JP2012224729A - グラフト鎖を導入する方法、多孔質吸着膜、及びタンパク質の精製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】多孔質膜に、吸着膜として適したグラフト鎖を形成させる場合、競争反応であるモノマーどうしのラジカル重合を抑えることが必要となる。
【解決手段】高分子を含む多孔質基材にグラフト鎖を導入する方法であって、多孔質基材を、ラジカル重合性モノマーを含む溶液中に浸漬させる浸漬工程と、浸漬状態のまま、多孔質基材に放射線照射を行い、多孔質基材にラジカル重合性モノマーをグラフト重合させて、多孔質基材にグラフト鎖を形成させる照射グラフト工程と、を含み、ラジカル重合性モノマーを含む溶液が、第１級又は第２級の１価の低級アルコールを４０〜７０ｖｏｌ％含む溶媒を含む、多孔質基材にグラフト鎖を導入する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、高分子を含む多孔質基材へグラフト鎖を導入する方法、及びグラフト鎖にイオン交換基を固定した多孔質吸着膜、及び多孔質吸着膜を用いたタンパク質の精製方法に関する。

近年、バイオテクノロジー産業において、タンパク質の大量精製が重要な課題となっている。特に、医薬の分野において、血液製剤、及び抗体医薬等の需要が急速に拡大しており、効率的に大量のタンパク質を生産及び精製可能な技術の確立が強く望まれている。

一般的に、タンパク質は、動物由来の細胞株を用いる細胞培養によって産生される。細胞培養液からタンパク質を精製する通常の操作においては、最初に、細胞培養液を遠心分離し、濁質成分を沈降除去する。次いで、遠心分離で除去しきれない約１μｍ以下の細胞デブリを、精密ろ過膜を用いるサイズろ過により除去する。さらに無菌化するために、最大細孔径が０．２２μｍ以下のろ過膜を用いて無菌化ろ過を施して、目的タンパク質の清澄な溶液を得る（ハーベスト工程）。続いて、プロテインＡに代表されるアフィニティークロマトグラフィーを初めとする、複数のクロマトグラフィー技術の組み合わせによる精製プロセスを用いて、Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、目的たんぱく質の凝集物、エンドトキシン、ウイルス、及びカラムから脱離したプロテインＡなどの夾雑物を清澄な溶液から除去し、目的タンパク質を分離・精製する（ダウンストリーム工程）。

以上説明した従来のタンパク質の精製方法の対象となる細胞培養液中の目的タンパク質の濃度は、現状では通常１ｇ／Ｌ程度である。また、夾雑物の濃度も、目的タンパク質の濃度とほぼ同程度であると考えられる。このような濃度範囲では、ハーベスト工程及びダウンストリーム工程を含む従来のタンパク質の精製方法は、有効である。

しかしながら、抗体医薬の需要が急速に拡大し、抗体医薬に用いられるタンパク質の大量生産が指向されたため、近年では細胞培養液中のタンパク質濃度を高める細胞培養技術が急速に発達している。そのため、近年では細胞培養液中の目的タンパク質の濃度が１０ｇ／Ｌあるいはそれ以上にまで到達しようとしている。しかし同時に、細胞培養液中の夾雑物の濃度も同様に増加しており、従来のタンパク質の精製方法では、目的タンパク質の精製が困難になりつつある。

これに対し、各種の夾雑物を迅速かつ有効に除去し、抗体医薬品として使われる抗体タンパク質、すなわちモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び免疫グロブリンなどを精製することを目的として、近年では、多孔質膜にイオン交換基を導入して、タンパク質吸着能力を付与したタンパク質吸着膜が、多数開発されている。中でも、特許文献１及び２に示されているタンパク質吸着膜は、高いタンパク質吸着容量と、選択性と、を有している。これらのタンパク質吸着膜は、多孔質基材の主表面及び細孔の側壁に、放射線照射によって固定されたグラフト鎖を有し、さらにグラフト鎖の側鎖にリガンドを備えている。このような多孔膜は、多孔質基材に固定された各グラフト鎖が１以上の側鎖を有し、その側鎖にリガンドが１以上固定された構造を有する。そのため、リガンドが細孔空間内に立体的に分布する。よって、吸着物質に対して吸着点の数が多く、吸着量が増加するとともに、相互作用の小さなタンパク質などの吸着性も高くなる。このように、リガンドを備えたグラフト鎖を有する多孔質吸着膜の開発は、タンパク質精製に、多大な恩恵をもたらしている。

