WO2017126496A1 - タンパク質の精製方法 - Google Patents

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WO2017126496A1
WO2017126496A1 PCT/JP2017/001364 JP2017001364W WO2017126496A1 WO 2017126496 A1 WO2017126496 A1 WO 2017126496A1 JP 2017001364 W JP2017001364 W JP 2017001364W WO 2017126496 A1 WO2017126496 A1 WO 2017126496A1
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antibody
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solution
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敬郎 横山
弘樹 谷口
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旭化成メディカル株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a protein purification method.
  • Immunoglobulin is a physiologically active substance that controls the immune reaction.
  • the antibody is obtained from blood of the immunized animal or a cell culture solution of cells possessing antibody-producing ability or an ascites culture solution of the animal.
  • blood and culture fluids containing these antibodies include proteins other than antibodies, or complex contaminants derived from the raw material used for cell culture, and in order to separate and purify antibodies from those impurity components A complicated and time-consuming operation is usually necessary.
  • Liquid chromatography is important for antibody separation and purification.
  • Chromatographic techniques for separating antibodies include gel filtration chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, and the like, and antibodies are separated and purified by combining these techniques.
  • Ion exchange chromatography is a method of performing separation by reversibly adsorbing counter ions present in a mobile phase using an ion exchange group on the surface of an adsorbent as a stationary phase.
  • an ion exchange group on the surface of an adsorbent as a stationary phase.
  • the shape of the adsorbent beads, flat membranes, membranes such as hollow fibers, etc. are adopted, and those obtained by binding cation exchange groups or anion exchange groups to these base materials are commercially available as adsorbents. .
  • purification can be carried out by eluting the adsorbed physiologically active substance by adsorbing antibodies by bringing a low salt concentration antibody solution into contact with the adsorbent and increasing the salt concentration of the mobile phase. Generally done. Furthermore, as a better method, purification of the target substance by the flow-through mode described below has been proposed.
  • the flow-through mode is a purification method in which impurities are selectively adsorbed on the adsorbent over the target substance. Therefore, compared with the conventional method using adsorption and elution, it leads to saving of buffer solution and simplification of the process. Further, if the antibody solution can be processed at a high flow rate, it is considered that the advantages of flow-through purification are further utilized.
  • the cation exchange step it is often aimed to separate antibody monomers and aggregates such as antibody dimers.
  • antibody monomers and aggregates such as antibody dimers.
  • the isoelectric points of the antibody monomer and the antibody aggregate are almost equal, in the flow-through purification, separation of the antibody monomer and the antibody dimer is particularly difficult, including the density of cation exchange groups. Therefore, a precise design of the cation exchanger is required.
  • the antibodies have different properties, the same design is not optimal for all antibodies even if elaborately designed, and it is considered that there is a cation exchange group density suitable for each antibody.
  • Patent Document 1 discloses a multimodal chromatography resin used for flow-through purification in which a low-molecular compound having an aromatic and weak cation exchange group is bonded on a resin.
  • Patent Document 2 discloses a chromatography carrier in which a copolymer having a weak cation exchange group is bound to silica beads.
  • Patent Document 3 discloses a chromatography carrier suitable for flow-through in which a monomer having a strong cation exchange group and an uncharged (neutral) monomer are graft-polymerized on a carrier.
  • the virus removal method by filtration using a virus removal membrane is an effective method that can reduce viruses without denaturing useful proteins.
  • parvoviruses In particular, have been reported as examples of infection with human parvovirus B19 in the field of plasma fractionation and in cases of contamination of mouse parvovirus CHO (Chinese Hamster Ovary) cells in the biopharmaceutical field. It is coming. Parvovirus, which is a small virus, has no envelope, so it is physicochemically stable and resistant to heating, low pH, chemical treatment, which is an inactivation step commonly used in pharmaceutical manufacturing processes. And resistant. For this reason, there is an increasing need for removal of parvovirus by a virus removal membrane as a virus removal method having a different mechanism of action from the inactivation method.
  • virus removal membranes that have high virus removal properties for small viruses (eg, parvovirus) that are close in size to useful proteins, and that have high protein filtration efficiency.
  • small viruses eg, parvovirus
  • the demand for is getting stricter year by year.
  • the total amount of virus loaded on the virus removal membrane (spike amount for virus protein preparation or total filtration amount) should be increased. It has become.
  • the conditions for clearing the virus removal membrane evaluation test are becoming stricter year by year.
  • this invention makes it a subject to provide the protein purification method which can suppress the fall of the permeation
  • the present inventors have studied and developed from various angles. As a result, when the aggregate is removed using a cation exchange chromatography carrier having a cation exchange group density higher than 30 mmol / L and then the virus is removed with a virus removal membrane, the decrease in permeation flux in the virus removal step is suppressed. As a result, the present invention has been completed. Although this is not bound by theory, it is considered that the clogging of the virus removal membrane by the aggregate was suppressed by removing the aggregate in the target protein solution by the cation exchange chromatography carrier. .
  • a solution containing a target protein monomer and an aggregate is prepared, and at least one weak cation exchange group is provided, and the cation exchange group density is higher than 30 mmol / L.
  • a chromatography carrier to remove aggregates of the target protein to obtain a purified monomer solution, and to remove the virus from the purified solution using a virus removal membrane with a virus log removal rate of 3 or more And a virus removal step.
  • the cation exchange chromatography carrier comprises a membrane substrate and a copolymer fixed on the surface of the membrane substrate, and the copolymer is a (meth) acrylamide compound as a monomer unit. And / or a (meth) acrylate compound.
  • the monomer unit other than the monomer unit having a cation exchange group may be a neutral monomer having no charge, and the neutral monomer may be a hydrophobic monomer unit and / or a hydrophilic monomer unit.
  • the hydrophobic monomer unit may have a linear or branched alkyl group having 4 or more carbon atoms.
  • the mass ratio of the hydrophobic monomer unit and / or the hydrophilic monomer unit may be higher than the mass ratio of the monomer unit having a cation exchange group.
  • the weak cation exchange group may be derived from any one of an acrylic acid monomer, a methacrylic acid monomer, an acrylic acid compound monomer, and a methacrylic acid compound monomer.
  • the cation exchange group provided in the cation exchange chromatography carrier may be only a weak cation exchange group.
  • carrier is equipped may contain the weak cation exchange group and the strong cation exchange group.
  • the strong cation exchange group may be a sulfonic acid group.
  • the copolymer may be fixed to the surface of the membrane substrate by covalent bond.
  • the hydrophilic monomer unit may contain at least one of isopropylacrylamide and 2-hydroxyethyl methacrylate.
  • the membrane-like substrate of the cation exchange chromatography carrier may contain polyethylene.
  • the graft ratio of the copolymer graft-polymerized on the film-like substrate may be 20 to 200%.
  • the film substrate may contain polyvinylidene fluoride.
  • the graft ratio of the copolymer graft-polymerized on the film substrate may be 5 to 100%.
  • the copolymer may not have a substantially crosslinked structure.
  • the copolymer may contain a monomer unit containing two or more polymerizable functional groups.
  • the cation exchange group density may be higher than 45 mmol / L.
  • the virus removal membrane comprises a primary surface to which a monomer purification solution is supplied and a secondary surface facing the primary surface, and in the cross section of the virus removal membrane Further, at least a portion in which the hole diameter decreases from the primary side to the secondary side may be provided.
  • the virus removal membrane comprises a primary surface to which a monomer purification solution is supplied and a secondary surface facing the primary surface, and in the cross section of the virus removal membrane The pore diameter may decrease and then increase from the primary side to the secondary side.
  • the virus removal membrane comprises a primary surface to which a monomer purification solution is supplied and a secondary surface facing the primary surface, and in the cross section of the virus removal membrane After the pore diameter decreases from the primary side to the secondary side, it becomes constant, and the densest layer may be provided near the surface on the secondary side.
  • the virus removal membrane may contain cellulose.
  • the virus removal membrane may contain a hydrophilic synthetic polymer.
  • the target protein may be an antibody.
  • the antibody may be a monoclonal antibody.
  • the target protein may be a recombinant protein.
  • the protein purification method of the present invention it is possible to suppress a decrease in permeation flow rate in the virus removal step.
  • FIG. 4 is a graph of absorbance when the antibody solution according to Reference Example 1 was subjected to size exclusion chromatography.
  • FIG. 6 is an enlarged view of the graph of FIG. 5.
  • 10 is a table showing the results of Reference Examples 1 to 29 and Reference Comparative Examples 1 to 3.
  • 10 is a table showing the results of Reference Example 30. It is a table
  • FIG. It is a table
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Example 1 and Comparative Example 1.
  • the method for purifying a protein includes preparing a solution containing a monomer and an aggregate of a target protein, including at least one kind of weak cation exchange group, and a cation exchange group density of 30 mmol / L or more. Using a high cation exchange chromatography carrier, the aggregate of the target protein is removed to obtain a purified monomer solution, and the virus is removed from the purified solution using a virus removal membrane having a virus log removal rate of 3 or more. Removing.
  • the target protein is, for example, an antibody protein.
  • the aggregate of the target protein is, for example, a low-order aggregate such as a dimer or trimer of the target protein (which may itself be an aggregate such as a dimer), a tetramer or higher. It refers to at least one of higher order aggregates and mixtures thereof.
  • the target protein aggregate is formed, for example, by aggregating a plurality of monomers of the target protein.
  • Antibody protein is a glycoprotein molecule (also referred to as gamma globulin or immunoglobulin) produced by B lymphocytes as a vertebrate infection prevention mechanism as generally defined in biochemistry.
  • the antibody protein purified by the cation exchange chromatography carrier according to the embodiment is used as a human pharmaceutical and has substantially the same structure as the antibody protein in the human body to be administered.
  • the antibody protein may be a human antibody protein, or may be an antibody protein derived from mammals such as non-human bovines and mice.
  • the antibody protein may be a chimeric antibody protein with human IgG and a humanized antibody protein.
  • a chimeric antibody protein with human IgG is an antibody protein in which the variable region is derived from a non-human organism such as a mouse, but the other constant region is substituted with a human-derived immunoglobulin.
  • the humanized antibody protein is a variable region of which complementarity-determining region (CDR) is derived from a non-human organism, but the other framework region (framework region: FR) is derived from a human. It is an antibody protein. Humanized antibody proteins are further reduced in immunogenicity than chimeric antibody proteins.
  • the class (isotype) and subclass of the antibody protein that is an example of the purification target of the purification method according to the embodiment is not particularly limited.
  • antibody proteins are classified into five classes, IgG, IgA, IgM, IgD, and IgE, depending on the structure of the constant region.
  • the antibody protein to be purified by the purification method according to the embodiment may be any of the five classes.
  • IgG has four subclasses, IgG1 to IgG4, and IgA has two subclasses, IgA1 and IgA2.
  • the antibody protein subclass to be purified by the purification method according to the embodiment may be any.
  • antibody-related proteins such as Fc fusion proteins in which a protein is bound to the Fc region can also be included in the antibody protein to be purified by the purification method according to the embodiment.
  • Antibody proteins can also be classified by origin.
  • the antibody protein to be purified by the purification method according to the embodiment is any of a natural human antibody protein, a recombinant human antibody protein produced by gene recombination technology, a monoclonal antibody protein, and a polyclonal antibody protein. May be.
  • human IgG is preferable from the viewpoint of demand and importance as an antibody drug, but is not limited thereto.
  • the cation exchange chromatography carrier includes a membrane substrate and a copolymer fixed on the surface of the membrane substrate, and the copolymer is a (meth) acrylamide compound as a monomer unit. And / or a (meth) acrylate compound, the density per volume of the carrier being higher than 30 mmol / L, preferably higher than 40 mmol / L, more preferably higher than 45 mmol / L, more preferably higher than 100 mmol / L. At high density, it has one or more kinds of cation exchange groups including at least a weak cation exchange group.
  • a (meth) acrylamide compound is a monomer or monomer unit having acrylamide as a basic skeleton, and may be hydrophilic or hydrophobic depending on the structure other than the basic skeleton.
  • the “(meth) acrylate compound” is a monomer or a monomer unit having an acrylate as a basic skeleton, and may be hydrophilic or hydrophobic depending on the structure other than the basic skeleton.
  • Density means the concentration of cation exchange groups in a cation exchange chromatography support, generally expressed as the concentration in moles of cation exchange groups per liter of cation exchange chromatography support. “Cation” is also expressed as a cation, and “anion” is also expressed as an anion. The “support” is also expressed as an exchanger, an adsorbent, and a stationary phase.
  • the shape of the membrane substrate provided in the cation exchange chromatography carrier according to the embodiment is not particularly limited, but the shape is hollow fiber, flat membrane, nonwoven fabric, monolith, capillary, sintered body, disc or A cylindrical shape etc. are mentioned.
  • the material is not particularly limited, but it is preferably composed of a polyolefin polymer, polyamide (nylon), polyester, polyethersulfone, cellulose or the like.
  • polyolefin polymers include olefin homopolymers such as ethylene, propylene, butylene, and vinylidene fluoride, two or more types of copolymers of these olefins, or one or more types of olefins, and perhalogenated compounds. Examples thereof include copolymers with olefins. Examples of the perhalogenated olefin include tetrafluoroethylene and / or chlorotrifluoroethylene. Among these, polyethylene or polyvinylidene fluoride is preferable because it is excellent in mechanical strength and can provide a high adsorption capacity for contaminants such as proteins.
  • the polyamide is not particularly limited, but nylon 6 ( ⁇ -caprolactam polycondensate), nylon 11 (undecanactam polycondensate), nylon 12 (lauryl lactam polycondensate), nylon 66 (hexacondensate).
  • the polyester is not particularly limited, and examples thereof include polyethylene terephthalate, polytrimethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, polyethylene naphthalate, and polybutylene na
  • the film substrate has, for example, a plurality of pores.
  • the pore diameter is not particularly limited, but when the substrate is in the form of a hollow fiber, it is, for example, 5 nm to 1000 nm, preferably 10 nm or more, more preferably 50 nm or more, further preferably 100 nm or more, particularly preferably 150 nm or more, or It is 400 nm or more.
  • the pore diameter is not particularly limited, but is preferably 900 nm or less, more preferably 800 nm or less, still more preferably 700 nm or less, and particularly preferably 650 nm or less.
  • the pore diameter is 5 nm or less, the molecular weight of the separable antibody protein tends to be low. Further, when the pore diameter is 1000 nm or more, the surface area of the film-like substrate is reduced, and the binding capacity of impurities tends to be reduced.
  • a pore diameter of about 400 nm or more and 650 nm or less is preferable.
  • the pore size is suitable.
  • the range becomes wider.
  • a preferable range is 10 nm or more and 1 mm or less, preferably 100 nm or more, more preferably 200 nm or more, and further preferably 300 nm or more.
  • the pore diameter is preferably 500 ⁇ m or less, more preferably 300 ⁇ m or less, and still more preferably 100 ⁇ m or less.
  • the cation exchange chromatography carrier according to the embodiment has at least a weak cation exchange group and one or more kinds of cation exchange groups at a density higher than 30 mmol / L per volume of the carrier.
  • Weak cation exchange groups include carboxylic acid groups, phosphonic acid groups, and phosphoric acid groups.
  • the weak cation exchange group can change the amount of charge depending on the pH of the mobile phase. Therefore, the charge density of the cation exchange chromatography carrier can be adjusted by changing the pH of the mobile phase.
  • a method for introducing a weak cation exchange group there is a method of copolymerizing a monomer having a weak cation exchange group.
  • monomers include acrylic acid, methacrylic acid, acrylic acid compounds, and methacrylic acid compounds.
  • acrylic acid compounds include 2-acryloxyethyl succinic acid, 2-acryloyloxyethyl hexahydrophthalic acid, and 2-acryloyloxyethyl phthalic acid.
  • the methacrylic acid compound include 2-methacryloxyethyl succinic acid, 2-methacryloyloxyethyl hexahydrophthalic acid, and 2-methacryloyloxyethyl phthalic acid.
  • a weak cation exchange group may be introduced by copolymerizing a monomer that can be converted into a weak cation exchange group and then converting the functional group.
  • functional groups include esters, and examples include monomers such as t-butyl acrylate, t-butyl methacrylate, benzyl acrylate, benzyl methacrylate, allyl acrylate, and allyl methacrylate. These can be used as monomers for copolymerization and then deprotected under acidic conditions to convert them into carboxylic acid groups.
  • the cation exchange chromatography carrier according to the embodiment may have a strong cation exchange group or a strong cation exchange group as long as it has at least one kind of weak cation exchange group. It is only necessary to have weak cation exchange groups, and the total density of the cation exchange groups is sufficient if the density per volume of the carrier is higher than 30 mmol / L.
  • strong cation exchange groups include sulfonic acid groups.
  • the total density of cation exchange groups is lower than 30 mmol / L, the amount of cation exchange groups that can be charged tends to be small, the adsorption capacity is low, and the amount of antibody that can be processed tends to be low.
  • Patent Document 3 by using a strong cation exchange group and setting the density of the cation exchange group to 30 mmol / L or less, the selectivity of the antibody monomer and the aggregate in the flow-through purification is expressed.
  • the density of the cation exchange group is low, the adsorption capacity is small and the amount of antibody that can be processed is small.
  • the density of the cation exchange group is 30 mmol / L or less, the chargeable amount range is narrowed, and the applicable antibody species tend to be narrowed.
  • the density per unit volume of the carrier in the total of cation exchange groups may be higher than 30 mmol / L.
  • the density of weak cation exchange groups is 5 mol / L or more, preferably 10 mol / L or more. If it is preferably 15 mmol / L or more, the charge density can be adjusted.
  • at least a weak cation exchange group is present at a density lower than 1000 mmol / L, preferably lower than 700 mmol / L, more preferably lower than 500 mmol / L, more preferably lower than 400 mmol / L per volume of the carrier.
  • the carrier may have one or more kinds of cation exchange groups. When the total density of the cation exchange groups is within this range, the target protein aggregate can be efficiently separated.
  • the copolymer included in the cation exchange chromatography carrier according to the embodiment is fixed to a membrane substrate, and is fixed to the membrane substrate by, for example, a covalent bond.
  • the carrier only needs to have at least a weak cation exchange group and one or more kinds of cation exchange groups so that the density finally becomes higher than 30 mmol / L.
  • graft polymerization As a method for fixing the copolymer to the film substrate.
  • examples of the graft polymerization method include a radiation graft polymerization method and a surface living radical polymerization method.
  • any means can be employed to generate radicals on the film substrate, but when the film substrate is irradiated with ionizing radiation This is preferable because uniform radicals are generated on the entire film-like substrate.
  • ionizing radiation ⁇ rays, electron beams, ⁇ rays, neutron rays and the like can be used.
  • electron beams or ⁇ rays are preferable for implementation on an industrial scale.
  • the ionizing radiation is obtained from radioactive isotopes such as cobalt 60, strontium 90, and cesium 137, or by an X-ray imaging apparatus, an electron beam accelerator, an ultraviolet irradiation apparatus, or the like.
  • the irradiation dose of ionizing radiation is preferably 1 kGy or more and 1000 kGy or less, more preferably 2 kGy or more and 500 kGy or less, and further preferably 5 kGy or more and 200 kGy or less. If the irradiation dose is less than 1 kGy, radicals tend not to be generated uniformly. Moreover, when the irradiation dose exceeds 1000 kGy, the physical strength of the film-shaped substrate tends to be reduced.
  • radicals are generally generated on a film-like substrate, and then a pre-irradiation method in which the radical is brought into contact with the reactive compound, and the film-like substrate is brought into contact with the reactive compound. And a simultaneous irradiation method in which radicals are generated on a film-like substrate in a state.
  • any method can be applied, but a pre-irradiation method with less oligomer formation is preferable.
  • the solvent used in the polymerization of the copolymer is not particularly limited as long as the reactive compound can be uniformly dissolved.
  • a solvent include alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol and t-butyl alcohol, ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran, ketones such as acetone and 2-butanone, water, or a mixture thereof. Can be mentioned.
  • the copolymer contains, in addition to the monomer unit having a cation exchange group, one or more compounds of acrylamides, methacrylamides, acrylates, and methacrylates as monomer units.
  • the copolymer may consist only of a combination of acrylamides, methacrylamides, acrylates and methacrylates, or may consist only of methacrylates.
  • the copolymer may contain one or more kinds of hydrophilic and / or hydrophobic compounds, which are neutral monomers having no charge, as monomer units. These monomer units are stable with respect to general acid and base conditions for washing cation exchange chromatography, are unlikely to deteriorate in performance due to washing, and tend not to lower the strength of the membrane.
  • hydrophilic and / or hydrophobic monomers By copolymerizing these hydrophilic and / or hydrophobic monomers with a monomer having a cation exchange group, it is considered that the distance between the cation exchange groups is increased and the antibody aggregate is more easily adsorbed more selectively.
  • monomer units include, for example, acrylonitrile. Since acrylonitrile is easily hydrolyzed by alkali, it is preferable to use acrylonitrile as a monomer unit because performance tends to be impaired by alkali cleaning. Absent. Also, monomer units containing aromatics such as styrenes are not preferred because they tend to harden the film and become brittle.
  • the mass ratio of the hydrophilic monomer unit and / or the hydrophobic monomer unit, which is a neutral monomer is a cation. It is preferably higher than the mass ratio of the monomer unit having exchange, more preferably 2 times or more, and further preferably 3 times or more.
  • the mass of the monomer having a cation exchange group and the mass of the neutral monomer are determined as follows. I can do it.
  • (Cation exchange group monomer mass) (Cation exchange group density x carrier volume x cation exchange group monomer molecular weight)
  • (Mass of neutral monomer) (Cation exchange carrier mass-substrate carrier mass-cation exchange group monomer mass) From these mass ratios, the mass proportion of monomer units having a cation exchange group and the mass proportion of neutral monomer units can be determined.
  • the antibody since the antibody has a property of hydrophobic interaction, if the membrane substrate is highly hydrophobic, the antibody is adsorbed on the membrane substrate due to the hydrophobic interaction, and the recovery rate of the target antibody is reduced. Sometimes. For this phenomenon, it is possible to prevent the antibody from adsorbing to the membrane substrate by introducing a hydrophilic monomer during the polymerization of the copolymer.
  • hydrophilic monomers examples include acrylamide, methacrylamide, and dimethylacrylamide, dimethylmethacrylamide, diethylacrylamide, diethylmethacrylamide, N-methylacrylamide, N-methylmethacrylamide, N-ethylacrylamide, N-ethylmethacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N- (hydroxymethyl) acrylamide, N- (hydroxymethyl) methacrylamide, N- (2-hydroxyethyl) acrylamide, N- (2-hydroxyethyl) methacrylamide, etc.
  • the (meth) acrylamide compound of this is mentioned.
  • hydrophilic monomer as described above, acrylate, methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, 3-hydroxypropyl acrylate, 3-hydroxypropyl methacrylate, 4-hydroxybutyl acrylate, 4-hydroxy And (meth) acrylate compounds such as butyl methacrylate, 2- (dimethylamino) ethyl acrylate, and 2- (dimethylamino) ethyl methacrylate.
  • the adsorption selectivity of the antibody aggregate to the antibody monomer can be increased by introducing a hydrophobic monomer during polymerization of the copolymer and utilizing the hydrophobic interaction.
  • a hydrophobic monomer exhibit stronger hydrophobic interactions than antibody monomers.
  • hydrophobic monomers include styrenes, alkyl acrylamides, alkyl methacrylamides, alkyl acrylates, and alkyl methacrylates.
  • alkyl acrylamides, alkyl methacrylamides, alkyls, etc. Acrylates and alkyl methacrylates are desirable.
  • alkyl group a linear or branched alkyl group having 4 or more carbon atoms can substantially exhibit a hydrophobic interaction with the antibody.
  • the copolymer does not include a monomer unit including two or more polymerizable functional groups, and may not have a crosslinked structure.
  • the copolymer may include a monomer unit containing two or more polymerizable functional groups in the monomer unit, and may have a crosslinked structure.
  • it is preferable that the copolymer has a substantially non-crosslinked structure. “Substantially non-cross-linked” means that the degree of cross-linking is low enough that it does not affect the adsorption performance of antibody aggregates even if it has a cross-linked structure.
  • the mass ratio of the monomer unit containing two or more polymerizable functional groups is, for example, 10% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less. 1% or less, 0.5% or less, or 0.1% or less, and the lower the better.
  • the monomer containing two or more polymerizable functional groups in the monomer is not particularly limited, and examples of the polymerizable functional group include olefins.
  • examples of such a monomer include a (meth) acrylamide monomer, a (meth) acrylate monomer, and a monomer mixed with these functional groups.
  • (Meth) acrylamide monomers include N, N'-methylenebisacrylamide, N, N'-ethylenebisacrylamide, N, N'-propylenebisacrylamide, N, N '-(1,2-dihydroxyethylene) bis Acrylamide, N, N'-methylenebismethacrylamide, N, N'-ethylenebismethacrylamide, N, N'-propylenebismethacrylamide, N, N '-(1,2-dihydroxyethylene) bismethacrylamide, etc. Is mentioned.
