質含有溶液中のタンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ウイルス除去膜で除去されるウイルスがパルボウイルスである、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記比表面積が１２．０ｍ2／ｍＬ以上である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記多孔質媒体が、ポリケトンからなる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法により、実質的にウイルスを含まないタンパク質含有溶液を製造する方法。
  14. 比表面積が８．０ｍ2／ｍＬ以上であり、ポリケトンを含む多孔質媒体を備える、ウイルス除去膜用プレフィルター。
  15. ポリケトンからなる、請求項１４に記載のウイルス除去膜用プレフィルター。

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