基材にグラフト鎖を形成させる主なグラフト重合法の中で、多孔質膜にγ線等の放射線を照射してラジカルを発生させ、ラジカル重合性モノマーを反応させてグラフト鎖を導入する、放射線グラフト重合法が知られている。放射線グラフト重合法は、大気圧下において、基材種によらず、放射線照射でラジカルが生成するため、容易にグラフト重合が可能な方法である。これまでに、放射線照射グラフト重合法は、大きく分けると、前照射法と呼ばれる方法と、同時照射法と呼ばれる方法と、の２つが提案されている。

前照射法は、酸素濃度の低い雰囲気で、基材に放射線を照射し、基材やその内部にラジカルを作る放射線照射工程と、その後、ラジカル重合性モノマーを含む溶液中に浸漬することにより、グラフト鎖を形成させるグラフト工程と、からなる方法である。放射線照射工程と、グラフト工程と、が分かれていることから、グラフト鎖の長さ／分子量などを制御しやすいという利点がある。したがって、発生したラジカルを比較的安定に維持できる場合、前照射法が望ましい。特許文献１及び２によれば、多孔質基材にグラフト鎖を形成する手法に、この前照射法を用いている。しかし、非晶性高分子をグラフト鎖形成の基材として用いる場合、ラジカルが不安定で失活しやすいため、直ちにグラフト重合する必要があり、大規模な生産を行うには、大規模な施設等が必要となり、非常にハードルが高い。また、結晶性高分子をグラフト鎖形成の基材として用いる場合でも、ラジカルを長時間安定に維持するには、ガラス転移点以下の極低温で冷却しなければならず、大規模生産に対して、そのハードルは、必ずしも低くはない。

一方、同時照射法は、先ず基材にラジカル重合性モノマーを含む溶液中に浸漬させる浸漬工程の後、次いで酸素濃度の低い雰囲気で、基材とラジカル重合性モノマーの共存下、放射線を照射し、基材にラジカル重合性モノマーをグラフト重合してグラフト鎖を形成させる照射グラフト工程と、からなる方法である。この方法は、基材高分子の結晶化度を問わないことや、前述の前照射法に比べて工程が簡便であることから、特に非晶性高分子基材へのグラフト鎖形成において、工業化しやすい方法である。同時照射法を用いた基材の改質例としては、特許文献３乃至５に示すように各種報告されている。

特許文献３では、繊維と、ラジカル重合性化合物と、を含む溶液を、高分子フィルムの間に密封した後、放射線照射を行い、さらにその後、加熱処理を行う方法で、高いグラフト率を有する均一なグラフト化繊維が得られることが示されている。

特許文献４では、糸にラジカル重合性化合物を含む溶液を含浸させ、溶液を含侵させた糸をチーズボビンに巻きつけ、チーズボビンに巻かれた糸に放射線照射を行い、その後、加熱処理する方法で、大量の糸に安定したグラフト重合反応を発現させられることが示されている。

特許文献５では、非極性の多孔質高分子基材に、低級アルコールを１５ｖｏｌ％以上添加した、極性を有するラジカル重合性化合物を含む溶液を接触させた後、放射線照射を行う方法が示されている。ラジカル重合性化合物を含む溶液に、低級アルコールを所定量以上含ませることで、非極性の多孔質高分子基材への含浸を容易にし、多孔質基材表面へグラフト鎖を形成可能としている。

国際公開第２００９／０５４２２６号パンフレット 特開２０１０−１５８６２４号公報 特許３２９３０３１号公報 特開２０１０−１４４２９６号公報 特開平７−２５８３０４号公報

前述のように、リガンドを備えたグラフト鎖を有する多孔質吸着膜は、タンパク質精製に非常に有用である。さらに、大規模な生産において、非晶性高分子を基材とする多孔質膜へグラフト鎖を導入する方法としては、放射線照射グラフト重合法の同時照射法が、最も適している。