  • (Meth) acrylate monomers include ethylene glycol diacrylate, 1,3-butanediol diacrylate, 1,4-butanediol diacrylate, 1,5-pentanediol diacrylate, 1,6-hexanediol diacrylate, 1,9-nonanediol diacrylate, 1,10-decanediol diacrylate, neopentyl glycol diacrylate, diethylene glycol diacrylate, triethylene glycol diacrylate, polyethylene glycol diacrylate, dipropylene glycol diacrylate, tripropylene glycol diacrylate 2-hydroxy-1,3-propanediol diacrylate, 4,4′-thiodibenzenethiol diacrylate, trimethylol proppant Acrylate, pentaerythritol tetraacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, 1,3-butanediol dimethacrylate, 1,4-butane
  • the graft chain bonding rate (graft rate) by graft polymerization may vary depending on the density of the base film.
  • the substrate film is polyethylene, it is preferably 20% or more from the viewpoint of adsorption capacity, more preferably 25% or more, and further preferably 30% or more. Further, from the viewpoint of ensuring a mechanically stable strength, it is preferably 200% or less, more preferably 150% or less, and still more preferably 100% or less.
  • w 0 is the weight of the porous hollow fiber before the reaction
  • w 1 is the weight of the porous hollow fiber into which the graft chain is introduced.
  • the density of the polyvinylidene fluoride is higher than that of polyethylene, so the appropriate graft ratio is different from that of polyethylene.
  • the substrate film is polyvinylidene fluoride, it is preferably 5% or more, more preferably 10% or more, and further preferably 15% or more from the viewpoint of adsorption capacity. Further, from the viewpoint of ensuring a mechanically stable strength, it is preferably 100% or less, more preferably 80% or less, and even more preferably 70% or less.
  • the copolymer having a cation exchange group since the copolymer having a cation exchange group is fixed to the membrane substrate, it can be adsorbed three-dimensionally compared to the case where the cation exchange group is distributed on the membrane substrate surface. It becomes. Therefore, the antibody aggregate is more strongly adsorbed to the substrate than the antibody monomer, and the antibody monomer can be obtained with high purity. Therefore, it is preferable that the copolymer has at least a weak cation exchange group and one or more kinds of cation exchange groups.
  • the copolymer has a crosslinked structure, there is a merit that the passage pressure is suppressed by suppressing the rising of the copolymer, but it prevents the antibody aggregate from adsorbing to the base material three-dimensionally. Therefore, the copolymer has a substantially non-crosslinked structure from the viewpoint of adsorbing antibody aggregates more strongly than antibody monomers and making it possible to obtain antibody monomers with high purity. It is desirable that
  • the copolymer expands and contracts, making it impossible to three-dimensionally adsorb antibody aggregates.
  • a certain level of content is required.
  • the mass ratio of the hydrophilic monomer in such a copolymer is preferably 30% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 50% or more, and particularly preferably 60% or more.
  • it is desirable that the ratio of the hydrophilic monomer is higher than the mass ratio of the hydrophobic monomer.
  • it is 1.3 times or more, More preferably, it is 1.5 times or more, More preferably, it is 1.7 times or more, Most preferably, it is 1.9 times or more.
  • the mass fraction of hydrophilic and hydrophobic monomers can be detected from the final product by pyrolysis GC / MS. Alternatively, it can be calculated that the composition ratio matches the composition ratio at the time of synthesis. In the case of graft polymerization, the mass ratio of the hydrophilic monomer in the copolymer is the mass ratio of the hydrophilic monomer in all the monomers at the time of preparation.
  • the total cation exchange group density which is the sum of the strong cation exchange group density and the weak cation exchange group density
  • all the cation exchange groups are protonated using a strong acid, etc., then neutralized with a base, and back titration is performed.
  • a method for measuring the density of strong cation exchange groups for example, after protonating all strong cation exchange groups with a strong acid or the like, it is measured by adding an aqueous sodium chloride solution and titrating the eluted hydrogen chloride. It is possible.
  • the weak cation exchange group density can be determined by subtracting the strong cation exchange group density from the total cation exchange group density.
  • a purification method is a purification method for purifying a protein monomer from a mixed solution containing a protein monomer and a protein aggregate, and the above-described cation exchange chromatography carrier, Contacting the mixed solution.
  • the recovery rate of the protein monomer by the above-described cation exchange chromatography carrier is, for example, 78% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more. 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the recovery rate of the target protein monomer is calculated based on the following formula.
  • the treatment amount of the aqueous solution containing the target protein is the total amount of the aqueous solution containing the target protein introduced into the cation exchange chromatography carrier.
  • Recovery rate of target protein (%) (recovered amount of target protein aqueous solution (mL) ⁇ content of target protein monomer in recovered aqueous solution (mg / mL)) / (treatment amount of aqueous solution containing target protein (mL)) ⁇ Content of target protein monomer in aqueous solution before treatment (mg / mL) ⁇ 100
  • Flow-through refers to a purification method in which the target protein monomer is intended to flow through the cation exchange chromatography carrier.
  • the antibody protein monomer when the antibody protein monomer is the target and the antibody protein aggregate is an impurity, the antibody protein monomer generally flows over the surface of the cation exchange chromatography carrier, and the antibody protein aggregate is generally cationic. Adsorbed on exchange chromatography support. At this time, the antibody protein monomer may be adsorbed to the cation exchange chromatography carrier, but the antibody protein aggregate is more selectively adsorbed to the adsorbent so that the antibody protein monomer is adsorbed. Purified.
  • a buffer solution other than a strong acid or strong alkali may be used, and an organic solvent is not required.
  • the buffer solution is an aqueous solution containing salts, and specifically includes a phosphate buffer solution, a Tris buffer solution, an acetate buffer solution, and the like. Is not to be done.
  • the concentration of the salt is 0 mmol / L or more and 100 mmol / L or less, preferably 0 mmol / L or more and 50 mmol / L or less, more preferably 0 mmol / L or more and 30 mmol / L or less.
  • the buffer concentration is 1 mmol / L or more and 100 mmol / L or less, preferably 2 mmol / L or more and 70 mmol / L or less, more preferably 5 mmol / L or more and 50 mmol / L or less.
  • the buffer concentration means the concentration of the active ingredient in the buffer.
  • an acetic acid buffer is usually prepared from acetic acid and sodium acetate, and is the total concentration of acetic acid and sodium acetate at that time.
  • Tris buffer it means the concentration of trishydroxymethylaminomethane.
  • the buffer expressed as acetic acid-Tris buffer is the former concentration, and acetic acid-Tris is acetic acid, and Tris-acetic acid is the concentration of Tris.
  • a solution having a pH with little buffer capacity for example, an acetic acid buffer solution having a pH of 3.4
  • the concentration of the inorganic salts in the buffer solution is higher than 100 mmol / L, the degree of detachment of the ion exchange groups tends to be low, and the cation exchange chromatography carrier tends to be difficult to retain impurities such as aggregates.
  • the electrical conductivity of the aqueous solution containing the target protein is 0.5 mS / cm or more and 20 mS / cm or less, more preferably 0.5 mS / cm or more and 15 mS / cm or less, and further preferably 0.5 mS / cm or more and 10 mS / cm or less. cm or less, particularly preferably 0.8 mS / cm or more and 5.0 mS / cm or less.
  • the electric conductivity exceeds 20 mS / cm, the shielding effect becomes large, and it tends to be difficult for the cation exchange chromatography support to retain impurities such as aggregates.
  • the hydrogen ion concentration of the buffer varies depending on the isoelectric point and size of the antibody protein to be processed, and it is necessary to appropriately examine the optimum conditions.
  • the pH is 4.0 to 10.0, and preferably 5
  • the pH is not less than 0.0 and not more than 9.5, more preferably not less than 6.0 and not more than 9.0, and particularly preferably not less than 6.5 and not more than 8.0.
  • the electrostatic repulsion between the antibody proteins decreases and tends to aggregate.
  • the pH is lower than 4.0, the antibody protein is denatured and tends to cause a reduction in quality such as a decrease in activity and purification of aggregates.
  • the amount of antibody load in the cation exchange chromatography step is not particularly limited as long as impurities can be removed, but is 100 mg or more per mL of carrier, and from the viewpoint of efficient purification, 300 mg or more per mL of carrier is preferable, more preferably 500 mg. Above, more preferably 700 mg or more, still more preferably 0.8 g or more, particularly preferably 1 g or more.
  • the ratio of the antibody aggregate is reduced by 50% or more, more preferably 60% or more, More preferably, it is reduced by 70% or more.
  • the purified solution of monomer obtained in the purification step is introduced into a virus removal membrane having a virus log removal rate of 3 or more.
  • a virus removal membrane having a virus log removal rate of 3 or more.
  • an aggregate may be formed from the monomer. Therefore, it is preferable not to include other steps between the purification step and the virus removal step. Moreover, an aggregate may be formed from a monomer with progress of time. Therefore, it is preferable to introduce the monomer purification solution obtained in the purification step into the virus removal membrane immediately without storing it.
  • the purification step and the virus removal step may be performed in a continuous process.
  • the virus removal membrane is not particularly limited as long as the virus log removal rate is 3.00 or more.
  • the virus removal membrane disclosed in International Publication No. 2003/026779, International Publication No. 2004/035180, International Publication No. 2015/156401, and International Publication No. 2015/156403 can be used.
  • the virus removal membrane 10 includes a primary-side surface 1 to which a solution containing protein is supplied, and a secondary-side surface from which the permeate that has permeated the virus removal membrane 10 is discharged. 2 and.
  • the small virus removed by the virus removal film 10 has a diameter of, for example, 10 to 30 nm, or 18 to 24 nm.
  • a specific example of the virus is parvovirus. Parvovirus has a diameter of about 20 nm.
  • the virus removal membrane 10 has a virus capture site where the virus is captured in its cross section. In the virus removal membrane 10, it is preferable that the amount of virus trapped at the virus trapping site is uniform in the cross section regardless of the location on the filtration surface (primary side surface 1) through which the solution enters. This is because, when the virus trapping amount of the virus removal membrane 10 is non-uniform depending on the location on the filtration surface, the solution concentrates on a certain location on the filtration surface, and the virus load on that location partially.
  • the virus removal membrane 10 has a hollow fiber membrane shape, the amount of virus trapped at the virus trapping site is not uneven as shown in FIG. It is preferable that it is uniform.
  • the thickness of the site where the virus is captured is uniform within the virus capture site.
  • the virus removal membrane 10 has a hollow fiber membrane shape, it is preferable that the thickness of the virus capturing site is uniform in the circumferential direction. This is because if the thickness of the virus-capturing site is uniform, the solution spreads uniformly in the circulation direction and the possibility of virus leakage decreases.
  • the structure of the virus removal membrane 10 is preferably an asymmetric structure that starts to increase after the pore diameter decreases from the primary side to the secondary side.
  • the virus capturing site includes a site where the pore diameter is minimum.
  • a structure including a site where the pore diameter is minimum is effective in improving virus removability.
  • colloidal gold is easy to visually detect because it has the same diameter as a virus but does not transmit light. Therefore, for example, after the solution containing the gold colloid is filtered through the virus removal film 10, the relative luminance of the gold colloid capturing portion of the virus removal film 10 that has captured the gold colloid in the cross section of the virus removal film 10 is measured. Thus, the characteristics of the virus removal film 10 can be evaluated.
  • a solution containing a gold colloid with a diameter of 20 nm is supplied from the primary surface 1 to the virus removal membrane 10 to capture the gold colloid with the virus removal membrane 10.
  • the value obtained by dividing the standard deviation of the area value of the luminance displacement spectrum by the average value of the area value of the luminance displacement spectrum is 0.01 or more and 1.50 or less. This value indicates the coefficient of variation of the amount of gold colloid trapped in the virus removal membrane 10, and the smaller the value, the higher the uniformity of the gold colloid trapping amount at the gold colloid trapping site in the virus removal membrane 10. .
  • the values indicating the coefficient of variation are 0.01 or more and 1.50 or less, 0.01 or more and 1.40 or less, 0.01 or more and 1.30 or less, 0.01 It is 1.20 or less, 0.01 or more and 1.10 or less, or 0.01 or more and 1.00 or less.
  • less than 0.01 is the measurement limit.
  • the coefficient of variation is greater than 1.50, the solution may concentrate in at least one place in the circulation direction of the membrane, and thus viruses may leak.
  • the virus is uniformly trapped at the virus trapping site of the membrane (circular direction for the hollow fiber membrane), and the virus is loaded on the virus removal membrane. High virus removal performance can be maintained even when the total amount (spike amount or total filtration amount of the virus protein preparation) is increased.
  • the above coefficient of variation is measured, for example, by the following method.
  • a section is cut out from the virus removal membrane after the colloidal gold solution is filtered, and the luminance profile of a plurality of portions of the section stained with the gold colloid is measured with an optical microscope. Since colloidal gold absorbs light, the luminance displacement depends on the amount of colloidal gold captured. Note that background noise may be removed from the luminance profile as necessary. Thereafter, a graph having a film thickness on the horizontal axis and a luminance displacement on the vertical axis is created, and the area of the spectrum of the luminance displacement appearing on the graph is calculated.
  • the value obtained by dividing the standard deviation of the area of the luminance displacement spectrum at a plurality of locations by the average of the area of the luminance displacement spectrum at the plurality of locations is the amount of gold colloid trapped at the gold colloid capturing site in the virus removal film 10. Is calculated as a value indicating the coefficient of variation.
  • the thickness of the site for capturing the gold colloid having a diameter of 20 nm to 30 nm is 10.0 ⁇ m to 30.0 ⁇ m, 10.0 ⁇ m to 25.0 ⁇ m, 10.0 ⁇ m or more. 22.0 ⁇ m or less, 10.0 ⁇ m or more and 20.0 ⁇ m or less, preferably 11.0 ⁇ m or more and 20.0 ⁇ m or less, more preferably 12.0 ⁇ m or more and 20.0 ⁇ m or less, and further preferably 13.0 ⁇ m or more and 20.0 ⁇ m or less. .
  • the thickness of the colloidal gold capture site is larger than 30.0 ⁇ m, not only the colloidal gold-containing solution but also the filtration efficiency of the virus-containing solution tends to decrease.
  • the thickness is less than 10 ⁇ m, the virus may leak when the total amount of virus loaded on the virus removal membrane (the spike amount or the total filtration amount with respect to the virus protein preparation) increases, which is not preferable.
  • the thickness of the colloidal gold capture site having a diameter of 20 nm or more and 30 nm or less is obtained by, for example, the following method.
  • a section is cut out from a virus removal membrane obtained by filtering a colloidal gold solution having a diameter of 20 nm and 30 nm, respectively.
  • the luminance profile of a plurality of portions stained with colloidal gold in the section of the section is measured with an optical microscope.
  • a first distance a from the primary surface 1 of the virus removal film 10 to a portion closest to the primary surface of the gold colloid capturing site is measured.
  • a second distance b from the primary surface 1 of the virus removal membrane 10 to the portion closest to the secondary surface 2 of the gold colloid capture site is measured.
  • the average value of the values A is calculated as the first achievement level.
  • the average value of B is calculated as the second achievement level.
  • a value obtained by multiplying the average value CAVE of the average value C30 of the film thickness is 20 nm to 30 nm. It is calculated as the thickness T of the site where the gold colloid is captured.
  • the thickness T of the colloidal gold capture site is also expressed as the thickness T of the dense layer of the virus removal membrane.
  • the colloidal gold capturing site having a diameter of 20 nm or more and a diameter of 30 nm or less, the first arrival position in the virus removal film obtained by filtering the gold colloid having a diameter of 30 nm, and the virus removal film obtained by filtering the gold colloid having a diameter of 20 nm It is calculated as the thickness of the region between the second arrival position and the gold colloid with a diameter of 20 nm or more and 30 nm or less except for the error range, and confirmed that it is captured in the above range. is doing.
  • the site where the gold colloid with a diameter of 30 nm is captured in the cross section of the virus removal membrane 10 in a wet state is measured with an optical microscope. From the surface 1 on the primary side, it is 15% to 60% or less, or 20% to 55% of the film thickness. In a film where gold colloid with a diameter of 30 nm is captured from the primary surface at a site of less than 15% of the film thickness, viruses and impurities are captured near the primary surface of the film, which may cause clogging. Increases nature.
  • the target virus is captured at a position close to the secondary surface of the film, and the virus May not be captured.
  • a constant (255) can be obtained by observation with an optical microscope. If the absolute value of the spectrum is 10% or less of the maximum value of the absolute value of the spectrum, the displacement of the luminance obtained by subtracting the luminance profile measured from The capture of colloidal gold can be regarded as within error. Therefore, in this case, the site where the gold colloid with a diameter of 30 nm is captured can be regarded as being 15% to 60% of the film thickness from the surface 1 on the primary side.
  • the site where the gold colloid is captured is intermittently different from the case where the gold colloid is continuously formed in the thickness direction depending on the film structure when the gold colloid is passed from the primary side surface to the secondary side surface in the film thickness direction. May be formed.
  • the site where the gold colloid is captured is continuously formed from the inner side of the primary side surface to the inner side of the secondary side surface. If the site where the gold colloid is captured in the liquid passing direction is continuously formed without interruption, clogging is less likely to occur.
  • the site where the gold colloid with a diameter of 20 nm is captured in the cross section of the virus removal membrane 10 in a wet state is measured with an optical microscope. It is 25% or more and 85% or less, or 30% or more and 80% or less of the film thickness from the surface 1 on the primary side.
  • viruses and impurities are captured at a position close to the primary surface of the film, which may cause clogging. Increases nature.
  • the target virus is captured at a position close to the secondary surface of the film, and the virus May not be captured.
  • a gold colloid with a diameter of 30 nm even if the gold colloid is observed in a region less than 25% or more than 85% of the film thickness from the surface 1 on the primary side, a constant is obtained by observation with an optical microscope.
  • the luminance displacement obtained by subtracting the luminance profile measured from (255) if the absolute value of the spectrum is 10% or less of the maximum value of the absolute value of the spectrum, it can be regarded as within the error range.
  • the site where the gold colloid with a diameter of 20 nm is captured may be continuously formed in the film thickness direction from the inner surface of the primary side to the inner surface of the secondary side. preferable.
  • the site where the gold colloid with a diameter of 15 nm is captured in the cross section of the virus removal membrane 10 in a wet state is measured with an optical microscope. It is 60% or more and 90% or less, preferably 60% or more and 89% or less, 60% or more and 88% or less, and 60% or more and 87% or less of the film thickness from the surface 1 on the primary side. In particular, it is preferably 87% or less in capturing viruses. Furthermore, it is more preferable that it is 86% or less.
  • viruses and impurities are captured at a position close to the primary surface of the film, which may cause clogging. Becomes higher.
  • the target virus is captured at a position close to the secondary side surface of the film, and the virus is May not be captured.
  • the site layer where the gold colloid with a diameter of 15 nm is captured is continuously formed in the film thickness direction from the inner surface of the primary side to the inner surface of the secondary side. Is preferred.
  • the measurement is performed only for the gold colloid captured on the film. Therefore, the gold colloid that was not captured by the membrane and permeated through the membrane was not measured. That is, the capture position is not measured for all the gold colloids permeated through the film, but the capture position on the film is measured for the gold colloid captured by the film.
  • the gold colloid with a diameter of 10 nm is hardly captured on the cross section of the virus removal membrane 10. This can be confirmed from the fact that the luminance spectrum cannot be detected as a significant value by observation using an optical microscope (Biozero, BZ8100, manufactured by Keyence Corporation). It can also be confirmed from the fact that the logarithmic removal rate is low. In addition, the fact that gold colloid having a diameter of 10 nm is not captured indicates that high permeability of useful proteins such as IgG having a diameter of about 10 nm can be achieved.
  • the material of the virus removal membrane 10 is made of cellulose.
  • cellulose regenerated cellulose, natural cellulose, cellulose acetate and the like can be used.
  • the method for producing regenerated cellulose include a method of preparing from a copper ammonia cellulose solution (copper ammonium method) and a method of preparing cellulose acetate by saponification with alkali (saponification method).
  • the material of the virus removal film 10 may be a synthetic polymer such as a thermoplastic crystalline resin.
  • a thermoplastic crystalline resin from the viewpoint of the balance between heat resistance and molding processability, polyolefin resins and fluororesins are preferred.
  • the hydrophobic thermoplastic crystalline resin is preferably imparted with hydrophilicity because it may cause protein adsorption, membrane contamination, membrane clogging, and the like.
  • a hydrophilic graft chain may be imparted to a film made of a hydrophobic thermoplastic crystalline resin by a graft polymerization method.
  • the virus removal membrane 10 has, for example, a hollow fiber membrane shape.
  • the virus removal membrane 10 may have a flat membrane shape as shown in FIG. If it is a hollow fiber membrane, even if the membrane area is large, it is possible to make a small filter by loading the membrane into a container.
  • the film thickness of the virus removal membrane 10 shown in FIG. 1 is, for example, 24 ⁇ m or more and 41 ⁇ m or less in a dry state, preferably 24 ⁇ m or more and 40 ⁇ m or less, more preferably 24 ⁇ m or more and 35 ⁇ m or less, and even more preferably 24 ⁇ m or more. 30 ⁇ m or less. If the film thickness is less than 24 ⁇ m, the strength of the film may be reduced, and the filtration pressure may not be able to be tolerated. If the film thickness is greater than 41 ⁇ m, the filtration rate may be decreased.
  • the average pore diameter of the pores of the virus removal membrane 10 is, for example, 13 nm or more and 21 nm or less, preferably 13 nm or more and 20.5 nm or less, more preferably 13.5 nm or more and 20.5 nm or less. If the average pore size is smaller than 13 nm, the filtration rate may decrease, and if it is larger than 21 nm, the virus may leak. In the cross section of the virus removal film 10, the pore diameter decreases from decreasing to increasing from the primary side to the secondary side. For example, in the cross section of the virus removal film 10, the virus capturing site includes a site where the pore diameter is minimum.
  • the pore diameter may be constant after decreasing from the primary side to the secondary side, and the densest layer may be provided near the surface on the secondary side.
  • the logarithmic removal rate (LRV) of the virus by the virus removal membrane 10 is, for example, 3.00 or more, preferably 4.00 or more, the virus is sufficiently removed by membrane filtration, 4.50 or more, If it is 5.00 or more or 6.00 or more, it is more preferable. If the logarithmic removal rate of the virus is 6.00 or more, it is considered that the virus is removed and the virus hardly leaks.
  • the logarithmic removal rate (LRV) of the gold colloid with a diameter of 30 nm by the virus removal film 10 is, for example, 1.00 or more, preferably 1.20 or more.
  • the logarithmic removal rate of the gold colloid having a diameter of 20 nm by the virus removal film 10 is, for example, 1.00 or more, preferably 1.20 or more.
  • the logarithmic removal rate of the gold colloid having a diameter of 15 nm by the virus removal film 10 is, for example, 0.10 or more, preferably 0.15 or more, more preferably 0.20 or more.
  • the logarithmic removal rate of the colloidal gold having a diameter of 10 nm by the virus removal film 10 is, for example, less than 0.10.
  • the colloidal gold capture site includes a site where the pore diameter is minimized.
  • the bubble point measured by the virus removal film 10 is, for example, 1.2 MPa or more and 1.8 MPa or less.
  • the pure water permeation rate measured by the virus removal membrane 10 is 30 L / m 2 /hrs/0.1 MPa or more and 120 L / m 2 /hrs/0.1 MPa or less, 40 L / m 2 /hrs/0.1 MPa or more and 115 L / m 2 / hrs. /0.1 MPa or less, or 50 L / m 2 /hrs/0.1 MPa or more and 110 L / m 2 /hrs/0.1 MPa or less.
  • the virus removal membrane according to the embodiment having the characteristics described above is manufactured, for example, by the method described below.
  • cellulose is dissolved in a copper ammonia solution, and a cellulose copper ammonia solution having a cellulose concentration of, for example, about 7.0 wt% or more and about 8.0 wt% or less.
  • an inorganic salt is added thereto to obtain a spinning dope.
  • the inorganic salt may be added before the cellulose is dissolved in the copper ammonia solution.
  • inorganic salts sodium, potassium, calcium, and magnesium sulfates, sulfites, and carbonates can be used.
  • sodium and potassium sulfates and sulfites are preferred, and sodium sulfate and sodium sulfite are more preferred.
  • the addition amount of the inorganic salt is 0.02% by weight or more and 0.90% by weight or less, 0.03% by weight or more and 0.80% by weight or less, or 0.04% by weight or more and 0.70% by weight or less.
  • microphase separation can be performed on a cellulose copper ammonia solution which does not have a hydroxyl group, has a solubility in a 28 wt% ammonia aqueous solution of 10 wt% or more, and contains at least one organic solvent which does not swell cellulose.
  • the resulting solution is prepared as a coagulation liquid.
  • the microphase separation will be described later.
  • the coagulation liquid consists of acetone, ammonia, and water.
  • the acetone concentration is about 30 wt% or more and about 50 wt% or less, and the ammonia concentration is about 0.5 wt% or more and about 1.0 wt% or less.
  • the acetone concentration is about 20 wt% or more and about 40 wt% or less, and the ammonia concentration is about 0 wt% or more and about 0.2 wt% or less.
  • the spinning stock solution is discharged from the annular double nozzle at a fixed amount of 1.5 cc / min to 8.0 cc / min, and at the same time, from the central nozzle provided in the center of the annular double nozzle.
  • the coagulation liquid is discharged.
  • the discharged spinning solution and the internal coagulation liquid are immediately immersed in the external coagulation liquid in the coagulation bath.
  • microphase separation occurs in the spinning dope due to the action of the internal and external coagulating liquids.
  • Microphase separation means that a cellulose concentrated phase is separated from a solvent or a cellulose diluted phase as particles having a diameter of 0.01 to several ⁇ m, and dispersed and stabilized.