しかし、同時照射法を行う場合、基材にラジカルを発生させると共に、ラジカル重合性モノマーにもラジカルを発生させるため、基材及びラジカル重合性モノマーのグラフト反応と、ラジカル重合性モノマーどうしのラジカル重合と、が競争反応となる。多孔質吸着膜のように、細孔径が０．０１〜５μｍ程である多孔質膜を基材として用いる場合、ラジカル重合性モノマーどうしのラジカル重合が優位になると、形成されるホモポリマーによって、細孔の閉塞や、通液性能の著しい低下を招いてしまう。特に、細孔径が小さな膜において、その影響は顕著に表れる。したがって、同時照射法によって、多孔質膜に、吸着膜として適したグラフト鎖を形成させる場合、競争反応であるモノマーどうしのラジカル重合を抑えることが必要となる。

しかし、特許文献３及び４に示される方法では、同時照射法でのグラフト鎖形成の後、加熱処理を行っていることから、ラジカル重合性モノマーからなるホモポリマー形成を、より促進してしまう。

特許文献５で示された方法で作製されたグラフト鎖は、グラフト率が２〜６％と、グラフト率が低く、吸着膜として使用するには不十分なグラフト鎖しか形成できていない。さらに、作製された膜については、長時間の吸水性しか評価しておらず、通液性能は不明である。

本発明の解決しようとする課題は、上述のような、高分子を基材とする多孔質膜に、放射線を用いた同時照射法によって、グラフト鎖を導入する際に特有の課題に対して、新たな技術を提供することである。さらに、グラフト鎖にイオン交換基を固定した多孔質吸着膜を提供すると共に、多孔質吸着膜を用いて、動物細胞培養液に代表される、目的タンパク質と不純物とを含む混合溶液から、不純物を簡便に除去し、目的タンパク質を効率的に精製する方法を提供することも課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、高分子を基材とする多孔質膜を、第１級又は第２級の１価の低級アルコールを４０〜７０ｖｏｌ％含有するラジカル重合性モノマー溶液に浸漬した状態で、放射線を照射することにより、基材表面にラジカル重合性モノマーをグラフト重合して、グラフト鎖を形成させる、グラフト鎖の導入方法を用いることが、有効であることを見出した。

すなわち、本発明は、以下のグラフト鎖の導入方法、及びグラフト鎖にイオン交換基を固定した多孔質吸着膜、及び多孔質吸着膜を用いたタンパク質の精製方法を提供する。

［１］高分子を含む多孔質基材にグラフト鎖を導入する方法であって、
多孔質基材を、ラジカル重合性モノマーを含む溶液中に浸漬させる浸漬工程と、
浸漬状態のまま、多孔質基材に放射線照射を行い、多孔質基材にラジカル重合性モノマーをグラフト重合させて、多孔質基材にグラフト鎖を形成させる照射グラフト工程と、
を有し、
ラジカル重合性モノマーを含む溶液が、第１級又は第２級の１価の低級アルコールを４０〜７０ｖｏｌ％含む溶媒を含む、
グラフト鎖を導入する方法。

［２］多孔質基材が非晶性高分子を含む、［１］に記載のグラフト鎖の導入方法。

［３］非晶性高分子がポリスルホンである、［１］又は［２］に記載のグラフト鎖の導入方法。

［４］多孔質基材の細孔径が、０．０１μｍから５μｍの範囲である、［１］から［３］のいずれかに記載のグラフト鎖の導入方法。

［５］多孔質基材が中空糸多孔膜である、［１］から［４］のいずれかに記載のグラフト鎖の導入方法。

［６］ラジカル重合性モノマーがグリシジルメタクリレートである、［１］から［５］のいずれかに記載のグラフト鎖の導入方法。

［７］多孔質吸着膜であって、［１］から［６］のいずれかに記載の方法によって導入された、グラフト鎖を有する多孔質膜と、グラフト鎖が有する側鎖に固定されたイオン交換基と、を備える多孔質吸着膜。

［８］イオン交換基がアニオン交換基であって、イソプロピルアミン、プロピルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、及びトリエチルアミンからなる群より選択される少なくとも１種類である、［７］に記載の多孔質吸着膜。

［９］イオン交換基がカチオン交換基であって、スルホン酸基、及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種類である、［７］に記載の多孔質吸着膜。