  • Microphase separation initially occurs at the interface between the spinning dope and the internal and external coagulating liquids, and gradually occurs inside the spinning dope.
  • Particles formed by microphase separation form large particles while repeating collision and fusion.
  • the particles are gradually solidified by the action of the coagulation liquid, and a hollow fiber membrane having a polymer porous structure in which the particles are three-dimensionally connected is formed.
  • the formed hollow fiber membrane is wound up.
  • the flow rate of the spinning solution in the coagulation bath is, for example, 5 m / min to 20 m / min, 8 m / min to 15 m / min, or 9 m / min to 12 m / min. It is.
  • the flow rate of the spinning solution in the coagulation bath is equal to the winding speed (spinning speed) of the formed hollow fiber membrane.
  • the flow rate of the external coagulation liquid fed to the coagulation bath is, for example, 50 cc / min to 500 cc / min, 100 cc / min to 300 cc / min, or 130 cc / min to 200 cc / min.
  • the flow rate of the external coagulation liquid in the coagulation bath obtained by dividing the flow rate of the external coagulation liquid by the cross-sectional area of the narrow tube constituting the coagulation bath is, for example, 1.8 m / min to 10.4 m / min, 3.2 m / Min to 7.8 m / min, or 3.5 m / min to 5.4 m / min.
  • the ratio of the flow rate of the external coagulation liquid to the flow rate of the spinning dope in the coagulation bath is, for example, 0.32 or more and 0.54 or less, or 0.33 or more and 0.53 or less. If the ratio of the flow rate of the external coagulation liquid to the flow rate of the spinning stock solution is within the above range, the absolute values of the flow rate of the spinning stock solution and the flow rate of the external coagulation liquid are arbitrary.
  • the wound hollow fiber membrane is immersed in 2% by weight or more and 10% by weight or less of dilute sulfuric acid, and then washed with pure water. Thereby, cellulose is regenerated. Furthermore, the moisture of the hollow fiber membrane is replaced with an organic solvent. As the organic solvent, methanol, ethanol, acetone and the like can be used. Thereafter, both ends of the hollow fiber membrane bundle are fixed and stretched by 1% to 8%, followed by drying under a reduced pressure of 30 ° C. or higher and 60 ° C. or lower and 5 kPa or lower to remove the hollow fiber membrane-like virus according to the embodiment. A membrane is obtained.
  • the flat membrane-like virus removal membrane is produced by, for example, the following method.
  • An inorganic salt is added to and mixed with the copper ammonia cellulose solution to obtain a film forming solution. Subsequently, the film forming solution is filtered and degassed.
  • the kind of inorganic salt used is the same as described above.
  • the film-forming solution is cast and cast on a support that runs in a coagulation bath to coagulate it.
  • the moving speed of the support is about 1.0 to 10.0 m / min.
  • the formed flat membrane is regenerated with an acid, drawn through an additional water bath, and then dried using a dryer.
  • the casting speed and the moving speed of the coagulation liquid are set to an appropriate relationship. Specifically, the ratio of the moving speed of the coagulating liquid to the moving speed of the support is set within a certain range.
  • the hollow fiber produced by the above-described method and the flat membrane virus removal membrane create a filter in which the primary space on the filtrate inlet side and the secondary space on the filtrate outlet side are partitioned by a membrane. Can be used.
  • the purity of the purified product can be further improved by combining with the anion exchange chromatography step.
  • the target substance is once adsorbed on the carrier and eluted to be purified, so that impurities having a pI higher than the pI of the target substance and a low pI are added. It is possible to remove both impurities.
  • impurities having a pI lower than that of the target substance it may be difficult to remove impurities having a pI lower than that of the target substance.
  • impurities having a lower pI than the target substance can be removed by purification with an anion exchange chromatography support. Therefore, by combining the purification step using the cation exchange chromatography carrier according to this embodiment and the purification step using the anion exchange chromatography carrier, efficient purification can be achieved while maintaining the conventional impurity removal property.
  • Examples of the impurity having a lower pI than the target substance include, but are not limited to, host cell-derived protein (HCP), DNA, and protein A, which is an impurity derived from an affinity chromatography step.
  • HCP host cell-derived protein
  • DNA DNA
  • protein A which is an impurity derived from an affinity chromatography step.
  • the purification step using an anion exchange chromatography carrier may be before or after the purification step using a cation exchange chromatography carrier. However, when other steps are not included between the purification step with the cation exchange chromatography carrier and the virus removal step, or when the purification step with the cation exchange chromatography carrier and the virus removal step are performed in a continuous process, The purification step using an anion exchange chromatography carrier is before the purification step using a cation exchange chromatography carrier.
  • the anion exchange chromatography carrier is not particularly limited, but if it is in the form of a membrane, a high flow rate is possible and a more efficient purification process can be constructed. Further, the anion exchange chromatography carrier may have a structure having a graft polymer chain on the substrate.
  • the structure of the anion exchange chromatography carrier is not particularly limited, but a structure having a graft polymer on a substrate can be adsorbed sterically with impurities, so that higher impurity removability can be expected. .
  • the purification method using an anion exchange chromatography carrier is not particularly limited, but can be more efficiently purified by flow-through purification.
  • the amount of antibody load in the anion exchange chromatography step is not particularly limited as long as impurities can be removed, but from the viewpoint of efficient purification, it is preferably 0.2 g or more, more preferably 0.5 g or more, 1. It is 0 g or more, 2.0 g or more, or 4.0 g or more.
  • Buffer exchange may or may not be performed between the purification step using the anion exchange chromatography carrier and the purification step using the cation exchange chromatography carrier. More efficient purification is possible without buffer exchange.
  • the purification step in the anion exchange chromatography carrier and the purification step in the cation exchange chromatography carrier may be carried out continuously, or once stored in a tank after the previous step, the next step may be carried out. .
  • the pH may be adjusted between the purification step using an anion exchange chromatography carrier and the purification step using a cation exchange chromatography carrier.
  • the pH By adjusting the pH, the removability of impurities having a pI near the former treatment pH becomes higher.
  • impurities can be further removed by adding a base and raising the pH before purification using an anion exchange chromatography support.
  • impurities can be further removed by adding an acid and lowering the pH before purification by the cation exchange chromatography carrier.
  • the pH value to be changed is not particularly limited as long as the impurity removability is improved, but can be arbitrarily changed according to the target impurity.
  • As the value of the amount of change in pH 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 0.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, etc., and the units shown may be used or values between them may be used. Good.
  • the impurity removability is particularly improved if the pH is changed by 0.1 or more.
  • the electrical conductivity may be adjusted between the purification step using a cation exchange chromatography carrier and the purification step using an anion exchange chromatography carrier.
  • the value of the electrical conductivity to be changed is not particularly limited as long as the impurity removability is improved, but can be arbitrarily changed according to the target impurity.
  • As the value of change in electrical conductivity 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1. 4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, etc.
  • a value between may be used.
  • an affinity chromatography step may be performed before the anion exchange chromatography step and the purification step by cation exchange chromatography.
  • efficiency is improved by performing flow-through purification by anion exchange chromatography and flow-through purification by cation exchange chromatography without performing buffer exchange of the eluate containing the antibody after the affinity chromatography step. Purification is possible.
  • an eluent there is a buffer containing a monovalent acid as a main component.
  • an anion exchange chromatography step when an elution buffer mainly composed of a polyvalent acid is used, the amount of adsorption tends to decrease and the impurity removal performance tends to decrease.
  • an elution buffer having a main component it is desirable to exchange the buffer before anion exchange chromatography.
  • the elution of the affinity chromatography step is performed using an elution buffer containing a monovalent acid as a main component, purification by the cation exchange chromatography step and the anion exchange chromatography step is possible without the need for buffer exchange.
  • the elution buffer mainly composed of monovalent acid can be eluted in the affinity chromatography step, and is not particularly limited as long as impurities can be removed in the subsequent ion exchange chromatography step, but acetic acid is desirable.
  • the elution buffer used for elution in the affinity chromatography step is not limited to the following, but from the viewpoint of removing impurities in flow-through purification by subsequent cation exchange chromatography, the electric conductivity is 10.0 mS / cm or less. It is desirable that it is 7.0 mS / cm or less, more preferably 5.0 mS / cm or less, and particularly preferably 3.0 mS / cm or less.
  • the carrier in order to keep the electric conductivity of the elution pool low, it is desirable to wash the carrier with a buffer solution having a low electric conductivity just before the elution in the affinity chromatography step.
  • a buffer solution having a low electric conductivity just before the elution in the affinity chromatography step.
  • the buffer it is sufficient that the pH is sufficiently high and the electric conductivity is sufficiently low so as not to elute the antibody.
  • Such pH is preferably 5.0 or more, more preferably 6.0 or more, still more preferably 7.0 or more, and the electric conductivity is preferably 10.0 mS / cm or less, more Preferably it is 7.0 mS / cm or less, More preferably, it is 5.0 mS / cm or less, Most preferably, it is 3.0 mS / cm or less.
  • the virus may be inactivated by exposing the virus that may be contained in the eluate to acidic (low pH) conditions for a certain period of time.
  • the pH is desirably 4.0 or less, preferably 3.8 or less, more preferably 3.6 or less, still more preferably 3.5 or less, and particularly preferably 3.4 or less.
  • the pH of the eluate may be adjusted by adding a base to the eluate.
  • the pH value after adjustment is not particularly limited as long as impurities can be removed in the subsequent ion exchange chromatography step, but is preferably 4.0 or more, more preferably 5.0 or more, and still more preferably 6.0. That's it.
  • Reference Example 1 a hollow fiber cation exchange membrane having a carboxylic acid group was synthesized by a radiation graft polymerization method.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours. Thereafter, the hollow fiber was washed with methanol and vacuum-dried in a vacuum dryer to obtain 5.31 g of a cation exchange membrane having a graft rate of 77%.
  • the volume of one hollow fiber obtained was measured and found to be 1.05 mL.
  • This hollow fiber was hydrophilized with ethanol and replaced with water. After removing water, 10 mL of 0.1 mol / L sodium hydroxide aqueous solution was added. After standing for 1 hour, the aqueous sodium hydroxide solution was taken out and 10 mL of pure water was added. After further standing for 1 hour, pure water was recovered to recover sodium hydroxide remaining in the membrane. The collected sodium hydroxide solution was integrated and titrated with 0.1 mol / L hydrochloric acid. As a result, 7.98 mL was required for neutralization.
  • the weak cation exchange group of the membrane reacted with sodium hydroxide was 179 umol.
  • the weak cation exchange group density could be determined, and the cation exchange group density was 170 mmol / L.
  • This was modularized (membrane volume of 0.25 mL) to obtain a cation exchange membrane 1 according to Reference Example 1.
  • the mass ratios of the cation exchange group monomer and the neutral monomer were 0.100 and 0.900, respectively.
  • AE6F4 antibody human monoclonal antibody
  • AE6F4-producing cells were provided by Associate Professor Yoshinori Katakura, graduate School of Agriculture, Kyushu University.
  • the AE6F4 antibody-producing cells were cultured with reference to literature (Abstracts of the Japanese Society for Biotechnology, 1994, Volume 65, page 65).
  • the culture solution containing AE6F4 antibody-producing cells was filtered using a filter membrane (trade name BioOptimal (registered trademark) MF-SL, manufactured by Asahi Kasei Medical) to obtain an antibody solution (culture supernatant) containing impurities and antibodies. . Filtration was performed with reference to the instruction manual of the provider.
  • phosphate buffer 20 mmol / L sodium phosphate + 150 mmol / L NaCl (pH 8.0)
  • elution buffer 100 mmol / L sodium citrate ( 240 mL of pH 3.6)
  • FIG. 5 the chromatographic chart of FIG. 5 was obtained, and FIG. What appears in the peaks of (1) and (2) in FIG. 6 is an antibody aggregate, and the peak that appears in (3) is a monomer.
  • the ratio of aggregate (1) calculated from the peak area of the chromatograph was 1.54%
  • the ratio of aggregate (2) was 2.20%
  • the ratio of monomer was 96.25%. It was.
  • the peak of the aggregate that appears first is referred to as aggregate (1)
  • the peak of the aggregate that appears second is referred to as aggregate (2).
  • the reduction ratio of the ratio of antibody aggregates is the difference between the ratio of aggregate components (1) and (2) after treatment from the ratio of aggregate components (1) and (2) before treatment.
  • FIG. 4 is a percentage display of a value obtained by dividing the difference by the content of aggregate components (1) and (2) before processing.
  • the cation exchange membrane 1 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 20 mL (5.12 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 1 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 30 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process.
  • an antibody protein aggregate component impurities
  • a monomer component target physiologically active substance
  • aggregate ratio reduction rate is the content of aggregate components (1) and (2) after treatment from the content of aggregate components (1) and (2) before treatment. It is a percentage display of the value which took the difference of and divided
  • a cation exchange membrane 2 described below was used.
  • the cation exchange membrane 2 was synthesized as follows. N-isopropylacrylamide 3.09 g, butyl methacrylate 1.03 g, and methacrylic acid 1.03 g were dissolved in 240 mL of a 50 vol% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbled with nitrogen for 30 minutes, and used as a reaction solution.
  • a polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • the ratio of the aggregate (1) in the antibody solution used in Reference Example 2 was 1.59%, the ratio of the aggregate (2) was 1.67%, and the ratio of the monomer was 96.74%. .
  • the cation exchange membrane 2 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 20 mL (5.29 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 2 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 30 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 3 In Reference Example 3, a cation exchange membrane 3 described below was used.
  • the cation exchange membrane 3 was synthesized as follows. A solution prepared by dissolving 3.09 g of N-isopropylacrylamide, 1.77 g of butyl methacrylate and 0.28 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50% by volume t-butyl alcohol aqueous solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used. A polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • the antibody solution used in Reference Example 3 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 8.0), the ratio of aggregate (1) was 1.31%, and the ratio of aggregate (2) was 2.04%. The proportion of monomers was 96.66%.
  • the cation exchange membrane 3 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 20 mL (5.37 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 3 was washed with 10 mL of 25 mmol / L Tris buffer (pH 8.0) flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 30 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 4 In Reference Example 4, the cation exchange membrane 3 and the antibody solution described below were used.
  • the antibody solution used in Reference Example 4 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 9.0), the ratio of aggregate (1) was 2.49%, and the ratio of aggregate (2) was 3.19%.
  • the monomer ratio was 94.32%.
  • the cation exchange membrane 3 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 20 mL (4.31 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 3 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer solution (pH 9.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 30 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • the cation exchange membrane 4 described below was used.
  • the cation exchange membrane 4 was synthesized as follows. N-isopropylacrylamide (3.83 g), butyl methacrylate (1.92 g), and methacrylic acid (0.64 g) were dissolved in 240 mL of a 50 vol% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbled with nitrogen for 30 minutes.
  • a polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • the antibody solution used in Reference Example 5 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 3.25%, and the ratio of aggregate (2) was 2.07%. The proportion of monomers was 94.68%.
  • the cation exchange membrane 4 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 25 mL (5.76 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 4 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 35 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 6 In Reference Example 6, a cation exchange membrane 5 described below was used.
  • the cation exchange membrane 5 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 1.49 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 0.72 g of butyl methacrylate and 0.36 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution. A polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • a polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the
  • the antibody solution used in Reference Example 6 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.35%, and the ratio of aggregate (2) was 1.82%. The monomer ratio was 95.83%.
  • An antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurity) and a monomer component (target physiologically active substance) was brought into contact with the cation exchange membrane 5.
  • the amount added was 20 mL (4.73 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C.
  • the cation exchange membrane 5 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 30 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 7 a cation exchange membrane 6 described below was used.
  • the cation exchange membrane 6 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 2.06 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 1.03 g of butyl methacrylate and 0.51 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% aqueous t-butyl alcohol solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution. A polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • the antibody solution used in Reference Example 7 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.12%, and the ratio of aggregate (2) was 1.56%. The proportion of monomers was 96.32%.
  • a cation exchange membrane 7 described below was used.
  • the cation exchange membrane 7 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 2.57 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 1.29 g of butyl methacrylate and 0.51 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% aqueous t-butyl alcohol solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution. A polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • the antibody solution used in Reference Example 8 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 3.37%, and the ratio of aggregate (2) was 1.94%. The proportion of monomers was 94.69%.
  • the cation exchange membrane 7 was contacted with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 25 mL (5.49 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 7 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 35 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • a cation exchange membrane 8 described below was used.
  • the cation exchange membrane 8 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 2.57 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 1.29 g of butyl methacrylate and 0.51 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% aqueous t-butyl alcohol solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution. A polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • the antibody solution used in Reference Example 9 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.45%, and the ratio of aggregate (2) was 2.39%. The monomer ratio was 95.17%.
  • An antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurity) and a monomer component (target physiologically active substance) was brought into contact with the cation exchange membrane 8.
  • the amount added was 25 mL (concentration of 6.02 mg / mL), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C.
  • the cation exchange membrane 8 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 35 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • a cation exchange membrane 9 described below was used.
  • the cation exchange membrane 9 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 2.40 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 1.20 g of butyl methacrylate and 0.77 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution. A polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • the antibody solution used in Reference Example 10 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 0.72%, and the ratio of aggregate (2) was 1.14%. The proportion of monomers was 98.14%.
  • the cation exchange membrane 9 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 50 mL (concentration of 5.30 mg / mL), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 9 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 60 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 11 In Reference Example 11, a cation exchange membrane 10 described below was used.
  • the cation exchange membrane 10 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 3.08 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 1.54 g of butyl methacrylate and 0.57 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% aqueous t-butyl alcohol solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution. A polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • a polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the
  • the antibody solution used in Reference Example 11 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 1.57%, and the ratio of aggregate (2) was 1.55%. The monomer ratio was 96.88%.
  • the cation exchange membrane 10 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 40 mL (5.91 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 10 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 50 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 12 In Reference Example 12, a cation exchange membrane 11 described below was used.
  • the cation exchange membrane 11 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 1.93 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 1.93 g of butyl methacrylate and 0.51 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50% by volume aqueous t-butyl alcohol solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution. A polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • a polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the
  • the antibody solution used in Reference Example 12 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.71%, and the ratio of aggregate (2) was 2.69%. The proportion of monomers was 94.60%.
  • the cation exchange membrane 11 was contacted with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 30 mL (5.08 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 11 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 40 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG. (Reference Example 13)
  • Reference Example 13 a cation exchange membrane 10 and an antibody solution described below were used.
  • the antibody solution used in Reference Example 13 was a 15 mmol / L Tris buffer solution (pH 7.0) containing 10 mmol / L sodium chloride, the ratio of the aggregate (1) was 2.47%, and the aggregate (2 ) was 1.59%, and the monomer was 95.94%.
  • the cation exchange membrane 10 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 50 mL (5.31 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 10 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) containing 10 mmol / L sodium chloride at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 60 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 14 In Reference Example 14, the cation exchange membrane 10 and the antibody solution described below were used.
  • the antibody solution used in Reference Example 14 was a 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) containing 30 mmol / L sodium chloride, the ratio of the aggregate (1) was 2.32%, and the aggregate (2 ) was 2.21%, and the monomer was 95.47%.
  • the cation exchange membrane 10 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 50 mL (5.66 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 10 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) containing 30 mmol / L sodium chloride at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 60 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 15 In Reference Example 15, the cation exchange membrane 10 and the antibody solution described below were used.
  • the antibody solution used in Reference Example 15 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.5), the ratio of aggregate (1) was 1.32%, and the ratio of aggregate (2) was 2.00%. The proportion of monomers was 96.68%.
  • the cation exchange membrane 10 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 50 mL (5.36 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 10 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.5) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 60 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 16 In Reference Example 16, the cation exchange membrane 10 and the antibody solution described below were used.
  • the antibody solution used in Reference Example 16 was a 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.5) containing 10 mmol / L sodium chloride, the ratio of the aggregate (1) was 1.59%, and the aggregate (2 ) was 2.20%, and the monomer was 96.21%.
  • the cation exchange membrane 10 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 50 mL (5.63 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 10 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.5) containing 10 mmol / L sodium chloride at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 60 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 17 In Reference Example 17, a cation exchange membrane 10 and an antibody solution described below were used.
  • the antibody solution used in Reference Example 17 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 8), the ratio of aggregate (1) was 1.41%, the ratio of aggregate (2) was 1.81%, The proportion of the monomer was 96.78%.
  • the cation exchange membrane 10 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 50 mL (concentration of 5.30 mg / mL), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 10 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 8) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 60 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 18 In Reference Example 18, the cation exchange membrane 10 and an antibody solution described below were used.
  • the antibody solution used in Reference Example 18 was a 15 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0), the proportion of aggregate (1) was 2.30%, and the proportion of aggregate (2) was 2.08. %, And the monomer ratio was 95.62%.
  • the cation exchange membrane 10 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 50 mL (5.72 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 10 was washed with 10 mL of 15 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 60 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 19 In Reference Example 19, a cation exchange membrane 12 described below was used.
  • the cation exchange membrane 12 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 2.57 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 1.29 g of ethylene glycol dimethacrylate and 0.51 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% aqueous t-butyl alcohol solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution.
  • a polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen. Thereafter, while cooling with dry ice from the outside of the container, ⁇ rays 25 kGy were irradiated to generate radicals.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours.
  • the hollow fiber was washed with methanol and vacuum-dried in a vacuum dryer to obtain a cation exchange membrane having 5.11 g and a graft rate of 70%.
  • the cation exchange group density was 178 mmol / L.
  • This was modularized (membrane volume 0.25 mL), and the cation exchange membrane 12 according to Reference Example 19 was obtained.
  • the mass ratios of the cation exchange group monomer and the neutral monomer were 0.109 and 0.891, respectively.
  • the antibody solution used in Reference Example 19 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.99%, and the ratio of aggregate (2) was 2.31%. The monomer ratio was 94.70%.
  • the cation exchange membrane 12 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 22 mL (5.33 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 12 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 32 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 20 In Reference Example 20, a cation exchange membrane 13 described below was used.
  • the cation exchange membrane 13 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 2.69 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 1.17 g of ethylene glycol dimethacrylate and 0.51 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 volume% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution.
  • a polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen. Thereafter, while cooling with dry ice from the outside of the container, ⁇ rays 25 kGy were irradiated to generate radicals.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours.
  • the hollow fiber was washed with methanol and vacuum-dried in a vacuum dryer to obtain a cation exchange membrane having 5.16 g and a graft rate of 70%.
  • the cation exchange group density was 176 mmol / L.
  • This was modularized (membrane volume of 0.25 mL) to obtain a cation exchange membrane 13 according to Reference Example 20.
  • the mass ratios of the cation exchange group monomer and the neutral monomer were 0.105 and 0.895, respectively.
  • the antibody solution used in Reference Example 20 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.48%, and the ratio of aggregate (2) was 2.24%. The proportion of monomers was 95.29%.
  • Reference Example 21 In Reference Example 21, a cation exchange membrane 14 described below was used.
  • the cation exchange membrane 14 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 2.50 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 1.36 g of diethylene glycol dimethacrylate and 0.51 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50% by volume t-butyl alcohol aqueous solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution.
  • a polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen. Thereafter, while cooling with dry ice from the outside of the container, ⁇ rays 25 kGy were irradiated to generate radicals.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours.
  • the hollow fiber was washed with methanol and vacuum-dried in a vacuum dryer to obtain a cation exchange membrane having 5.16 g and a graft rate of 70%.
  • the cation exchange group density was 176 mmol / L.
  • This was modularized (membrane volume 0.25 mL), and the cation exchange membrane 14 according to Reference Example 21 was obtained.
  • the mass ratios of the cation exchange group monomer and the neutral monomer were 0.105 and 0.895, respectively.
  • the antibody solution used in Reference Example 21 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.73%, and the ratio of aggregate (2) was 2.10%. The monomer ratio was 95.16%.
  • An antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurity) and a monomer component (target physiologically active substance) was brought into contact with the cation exchange membrane 14.
  • the amount added was 40 mL (concentration of 5.52 mg / mL), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C.
  • the cation exchange membrane 14 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 50 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • the cation exchange membrane 15 described below was used.
  • the cation exchange membrane 15 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 3.08 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 1.54 g of butyl methacrylate and 0.57 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% aqueous t-butyl alcohol solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution.
  • a polyvinylidene fluoride porous hollow fiber (5.80 g, 15 cm, 30 fibers) having an outer diameter of 2.0 mm, an inner diameter of 1.1 mm, and an average pore diameter of 0.45 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen. Thereafter, while cooling with dry ice from the outside of the container, ⁇ rays 25 kGy were irradiated to generate radicals.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours.
  • the hollow fiber was washed with methanol and vacuum-dried in a vacuum dryer to obtain 8.36 g of a cation exchange membrane having a graft rate of 46%.
  • the cation exchange group density was 227 mmol / L.
  • This was modularized (membrane volume 0.11 mL) to obtain a cation exchange membrane 15 according to Reference Example 22.
  • the mass ratios of the cation exchange group monomer and the neutral monomer were 0.115 and 0.885, respectively.
  • the antibody solution used in Reference Example 22 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 3.14%, and the ratio of aggregate (2) was 2.03%. The proportion of monomers was 94.82%.
  • An antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurity) and a monomer component (target physiologically active substance) was brought into contact with the cation exchange membrane 15.
  • the amount added was 10 mL (concentration of 5.53 mg / mL), the flow rate was 0.7 mL / min, and the temperature was 25 ° C.