［１０］精製対象タンパク質と、夾雑物と、を含む混合溶液から精製対象タンパク質を精製する方法であって、
［７］から［９］のいずれかに記載の多孔質吸着膜を用意することと、
多孔質吸着膜に混合溶液を通液して夾雑物を除去し、精製対象タンパク質を得ることと、
を含むタンパク質の精製方法。

本発明に係るグラフト鎖の導入方法を用いることにより、高分子を基材とする多孔質膜へ、グラフト鎖を簡便に形成させることが可能となる。さらにグラフト鎖にイオン交換基を固定した多孔質吸着膜を用いることにより、目的タンパク質と、夾雑物と、を含む混合液から夾雑物を除去し、目的タンパク質を効率よく且つ迅速に精製することが可能となる。

以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

本実施の形態に係る高分子を含む多孔質基材にグラフト鎖を導入する方法は、多孔質基材を、ラジカル重合性モノマーを含む溶液中に浸漬させる浸漬工程と、浸漬状態のまま、多孔質基材に放射線照射を行い、多孔質基材にラジカル重合性モノマーをグラフト重合させて、多孔質基材にグラフト鎖を形成させる照射グラフト工程と、を含む。ここで、ラジカル重合性モノマーを含む溶液が、第１級又は第２級の１価の低級アルコールを４０〜７０ｖｏｌ％含む溶媒を含む。

本実施の形態において、多孔質膜の基材としては、特に限定されないが、同時照射法を用いてグラフト鎖を導入するという観点から、非晶性高分子が、重量比率で９０％以上含まれている基材が好ましい。

非晶性高分子としては、機械的性質の保持のために、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリイミド、及びポリフェニレンエーテル等が挙げられる。ここで非晶性高分子とは、ガラス転移点Ｔ_gは有するが、融点Ｔ_mがない高分子のことをいう。これらの基材の中でも、機械的強度に特に優れ、かつタンパク質などの夾雑物の高い吸着容量が得られる素材である点で、ポリスルホン又はポリエーテルスルホンが好ましい。

ポリスルホン又はポリエーテルスルホンを用いて多孔質膜を製造する方法は、当業者にとって公知の方法が使用可能であり、例えば、特開昭５４−１３４８７９や、特開平２−１７４９１５に開示される方法などが挙げられる。

多孔質膜の細孔径は、特に限定されないが、多孔質膜の形状を保持し、且つ通液時の圧損が実用上問題がない程度であれば、特に限定されないが、０．０１μｍ〜５μｍであることが好ましく、より好ましくは０．０５μｍ〜３μｍであり、さらに好ましくは０．１μｍ〜１μｍである。また、細孔の構造は、膜の深さ方向に対して対称構造でも、非対称構造であってもよい。

多孔質膜中の細孔の占める体積である空孔率も、多孔質膜の形状を保持しかつ通液時の圧損が実用上問題のない程度であれば、特に限定されないが、好ましくは５％〜９９％であり、より好ましくは１０％〜９５％であり、さらに好ましくは３０％〜９０％である。

細孔径及び空孔率の測定は、Ｍａｒｃｅｌ Ｍｕｌｄｅｒ著「膜技術」（株式会社アイピーシー）などに記載されているような、当業者にとって公知の方法により行うことができるが、測定方法としては、例えば、電子顕微鏡による観察、バブルポイント法、水銀圧入法、及び透過率法などが挙げられる。

多孔質膜の形態は、多孔質体であれば特に限定されないが、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、キャピラリー、円板又は円筒状などが挙げられる。これらの形態の中でも、製造の容易さ、スケールアップ性、及びモジュール成型した際の膜のパッキング性などから、多孔質膜は、中空糸多孔膜であることが好ましい。

本実施の形態において、中空糸多孔膜とは、中空部分を有する円筒状又は繊維状の多孔膜であり、中空糸の内層と、外層と、が貫通孔である細孔によって連続しており、その細孔によって内層から外層、あるいは外層から内層に液体あるいは気体が透過する性質を有する多孔体を意味する。