  • the cation exchange membrane 15 was washed with 5 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 0.7 mL / min. 15 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 23 In Reference Example 23, the cation exchange membrane 16 described below was used.
  • the cation exchange membrane 16 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 3.85 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 0.77 g of butyl methacrylate and 0.57 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution.
  • a polyvinylidene fluoride porous hollow fiber (5.80 g, 15 cm, 30 fibers) having an outer diameter of 2.0 mm, an inner diameter of 1.1 mm, and an average pore diameter of 0.45 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen. Thereafter, while cooling with dry ice from the outside of the container, ⁇ rays 25 kGy were irradiated to generate radicals.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours.
  • the hollow fiber was washed with methanol and vacuum-dried in a vacuum dryer to obtain 8.26 g of a cation exchange membrane having a graft rate of 44%.
  • the cation exchange group density was 198 mmol / L.
  • This was modularized (membrane volume 0.11 mL) to obtain a cation exchange membrane 16 according to Reference Example 23.
  • the mass ratios of the cation exchange group monomer and the neutral monomer were 0.104 and 0.896, respectively.
  • the antibody solution used in Reference Example 23 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 4.41%, and the ratio of aggregate (2) was 2.16%. The monomer ratio was 93.43%.
  • the cation exchange membrane 16 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 18 mL (concentration of 5.53 mg / mL), the flow rate was 0.7 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 16 was washed with 5 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 0.7 mL / min. 23 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 24 In Reference Example 24, a cation exchange membrane 17 described below was used.
  • the cation exchange membrane 17 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 4.62 g of 2-hydroxyethyl methacrylate and 0.57 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution. A polyvinylidene fluoride porous hollow fiber (5.80 g, 15 cm, 30 fibers) having an outer diameter of 2.0 mm, an inner diameter of 1.1 mm, and an average pore diameter of 0.45 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • a polyvinylidene fluoride porous hollow fiber (5.80 g, 15 cm, 30 fibers) having an outer diameter of 2.0 mm, an inner diameter of 1.1 mm, and an average pore diameter of 0.45 ⁇ m was placed in a sealed container, and the
  • the antibody solution used in Reference Example 24 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.42%, and the ratio of aggregate (2) was 1.77%. The monomer ratio was 95.81%.
  • An antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurity) and a monomer component (target physiologically active substance) was brought into contact with the cation exchange membrane 17.
  • the amount added was 18 mL (5.64 mg / mL concentration), the flow rate was 0.2 mL / min, and the temperature was 25 ° C.
  • the cation exchange membrane 17 was washed with 5 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 0.2 mL / min. 23 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 25 In Reference Example 25, a cation exchange membrane 18 described below was used.
  • the cation exchange membrane 18 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 3.85 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 0.77 g of butyl methacrylate and 0.57 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution.
  • Polyvinylidene fluoride porous hollow fiber 5.80 g (15 cm, 30 fibers) having an outer diameter of 2.0 mm, an inner diameter of 1.1 mm, and an average pore diameter of 0.65 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen. Thereafter, while cooling with dry ice from the outside of the container, ⁇ rays 25 kGy were irradiated to generate radicals.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours.
  • the hollow fiber was washed with methanol and vacuum-dried in a vacuum dryer to obtain a cation exchange membrane having 8.29 g and a graft ratio of 43%.
  • the cation exchange group density was 209 mmol / L.
  • This was modularized (membrane volume 0.11 mL) to obtain a cation exchange membrane 18 according to Reference Example 25.
  • the mass ratios of the cation exchange group monomer and the neutral monomer were 0.108 and 0.892, respectively.
  • the antibody solution used in Reference Example 25 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.96%, and the ratio of aggregate (2) was 2.01%. The proportion of the monomer was 95.03%.
  • An antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurity) and a monomer component (target physiologically active substance) was brought into contact with the cation exchange membrane 18.
  • the amount added was 18 mL (concentration of 5.61 mg / mL), the flow rate was 0.7 mL / min, and the temperature was 25 ° C.
  • the cation exchange membrane 18 was washed with 5 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 0.7 mL / min. 23 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • the cation exchange membrane 19 described below was used.
  • the cation exchange membrane 19 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 4.62 g of 2-hydroxyethyl methacrylate and 0.57 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution. Polyvinylidene fluoride porous hollow fiber 5.80 g (15 cm, 30 fibers) having an outer diameter of 2.0 mm, an inner diameter of 1.1 mm, and an average pore diameter of 0.65 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen.
  • the antibody solution used in Reference Example 26 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.83%, and the ratio of aggregate (2) was 1.96%. The proportion of the monomer was 95.21%.
  • Reference Example 27 In Reference Example 27, the cation exchange membrane 20 described below was used.
  • the cation exchange membrane 20 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 2.99 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 1.63 g of diethylene glycol dimethacrylate, and 0.57 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 volume% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution.
  • Polyvinylidene fluoride porous hollow fiber 5.80 g (15 cm, 30 fibers) having an outer diameter of 2.0 mm, an inner diameter of 1.1 mm, and an average pore diameter of 0.65 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen. Thereafter, while cooling with dry ice from the outside of the container, ⁇ rays 25 kGy were irradiated to generate radicals.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours.
  • the hollow fiber was washed with methanol and vacuum dried in a vacuum drier to obtain 8.42 g of a cation exchange membrane having a graft rate of 45%.
  • the cation exchange group density was 241 mmol / L.
  • This was modularized (membrane volume 0.11 mL) to obtain a cation exchange membrane 20 according to Reference Example 27.
  • the mass ratios of the cation exchange group monomer and the neutral monomer were 0.119 and 0.881, respectively.
  • the antibody solution used in Reference Example 27 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.54%, and the ratio of aggregate (2) was 1.93%. The proportion of monomers was 95.53%.
  • An antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurity) and a monomer component (target physiologically active substance) was brought into contact with the cation exchange membrane 20.
  • the amount added was 18 mL (concentration of 5.51 mg / mL), the flow rate was 0.7 mL / min, and the temperature was 25 ° C.
  • the cation exchange membrane 20 was washed with 5 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 0.7 mL / min. 23 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 28 In Reference Example 28, a cation exchange membrane 21 described below was used.
  • the cation exchange membrane 21 was synthesized as follows. N-isopropylacrylamide 3.09 g, butyl methacrylate 1.29 g, glycidyl methacrylate 0.51 g, t-butyl methacrylate 0.26 g dissolved in 240 volume of 50 vol% t-butyl alcohol aqueous solution and nitrogen bubbled for 30 minutes to react. Used as.
  • a polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen. Thereafter, while cooling with dry ice from the outside of the container, ⁇ rays 200 kGy were irradiated to generate radicals.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours. Thereafter, the hollow fiber was washed with methanol and dried in a vacuum dryer to obtain 5.12 g of a cation exchange membrane precursor having a graft rate of 71%.
  • the sulfonic acid group density was determined by the following method. All the sulfonic acid was hydrogenated by immersing in 1 mol / L hydrochloric acid for 1 hour. After washing with pure water and removing hydrochloric acid, 10 mL of 1 mol / L sodium chloride aqueous solution was added to elute hydrogen chloride. After standing for 1 hour, an aqueous sodium chloride solution containing hydrogen chloride was recovered. Further, 10 mL of a 1 mol / L sodium chloride aqueous solution was added, and the mixture was allowed to stand for 1 hour and recovered to recover hydrogen chloride remaining in the membrane. The collected materials were integrated and titrated with a 0.01 mol / L sodium hydroxide aqueous solution.
  • the antibody solution used in Reference Example 28 was 15 mmol / L acetate buffer (pH 6.0), the ratio of aggregate (1) was 2.80%, and the ratio of aggregate (2) was 3.21%. The proportion of monomers was 93.99%.
  • the cation exchange membrane 21 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 20 mL (concentration of 4.99 mg / mL), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 21 was washed with 10 mL of 15 mmol / L acetate buffer (pH 6.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 30 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 29 In Reference Example 29, a cation exchange membrane 21 and an antibody solution described below were used.
  • the antibody solution used in Reference Example 29 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the proportion of aggregate (1) was 1.77%, and the proportion of aggregate (2) was 1.78%.
  • the proportion of monomers was 96.44%.
  • the cation exchange membrane 21 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 20 mL (4.74 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 21 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 30 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process. When the collected solution was subjected to size exclusion chromatography (SEC: Size Exclusion Chromatography), the content of aggregate components was reduced. The results are shown in FIG.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Comparative Example 1 a cation exchange membrane 22 having a cation exchange group density described below of less than 30 mmol / L was used.
  • the cation exchange membrane 22 was synthesized as follows. N-isopropylacrylamide 3.09 g, butyl methacrylate 1.86 g, and methacrylic acid 0.2 g were dissolved in 240 volume of 50% by volume t-butyl alcohol aqueous solution and bubbled with nitrogen for 30 minutes, and used as a reaction solution.
  • a polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen. Thereafter, while cooling with dry ice from the outside of the container, ⁇ rays 200 kGy were irradiated to generate radicals.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours.
  • the hollow fiber was washed with methanol and dried in a vacuum dryer to obtain 5.22 g of a cation exchange membrane having a graft rate of 74%.
  • the cation exchange group density was 27 mmol / L, which was lower than 30 mmol / L.
  • the mass ratios of the cation exchange group monomer and the neutral monomer were 0.017 and 0.983, respectively.
  • This was modularized (membrane volume: 0.25 mL) to obtain a cation exchange membrane 22 according to Reference Comparative Example 1.
  • the antibody solution used in Reference Comparative Example 1 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.27%, and the ratio of aggregate (2) was 1.86. %, And the monomer ratio was 95.87%.
  • An antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance) was brought into contact with the cation exchange membrane 22.
  • the amount added was 20 mL (5.13 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C.
  • the cation exchange membrane 22 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 30 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Comparative Example 2 a cation exchange membrane 23 having only a strong cation exchange group having a cation exchange group density of less than 30 mmol / L described below was used.
  • the cation exchange membrane 23 was synthesized as follows. 3.6 g of N-isopropylacrylamide, 1.8 g of butyl methacrylate, and 0.6 g of glycidyl methacrylate were dissolved in 280 mL of 50 volume% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbled with nitrogen for 30 minutes.
  • a polyethylene porous hollow fiber (3.00 g, 15 cm, 15 fibers) having an outer diameter of 3.0 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and an average pore diameter of 0.25 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen. Thereafter, while cooling with dry ice from the outside of the container, ⁇ rays 200 kGy were irradiated to generate radicals.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours. Thereafter, the hollow fiber was washed with methanol and vacuum-dried in a vacuum dryer to obtain 5.11 g of a cation exchange membrane precursor with a graft rate of 70%.
  • the cation exchange group density was 18 mmol / L, which was lower than 30 mmol / L. Moreover, the mass ratios of the cation exchange group monomer and the neutral monomer were 0.03 and 0.97, respectively.
  • the antibody solution used in Reference Comparative Example 2 was 15 mmol / L acetate buffer (pH 6.0), the ratio of aggregate (1) was 2.03%, and the ratio of aggregate (2) was 2.06. %, And the monomer ratio was 95.91%.
  • the cation exchange membrane 23 was brought into contact with an antibody solution containing an antibody protein aggregate component (impurities) and a monomer component (target physiologically active substance). The amount added was 50 mL (concentration of 4.80 mg / mL), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C. After flowing the antibody solution, the cation exchange membrane 23 was washed with 10 mL of 15 mmol / L acetate buffer (pH 6.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 60 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process.
  • Reference Comparative Example 3 a cation exchange membrane 24 having a homopolymer fixed on the surface of a membrane-like substrate, which will be described below, was used.
  • the cation exchange membrane 24 was synthesized as follows. A solution obtained by dissolving 0.51 g of methacrylic acid in 240 mL of a 50 vol% t-butyl alcohol aqueous solution and bubbling with nitrogen for 30 minutes was used as a reaction solution.
  • a 3.0 g (15 cm, 15 pieces) polyvinylidene fluoride porous hollow fiber having an outer diameter of 2.0 mm, an inner diameter of 1.1 mm, and an average pore diameter of 0.65 ⁇ m was placed in a sealed container, and the air in the container was replaced with nitrogen. Thereafter, while cooling with dry ice from the outside of the container, ⁇ rays 25 kGy were irradiated to generate radicals.
  • the obtained polyethylene porous hollow fiber having radicals was transferred to a glass container and decompressed to 200 Pa or less to remove oxygen in the reaction tube. 140 mL of the reaction solution adjusted to 40 ° C. was introduced into this, and allowed to stand for 16 hours.
  • the hollow fiber was washed with methanol and vacuum-dried in a vacuum dryer to obtain a cation exchange membrane having 3.28 g and a graft rate of 9%.
  • the cation exchange group density was 183 mmol / L.
  • This was modularized (membrane volume 0.25 mL) to obtain a cation exchange membrane 24 according to Reference Comparative Example 3.
  • the mass ratios of the cation exchange group monomer and the neutral monomer are 1.0 and 0, respectively.
  • the antibody solution used in Reference Comparative Example 3 was 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0), the ratio of aggregate (1) was 2.12%, and the ratio of aggregate (2) was 2.31. %, And the monomer ratio was 95.57%.
  • the antibody solution containing the antibody protein aggregate component (impurities) and the monomer component (target physiologically active substance) was brought into contact with the cation exchange membrane 24.
  • the amount added was 20 mL (5.15 mg / mL concentration), the flow rate was 1.5 mL / min, and the temperature was 25 ° C.
  • the cation exchange membrane 24 was washed with 10 mL of 15 mmol / L Tris buffer (pH 7.0) at 25 ° C. flowing at a flow rate of 1.5 mL / min. 30 mL of solution was collected in the flow-through process and the washing process.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Reference Example 30 shows an example in which impurities are reduced by flow-through purification using a cation exchange chromatography carrier after flow-through purification using an anion exchange chromatography carrier.
  • Reference Example 31 In Reference Example 31, a culture supernatant containing 0.163 g / L of AE6F4 antibody (human monoclonal antibody) is used as an antibody protein, and a series of purification steps of affinity chromatography, anion exchange chromatography, and cation exchange chromatography are buffered. We went without exchanging.
  • AE6F4 antibody human monoclonal antibody
  • phosphate buffer (20 mmol / L sodium phosphate + 150 mmol / L NaCl (pH 8.0)) is passed through, and 48 mL of Tris / acetate buffer (100 mmol / L (pH 8.0)) is passed through.
  • a 1 mol / L Tris buffer was added to the eluate to adjust the pH to 7.8 to obtain an antibody solution.
  • the electric conductivity of the obtained antibody solution was 1.8 mS / cm.
  • the antibody solution used for the anion exchange chromatography process mentioned later was prepared by mixing with the antibody solution which is the same solution composition as the obtained antibody solution and contains many aggregates.
  • the ratio of aggregate (1) in the antibody solution was 0.83%, the ratio of aggregate (2) was 1.12%, and the ratio of monomer was 98.05%.
  • the HCP content was 317 ppm, and the protein A content was 3 ppm.
  • Reference Example 32 In Reference Example 32, a culture supernatant containing 0.163 g / L of AE6F4 antibody (human monoclonal antibody) is used as an antibody protein, and a series of purification steps of affinity chromatography, anion exchange chromatography, and cation exchange chromatography are buffered. We went without exchanging.
  • AE6F4 antibody human monoclonal antibody
  • phosphate buffer (20 mmol / L sodium phosphate + 150 mmol / L NaCl (pH 8.0)) is passed through, and 48 mL of Tris / acetate buffer (100 mmol / L (pH 8.0)) is passed through.
  • a 1 mol / L Tris buffer was added to the eluate to adjust the pH to 7.8 to obtain an antibody solution.
  • the electric conductivity of the obtained antibody solution was 1.8 mS / cm.
  • the antibody solution used for the anion exchange chromatography process mentioned later was prepared by mixing with the antibody solution which is the same solution composition as the obtained antibody solution and contains many aggregates.
  • the ratio of the aggregate (1) of the antibody solution was 0.78%
  • the ratio of the aggregate (2) was 1.21%
  • the ratio of the monomer was 98.01%.
  • the HCP content was 365 ppm
  • the protein A content was 3 ppm.
  • Example 1 (Preparation of buffer) A solution consisting of 0.5451 g of Tris (molecular weight 121.14), 3 mL of 1 mol / L NaCl, and water was adjusted to pH 7.0 with 0.1 N HCl, and further made up to 300 mL with water, and 15 mmol / L A buffer consisting of Tris-HCl (pH 7.0) and 10 mmol / L NaCl was obtained.
  • the filtrate of the ultrafiltration membrane was suction filtered with a filter having a pore size of 0.20 ⁇ m (Thermo Scientific (registered trademark) Nalgene (registered trademark) Rapid-Flow (registered trademark) PES membrane filter unit), and the monomer of the antibody A purified solution of was obtained.
  • the filtrate of the ultrafiltration membrane was suction filtered with a filter (Thermo Scientific (registered trademark) Nalgene (registered trademark) Rapid-Flow (registered trademark) PES membrane filter unit) having a pore diameter of 0.20 ⁇ m, and the antibody coagulation was performed. A solution containing the aggregate was obtained.
  • a filter Thermo Scientific (registered trademark) Nalgene (registered trademark) Rapid-Flow (registered trademark) PES membrane filter unit) having a pore diameter of 0.20 ⁇ m
  • a cation exchange membrane 1 according to Reference Example 1 was prepared, and the cation exchange membrane was washed at a flow rate of 1.5 mL / min using 30 mL of buffer. Next, 78 mL of the antibody monomer-aggregate solution and aggregates were passed through the cation exchange membrane at a flow rate of 1.5 mL / min and filtered through a flow-through. The total amount of antibody flowed per mL of membrane volume was 1.5 g. Thereafter, 10 mL of buffer was passed through the cation exchange membrane at a flow rate of 1.5 mL / min, and the antibody remaining on the cation exchange membrane was recovered.
  • the filtrate obtained by flow-through and the antibody recovery solution recovered by flowing a buffer were combined to obtain a prefiltered solution.
  • the ratio of the antibody monomer contained in the pre-filtered solution was 99.56%
  • the ratio of the antibody dimer was 0.44%
  • the antibody trimer or higher Aggregates were not detected. Therefore, aggregates of the antibody dimer or higher were remarkably removed.
  • a virus removal filter (Planova (registered trademark) 20N, Asahi Kasei Medical) equipped with a regenerated cellulose hollow fiber by the copper ammonia method was prepared.
  • the virus removal filter includes a primary surface to which a pre-filtered solution is supplied and a secondary surface that faces the primary surface. In the cross section of the virus removal filter, the pore diameter decreases from the primary side to the secondary side and then increases. 30 mL of the solution obtained by the prefiltration was immediately filtered without treatment at a filtration pressure of 0.8 kgf / cm 2 using a virus removal filter, and 15 mL of the filtrate was collected in 15 mL fractions. This was the later solution. As shown in FIG.
  • the ratio of the monomer contained in the solution after the main filtration was 99.55%, the ratio of the antibody dimer was 0.45%, and the aggregate of the antibody trimer or higher was not detected. Furthermore, as shown in FIG. 11, the permeation flux (Flux) was not reduced in the main filtration.
  • the purified antibody monomer solution prepared in Example 1 was subjected to suction filtration with a 0.20 ⁇ m filter, and further filtered with a 0.10 ⁇ m filter at a filtration pressure of 19.6 kPa.
  • the ratio of the antibody monomer was 99.75% as shown in FIG.
  • the proportion of the body was 0.25%, and aggregates of antibody trimer or higher were not detected.
  • the purified antibody monomer solution was filtered using a virus removal filter (Planova (registered trademark) 20N, Asahi Kasei Medical) at a filtration pressure of 78.4 kPa, and 15 mL of the filtrate was collected in 15 fractions.
  • a virus removal filter Plantova (registered trademark) 20N, Asahi Kasei Medical
  • the antibody monomer ratio was 99.74% and the antibody dimer ratio was 0.26%. Aggregates above the mer were not detected.
  • Example 1 Comparative Example 1
  • 30 mL of the solution containing the antibody monomers and aggregates prepared in Example 1 was filtered using a virus removal filter (Planova (registered trademark) 20N, Asahi Kasei Medical) at a filtration pressure of 78.4 kPa. 15 fractions of 2 mL were collected.
  • the antibody monomer ratio was 97.75%
  • the antibody dimer ratio was 1.31%
  • FIG. 11 in the filtration process using the virus removal membrane, a decrease in permeation flux (Flux) was observed.
  • Example 4 (Reference Comparative Example 4)
  • a cation exchange membrane according to Comparative Example 2 having a strong cation exchange group (sulfonic acid group) and no weak cation exchange group was prepared.
  • the cation exchange membrane was washed using a 12 mL buffer prepared in Example 1 at a flow rate of 0.6 mL / min.
  • 33 mL of the antibody monomer and the aggregate-containing solution were passed through the cation exchange membrane at a flow rate of 1.5 mL / min and filtered through a flow-through.

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Abstract

目的タンパク質の単量体と凝集体とを含む溶液を用意し、少なくとも１種類の弱カチオン交換基を備え、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高いカチオン交換クロマトグラフィー担体を用いて、目的タンパク質の凝集体を除去し、単量体の精製溶液を得る精製工程と、ウイルス対数除去率が３以上のウイルス除去膜を用いて、精製溶液からウイルスを除去するウイルス除去工程と、を備える、タンパク質の精製方法。

Description

タンパク質の精製方法
　本発明は、タンパク質の精製方法に関する。
　免疫グロブリン（抗体）は、免疫反応を司る生理活性物質である。近年、医薬品、診断薬あるいは対応する抗原タンパク質の分離精製材料等の用途において、その利用価値が高まっている。抗体は免疫した動物の血液あるいは抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から取得される。但し、それらの抗体を含有する血液や培養液は、抗体以外のタンパク質、又は細胞培養に用いた原料液に由来する複雑な夾雑成分を包含し、それらの不純物成分から抗体を分離精製するには、煩雑で長時間を要する操作が通常必要である。
　液体クロマトグラフィーは、抗体の分離精製に重要である。抗体を分離するためのクロマトグラフィー手法として、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等があり、これらの手法を組み合わせることで抗体が分離精製される。
　イオン交換クロマトグラフィーは、吸着剤表面のイオン交換基を固定相として移動相中に存在する対イオンを可逆的に吸着することにより分離を行う方法である。吸着剤の形状としては、ビーズや、平膜、及び中空糸等の膜などが採用されており、これらの基材にカチオン交換基又はアニオン交換基を結合したものが吸着剤として市販されている。
　カチオン交換基を有する吸着剤では、低塩濃度の抗体溶液を吸着剤に接触させることにより、抗体を吸着させ、移動相の塩濃度を高めることにより、吸着させた生理活性物質を溶出させる精製が一般的に行われている。さらに、より良好な方法として、以下に説明するフロースルー様式による目的物質の精製も提案されている。
　フロースルー様式とは、目的物質よりも不純物を選択的に吸着剤に吸着させる精製方法の様式である。そのため、従来の吸着、溶出を利用した方法に比べ、緩衝液の節約や工程の簡略化につながる。また、高流速で抗体溶液を処理することが出来れば、さらにフロースルー精製の利点が活きると考えられる。
　カチオン交換工程においては、抗体の単量体と抗体２量体等の凝集体を分離することがしばしば目的とされている。しかし、抗体の単量体と抗体の凝集体の等電点はほぼ等しいため、フロースルー精製において、抗体の単量体と抗体２量体の分離は特に難しく、カチオン交換基の密度をはじめとする、カチオン交換体の緻密な設計が必要となる。また、抗体はそれぞれ性質が異なるため、綿密な設計をしても全ての抗体に対して、同じ設計が最適であるわけではなく、それぞれの抗体に適したカチオン交換基密度が存在すると考えられる。
　特許文献１では、樹脂上に芳香族と弱カチオン交換基を有する低分子化合物を結合させたフロースルー精製に用いるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が開示されている。
　特許文献２では、シリカビーズに弱カチオン交換基を有する共重合体を結合させたクロマトグラフィー担体が開示されている。
　特許文献３では、強カチオン交換基を有するモノマーと非荷電（中性）モノマーを担体にグラフト重合を施したフロースルーに適したクロマトグラフィー担体が開示されている。
　また、近年、人血液由来の血漿分画製剤に加え、バイオ医薬品においても、ウイルス安全性を向上させる対策が必要となってきている。そのため医薬品メーカーにおいては製造工程中にウイルス除去／不活化工程を導入する検討を行っている。中でも、ウイルス除去膜を用いたろ過によるウイルス除去法は、有用なタンパク質を変性させることなく、ウイルスを低減することができる有効な方法である。
　ウイルスのなかでも、特にパルボウイルスは、血漿分画製剤分野において、ヒトパルボウイルスＢ１９による感染の事例やバイオ医薬品分野でマウスのパルボウイルスのＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞への汚染の事例が報告されてきている。小ウイルスであるパルボウイルスは、エンベロープを持たないことから、物理化学的に安定で、医薬品の製造プロセス中で一般的に行われている不活化工程である加熱、低ｐＨ、化学薬品処理に対して耐性がある。そのため、不活化法とは異なる作用機序のウイルス除去方法として、ウイルス除去膜によるパルボウイルス除去のニーズが高まっている。
特許第４７７６６１５号公報 特許第５２３４７２７号公報 特開２０１３－１８９４２７号公報
　医薬品製造の現場では、有用なタンパク質とサイズが近い、小ウイルス（例としてパルボウイルス）に対する高いウイルス除去性を備えると共に、タンパク質の高いろ過効率を有するウイルス除去膜が求められており、ウイルス除去膜に対する要求は年々厳しくなっている。
　これを受け、製造プロセス中のウイルス除去工程の能力を示すウイルス除去膜の評価試験では、ウイルス除去膜に負荷するウイルスの総量(ウイルスのタンパク製剤に対するスパイク量または、総ろ過量)を増加させるようになっている。このように、ウイルス除去膜の評価試験をクリアするための条件は年々厳しくなっている。
　しかし、高いウイルス除去性能を維持しつつ、ウイルス除去工程における透過流速の低下を抑制することは、従来、困難である。そこで、本発明は、ウイルス除去工程における透過流速の低下を抑制することが可能なタンパク質の精製方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高いカチオン交換クロマトグラフィー担体を用いて凝集体を除去した後に、ウイルス除去膜でウイルスを除去すると、ウイルス除去工程における透過流束の低下を抑制することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。これは、理論に束縛されるものではないが、カチオン交換クロマトグラフィー担体により目的タンパク質溶液中の凝集体が除去されることで、ウイルス除去膜の凝集体による閉塞が抑制されたためであると考えられる。
　本発明の態様によれば、目的タンパク質の単量体と凝集体とを含む溶液を用意することと、少なくとも１種類の弱カチオン交換基を備え、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高いカチオン交換クロマトグラフィー担体を用いて、目的タンパク質の凝集体を除去し、単量体の精製溶液を得る精製工程と、ウイルス対数除去率が３以上のウイルス除去膜を用いて、精製溶液からウイルスを除去するウイルス除去工程と、を備える、タンパク質の精製方法が提供される。
　上記の精製方法において、カチオン交換クロマトグラフィー担体が、膜状基材と、膜状基材の表面に固定された共重合体と、を備え、共重合体がモノマー単位として（メタ）アクリルアミド類化合物及び／又は（メタ）アクリレート類化合物を含んでいてもよい。共重合体において、カチオン交換基を有するモノマー単位以外のモノマー単位が荷電を持たない中性モノマーであり、中性モノマーが、疎水性モノマー単位及び／又は親水性モノマー単位であってもよい。疎水性モノマー単位が、炭素数４以上の直鎖又は分岐状のアルキル基を有していてもよい。共重合体において、疎水性モノマー単位及び／又は親水性モノマー単位の質量割合が、カチオン交換基を有するモノマー単位の質量割合よりも高くてもよい。
　上記の精製方法において、弱カチオン交換基が、アクリル酸モノマー、メタクリル酸モノマー、アクリル酸化合物モノマー、及びメタクリル酸化合物モノマーのいずれかの由来であってもよい。カチオン交換クロマトグラフィー担体が備えるカチオン交換基が、弱カチオン交換基のみであってもよい。あるいは、カチオン交換クロマトグラフィー担体が備えるカチオン交換基が、弱カチオン交換基と、強カチオン交換基と、を含んでいてもよい。強カチオン交換基がスルホン酸基であってもよい。
　上記の精製方法において、共重合体が、共有結合により膜状基材の表面に固定されていてもよい。
　上記の精製方法において、親水性モノマー単位が、イソプロピルアクリルアミド及び２－ヒドロキシエチルメタクリレートの少なくとも一方を含んでいてもよい。
　上記の精製方法において、カチオン交換クロマトグラフィー担体の膜状基材がポリエチレンを含んでいてもよい。膜状基材にグラフト重合された共重合体のグラフト率が２０～２００％であってもよい。膜状基材がポリフッ化ビニリデンを含んでいてもよい。膜状基材にグラフト重合された共重合体のグラフト率が５～１００％であってもよい。共重合体が、実質的に架橋構造を有していなくともよい。共重合体が、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位を含んでいてもよい。
　上記の精製方法において、カチオン交換基密度が、４５ｍｍｏｌ／Ｌより高くともよい。
　上記の精製方法において、ウイルス除去膜が、単量体の精製溶液が供給される一次側の表面と、一次側の表面と対向する二次側の表面と、を備え、ウイルス除去膜の断面において、一次側から二次側にむけて孔径が減少する部分を少なくとも備えていてもよい。
　上記の精製方法において、ウイルス除去膜が、単量体の精製溶液が供給される一次側の表面と、一次側の表面と対向する二次側の表面と、を備え、ウイルス除去膜の断面において、一次側から二次側にむけて孔径が減少した後増加に転じてもよい。
　上記の精製方法において、ウイルス除去膜が、単量体の精製溶液が供給される一次側の表面と、一次側の表面と対向する二次側の表面と、を備え、ウイルス除去膜の断面において、一次側から二次側にむけて孔径が減少した後、一定となり、二次側の表面付近に最も緻密な層を備えていてもよい。
　上記の精製方法において、ウイルス除去膜が、セルロースを含んでいてもよい。あるいは、ウイルス除去膜が、親水化された合成高分子を含んでいてもよい。
　上記の精製方法において、精製工程と、ウイルス除去工程との間に他の工程を含まないようにしてもよい。また、精製工程とウイルス除去工程を連続プロセスで行ってもよい。
　上記の精製方法において、目的タンパク質が抗体であってもよい。抗体がモノクローナル抗体であってもよい。目的タンパク質がリコンビナントタンパク質であってもよい。
　本発明に係るタンパク質の精製方法によれば、ウイルス除去工程における透過流速の低下を抑制することが可能となる。
本発明の実施の形態に係る中空糸膜の形状を有するウイルス除去膜の模式図である。 本発明の参考例に係る中空糸膜の形状を有するウイルス除去膜におけるウイルス捕捉部位の模式図である。 本発明の実施の形態に係る中空糸膜の形状を有するウイルス除去膜におけるウイルス捕捉部位の模式図である。 本発明の実施の形態に係る平膜の形状を有するウイルス除去膜の模式図である。 参考例１に係る抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。 図５のグラフの拡大図である。 参考例１から２９及び参考比較例１から３の結果を示す表である。 参考例３０の結果を示す表である。 参考例３１、３２の結果を示す表である。 実施例１、参考例３３、及び比較例１、２の結果を示す表である。 実施例１及び比較例１の結果を示すグラフである。
　以下、本発明の好適な実施の形態（以下、「実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
　実施の形態に係るタンパク質の精製方法は、目的タンパク質の単量体と凝集体とを含む溶液を用意することと、少なくとも１種類の弱カチオン交換基を備え、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高いカチオン交換クロマトグラフィー担体を用いて、目的タンパク質の凝集体を除去し、単量体の精製溶液を得ることと、ウイルス対数除去率が３以上のウイルス除去膜を用いて、精製溶液からウイルスを除去することと、を備える。
　目的タンパク質とは、例えば、抗体タンパク質である。目的タンパク質の凝集体とは、例えば、目的タンパク質（それ自体は２量体等の会合体であってもよい）の２量体及び３量体等の低次の凝集体、４量体以上の高次の凝集体、及びそれらの混合物の少なくともいずれかを指す。目的タンパク質の凝集体は、例えば、目的タンパク質の単量体が複数凝集して形成される。
　抗体タンパク質は、生化学における一般的な定義のとおり、脊椎動物の感染防禦機構としてＢリンパ球が産生する糖タンパク質分子（ガンマグロブリン又は免疫グロブリンともいう）である。例えば、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体で精製される抗体タンパク質は、ヒトの医薬品として使用され、投与対象であるヒトの体内にある抗体タンパク質と実質的に同一の構造を有する。
　抗体タンパク質は、ヒト抗体タンパク質であってもよく、ヒト以外のウシ及びマウス等の哺乳動物由来抗体タンパク質であってもよい。あるいは、抗体タンパク質は、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質、及びヒト化抗体タンパク質であってもよい。ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質とは、可変領域がマウスなどのヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域がヒト由来の免疫グロブリンに置換された抗体タンパク質である。また、ヒト化抗体タンパク質とは、可変領域のうち、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ：　ＣＤＲ）がヒト以外の生物由来であるが、その他のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ：　ＦＲ）がヒト由来である抗体タンパク質である。ヒト化抗体タンパク質は、キメラ抗体タンパク質よりも免疫原性がさらに低減される。
　実施の形態に係る精製方法の精製対象の一例である抗体タンパク質のクラス（アイソタイプ）及びサブクラスは特に限定されない。例えば、抗体タンパク質は、定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，及びＩｇＥの５種類のクラスに分類される。しかし、実施の形態に係る精製方法が精製対象とする抗体タンパク質は、５種類のクラスの何れであってもよい。また、ヒト抗体タンパク質においては、ＩｇＧにはＩｇＧ１～ＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがある。しかし、実施の形態に係る精製方法が精製対象とする抗体タンパク質のサブクラスは、いずれであってもよい。なお、Ｆｃ領域にタンパク質を結合したＦｃ融合タンパク質等の抗体関連タンパク質も、実施の形態に係る精製方法が精製対象とする抗体タンパク質に含まれ得る。
　抗体タンパク質は、由来によっても分類することができる。しかし、実施の形態に係る精製方法が精製対象とする抗体タンパク質は、天然のヒト抗体タンパク質、遺伝子組換え技術により製造された組換えヒト抗体タンパク質、モノクローナル抗体タンパク質、及びポリクローナル抗体タンパク質の何れであってもよい。これらの抗体タンパク質の中でも、抗体医薬としての需要や重要性の観点から、ヒトＩｇＧが好適であるが、これに限定されない。
　実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、膜状基材と、膜状基材の表面に固定された共重合体と、を備え、共重合体が、モノマー単位として（メタ）アクリルアミド類化合物及び／又は（メタ）アクリレート類化合物を含み、当該担体の体積あたり３０ｍｍｏｌ／Ｌより高い密度、好ましくは４０ｍｍｏｌ／Ｌより高い密度、より好ましくは４５ｍｍｏｌ／Ｌより高い密度、さらに好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌより高い密度で、少なくとも弱カチオン交換基を含む１又は複数種類のカチオン交換基を有する。
　「（メタ）アクリルアミド類化合物」とは、アクリルアミドを基本骨格に持つモノマーないしはモノマー単位であり、基本骨格以外の構造により、親水性にも疎水性にもなり得る。また、「（メタ）アクリレート類化合物」とは、アクリレートを基本骨格に持つモノマーないしはモノマー単位であり、基本骨格以外の構造により、親水性にも疎水性にもなり得る。
　「密度」とは、カチオン交換クロマトグラフィー担体１リットル当たりのカチオン交換基のモル数の濃度として一般的に表される、カチオン交換クロマトグラフィー担体におけるカチオン交換基の濃度を意味する。「カチオン」は陽イオンとも表現され、「アニオン」は陰イオンとも表現される。また、「担体」は、交換体、吸着剤、固定相とも表現される。
　実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体が備える膜状基材の形状は、特に限定されないが、形状としては、中空糸状、平膜状、不織布状、モノリス、キャピラリー、焼結体、円板または円筒状等が挙げられる。また、材料も特に限定を受けないが、ポリオレフィン系重合体や、ポリアミド（ナイロン）、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、セルロース等から構成されていることが好ましい。
　ポリオレフィン系重合体としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン及びフッ化ビニリデンなどのオレフィン単独重合体、該オレフィンの２種以上の共重合体、又は１種もしくは２種以上のオレフィンと、パーハロゲン化オレフィンと、の共重合体などが挙げられる。パーハロゲン化オレフィンとしては、テトラフルオロエチレン及び／又はクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。これらの中でも、機械的強度に優れ、かつタンパク質などの夾雑物の高い吸着容量が得られる点で、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンが好ましい。また、ポリアミドとしては特に限定を受けないが、ナイロン６（ε－カプロラクタムの重縮合体）、ナイロン１１（ウンデカンラクタムの重縮合体）、ナイロン１２（ラウリルラクタムの重縮合体）、ナイロン６６（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６１０（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６Ｔ（ヘキサメチレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン９Ｔ（ノナンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロンＭ５Ｔ（メチルペンタンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン６２１（カプロラクタムとラウリルラクタムの共縮重合体）、ｐ－フェニレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体、並びにｍ－フェニレンジアミンとイソフタル酸の共縮重合体等が挙げられる。ポリエステルとしては、特に限定を受けないが、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、及びポリブチレンナフタレート等が挙げられる。
　膜状基材は、例えば複数の細孔を有する。細孔径は、特に限定されないが、基材が中空糸状の場合は、例えば５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上、さらに好ましくは１００ｎｍ以上、特に好ましくは１５０ｎｍ以上、あるいは４００ｎｍ以上である。また、基材膜表面積の観点から、細孔径は、特に限定されないが、好ましくは９００ｎｍ以下、より好ましくは８００ｎｍ以下、さらに好ましくは７００ｎｍ以下、特に好ましくは６５０ｎｍ以下である。細孔径が５ｎｍ以下であると、分離できる抗体タンパク質の分子量が低くなる傾向にある。また細孔径が１０００ｎｍ以上であると、当該膜状基材の表面積が少なくなり、不純物の結合容量が小さくなる傾向にある。
　また、後述のグラフト率が高い場合や、共重合体中の親水性モノマーが占める割合が高い場合、中空糸膜の細孔が塞がりやすい傾向にある。このような場合、４００ｎｍ以上６５０ｎｍ以下程度の孔径が好ましい。
　また、基材が平膜状や不織布状の場合、基材を膜として用いる際に、支持体を用いることが可能であることや、積層しての使用が可能であるため、細孔径の好適範囲が広くなる。好ましい範囲としては、１０ｎｍ以上１ｍｍ以下であり、好ましくは１００ｎｍ以上、より好ましくは２００ｎｍ以上、さらに好ましくは３００ｎｍ以上である。また表面積の観点から、細孔径は、しくは５００ｕｍ以下、より好ましくは３００ｕｍ以下、さらに好ましくは１００ｕｍ以下である。
　実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、弱カチオン交換基を少なくとも有し、かつ、当該担体の体積あたり３０ｍｍｏｌ／Ｌよりも高い密度で１又は複数種類のカチオン交換基を有する。
　弱カチオン交換基とはカルボン酸基、ホスホン酸基、及びリン酸基等が挙げられる。弱カチオン交換基は、移動相のｐＨにより、荷電量を変化させることが可能である。そのため、移動相のｐＨを変化させることにより、カチオン交換クロマトグラフィー担体の電荷密度の調整が可能となる。
　弱カチオン交換基の導入方法として、弱カチオン交換基を有するモノマーを共重合させる方法がある。そのようなモノマーとして、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸化合物、及びメタクリル酸化合物等が挙げられる。アクリル酸化合物としては、２－アクリロキシエチルコハク酸、２－アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、及び２－アクリロイロキシエチルフタル酸等が挙げられる。メタクリル酸化合物としては、２－メタクリロキシエチルコハク酸、２－メタクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、及び２－メタクリロイロキシエチルフタル酸等が挙げられる。
　また、弱カチオン交換基に変換可能なモノマーを共重合させ、その後官能基変換により、弱カチオン交換基を導入してもよい。このような官能基としてエステル類等があり、ｔ－ブチルアクリレート、ｔ－ブチルメタクリレート、ベンジルアクリレート、ベンジルメタクリレート、アリルアクリレート、及びアリルメタクリレート等のモノマーが挙げられる。これらをモノマーとして共重合に用いた後、酸性条件により脱保護し、カルボン酸基へと変換できる。
　実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、少なくとも１種類の弱カチオン交換基を有していれば、強カチオン交換基を有していてもよく、あるいは強カチオン交換基を有していなくとも、弱カチオン交換基のみを有していればよく、カチオン交換基の合計で当該担体の体積あたりの密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌよりも高ければよい。
　例えば、カチオン交換クロマトグラフィー担体に、強カチオン交換基を導入することによって、ｐＨに対する荷電量変化を鈍感にさせ、再現性を向上させることが可能となる。ほぼ全ての強カチオン交換基は、抗体精製における実用的な抗体溶液のｐＨ領域で荷電しているため、荷電量が一定である。したがって、カチオン交換クロマトグラフィー担体に強カチオン交換基が存在することで、常に一定以上の荷電量が保証される。さらに、ｐＨを変化させることにより、弱カチオン交換基の荷電量を調整し、カチオン交換クロマトグラフィー担体全体の荷電量を微調整することが出来る。カチオン交換クロマトグラフィー担体に強カチオン交換基が存在することで、ｐＨの微変化によってカチオン交換クロマトグラフィー担体の性能が大きく左右されることを抑制することが可能である。強カチオン交換基としては、スルホン酸基等が挙げられる。
　３０ｍｍｏｌ／Ｌよりもカチオン交換基の合計密度が低ければ、荷電させることが可能なカチオン交換基量が少なくなり、吸着容量が低く、処理できる抗体量が低くなる傾向にある。特許文献３では、強カチオン交換基を用い、カチオン交換基の密度を３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、フロースルー精製における、抗体の単量体と凝集体の選択性を発現している。しかし、カチオン交換基の密度が低密度であるため、吸着容量が小さくなり、処理できる抗体量が少ない。また、カチオン交換基の密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であると、荷電可能量範囲が狭くなり、適用できる抗体種が狭くなる傾向にある。
　なお、カチオン交換基の合計で当該担体の体積あたりの密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌよりも高ければよいが、このうち、弱カチオン交換基の密度が、５ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは１０ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であれば、電荷密度の調整が可能となる。また、当該担体の体積あたり１０００ｍｍｏｌ／Ｌより低い密度、好ましくは７００ｍｍｏｌ／Ｌより低い密度、より好ましくは５００ｍｍｏｌ／Ｌより低い密度、さらに好ましくは４００ｍｍｏｌ／Ｌより低い密度で、少なくとも弱カチオン交換基を含む１又は複数種類のカチオン交換基を担体が有していてもよい。カチオン交換基の合計密度がこの範囲にあると、目的タンパク質の凝集体の分離を効率よく行うことが可能である。
　実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体が備える共重合体は、膜状基材に固定されており、例えば共有結合により膜状基材に固定されている。当該担体は、少なくとも弱カチオン交換基を有し、かつ、最終的に３０ｍｍｏｌ／Ｌよりも高い密度になるように１又は複数種類のカチオン交換基を有しておればよい。
　膜状基材に共重合体を固定する方法として、グラフト重合がある。グラフト重合法としては、放射線グラフト重合法や、表面リビングラジカル重合法が挙げられる。
　放射線グラフト重合法で膜状基材表面に共重合体を固定する場合、膜状基材にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用しうるが、膜状基材に電離性放射線を照射すると、膜状基材全体に均一なラジカルが生成するため、好適である。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線はコバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、又はＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等により得られる。
　電離性放射線の照射線量は、１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ未満では、ラジカルが均一に生成しにくくなる傾向にある。また、照射線量が１０００ｋＧｙを超えると、膜状基材の物理的強度の低下を引き起こす傾向にある。
　電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に膜状基材にラジカルを生成した後、次いでラジカルを反応性化合物と接触させる前照射法と、膜状基材を反応性化合物と接触させた状態で膜状基材にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。実施の形態においては、いかなる方法も適用しうるが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。
　実施の形態において共重合体の重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、メタノールやエタノール、イソプロパノール、ｔ－ブチルアルコール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２－ブタノン等のケトン類、水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
　共重合体は、その組成に、カチオン交換基を有するモノマー単位に加え、アクリルアミド類、メタアクリルアミド類、アクリレート類、メタアクリレート類の化合物をモノマー単位として１又は複数種類含む。共重合体は、アクリルアミド類、メタアクリルアミド類、アクリレート類、メタアクリレート類の組み合わせのみから成っていてもよいし、メタアクリレート類のみからなっていてもよい。さらに、共重合体は、その組成に、荷電を持たない中性モノマーである、親水性及び／又は疎水性の化合物をモノマー単位として１又は複数種類含んでいてもよい。これらのモノマー単位は、カチオン交換クロマトグラフィーを洗浄する際の一般的な酸や塩基条件に対して安定であり、洗浄による性能低下が起こり難く、さらに膜の強度を下げにくい傾向にある。これらの親水性及び／又は疎水性モノマーを、カチオン交換基を有するモノマーと共重合させることにより、カチオン交換基同士の距離を離し、より選択的に抗体の凝集体を吸着しやすくなると考えられる。この他のモノマー単位の例として、例えば、アクリルニトリルがあるが、アクリルニトリルは、アルカリにより加水分解されやすいため、アクリルニトリルをモノマー単位として用いると、アルカリ洗浄により性能が損なわれる傾向にあるため好ましくない。また、スチレン類等の芳香族を含むモノマー単位は膜を堅くし、脆くなる傾向にあるため好ましくない。さらに、抗体の単量体と抗体の凝集体の吸着力の差別化の観点から、共重合体において、中性モノマーである、親水性モノマー単位及び／又は疎水性モノマー単位の質量割合が、カチオン交換を有するモノマー単位の質量割合よりも高いことが好ましく、より好ましくは、２倍以上であり、さらに好ましくは３倍以上である。
　実施の形態において、共重合体は、カチオン交換基を有するモノマー及び中性モノマーのみから成り立っているため、カチオン交換基を有するモノマーの質量、及び中性モノマーの質量は、以下のように求めることが出来る。
　（カチオン交換基モノマー質量）＝
　　　　　　　　　（カチオン交換基密度×担体体積×カチオン交換基モノマー分子量）
　（中性モノマーの質量）＝
　　　　　　　（カチオン交換担体質量―基材担体質量―カチオン交換基モノマー質量）
　これらの質量比により、カチオン交換基を有するモノマー単位の質量割合、及び中性のモノマー単位の質量割合を求めることができる。
　また、抗体は疎水性相互作用の性質を有するため、膜状基材の疎水性が強いと、疎水性相互作用により、抗体が膜状基材に吸着され、目的の抗体の回収率が低下することがある。この現象に対し、共重合体の重合時に親水性モノマーを導入することにより、抗体が膜状基材へ吸着することを防ぐことが出来る。そのような親水性モノマーとして、アクリルアミド、メタアクリルアミド、並びにジメチルアクリルアミド、ジメチルメタクリルアミド、ジエチルアクリルアミド、ジエチルメタクリルアミド、Ｎ－メチルアクリルアミド、Ｎ－メチルメタクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－エチルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－（ヒドロキシメチル）メタクリルアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アクリルアミド、及びＮ－（２－ヒドロキシエチル）メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物が挙げられる。あるいは、上記のような親水性モノマーとして、アクリレート、メタアクリレート、並びに２－ヒドロキシエチルアクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、３－ヒドロキシプロピルアクリレート、３－ヒドロキシプロピルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、４－ヒドロキシブチルメタクリレート、２－（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、及び２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート等の（メタ）アクリレート化合物が挙げられる。
　あるいは、共重合体の重合時に疎水性モノマーを導入し、疎水性相互作用を活かすことにより抗体の単量体に対する抗体の凝集体の吸着選択性を上げることもできる。一般に抗体の凝集体は、抗体の単量体よりも強い疎水性相互作用を示す。適した疎水性モノマーを選択することにより、抗体の単量体の疎水性相互作用と、抗体の凝集体の疎水性相互作用と、の差を顕著にし、高い選択性を実現し得る。そのような疎水性モノマーとして、スチレン類、アルキルアクリルアミド類、アルキルメタクリルアミド類、アルキルアクリレート類、及びアルキルメタクリレート類等があるが、力学的強度の観点から、アルキルアクリルアミド類、アルキルメタクリルアミド類、アルキルアクリレート類、及びアルキルメタクリレート類が望ましい。アルキル基に関しては、炭素数４以上の直鎖又は分岐状のアルキル基であれば、抗体に対し、実質的に疎水性相互作用を発現しうる。　
　また、共重合体は、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位を含まず、架橋構造を持たなくてもよい。あるいは、共重合体は、モノマー単位中に重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位を含み、架橋構造を有していてもよい。しかし、共重合体は、実質的に非架橋構造であることが好ましい。実質的に非架橋であるとは、架橋構造を有していても実質的に抗体の凝集体の吸着性能に影響を及ぼさない程度に架橋度の低いことをいう。共重合体が実質的に非架橋である場合、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位の質量割合は、例えば、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、又は０．１％以下であり、低いほど好ましい。　
　モノマー中に重合性官能基を２つ以上含むモノマーは、特に限定されないが、重合性官能基としてはオレフィンが挙げられる。そのようなモノマーとして、（メタ）アクリルアミド系モノマーや（メタ）アクリレート系モノマー、又はそれらの官能基が混合したモノマーが挙げられる。（メタ）アクリルアミド系モノマーとしては、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－プロピレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－（１，２－ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－エチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－プロピレンビスメタクリルアミド、及びＮ，Ｎ’－（１，２－ジヒドロキシエチレン）ビスメタクリルアミド等が挙げられる。
　（メタ）アクリレート系モノマーとしては、エチレングリコールジアクリレート、１，３－ブタンジオールジアクリレート、１，４－ブタンジオールジアクリレート、１，５－ペンタンジオールジアクリレート、１，６－ヘキサンジオールジアクリレート、１，９－ノナンジオールジアクリレート、１，１０－デカンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、ジエチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、ジプロピレングリコールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、２－ヒドロキシ－１，３－プロパンジオールジアクリレート、４、４’－チオジベンゼンチオールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ペンタエリトリトールテトラアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、１，３－ブタンジオールジメタクリレート、１，４－ブタンジオールジメタクリレート、１，５－ペンタンジオールジメタクリレート、１，６－ヘキサンジオールジメタクリレート、１，９－ノナンジオールジメタクリレート、１，１０－デカンジオールジメタクリレート、ネオペンチルグリコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ジプロピレングリコールジメタクリレート、トリプロピレングリコールジメタクリレート、２－ヒドロキシ－１，３－プロパンジオールジメタクリレート、４、４’－チオジベンゼンチオールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、及びペンタエリトリトールテトラメタクリレート等が挙げられる。
　グラフト重合によるグラフト鎖の結合率（グラフト率）は、基材膜の密度により、最適値が異なりうる。基材膜がポリエチレンの時は、吸着容量の観点から２０％以上が好ましく、より好ましくは２５％以上、さらに好ましくは３０％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、さらに好ましくは１００％以下である。グラフト率は以下の式によって表わされる。
　ｄｇ（％）＝（ｗ１－ｗ０）／ｗ０×１００
　ここで、ｗ０は反応前の多孔質中空糸の重量、ｗ１はグラフト鎖が導入された多孔質中空糸の重量である。
　基材膜がポリフッ化ビニリデンの時は、ポリフッ化ビニリデンはポリエチレンに比べ、密度が高いため、適したグラフト率がポリエチレンの時と異なる。基材膜がポリフッ化ビニリデンの時は、吸着容量の観点から５％以上が好ましく、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは１００％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下である。
　また、カチオン交換基を有する共重合体が膜状基材に固定されていることにより、膜状基材表面上にカチオン交換基が分布している場合に比べ、立体的に吸着することが可能となる。そのため、抗体の単量体に比べ、抗体の凝集体はより強固に基材に吸着され、抗体の単量体を高い純度で得ることが可能となる。したがって、共重合体が、少なくとも弱カチオン交換基を有し、１又は複数種類のカチオン交換基を有していることが好ましい。また、共重合体が架橋構造であると、共重合体の立ち上がりを抑えることにより、通液圧を抑制するといったメリットがあるが、抗体の凝集体が基材に立体的に吸着することが妨げられるため、抗体の単量体に比べて抗体の凝集体をより強固に吸着し抗体の単量体を高い純度で得ることを可能とする観点からは、共重合体は実質的に非架橋構造であることが望ましい。
　また、共重合体において親水性モノマーが少ないと、共重合体が伸縮して抗体の凝集体の立体的な吸着が不可能となるため、抗体の凝集体の立体的な吸着をするには、ある程度以上の含有量が必要である。そのような共重合体中の親水性モノマーの質量割合として、３０％以上が好ましく、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上である。また、疎水性モノマーの質量割合に比べ、親水性モノマーの割が高いことが望ましい。好ましくは１．３倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは１．７倍以上、特に好ましくは１．９倍以上である。親水性モノマーおよび疎水性モノマーの質量割合は最終生成物から熱分解ＧＣ／ＭＳによって検出され得る。または、合成時の仕込み組成比と一致するとして算出することもできる。グラフト重合であれば、共重合体中の親水性モノマーの質量割合は、仕込み時の全モノマーの中の親水性モノマーの質量割合である。
　強カチオン交換基密度と弱カチオン交換基密度の合計である全カチオン交換基密度を求める方法として、強酸などを用いてカチオン交換基を全てプロトン化した後に、塩基を用いて中和し、逆滴定により測定する方法がある。また、カチオン交換基のカウンターカチオンをリチウムイオンに置換した後に、強酸で処理し、溶出するリチウムの量を測定する方法もある。これらの方法により、全カチオン交換基密度が測定できる。
　また、強カチオン交換基密度を測定する方法として、例えば、強酸などを用いて強カチオン交換基を全てプロトン化した後に、塩化ナトリウム水溶液を加え、溶出してくる塩化水素を滴定することにより測定することが可能である。
　弱カチオン交換基密度は、全カチオン交換基密度から、強カチオン交換基密度を差し引くことにより求めることが出来る。
　実施の形態に係る精製方法は、タンパク質の単量体とタンパク質の凝集体とを含む混合溶液から、タンパク質の単量体を精製する精製方法であって、上述したカチオン交換クロマトグラフィー担体に対し、混合溶液を接触させることを含む。上述したカチオン交換クロマトグラフィー担体によるタンパク質の単量体の回収率は、例えば７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である。目的タンパク質の単量体の回収率は、下記式に基づいて算出される。なお、下記式において、目的タンパク質を含む水溶液の処理量とは、カチオン交換クロマトグラフィー担体に導入された目的タンパク質を含む水溶液の全量である。
　　目的タンパク質の回収率（％）＝（目的タンパク質水溶液の回収量（ｍＬ）×回収水溶液における目的タンパク質単量体の含有量（ｍｇ／ｍＬ））／（目的タンパク質を含む水溶液の処理量（ｍＬ）×処理前の水溶液における目的タンパク質単量体の含有量（ｍｇ／ｍＬ））×１００
　フロースルーとは、目的タンパク質の単量体がカチオン交換クロマトグラフィー担体をフロースルーすることを意図する精製方法をいう。例えば、抗体タンパク質の単量体が目的物で、抗体タンパク質の凝集体が不純物である場合、抗体タンパク質の単量体は概してカチオン交換クロマトグラフィー担体の表面を流れ、抗体タンパク質の凝集体が概してカチオン交換クロマトグラフィー担体に吸着される。この時、抗体タンパク質の単量体は、カチオン交換クロマトグラフィー担体に吸着されてもよいが、抗体タンパク質の凝集体がより選択的に吸着剤に吸着されることにより、抗体タンパク質の単量体が精製される。
　カチオン交換クロマトグラフィー担体に導入される移動相としては、強酸、強アルカリ以外の緩衝液（バッファー）を利用すればよく、有機溶媒を必要としないものである。ここで、緩衝液とは塩類を含む水溶液であって、具体的には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、及び酢酸緩衝液等が挙げられるが、通常利用される緩衝液であれば特に限定されるものではない。その塩類の濃度は０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌ以上３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。また、バッファー濃度は１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ以上７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。ここで、バッファー濃度とは、バッファーの有効成分の濃度のことをいう。例えば、酢酸バッファーであれば、通常酢酸と酢酸ナトリウムから調製されるが、その時の、酢酸と酢酸ナトリウムの合計の濃度である。また、トリスバッファーでは、トリスヒドロキシメチルアミノメタンの濃度のことをいう。また、酢酸－トリスバッファー等のように表記されるバッファーについては、前者の濃度のことであり、酢酸－トリスでは酢酸、トリス－酢酸であればトリスの濃度のことである。また、本実施形態では、緩衝能をほとんど持たないｐＨの溶液（例えば、ｐＨ３．４の酢酸緩衝液）も、クロマトグラフィーに用いることができる。
　緩衝溶液における無機塩類の濃度は、１００ｍｍｏｌ／Ｌより高いと、イオン交換基の乖離度が低くなり、カチオン交換クロマトグラフィー担体が凝集体等の不純物を保持することが困難となる傾向にある。
　目的タンパク質を含む水溶液の電気伝導度は、０．５ｍＳ／ｃｍ以上２０ｍＳ／ｃｍ以下であり、より好ましくは、０．５ｍＳ／ｃｍ以上１５ｍＳ／ｃｍ以下、さらに好ましくは０．５ｍＳ／ｃｍ以上１０ｍＳ／ｃｍ以下、特に好ましくは、０．８ｍＳ／ｃｍ以上５．０ｍＳ／ｃｍ以下である。電気伝導度が２０ｍＳ／ｃｍを超えると、遮蔽効果が大きくなり、カチオン交換クロマトグラフィー担体が凝集体等の不純物を保持することが困難となる傾向にある。
　緩衝液の水素イオン濃度は、処理する抗体タンパク質の等電点や、大きさなどにより異なり、適宜最適条件を検討する必要があるが、例えばｐＨ４．０以上ｐＨ１０．０以下であり、好ましくはｐＨ５．０以上ｐＨ９．５以下であり、さらに好ましくはｐＨ６．０以上ｐＨ９．０以下、特に好ましくはｐＨ６．５以上ｐＨ８．０以下である。抗体タンパク質の等電点付近になると、抗体タンパク質同士の静電反発が小さくなり、凝集しやすい傾向にある。また、ｐＨが４．０より低くなると、抗体タンパク質の変性が起こり、活性の低下や、凝集体の精製等、品質低下が引き起こされる傾向にある。
　カチオン交換クロマトグラフィー工程における抗体ロード量は、不純物を除去できれば特に限定を受けないが、担体１ｍＬあたり１００ｍｇ以上であり、効率的な精製という観点から、担体１ｍＬあたり３００ｍｇ以上が好ましく、より好ましくは５００ｍｇ以上、さらに好ましくは７００ｍｇ以上、またさらに好ましくは０．８ｇ以上、特に好ましくは１ｇ以上である。
　カチオン交換クロマトグラフィー工程において、担体１ｍＬに対し、単量体と凝集体を含む抗体１００ｍｇ以上をフロースルー精製した時に、抗体の凝集体の割合は５０％以上低減され、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上低減される。
　精製工程で得られた単量体の精製溶液は、ウイルス対数除去率が３以上のウイルス除去膜に導入される。ここで、単量体の精製溶液を濃縮したり、精製溶液の液性を調整したりすると、単量体から凝集体が形成される場合がある。そのため、精製工程と、ウイルス除去工程との間に、他の工程を含まないことが好ましい。また、時間の経過とともに、単量体から凝集体が形成される場合がある。そのため、精製工程で得られた単量体の精製溶液を貯蔵することなく、すぐにウイルス除去膜に導入するのが好ましく、例えば、精製工程とウイルス除去工程を連続プロセスで行ってもよい。
　ウイルス除去膜は、ウイルス対数除去率が３．００以上であれば特に限定されない。例えば、国際公開第２００３／０２６７７９号、国際公開第２００４／０３５１８０号、国際公開第２０１５／１５６４０１号、及び国際公開第２０１５／１５６４０３号に開示されたウイルス除去膜が使用可能である。
　例えば、図１に示すように、ウイルス除去膜１０は、タンパク質を含有する溶液が供給される一次側の表面１と、当該ウイルス除去膜１０を透過した透過液が排出される二次側の表面２と、を有する。
　ウイルス除去膜１０で除去される小ウイルスは、例えば１０ないし３０ｎｍ、あるいは１８ないし２４ｎｍの直径を有する。ウイルスの具体例としては、パルボウイルスが挙げられる。パルボウイルスは、約２０ｎｍの直径を有する。ウイルス除去膜１０は、その断面において、ウイルスが捕捉されるウイルス捕捉部位を有する。ウイルス除去膜１０においては、溶液が進入するろ過面（一次側の表面１）上の場所によらず、断面において、ウイルス捕捉部位におけるウイルス捕捉量が均一であることが好ましい。これは、ウイルス除去膜１０のウイルス捕捉量が、ろ過面上の場所によって不均一である場合、ろ過面上のある箇所に溶液が集中することとなり、部分的にその箇所へのウイルスの負荷量が増えることになるため、高圧条件下で大容量のろ過を行うと、その箇所からウイルスが漏れる可能性があるからである。また、ウイルス除去膜１０が中空糸膜の形状を有する場合は、周回方向において、ウイルス捕捉部位におけるウイルス捕捉量が、図２に示すように不均一であることがなく、図３に示すように均一であることが好ましい。
　さらに、ウイルス除去膜１０は、ウイルスが捕捉される部位の厚みが、ウイルス捕捉部位内で均一であることが好ましい。また、ウイルス除去膜１０が中空糸膜の形状を有する場合は、周回方向において、ウイルス捕捉部位の厚みが均一であることが好ましい。ウイルス捕捉部位の厚みが均一であると、周回方向に均一に溶液が広がって、ウイルスが漏れる可能性が低下するためである。
　ウイルス除去膜１０の構造は、一次側から二次側に向けて、空孔の孔径が減少した後、増加に転じる非対称構造であることが好ましい。ウイルス除去膜１０の断面において、ウイルス捕捉部位は、空孔の孔径が最小となる部位を含む。空孔の孔径が最小となる部位を含む構造は、ウイルス除去性の向上に効果的である。
　ここで、ウイルス除去膜１０に捕捉されたウイルスを視覚的に検出することは、困難である場合がある。これに対し、金コロイドは、ウイルスと同程度の直径を有しながら光を透過させないことから、視覚的に検出することが容易である。そのため、例えば、金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した後、ウイルス除去膜１０の断面における、金コロイドを捕捉したウイルス除去膜１０の金コロイド捕捉部位の相対的な輝度を測定することにより、ウイルス除去膜１０の特性を評価することが可能である。
　実施の形態に係るウイルス除去膜１０について、一次側の表面１からウイルス除去膜１０に直径２０ｎｍの金コロイドを含有する溶液を供給してウイルス除去膜１０で金コロイドを捕捉し、ウイルス除去膜１０の断面において輝度を測定するとき、輝度の変位のスペクトルの面積値の標準偏差を輝度の変位のスペクトルの面積値の平均値で除した値は、０．０１以上１．５０以下である。この値は、ウイルス除去膜１０における金コロイドの捕捉量の変動係数を示しており、小さいほど、ウイルス除去膜１０における金コロイド捕捉部位における金コロイドの捕捉量の均一性が高いことを示している。
　実施の形態に係るウイルス除去膜１０について、上記の変動係数を示す値は、０．０１以上１．５０以下、０．０１以上１．４０以下、０．０１以上１．３０以下、０．０１以上１．２０以下、０．０１以上１．１０以下、あるいは０．０１以上１．００以下である。変動係数について、０．０１未満は測定限界である。また、変動係数が１．５０より大きいと、膜の周回方向の少なくともある一箇所に溶液が集中しうるため、ウイルスが漏れる可能性がある。
　上記の変動係数が０．０１以上１．５０以下であれば、膜のウイルス捕捉部位（中空糸膜については周回方向）において、ウイルスが均一に捕捉されることとなり、ウイルス除去膜に負荷するウイルスの総量（ウイルスのタンパク製剤に対するスパイク量、又は総ろ過量）が増加した場合においても、高いウイルス除去性能を保つことができる。
　上記の変動係数は、例えば以下の方法により測定される。金コロイド溶液をろ過した後のウイルス除去膜から切片を切り出し、切片の断面において金コロイドによって染まった部分の複数箇所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡で測定する。金コロイドは光を吸収するため、輝度の変位は、金コロイドの捕捉量に依存する。なお、必要に応じて、輝度プロファイルからバックグランドノイズを除去してもよい。その後、横軸に膜厚、縦軸に輝度の変位を有するグラフを作成し、グラフに現れた輝度の変位のスペクトルの面積を算出する。さらに、複数箇所における輝度の変位のスペクトルの面積の標準偏差を、複数箇所における輝度の変位のスペクトルの面積の平均で除した値を、ウイルス除去膜１０における金コロイド捕捉部位の金コロイドの捕捉量の変動係数を示す値として算出する。
　湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径２０ｎｍ以上３０ｎｍ以下の金コロイドを捕捉する部位の厚さは、１０．０μｍ以上３０．０μｍ以下、１０．０μｍ以上２５．０μｍ以下、１０．０μｍ以上２２．０μｍ以下、１０．０μｍ以上２０．０μｍ以下、好ましくは１１．０μｍ以上２０．０μｍ以下、より好ましくは１２．０μｍ以上２０．０μｍ以下、さらに好ましくは１３．０μｍ以上２０．０μｍ以下である。金コロイド捕捉部位の厚さが３０．０μｍより厚いと、金コロイド含有溶液のみならず、ウイルス含有溶液のろ過の効率が低下する傾向にある。また１０μｍよりも薄いとウイルス除去膜に負荷するウイルスの総量（ウイルスのタンパク製剤に対するスパイク量又は総ろ過量）が増加した場合にウイルスが漏れる可能性があるので、好ましくない。
　直径２０ｎｍ以上直径３０ｎｍ以下の金コロイド捕捉部位の厚さは、例えば以下の方法により取得される。直径２０ｎｍ及び３０ｎｍの金コロイド溶液をそれぞれろ過したウイルス除去膜から切片を切り出す。切片の断面において金コロイドによって染まった部分複数箇所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡で測定する。ここで、膜厚方向において、ウイルス除去膜１０の一次側の表面１から、金コロイド捕捉部位の最も一次側の表面に近い部分までの第１の距離ａを測定する。また、膜厚方向において、ウイルス除去膜１０の一次側の表面１から、金コロイド捕捉部位の最も二次側の表面２に近い部分までの第２の距離ｂを測定する。
　次に、複数箇所のそれぞれにおいて、第１の距離ａを湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ａ（＝ａ／ｃの百分率表示）を算出し、複数箇所における値Ａの平均値を第１の到達度として算出する。また、複数箇所のそれぞれにおいて、第２の距離ｂを湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ｂ（＝ｂ／ｃの百分率表示）を算出し、複数箇所における値Ｂの平均値を第２の到達度として算出する。
　さらに、下記（１）式に示すように、直径２０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第２の到達度の平均値Ｂ２０と、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第１の到達度の平均値Ａ３０と、の差に、直径２０ｎｍの金コロイドをろ過した湿潤したウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃ２０と直径３０ｎｍの金コロイドをろ過し、湿潤したウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃ３０の平均値ＣＡＶＥを乗じた値を、直径２０ｎｍの金コロイド及び直径３０ｎｍの金コロイドを流通させた時に、ウイルス除去膜１０の断面において、直径２０ｎｍ以上３０ｎｍ以下の金コロイドが捕捉される部位の厚さＴとして算出する。金コロイド捕捉部位の厚さＴは、ウイルス除去膜の緻密層の厚さＴとも表現される。
　　Ｔ＝（Ｂ２０－Ａ３０）×ＣＡＶＥ （１）
　なお、上記の方法では、直径２０ｎｍ以上直径３０ｎｍ以下の金コロイド捕捉部位を、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第１の到達位置と、直径２０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第２の到達位置と、の間の領域の厚みとして求めているが、誤差の範囲を除いて、直径２０ｎｍ以上直径３０ｎｍ以下の金コロイドであれば、上記の範囲に捕捉されることを確認している。
　直径３０ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した場合、湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、光学顕微鏡で測定すると、例えば、一次側の表面１から膜厚の１５％以上６０％以下、あるいは２０％以上５５％以下のところにある。一次側の表面から膜厚の１５％未満の部位で直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、ウイルスや不純物が膜の一次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、目詰まりを起こす可能性が高くなる。また、一次側の表面から膜厚の６０％より遠い部位で直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、目的とするウイルスが膜の二次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、ウイルスが捕捉できない可能性がある。なお、一次側の表面１から、膜厚の１５％未満、又は、６０％より遠い領域に、直径３０ｎｍの金コロイドの少量が捕捉される場合であっても、光学顕微鏡による観察で定数（２５５）から測定した輝度プロファイルを引いた輝度の変位について、そのスペクトルの絶対値が、スペクトルの絶対値の最大値の１０％以下の場合は、当該ウイルス除去膜のウイルス除去能の観点から当該領域における金コロイドの捕捉は誤差の範囲内とみなすことができる。したがって、この場合、直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、一次側の表面１から膜厚の１５％以上６０％以下のところにあるものとみなしうる。
　金コロイドが捕捉される部位は、金コロイドが一次側の表面から二次側の表面にかけて膜厚方向に通液した際、膜構造によって、厚み方向に連続的に形成される場合と断続的に形成される場合がある。実施の形態に係るウイルス除去膜では一次側の表面の内側から二次側の表面内側にかけて、金コロイドが捕捉される部位が、連続的に形成されることが好ましい。通液方向に対して金コロイドが捕捉される部位が途切れることなく連続に形成されると、目詰まりが生じにくくなる。
　直径２０ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した場合、湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、光学顕微鏡で測定すると、例えば、一次側の表面１から膜厚の２５％以上８５％以下、あるいは３０％以上８０％以下のところにある。一次側の表面から膜厚の２５％未満の部位で直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、ウイルスや不純物が膜の一次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、目詰まりを起こす可能性が高くなる。また、一次側の表面から膜厚の８５％より遠い部位で直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、目的とするウイルスが膜の二次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、ウイルスが捕捉できない可能性がある。なお、直径３０ｎｍの金コロイドの場合と同様に、一次側の表面１から膜厚の２５％未満、又は、８５％より遠い領域で、金コロイドが観察されたとしても、光学顕微鏡による観察で定数（２５５）から測定した輝度プロファイルを引いた輝度の変位について、そのスペクトルの絶対値が、スペクトルの絶対値の最大値の１０％以下の場合は、誤差の範囲内とみなしうる。なお、実施の形態に係るウイルス除去膜では、直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、一次側の表面内側から二次側の表面内側にかけて、膜厚方向に連続して形成されることが好ましい。
　直径１５ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した場合、湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径１５ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、光学顕微鏡で測定すると、例えば、一次側の表面１から膜厚の６０％以上９０％以下好ましくは６０％以上８９％以下、６０％以上８８％以下、６０％以上８７％以下である。特に８７％以下にあると、ウイルスの捕捉において好ましい。さらに、８６％以下であるとより好ましい。一次側の表面から膜厚の６０％未満の部位で直径１５ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、ウイルスや不純物が膜の一次側表面に近い位置で捕捉されてしまい、目詰まりを起こす可能性が高くなる。また、一次側の表面から膜厚の９０％より遠い部位で直径１５ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、目的とするウイルスが膜の二次側表面に近い位置で捕捉されてしまい、ウイルスが捕捉できない可能性がある。なお、直径３０ｎｍ、２０ｎｍの金コロイドの場合と同様に、一次側の表面１から膜厚の６０％未満、又は、９０％より遠い領域で、金コロイドが観察されたとしても、光学顕微鏡による観察で定数（２５５）から測定した輝度プロファイルを引いた輝度の変位について、スペクトルの絶対値の最大値の１０％以下の場合は誤差の範囲内とみなしうる。なお、実施の形態に係るウイルス除去膜では、直径１５ｎｍの金コロイドが捕捉される部位層が、一次側の表面内側から二次側の表面内側にかけて、膜厚方向に連続して形成されることが好ましい。
　また、なお、直径３０ｎｍ、２０ｎｍ及び１５ｎｍの金コロイドの捕捉位置の測定については、あくまで、膜に捕捉された金コロイドについて、測定を行っている。したがって、膜に捕捉されず、膜を透過した金コロイドについては測定していないものである。つまり、膜に透過させた金コロイドの全てについて捕捉位置を測定したものではなく、膜に捕捉された金コロイドについて、その膜上の捕捉位置を測定したものである。
　直径１０ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過する場合、ウイルス除去膜１０の断面には直径１０ｎｍの金コロイドは、ほぼ捕捉されない。このことは、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）を用いた観察で、輝度のスペクトルを有意な値として検出できないことから確認できる。また、対数除去率が低くなることからも確認できる。なお、直径１０ｎｍの金コロイドが捕捉されないことは、ＩｇＧなどの直径１０ｎｍ程度の有用なタンパクの高い透過性を達成できることを示している。
　ウイルス除去膜１０の材質は、セルロースからなる。セルロースとしては、再生セルロース、天然セルロース、酢酸セルロース等を用いることができる。再生セルロースを製造する方法としては、銅アンモニアセルロース溶液から作成する方法(銅安法)や、酢酸セルロースをアルカリでケン化させて作成する方法（ケン化法）が挙げられる。
　あるいは、ウイルス除去膜１０の材質は、熱可塑性結晶性樹脂等の合成高分子であってもよい。耐熱性及び成型加工性のバランスの観点から、ポリオレフィン樹脂及びフッ素系樹脂が好適である。なお、疎水性の熱可塑性結晶性樹脂は、タンパク質等の吸着、膜の汚染、及び膜の目詰まり等が生じる場合があるので、親水性を付与することが好ましい。例えば、グラフト重合法により、疎水性の熱可塑性結晶性樹脂からなる膜に、親水性のグラフト鎖を付与するとよい。
　ウイルス除去膜１０は、例えば、中空糸膜の形状を有している。あるいは、ウイルス除去膜１０は、図４に示すように、平膜の形状を有していてもよい。中空糸膜であれば、膜面積が大きくても、膜を容器に装填して小型のフィルターを作成できる。
　図１に示すウイルス除去膜１０の膜厚は、例えば、乾燥状態で２４μｍ以上４１μｍ以下であり、好ましくは２４μｍ以上４０μｍ以下であり、より好ましくは２４μｍ以上３５μｍ以下であり、よりさらに好ましくは２４μｍ以上３０μｍ以下である。膜厚が２４μｍより薄いと膜の強度が低下し、ろ過圧に耐えられなくなる可能性があり、また４１μｍより厚いとろ過速度が低下する可能性がある。
　ウイルス除去膜１０が有する空孔の平均孔径は、例えば、１３ｎｍ以上２１ｎｍ以下であり、好ましくは１３ｎｍ以上２０．５ｎｍ以下であり、より好ましくは１３．５ｎｍ以上２０．５ｎｍ以下である。平均孔径が１３ｎｍより小さいとろ過速度が低下する可能性があり、また、２１ｎｍより大きいとウイルスが漏れる可能性がある。ウイルス除去膜１０の断面において、一次側から二次側に向けて、空孔の孔径は、減少した後増加に転じる。例えば、ウイルス除去膜１０の断面において、ウイルス捕捉部位は、空孔の孔径が最小となる部位を含む。
　あるいは、ウイルス除去膜１０の断面において、ウイルス除去膜の断面において、一次側から二次側にむけて孔径が減少する部分を少なくとも備えていてもよい。またあるいは、ウイルス除去膜１０の断面において、一次側から二次側にむけて孔径が減少した後、一定となり、二次側の表面付近に最も緻密な層を備えていてもよい。
　ウイルス除去膜１０によるウイルスの対数除去率（ＬＲＶ：Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ　Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　Ｖａｌｕｅ）は、例えば３．００以上、好ましくは４．００以上であれば、膜ろ過によりウイルスが十分に除去され、４．５０以上、５．００以上あるいは６．００以上であれば、より好ましい。ウイルスの対数除去率が６．００以上であれば、ウイルスが除去され、ほとんどウイルスが漏れないと考えられる。
　ウイルス除去膜１０による直径３０ｎｍの金コロイドの対数除去率（ＬＲＶ）は、例えば１．００以上、好ましくは１．２０以上である。ウイルス除去膜１０による直径２０ｎｍの金コロイドの対数除去率は、例えば１．００以上、好ましくは１．２０以上である。ウイルス除去膜１０による直径１５ｎｍの金コロイドの対数除去率は、例えば０．１０以上、好ましくは０．１５以上、より好ましくは０．２０以上である。ウイルス除去膜１０による直径１０ｎｍの金コロイドの対数除去率は、例えば、０．１０未満である。
　例えば、ウイルス除去膜１０の断面において、金コロイド捕捉部位は、孔径が最小となる部位を含む。
　ウイルス除去膜１０で測定されるバブルポイントは、例えば、１.２ＭＰａ以上１.８ＭＰａ以下である。ウイルス除去膜１０で測定される純水透過速度は、３０Ｌ／ｍ２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上１２０Ｌ／ｍ２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下、４０Ｌ／ｍ２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上１１５Ｌ／ｍ２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下、あるいは５０Ｌ／ｍ２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上１１０Ｌ／ｍ２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下である。
　以上説明した特性を有する実施の形態に係るウイルス除去膜は、例えば、以下で説明する方法により製造される。中空糸膜状のウイルス除去膜を製造する際には、まず、セルロースを銅アンモニア溶液に溶解させた、セルロース濃度が例えば約７．０重量％以上約８．０重量％以下のセルロース銅アンモニア溶液を用意し、これに無機塩を添加して、紡糸原液とする。なお、無機塩の添加は、セルロースを銅アンモニア溶液に溶解させる前でもよい。無機塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムの硫酸塩、亜硫酸塩、並びに炭酸塩を用いることができる。これらのうち、ナトリウム及びカリウムの硫酸塩、並びに亜硫酸塩が好ましく、硫酸ナトリウム及び亜硫酸ナトリウムがより好ましい。無機塩の添加量は、０．０２重量％以上０．９０重量％以下、０．０３重量％以上０．８０重量％以下、あるいは０．０４重量％以上０．７０重量％以下である。
　また、水酸基を有さず、２８重量％のアンモニア水溶液への溶解度が１０重量％以上であり、かつ、セルロースを膨潤させない有機溶媒を少なくとも１種含む、セルロース銅アンモニア溶液に対してミクロ相分離を生じさせる溶液を凝固液として用意する。ミクロ相分離については、後に説明する。例えば、凝固液は、アセトン、アンモニア、及び水からなる。中空糸膜を製造する際には、後述するように、内部凝固液と、外部凝固液と、を用意する。内部凝固液においては、例えば、アセトン濃度が約３０重量％以上約５０重量％以下であり、アンモニア濃度が約０．５重量％以上約１．０重量％以下である。外部凝固液においては、例えば、アセトン濃度が約２０重量％以上約４０重量％以下であり、アンモニア濃度が約０重量％以上約０．２重量％以下である。
　次に、紡糸原液を環状二重紡口より１．５ｃｃ／分以上８．０ｃｃ／分以下の一定量で吐出し、同時に、環状二重紡口の中央部に設けられた中央紡出口より内部凝固液を吐出する。吐出された紡糸原液及び内部凝固液を、直ちに凝固浴槽中の外部凝固液に浸漬する。ここで、内部及び外部凝固液の作用で、紡糸原液においてミクロ相分離が生じる。ミクロ相分離とは、セルロース濃厚相が、直径０．０１から数μｍの粒子として、溶媒又はセルロース希釈相から分離し、分散して安定化することをいう。ミクロ相分離は、最初、紡糸原液と内部及び外部凝固液との界面で生じ、次第に紡糸原液の内部でも生じていく。ミクロ相分離によって形成された粒子は、衝突や融合を繰り返しながら大きな粒子を形成していく。同時に、凝固液の作用により、粒子は次第に固化され、粒子が三次元的につながった高分子多孔質構造を有する中空糸膜が形成されていく。形成された中空糸膜は、巻き取られる。
　凝固浴槽が細管で構成されている場合、凝固浴槽中における紡糸原液の流速は、例えば、５ｍ／分以上２０ｍ／分以下、８ｍ／分以上１５ｍ／分以下、あるいは９ｍ／分以上１２ｍ／分以下である。なお、凝固浴槽中における紡糸原液の流速は、形成される中空糸膜の巻き取り速度（紡速）に等しい。また、凝固浴槽に送液する外部凝固液の流量は、例えば、５０ｃｃ／分以上５００ｃｃ／分以下、１００ｃｃ／分以上３００ｃｃ／分以下、あるいは１３０ｃｃ／分以上２００ｃｃ／分以下である。外部凝固液の流量を凝固浴槽を構成する細管の断面積で除して求められる凝固浴槽中における外部凝固液の流速は、例えば、１．８ｍ／分以上１０．４ｍ／分以下、３．２ｍ／分以上７．８ｍ／分以下、あるいは３．５ｍ／分以上５．４ｍ／分以下である。さらに、凝固浴槽中における紡糸原液の流速に対する外部凝固液の流速の比は、例えば、０．３２以上０．５４以下、あるいは０．３３以上０．５３以下である。なお、紡糸原液の流速に対する外部凝固液の流速の比が上記範囲内にあれば、紡糸原液の流速及び外部凝固液の流速のそれぞれの絶対値は、任意である。
　巻き取られた中空糸膜は、２重量％以上１０重量％以下の希硫酸に浸漬され、次いで純水で水洗される。これにより、セルロースが再生される。さらに、中空糸膜の水分を有機溶媒で置換する。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、及びアセトン等を用いることができる。その後、中空糸膜束の両端を固定し、１％から８％延伸した後、３０℃以上６０℃以下、５ｋＰａ以下の減圧下で乾燥を行い、実施の形態に係る中空糸膜状のウイルス除去膜が得られる。
　また、平膜状のウイルス除去膜は、例えば、以下の方法により製造される。銅アンモニアセルロース溶液に無機塩を添加して混合し、製膜溶液を得る。続いて、製膜溶液をろ過及び脱ガス処理する。使用される無機塩の種類は、上記と同様である。
　次に、製膜溶液を凝固浴中を走行する支持体上にキャスティングして流延し、凝固させる。支持体の移動速度は毎分約１．０～１０．０ｍとする。形成した平膜を酸で再生処理後、追加の水浴に通して引き出し、その後、乾燥機を使用して乾燥させる。ここで、製造される平膜状のウイルス除去膜のウイルス捕捉部位ないしは金コロイド捕捉部位を均質かつ緻密にするために、注型速度及び凝固液の移動速度を適切な関係に設定する。具体的には、支持体の移動速度に対する凝固液の移動速度の比を一定範囲に設定する。
　上述した方法で製造される中空糸、及び平膜状のウイルス除去膜は、被ろ過液入り口側の一次側空間とろ過液出側の２次側空間が膜によって仕切られたフィルターを作成するのに用いることができる。
　また、本実施形態において実施されるカチオン交換クロマトグラフィーによる精製工程に加え、アニオン交換クロマトグラフィー工程と組み合わせることにより、精製物の純度をさらに向上しうる。
　従来の一般的なカチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程では、目的物質を一旦、担体に吸着させ、溶出することにより精製をするため、目的物質のｐＩよりも高いｐＩを持つ不純物、及び低いｐＩを持つ不純物共に除去することが可能である。一方、本実施形態のフロースルー精製では、目的物質よりも低いｐＩを持つ不純物を除去することが困難な場合がある。しかし、目的物質よりも低いｐＩを持つ不純物はアニオン交換クロマトグラフィー担体による精製により除去できる。そのため、本実施形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程を組み合わせることにより、従来の不純物除去性を保持したまま、効率の良い精製が達成できる。
　目的物質よりも低いｐＩを持つ不純物とは、特に限定を受けないが、例えば、宿主細胞由来のタンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、及びアフィニティークロマトグラフィー工程由来の不純物であるプロテインＡ等がある。
　アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程は、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の前であってもよいし、後であってもよい。ただし、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、ウイルス除去工程との間に、他の工程を含まない場合、あるいは、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程とウイルス除去工程を連続プロセスで行う場合は、アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程は、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の前である。
　アニオン交換クロマトグラフィー担体は、特に限定を受けないが、膜状であれば、高流速が可能であり、より効率の良い精製工程の構築が可能である。また、アニオン交換クロマトグラフィー担体は、基材上にグラフト重合鎖を有する構造であってもよい。
　アニオン交換クロマトグラフィー担体の構造は、特に限定を受けないが、基材上にグラフト重合体を有する構造であれば、不純物に立体的に吸着することが出来るため、より高い不純物除去性が期待できる。
　アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製方法については、特に限定を受けないが、フロースルー精製であればより効率的に精製することが可能である。
　アニオン交換クロマトグラフィー工程における抗体ロード量は、不純物を除去できれば特に限定を受けないが、効率的な精製という観点から、担体１ｍＬあたり０．２ｇ以上が好ましく、より好ましくは０．５ｇ以上、１．０ｇ以上、２．０ｇ以上、又は４．０ｇ以上である。
　アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、の間に、バッファー交換をしてもよいし、しなくてもよい。バッファー交換をしない場合、より効率的な精製が出来る。
　アニオン交換クロマトグラフィー担体における精製工程と、カチオン交換クロマトグラフィー担体における精製工程と、は、連続で行ってもよいし、先の工程終了後、一旦タンクに貯蔵し、次の工程を行ってもよい。
　アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、の間に、ｐＨの調整を行ってもよい。ｐＨを調整することにより、より前者の処理ｐＨ付近のｐＩを持つ不純物の除去性が高くなる。具体的には、先にカチオン交換クロマトグラフィー担体による精製を行う場合には、アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製の前に、塩基を加え、ｐＨを上げることにより、より不純物が除去できるようになる。逆に、先にアニオン交換クロマトグラフフィー担体を行う場合には、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製の前に酸を加え、ｐＨを低くすることにより、より不純物が除去できるようになる。変化させるｐＨの値は不純物除去性が向上すれば特に限定を受けないが、標的となる不純物に応じて任意に変化させることが出来る。ｐＨの変化量の値としては、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０等があげられ、示した単位でもよいし、それぞれの間の値でもよい。
　不純物を除去出来れば特に限定は受けないが、好ましくは、ｐＨを０．１以上変化させれば不純物除去性が特に向上する。
　また、ｐＨと同様に、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程とアニオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間に電気伝導度の調整を行ってもよい。変化させる電気伝導度の値は不純物除去性が向上すれば特に限定を受けないが、標的となる不純物に応じて任意に変化させることが出来る。電気伝導度の変化量の値として、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０等が挙げられ、示した値でもよいし、それぞれの間の値でもよい。
　また、アニオン交換クロマトグラフィー工程及びカチオン交換クロマトグラフィーによる精製工程の前に、アフィニティークロマトグラフィー工程を行ってもよい。アフィニティークロマトグラフィー工程後に、上記アニオン交換クロマトグラフィー工程及びカチオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製を行うことにより、より純度の高い目的物を得ることが可能となる。
　本実施形態によれば、アフィニティークロマトグラフィー工程後の抗体を含む溶出液のバッファー交換を行わずに、アニオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製、及びカチオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製を行うことで、効率的な精製が可能である。そのような溶出液として、１価酸を主成分として含むバッファーがある。
　一般的にアニオン交換クロマトグラフィー工程では、多価酸を主成分とする溶出バッファーを用いると、吸着量が低下し、不純物除去性能が低下する傾向にあるため、アフィニティークロマトグラフィー工程で多価酸を主成分とする溶出バッファーを用いた場合、アニオン交換クロマトグラフィーまでにバッファーを交換しておくことが望ましい。しかし、１価酸を主成分とする溶出バッファーを用いてアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出を行えば、バッファー交換の必要なく、カチオン交換クロマトグラフィー工程及びアニオン交換クロマトグラフィー工程による精製が可能となる。
　１価酸を主成分とする溶出バッファーについては、アフィニティークロマトグラフィー工程において溶出が可能であり、その後のイオン交換クロマトグラフィー工程において、不純物が除去できれば特に限定を受けないが、酢酸が望ましい。
　また、アフィニティークロマトグラフィー工程の溶出に使用する溶出バッファーは、以下に限定されないが、その後のカチオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製の不純物除去性の観点から、電気伝導度が１０．０ｍＳ／ｃｍ以下であることが望ましく、より好ましくは７．０ｍＳ／ｃｍ以下、さらに好ましくは５．０ｍＳ／ｃｍ以下、特に好ましくは３．０ｍＳ／ｃｍ以下である。
　また、溶出プールの電気伝導度を低く保つために、アフィニティークロマトグラフィー工程の溶出の直前に、電気伝導度の低い緩衝液で担体を洗浄することが望ましい。緩衝液としては、抗体を溶出させることがないようｐＨが十分に高く、電気伝導度が十分低ければよい。
　そのようなｐＨとして、５．０以上が好ましく、より好ましくは６．０以上、さらに好ましくは７．０以上であり、電気伝導度としては、１０．０ｍＳ／ｃｍ以下であることが好ましく、より好ましくは７．０ｍＳ／ｃｍ以下、さらに好ましくは５．０ｍＳ／ｃｍ以下、特に好ましくは３．０ｍＳ／ｃｍ以下である。
　また、アフィニティークロマトグラフィー工程での溶出後に、溶出液に含まれうるウイルスを酸性（低ｐＨ）条件に一定時間曝すことにより、ウイルスの不活化を行ってもよい。ウイルスを不活化するためには、ｐＨは４．０以下が望ましく、好ましくは３．８以下、より好ましくは３．６以下、さらに好ましくは３．５以下、特に好ましくは３．４以下である。
　アフィニティークロマトグラフィー工程、またはそれに続くウイルス不活化の後に、塩基を溶出液に加えることにより、溶出液のｐＨの調整を行ってもよい。調整後のｐＨの値は、続くイオン交換クロマトグラフィー工程において不純物除去が可能であれば特に限定を受けないが、４．０以上が好ましく、より好ましくは５．０以上、さらに好ましくは６．０以上である。
　以下に、実施の形態を実施例、比較例、参考例、及び参考比較例に基づいてさらに詳しく説明するが、これらは実施の形態を何ら限定するものではない。
　（参考例１）
　参考例１では、放射線グラフト重合法によって、カルボン酸基を有する中空糸状のカチオン交換膜を合成した。
　１）放射線グラフト重合
　Ｎ－イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．５４ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３１ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。
　得られた中空糸１本の体積を測定したところ、１．０５ｍＬであった。この中空糸をエタノールにより親水化し、水に置換した。水を除去した後、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加えた。１時間放置した後、水酸化ナトリウム水溶液を取り出し、純水１０ｍＬを加えた。さらに１時間放置した後、純水を回収することにより、膜内に残った水酸化ナトリウムを回収した。回収した水酸化ナトリウム溶液を統合し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸により滴定をおこなったところ、中和に７．９８ｍＬ要した。ブランクが９．７７ｍＬであったことから、水酸化ナトリウムと反応した、膜が有する弱カチオン交換基は１７９ｕｍｏｌであることが分かった。これを測定した体積で除すると弱カチオン交換基密度を求めることが出来、カチオン交換基密度は１７０ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例１に係るカチオン交換膜１とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１００及び０．９００であった。
　２）細胞培養液の調製
　抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１１５ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用意した。ＡＥ６Ｆ４産生細胞は、九州大学大学院農学研究院、片倉喜範准教授よりご提供頂いた。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞の培養は、文献（日本生物工学会講演要旨集、１９９４年、６５巻、６５ページ）を参考に培養した。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名　ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標）　ＭＦ－ＳＬ）を用いてろ過し、不純物と抗体を含む抗体溶液（培養上澄）を取得した。ろ過は、提供者の取扱い説明書を参考に実施した。
　３）プロテインＡカラムによる抗体タンパク質の精製
　リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））１５０ｍＬで平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　Ｓｕｒｅを充填したもの）に、ろ過した抗体溶液を２Ｌ添加し、プロテインＡに抗体タンパク質を吸着させた。次に、カラムにリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））２０ｍＬを通液して洗浄した後、カラムに溶出緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．６））を２４０ｍＬ通液して、プロテインＡカラムから抗体タンパク質を溶出させて、不純物がある程度低減された抗体溶液を回収した。
　４）凝集体の調製
　得られた抗体溶液の一部に塩酸を加え、ｐＨ３に調整し、一時間放置した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和し、多量の凝集体を含む抗体溶液を調製した。
　５）凝集体を含む抗体溶液の調製
　プロテインＡカラムから得られた抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー交換した溶液と、多量の凝集体を含む抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー交換した溶液を任意の割合で混合し、凝集体を含む抗体溶液を調製した。
　６）凝集体量の測定
　得られた抗体溶液を下記の条件により、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）装置を用いて測定した。　カラム；ＡＣＱＵＩＴＹ　ＹＰＬＣ　ＢＥＨ２００　ＳＥＣ１．７ｕｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
　カラム温度：３０℃
　システム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｈ　ＣＬＡＳＳ（ｗａｔｅｒｓ社製）
　移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム＋０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｌ（＋）－アルギニン水溶液（塩酸でｐＨ６．７に調整）
　その結果、図５のクロマトチャートが得られ、それを拡大したものが図６である。図６の（１）及び（２）のピークで現れるものは抗体の凝集体であり、（３）で現れるピークは単量体である。クロマトチャートのピークの面積から算出される凝集体（１）の割合は１．５４％であり、凝集体（２）の割合は２．２０％、単量体の割合は９６．２５％であった。以下の参考例及び参考比較例においても、最初に現れる凝集体のピークを凝集体（１）、２番目に現れる凝集体のピークを凝集体（２）という。なお、抗体の凝集体の割合の低減率とは、処理前の凝集体成分（１）、（２）の割合から、処理後の凝集体成分（１）、（２）の割合の差をとり、当該差を、処理前の凝集体成分（１）、（２）の含有率で割った値の百分率表示である。
　７）凝集体の除去
　カチオン交換膜１に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（５．１２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。なお、図７において、「凝集体割合低減率」とは、処理前の凝集体成分（１）、（２）の含有率から、処理後の凝集体成分（１）、（２）の含有率の差をとり、当該差を、処理前の凝集体成分（１）、（２）の含有率で割った値の百分率表示である。
　（参考例２）
　参考例２では以下に説明するカチオン交換膜２を用いた。カチオン交換膜２は次のように合成した。Ｎ－イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．０３ｇ、メタクリル酸１．０３ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３２ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は３９０ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例２に係るカチオン交換膜２とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．２１７及び０．７８３であった。
　参考例２で用いた抗体溶液の凝集体（１）の割合は１．５９％であり、凝集体（２）の割合は１．６７％、単量体の割合は９６．７４％であった。
　カチオン交換膜２に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（５．２９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例３）
　参考例３では以下に説明するカチオン交換膜３を用いた。カチオン交換膜３は次のように合成した。Ｎ－イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．７７ｇ、メタクリル酸０．２８ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１７ｇ、グラフト率７２％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は５９ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例３に係るカチオン交換膜３とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．０３５及び０．９６５であった。
　参考例３で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）であり、凝集体（１）の割合は１．３１％であり、凝集体（２）の割合は２．０４％、単量体の割合は９６．６６％であった。
　カチオン交換膜３に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（５．３７ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬでカチオン交換膜３を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例４）
　参考例４では、カチオン交換膜３と以下に説明する抗体溶液を用いた。参考例４で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９．０）であり、凝集体（１）の割合は２．４９％であり、凝集体（２）の割合は３．１９％、単量体の割合は９４．３２％であった。
　カチオン交換膜３に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（４．３１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９．０）１０ｍＬでカチオン交換膜３を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例５）
　参考例５では以下に説明するカチオン交換膜４を用いた。カチオン交換膜４は次のように合成した。Ｎ－イソプロピルアクリルアミド３．８３ｇ、ブチルメタクリレート１．９２ｇ、メタクリル酸０．６４ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３２ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１８３ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例５に係るカチオン交換膜４とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０２及び０．８９８であった。
　参考例５で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は３．２５％であり、凝集体（２）の割合は２．０７％、単量体の割合は９４．６８％であった。
　カチオン交換膜４に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２５ｍＬ（５．７６ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜４を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例６）
　参考例６では以下に説明するカチオン交換膜５を用いた。カチオン交換膜５は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート１．４９ｇ、ブチルメタクリレート０．７２ｇ、メタクリル酸０．３６ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、４．３５ｇ、グラフト率４５％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１５５ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例６に係るカチオン交換膜５とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１４８及び０．８５２であった。
　参考例６で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．３５％であり、凝集体（２）の割合は１．８２％、単量体の割合は９５．８３％であった。
　カチオン交換膜５に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（４．７３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜５を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例７）
　参考例７では以下に説明するカチオン交換膜６を用いた。カチオン交換膜６は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート２．０６ｇ、ブチルメタクリレート１．０３ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、４．７２ｇ、グラフト率５７％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７８ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例７に係るカチオン交換膜６とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１３４及び０．８６６であった。
　参考例７で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．１２％であり、凝集体（２）の割合は１．５６％、単量体の割合は９６．３２％であった。
　カチオン交換膜６に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２５ｍＬ（５．１７ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜６を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例８）
　参考例８では以下に説明するカチオン交換膜７を用いた。カチオン交換膜７は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート２．５７ｇ、ブチルメタクリレート１．２９ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．２８ｇ、グラフト率７６％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７７ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例８に係るカチオン交換膜７とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１００及び０．９００であった。
　参考例８で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は３．３７％であり、凝集体（２）の割合は１．９４％、単量体の割合は９４．６９％であった。
　カチオン交換膜７に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２５ｍＬ（５．４９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜７を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例９）
　参考例９では以下に説明するカチオン交換膜８を用いた。カチオン交換膜８は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート２．５７ｇ、ブチルメタクリレート１．２９ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、４．９７ｇ、グラフト率６６％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７４ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例９に係るカチオン交換膜８とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１１４及び０．８８６であった。
　参考例９で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．４５％であり、凝集体（２）の割合は２．３９％、単量体の割合は９５．１７％であった。
　カチオン交換膜８に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２５ｍＬ（６．０２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜８を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例１０）
　参考例１０では以下に説明するカチオン交換膜９を用いた。カチオン交換膜９は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート２．４０ｇ、ブチルメタクリレート１．２０ｇ、メタクリル酸０．７７ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、４．８２ｇ、グラフト率６１％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２４９ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例１０に係るカチオン交換膜９とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１７７及び０．８２３であった。
　参考例１０で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は０．７２％であり、凝集体（２）の割合は１．１４％、単量体の割合は９８．１４％であった。
　カチオン交換膜９に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．３０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜９を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例１１）
　参考例１１では以下に説明するカチオン交換膜１０を用いた。カチオン交換膜１０は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート３．０８ｇ、ブチルメタクリレート１．５４ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３１ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７５ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例１１に係るカチオン交換膜１０とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０３及び０．８９７であった。
　参考例１１で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は１．５７％であり、凝集体（２）の割合は１．５５％、単量体の割合は９６．８８％であった。
　カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は４０ｍＬ（５．９１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で５０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例１２）
　参考例１２では、以下に説明するカチオン交換膜１１を用いた。カチオン交換膜１１は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート１．９３ｇ、ブチルメタクリレート１．９３ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．０６ｇ、グラフト率６９％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７７ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例１２に係るカチオン交換膜１１とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１１及び０．８９であった。
　参考例１２で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．７１％であり、凝集体（２）の割合は２．６９％、単量体の割合は９４．６０％であった。
　カチオン交換膜１１に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は３０ｍＬ（５．０８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で４０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例１３）
　参考例１３ではカチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。参考例１３で用いた抗体溶液は１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．４７％であり、凝集体（２）の割合は１．５９％、単量体の割合は９５．９４％であった。
　カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．３１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例１４）
　参考例１４では、カチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。参考例１４で用いた抗体溶液は３０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．３２％であり、凝集体（２）の割合は２．２１％、単量体の割合は９５．４７％であった。
　カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．６６ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例１５）
　参考例１５ではカチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。参考例１５で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）であり、凝集体（１）の割合は１．３２％であり、凝集体（２）の割合は２．００％、単量体の割合は９６．６８％であった。　
　カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．３６ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例１６）
　参考例１６では、カチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。参考例１６で用いた抗体溶液は１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）であり、凝集体（１）の割合は１．５９％であり、凝集体（２）の割合は２．２０％、単量体の割合は９６．２１％であった。
　カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．６３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例１７）
　参考例１７ではカチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。参考例１７で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）であり、凝集体（１）の割合は１．４１％であり、凝集体（２）の割合は１．８１％、単量体の割合は９６．７８％であった。
　カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．３０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例１８）
　参考例１８では、カチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。参考例１８で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．３０％であり、凝集体（２）の割合は２．０８％、単量体の割合は９５．６２％であった。
　カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．７２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例１９）
　参考例１９では以下に説明するカチオン交換膜１２を用いた。カチオン交換膜１２は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート２．５７ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１．２９ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１１ｇ、グラフト率７０％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７８ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例１９に係るカチオン交換膜１２とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０９及び０．８９１であった。
　参考例１９で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．９９％であり、凝集体（２）の割合は２．３１％、単量体の割合は９４．７０％であった。
　カチオン交換膜１２に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２２ｍＬ（５．３３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１２を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３２ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例２０）
　参考例２０では以下に説明するカチオン交換膜１３を用いた。カチオン交換膜１３は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート２．６９ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１．１７ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１６ｇ、グラフト率７０％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７６ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例２０に係るカチオン交換膜１３とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０５及び０．８９５であった。
　参考例２０で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．４８％であり、凝集体（２）の割合は２．２４％、単量体の割合は９５．２９％であった。
　カチオン交換膜１３に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２２ｍＬ（５．７０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１３を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３２ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例２１）
　参考例２１では以下に説明するカチオン交換膜１４を用いた。カチオン交換膜１４は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート２．５０ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート１．３６ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１６ｇ、グラフト率７０％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７６ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例２１に係るカチオン交換膜１４とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０５及び０．８９５であった。
　参考例２１で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．７３％であり、凝集体（２）の割合は２．１０％、単量体の割合は９５．１６％であった。
　カチオン交換膜１４に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は４０ｍＬ（５．５２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１４を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で５０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例２２）
　参考例２２では以下に説明するカチオン交換膜１５を用いた。カチオン交換膜１５は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート３．０８ｇ、ブチルメタクリレート１．５４ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．４５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．３６ｇ、グラフト率４６％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２２７ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、参考例２２に係るカチオン交換膜１５とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１１５及び０．８８５であった。
　参考例２２で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は３．１４％であり、凝集体（２）の割合は２．０３％、単量体の割合は９４．８２％であった。
　カチオン交換膜１５に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１０ｍＬ（５．５３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．７ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．７ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜１５を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で１５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例２３）
　参考例２３では以下に説明するカチオン交換膜１６を用いた。カチオン交換膜１６は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート３．８５ｇ、ブチルメタクリレート０．７７ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．４５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．２６ｇ、グラフト率４４％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１９８ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、参考例２３に係るカチオン交換膜１６とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０４及び０．８９６であった。
　参考例２３で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は４．４１％であり、凝集体（２）の割合は２．１６％、単量体の割合は９３．４３％であった。
　カチオン交換膜１６に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１８ｍＬ（５．５３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．７ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．７ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜１６を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で２３ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例２４）
　参考例２４では以下に説明するカチオン交換膜１７を用いた。カチオン交換膜１７は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート４．６２ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．４５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、７．９９ｇ、グラフト率３９％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２１４ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、参考例２４に係るカチオン交換膜１７とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１２６及び０．８７４であった。
　参考例２４で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．４２％であり、凝集体（２）の割合は１．７７％、単量体の割合は９５．８１％であった。
　カチオン交換膜１７に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１８ｍＬ（５．６４ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．２ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．２ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜１７を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で２３ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例２５）
　参考例２５では以下に説明するカチオン交換膜１８を用いた。カチオン交換膜１８は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート３．８５ｇ、ブチルメタクリレート０．７７ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．６５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．２９ｇ、グラフト率４３％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２０９ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、参考例２５に係るカチオン交換膜１８とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０８及び０．８９２であった。
　参考例２５で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．９６％であり、凝集体（２）の割合は２．０１％、単量体の割合は９５．０３％であった。
　カチオン交換膜１８に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１８ｍＬ（５．６１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．７ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．７ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜１８を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で２３ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例２６）
　参考例２６では以下に説明するカチオン交換膜１９を用いた。カチオン交換膜１９は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート４．６２ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．６５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．１７ｇ、グラフト率４１％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２２３ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、参考例２６に係るカチオン交換膜１９とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１２７及び０．８７３であった。
　参考例２６で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．８３％であり、凝集体（２）の割合は１．９６％、単量体の割合は９５．２１％であった。
　カチオン交換膜１９に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１８ｍＬ（５．６９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．７ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．７ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜１９を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で２３ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例２７）
　参考例２７では以下に説明するカチオン交換膜２０を用いた。カチオン交換膜２０は次のように合成した。２－ヒドロキシエチルメタクリレート２．９９ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート１．６３ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．６５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．４２ｇ、グラフト率４５％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２４１ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、参考例２７に係るカチオン交換膜２０とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１１９及び０．８８１であった。
　参考例２７で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．５４％であり、凝集体（２）の割合は１．９３％、単量体の割合は９５．５３％であった。
　カチオン交換膜２０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１８ｍＬ（５．５１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．７ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．７ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜２０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で２３ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例２８）
　参考例２８では以下に説明するカチオン交換膜２１を用いた。カチオン交換膜２１は次のように合成した。Ｎ－イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．２９ｇ、グリシジルメタクリレート０．５１ｇ、ｔ－ブチルメタクリレート０．２６ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１２ｇ、グラフト率７１％のカチオン交換膜前駆体を得た。
　放射線グラフト重合法によりグラフト鎖を導入した中空糸を、亜硫酸ナトリウムと、ＩＰＡと、の混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／ＩＰＡ／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した。その後、この中空糸を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。さらに、１４０ｍＬのクロロホルム中で、４ｍＬのメタンスルホン酸と反応させ、ｔ－ブチル基を脱保護し、カルボンキシル基に変換した。
　参考例１と同様の方法で、膜体積、及び全カチオン交換基密度を測定したところ、１．０ｍＬ、４９ｍｍｏｌ／Ｌであった。
　スルホン酸基密度は以下の方法により求めた。１ｍｏｌ／Ｌの塩酸に１時間浸漬し、スルホン酸を全て水素化した。純水で洗浄し、塩酸を除去した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加え、塩化水素を溶出させた。１時間放置した後、塩化水素を含む塩化ナトリウム水溶液を回収した。さらに１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加え、１時間放置し、回収することにより、膜内に残った塩化水素を回収した。回収物を統合し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を用いて滴定したところ、中和に２．０９ｍＬ要した。ブランクが０．２９ｍＬであったことから、膜が有するスルホン酸基は１８ｕｍｏｌであることが分かった。これを膜体積で除すると１８ｍｍｏｌ／Ｌであった。カルボキシル基は全カチオン交換基密度からスルホン酸基密度を差し引くことで求めることが出来、３１ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考例２８に係るカチオン交換膜２１とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．０４７及び０．９５３であった。
　参考例２８で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）であり、凝集体（１）の割合は２．８０％であり、凝集体（２）の割合は３．２１％、単量体の割合は９３．９９％であった。
　カチオン交換膜２１に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（４．９９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考例２９）
　参考例２９ではカチオン交換膜２１と以下に説明する抗体溶液を用いた。参考例２９で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は１．７７％であり、凝集体（２）の割合は１．７８％、単量体の割合は９６．４４％であった。　
　カチオン交換膜２１に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（４．７４ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図７に示す。
　（参考比較例１）
　参考比較例１では以下に説明するカチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ未満のカチオン交換膜２２を用いた。カチオン交換膜２２は次のように合成した。Ｎ－イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．８６ｇ、メタクリル酸０．２ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．２２ｇ、グラフト率７４％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２７ｍｍｏｌ／Ｌであり、３０ｍｍｏｌ／Ｌより低い密度であった。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．０１７及び０．９８３であった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考比較例１に係るカチオン交換膜２２とした。
　参考比較例１で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．２７％であり、凝集体（２）の割合は１．８６％、単量体の割合は９５．８７％であった。
　カチオン交換膜２２に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（５．１３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２２を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していたものの、参考例１と比較して多かった。結果を図７に示す。
　（参考比較例２）
　参考比較例２では以下に説明するカチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ未満の強カチオン交換基のみを有するカチオン交換膜２３を用いた。カチオン交換膜２３は次のように合成した。Ｎ－イソプロピルアクリルアミド３．６ｇ、ブチルメタクリレート１．８ｇ、グリシジルメタクリレート０．６ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２８０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１１ｇ、グラフト率７０％のカチオン交換膜前駆体を得た。
　放射線グラフト重合法によりグラフト鎖を導入した中空糸を、亜硫酸ナトリウムと、ＩＰＡと、の混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／ＩＰＡ／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した。その後、この中空糸を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１８ｍｍｏｌ／Ｌであり、３０ｍｍｏｌ／Ｌより低い密度であった。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．０３及び０．９７であった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考比較例２に係るカチオン交換膜２３とした。
　参考比較例２で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）であり、凝集体（１）の割合は２．０３％であり、凝集体（２）の割合は２．０６％、単量体の割合は９５．９１％であった。
　カチオン交換膜２３に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（４．８０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２３を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していたものの、参考例と比較して多く、処理容量が多い時に凝集体除去性能が不十分であった。結果を図７に示す。
　（参考比較例３）
　参考比較例３では以下に説明する、単独重合体が膜状基材の表面に固定されたカチオン交換膜２４を用いた。カチオン交換膜２４は次のように合成した。メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ－ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．６５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸３．０ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、３．２８ｇ、グラフト率９％のカチオン交換膜を得た。参考例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１８３ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、参考比較例３に係るカチオン交換膜２４とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、１．０及び０である。
　参考比較例３で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．１２％であり、凝集体（２）の割合は２．３１％、単量体の割合は９５．５７％であった。
　カチオン交換膜２４に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（５．１５ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２４を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していたものの、他の参考例と比較して多かった。結果を図７に示す。
　（参考例３０）
　参考例３０は、アニオン交換クロマトグラフィー担体によるフロースルー精製後に、カチオン交換クロマトグラフィー担体によりフロースルー精製することにより、不純物を低減させた例を示す。
　（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
　参考例３０のアニオン交換工程では体積１ｍＬのＣａｐｔｏ　Ｑ（ＧＥ　ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）を用いた。抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．８）であり、凝集体（１）の割合は０．４２％であり、凝集体（２）の割合は１．１４％、単量体の割合は９８．４４％であった。また、ＨＣＰの含有量は３０６ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。
　体積１ｍＬのＣａｐｔｏ　Ｑに、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）及びＨＣＰ、プロテインＡを含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（６．２８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．０ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．０ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．８）５ｍＬでＣａｐｔｏ　Ｑを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で５５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図８に示す。
　（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
　参考例３０のカチオン交換工程ではカチオン交換膜１０を用いた。アニオン交換工程で回収した抗体溶液に０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加え、ｐＨ７にし、カチオン交換膜１０に接触させた。加えた量は５０ｍＬ（４．６５ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの抗体溶液を回収した。回収した溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図８に示す。
　（参考例３１）
　参考例３１では、抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１６３ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用い、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、及びカチオン交換クロマトグラフィーの一連の精製工程をバッファーの交換をせずに行った。
　（アフィニティークロマトグラフィー工程）
　参考例３１に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速４ｍＬ／分（３００ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ　Ｓｕｒｅ１６ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み２．５Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬを通液し、さらにトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））４８ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）８０ｍＬを通液してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．８に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液の電気伝導度は１．８ｍＳ／ｃｍであった。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するアニオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調製した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．８３％であり、凝集体（２）の割合は１．１２％、単量体の割合は９８．０５％であった。また、ＨＣＰの含有量は３１７ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。
　（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
　参考例３１に係るアニオン交換工程では体積１ｍＬのＣａｐｔｏ　Ｑ（ＧＥ　ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）を用い、抗体溶液を精製した。Ｃａｐｔｏ　Ｑに加えた抗体溶液の量は８１ｍＬ（３．７２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．０ｍＬ／分、温度は２５℃であった。Ｃａｐｔｏ　Ｑに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．８）を流速１．０ｍＬ／分で５ｍＬ通液し、Ｃａｐｔｏ　Ｑを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計８６ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図９に示す。
　（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
　参考例３１に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１０を用いた。アニオン交換工程で回収した抗体溶液に酢酸を加え、ｐＨ７．０に調整したところ、電気伝導度は１．９ｍＳ／ｃｍであった。その後、カチオン交換膜１０に接触させた。加えた抗体溶液の量は８０ｍＬ（３．３３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。カチオン交換膜１０に抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、カチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計９０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図９に示す。
　（参考例３２）
　参考例３２では、抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１６３ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用い、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、及びカチオン交換クロマトグラフィーの一連の精製工程をバッファーの交換をせずに行った。
　（アフィニティークロマトグラフィー工程）
　参考例３２に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速４ｍＬ／分（３００ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ　Ｓｕｒｅ１６ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み２．５Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬを通液し、さらにトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））４８ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）８０ｍＬを通液してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．８に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液の電気伝導度は１．８ｍＳ／ｃｍであった。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するアニオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調製した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．７８％であり、凝集体（２）の割合は１．２１％、単量体の割合は９８．０１％であった。また、ＨＣＰの含有量は３６５ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。
　（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
　参考例３２に係るアニオン交換工程では体積０．２５ｍＬのＱｙｕＳｐｅｅｄ　Ｄ（旭化成メディカル）を用いた。ＱｙｕＳｐｅｅｄ　Ｄに加えた抗体溶液の量は８０ｍＬ（３．６９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。ＱｙｕＳｐｅｅｄ　Ｄに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．８）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、ＱｙｕＳｐｅｅｄ　Ｄを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計９０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図９に示す。
　（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
　参考例３２に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１０を用いた。アニオン交換工程で回収した抗体溶液に酢酸を加え、ｐＨ７．０に調整したところ、電気伝導度は１．９ｍＳ／ｃｍであった。その後、抗体溶液をカチオン交換膜１０に接触させた。加えた抗体溶液の量は８０ｍＬ（３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、カチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計９０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図９に示す。
　（実施例１）
　（バッファーの調製）
　０．５４５１ｇのＴｒｉｓ（分子量１２１．１４）、３ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、及び水からなる溶液を０．１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０に調整し、さらに水で３００ｍＬまでメスアップし、１５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）と１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌからなるバッファーを得た。
　（抗体のモノマーの精製溶液の調製）
　参考例１と同様にプロテインＡカラムで精製したＡＥ６Ｆ４抗体を用意した。当該抗体を含む溶液を、分子量３００００がカットオフ値である限外ろ過膜（アミコン（登録商標）ウルトラ－１５、遠心式フィルターユニット、メルクミリポア）を用いて、上記のバッファーへバッファー交換を行った。得られた抗体を含む溶液における抗体の濃度は、５ｍｇ／ｍＬであった。さらに、限外ろ過膜のろ液を、孔径が０．２０μｍのフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ（登録商標）ＰＥＳ　メンブレンフィルターユニット）で吸引ろ過し、抗体のモノマーの精製溶液を得た。
　（抗体の凝集体を含む溶液の調製）
　得られた抗体のモノマーの精製溶液の一部を、１ｍｏｌ／Ｌの塩酸（ＨＣｌ）でｐＨ３．０までｐＨ調整して１時間室温で静置し、抗体の凝集体を形成させた。次に、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）でｐＨ５．０以上にｐＨ調整した。当該抗体の凝集体を形成させた溶液を、分子量３００００がカットオフ値である限外ろ過膜（アミコン（登録商標）ウルトラ－１５、遠心式フィルターユニット、メルクミリポア）を用いて、上記のバッファーへバッファー交換を行った。さらに、限外ろ過膜のろ液を、孔径が０．２０μｍのフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ（登録商標）ＰＥＳ　メンブレンフィルターユニット）で吸引ろ過し、抗体の凝集体を含む溶液を得た。
　（抗体のモノマーと凝集体を含む溶液の調製）
　１５０ｍＬの抗体のモノマーの精製溶液と、３０ｍＬの抗体の凝集体を含む溶液と、を混合した。その後、当該混合液を、０．２０μｍのフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ（登録商標）ＰＥＳ　メンブレンフィルターユニット）で吸引ろ過し、さらに、ろ過圧１９．６ｋＰａで、０．１０μｍのフィルター（メルクミリポア、ミリパック２０フィルターユニット）を用いてろ過し、抗体のモノマーと凝集体を含む溶液を得た。抗体のモノマーと凝集体を含む溶液においては、図１０に示すように、抗体の単量体の割合は９７．７３％、抗体の二量体の割合は１．３０％、抗体の三量体以上の凝集体の割合は０．９７（＝０．７３＋０．２４）％であった。
　（前ろ過）
　参考例１に係るカチオン交換膜１を用意し、３０ｍＬのバッファーを用いて、流量１．５ｍＬ／分でカチオン交換膜を洗浄した。次に、７８ｍＬの抗体のモノマーと凝集体を含む溶液を流量１．５ｍＬ／分でカチオン交換膜に流して、フロースルーでろ過した。膜体積１ｍＬ当たり流した抗体の総量は１．５ｇであった。その後、１０ｍＬのバッファーを流量１．５ｍＬ／分でカチオン交換膜に流し、カチオン交換膜に残っていた抗体を回収した。フロースルーで得られたろ液と、バッファーを流して回収された抗体の回収液と、を合わせ、前ろ過後の溶液とした。図１０に示すように、前ろ過後の溶液に含まれる抗体の単量体の割合は９９．５６％、抗体の二量体の割合は０．４４％であり、抗体の三量体以上の凝集体は検出されなかった。よって、抗体の二量体以上の凝集体が顕著に除去されていた。
　（本ろ過）
　銅アンモニア法による再生セルロース中空糸を備えるウイルス除去フィルター（プラノバ（登録商標）２０Ｎ、旭化成メディカル）を用意した。当該ウイルス除去フィルターは、前ろ過後の溶液が供給される一次側の表面と、一次側の表面と対向する二次側の表面と、を備える。当該ウイルス除去フィルターの断面において、一次側から二次側にむけて孔径が減少した後増加に転じる。前ろ過で得られた溶液のうち３０ｍＬを、処理することなくすぐに、ろ過圧０．８ｋｇｆ／ｃｍ２で、ウイルス除去フィルターを用いてろ過し、ろ液を２ｍＬずつ１５フラクション回収し、本ろ過後の溶液とした。図１０に示すように、本ろ過後の溶液に含まれる単量体の割合は９９．５５％、抗体の二量体の割合は０．４５％であり、抗体の三量体以上の凝集体は検出されなかった。さらに、図１１に示すように、本ろ過において、透過流束（Ｆｌｕｘ）の低下はみられなかった。
　（参考例３３）
　実施例１で調製した抗体のモノマーの精製溶液を、０．２０μｍのフィルターで吸引ろ過し、さらにろ過圧１９．６ｋＰａで０．１０μｍのフィルターでろ過した。０．２０μｍのフィルター及び０．１０μｍのフィルターでろ過された抗体のモノマーの精製溶液においては、図１０に示すように、抗体の単量体の割合は９９．７５％であり、抗体の二量体の割合は０．２５％であり、抗体の三量体以上の凝集体は検出されなかった。その後、抗体のモノマーの精製溶液のうち３０ｍＬを、ろ過圧７８．４ｋＰａで、ウイルス除去フィルター（プラノバ（登録商標）２０Ｎ、旭化成メディカル）を用いてろ過し、ろ液を２ｍＬずつ１５フラクション回収した。図１０に示すように、ウイルス除去された抗体のモノマーの精製溶液において、抗体の単量体の割合は９９．７４％、抗体の二量体の割合は０．２６％であり、抗体の三量体以上の凝集体は検出されなかった。
　（比較例１）
　実施例１で調製した抗体のモノマーと凝集体を含む溶液のうち３０ｍＬを、ろ過圧７８．４ｋＰａで、ウイルス除去フィルター（プラノバ（登録商標）２０Ｎ、旭化成メディカル）を用いてろ過し、ろ液を２ｍＬずつ１５フラクション回収した。図１０に示すように、ウイルス除去された抗体のモノマーの精製溶液において、抗体の単量体の割合は９７．７５％、抗体の二量体の割合は１．３１％、抗体の三量体以上の凝集体の割合は０．９４（＝０．７２＋０．２２）％であった。図１１に示すように、ウイルス除去膜を用いたろ過工程においては、透過流束（Ｆｌｕｘ）の低下がみられた。
　（参考比較例４）
　特表２０１２－５１９０６５号公報に記載の実施例１に従って、強カチオン交換基（スルホン酸基）を備え、弱カチオン交換基を備えない比較例２に係るカチオン交換膜を用意した。次に、実施例１で用意した１２ｍＬのバッファーを用いて、流量０．６ｍＬ／分でカチオン交換膜を洗浄した。次に、３３ｍＬの抗体のモノマーと凝集体を含む溶液を流量１．５ｍＬ／分でカチオン交換膜に流して、フロースルーでろ過した。その後、４ｍＬのバッファーを流量１．５ｍＬ／分でカチオン交換膜に流し、カチオン交換膜に残っていた抗体を回収した。フロースルーで得られたろ液と、バッファーを流して回収された抗体の回収液と、を合わせ、前ろ過後の溶液とした。図１０に示すように、前ろ過後の溶液に含まれる抗体の単量体の割合は９８．９９％、抗体の二量体の割合は１．０１％であった。よって、実施例１と比較して、抗体の二量体の割合が高かった。

Claims (28)

  1. 　目的タンパク質の単量体と凝集体とを含む溶液を用意し、
    　少なくとも１種類の弱カチオン交換基を備え、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高いカチオン交換クロマトグラフィー担体を用いて、前記目的タンパク質の凝集体を除去し、前記単量体の精製溶液を得る精製工程と、
    　ウイルス対数除去率が３以上のウイルス除去膜を用いて、前記精製溶液からウイルスを除去するウイルス除去工程と、
    　を備える、タンパク質の精製方法。
  2. 　前記カチオン交換クロマトグラフィー担体が、膜状基材と、前記膜状基材の表面に固定された共重合体と、を備え、前記共重合体がモノマー単位として（メタ）アクリルアミド類化合物及び／又は（メタ）アクリレート類化合物を含む、請求項１に記載のタンパク質の精製方法。
  3. 　前記共重合体において、カチオン交換基を有するモノマー単位以外のモノマー単位が荷電を持たない中性モノマーであり、前記中性モノマーが、疎水性モノマー単位及び／又は親水性モノマー単位である、請求項２に記載のタンパク質の精製方法。
  4. 　前記疎水性モノマー単位が、炭素数４以上の直鎖又は分岐状のアルキル基を有する、請求項３に記載のタンパク質の精製方法。
  5. 　前記共重合体において、前記疎水性モノマー単位及び／又は前記親水性モノマー単位の質量割合が、前記カチオン交換基を有するモノマー単位の質量割合よりも高い、請求項３又は４に記載のタンパク質の精製方法。
  6. 　前記弱カチオン交換基が、アクリル酸モノマー、メタクリル酸モノマー、アクリル酸化合物モノマー、及びメタクリル酸化合物モノマーのいずれかの由来である、請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
  7. 　前記カチオン交換クロマトグラフィー担体が備えるカチオン交換基が、弱カチオン交換基のみである、請求項１から６のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  8. 　前記カチオン交換クロマトグラフィー担体が備えるカチオン交換基が、弱カチオン交換基と、強カチオン交換基と、を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  9. 　前記強カチオン交換基がスルホン酸基である、請求項８に記載のタンパク質の精製方法。
  10. 　前記共重合体が、共有結合により前記膜状基材の表面に固定されている、請求項２から５のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  11. 　前記親水性モノマー単位が、イソプロピルアクリルアミド及び２－ヒドロキシエチルメタクリレートの少なくとも一方を含む、請求項３から５のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  12. 　前記膜状基材がポリエチレンを含む、請求項２から５のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  13. 　前記膜状基材にグラフト重合された前記共重合体のグラフト率が２０～２００％である、請求項１２に記載のタンパク質の精製方法。
  14. 　前記膜状基材がポリフッ化ビニリデンを含む、請求項２から５のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  15. 　前記膜状基材にグラフト重合された前記共重合体のグラフト率が５～１００％である、請求項１４に記載のタンパク質の精製方法。
  16. 　前記共重合体が、実質的に架橋構造を有しない、請求項２から５のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  17. 　前記共重合体が、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位を含む、請求項２から５のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  18. 　前記カチオン交換基密度が、４５ｍｍｏｌ／Ｌより高い、請求項１から１７のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  19. 　前記ウイルス除去膜が、前記単量体の精製溶液が供給される一次側の表面と、前記一次側の表面と対向する二次側の表面と、を備え、
    　前記ウイルス除去膜の断面において、前記一次側から前記二次側にむけて孔径が減少する部分を少なくとも備える、請求項１から１８のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  20. 　前記ウイルス除去膜が、前記単量体の精製溶液が供給される一次側の表面と、前記一次側の表面と対向する二次側の表面と、を備え、
    　前記ウイルス除去膜の断面において、前記一次側から前記二次側にむけて孔径が減少した後増加に転じる、請求項１から１８のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  21. 　前記ウイルス除去膜が、前記単量体の精製溶液が供給される一次側の表面と、前記一次側の表面と対向する二次側の表面と、を備え、
    　前記ウイルス除去膜の断面において、前記一次側から前記二次側にむけて孔径が減少した後、一定となり、前記二次側の表面付近に最も緻密な層を備える、請求項１から１８のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  22. 　前記ウイルス除去膜が、セルロースを含む、請求項１から２０のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  23. 　前記ウイルス除去膜が、親水化された合成高分子を含む、請求項１から２０のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  24. 　前記精製工程と前記ウイルス除去工程の間に、他の工程を含まない、請求項１から２３のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  25. 　前記精製工程と前記ウイルス除去工程を連続して行う、請求項１から２４のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  26. 　前記目的タンパク質が抗体である、請求項１から２３のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
  27. 　前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２６に記載のタンパク質の精製方法。
  28. 　前記目的タンパク質がリコンビナントタンパク質である、請求項１から２３のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
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