中空糸の外径及び内径は、物理的に形状を保持することができ、かつモジュール成型可能であれば、特に限定されない。

多孔質基材表面にグラフト鎖を形成するモノマーは、ラジカル重合性モノマーであって、例えば、グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリレート、グリシジルソルベート、グリシジルイタコレート、グリシジルマエレート、酢酸ビニル、ヒドロキシプロピルアセテート、及びアリルグリシジルエーテルなどが挙げられる。イオン交換基を導入しやすいことから、グリシジルメタクリレート又は酢酸ビニルが好ましく、グリシジルメタクリレートがより好ましい。

本実施の形態において、ラジカル重合性モノマーを、第１級又は第２級の１価の低級アルコールを含む溶媒で希釈し、ラジカル重合性モノマー溶液を得る。次に、ラジカル重合性モノマー溶液に多孔質基材を浸漬させる。低級アルコールの具体例としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、及び２−ブタノール等が挙げられる。中でも、グラフト処理の効率の良さ、両親媒性を有することから、メタノール、エタノール、２−プロパノールが好ましく、２−プロパノールがより好ましい。

溶媒中に含まれる低級アルコールの配合比率は４０〜７０ｖｏｌ％、好ましくは４５〜６５ｖｏｌ％である。４０ｖｏｌ％未満では、ラジカル重合性モノマーどうしの重合反応の抑制効率が低くなるばかりでなく、溶液中へラジカル重合性モノマーを溶解させることや、多孔質基材の細孔内へ当該溶液を存在させることが難しくなる傾向にある。また、７０ｖｏｌ％以上では、放射線照射及びラジカル重合時の熱により、溶媒の突沸等の危険性が生じる傾向にあり、その場合は、基材表面にグラフト鎖が形成されにくくなる傾向にある。

溶媒の低級アルコール以外の成分は、グラフト重合に直接関与しない液体であれば、特に限定されないが、含まれる低級アルコールよりも、高い沸点と、大きい比熱と、を有する液体が好ましく、例えば、純水等が挙げられる。

また、ラジカル重合性モノマーの配合比率は、溶媒１００体積部に対して１〜３０体積部が好ましく、５〜２０体積部がより好ましい。ラジカル重合性モノマーの配合比率が前記よりも低いと、グラフト鎖の形成が不十分なために、タンパク質吸着膜として用いたときにタンパク質吸着能が著しく低くなる傾向にある。配合比率が前記よりも高いと、溶液中へのラジカル重合性モノマーの分散が不均一になり、均一なグラフト鎖が得られにくくなる傾向にある。また、ラジカル重合性モノマーは、グラフト鎖を形成させる多孔質膜基材の重量の５倍以上とすると、局部的な反応の暴走が起こり、目的とする均一なグラフト鎖が得られにくい。したがって、ラジカル重合性モノマーの量は、多孔質基材膜重量の５倍以下、好ましくは２倍以下とすることが好ましい。

本実施の形態において、溶存酸素を除去したラジカル重合性モノマー溶液を、酸素濃度の低い雰囲気におかれた多孔質膜基材に付与し、これらを密封する。密封する容器としては、酸素の透過と、ラジカル重合性モノマーの揮発と、を防ぐことができるもので、かつ、耐熱性や容器からの溶出が無いもの、さらには容器自身のグラフト重合が起こりにくい素材であることが必要である。上市されているものの中では、放射線照射でポリマーラジカルの生成効率が低く、酸素透過性が低いポリエチレンテレフタレートや、ポリビニルフルオライドのフィルムバッグが適している。

放射線の照射は、電離放射線やγ線等で行われるが、透過性が高く均一に照射可能であるγ線が好ましい。その照射条件として、照射線量は５〜２００ｋＧｙが好ましい。照射線量が５ｋＧｙ未満では十分なグラフト重合量に必要な活性種の生成が起こらず、２００ｋＧｙを超えると、多孔質基材の主鎖の切断による物性低下が起こるので好ましくない。放射線照射の雰囲気は、容器でシールされていることから、空気中又は窒素やヘリウムなど不活性ガスの雰囲気のいずれでもよい。照射雰囲気によるグラフト重合への影響はないことから、経済性を考慮して、空気中照射が適当である。

本実施の形態において、グラフト率とは、基材の重量に対する、前記共重合リガンドが固定される前の基材に導入されたグラフト鎖の重量の比（百分率）を意味する。

グラフト率は、１０％以上２５０％以下であることが好ましく、より好ましくは１０％以上１５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以上９０％以下である。グラフト率を１０％以上とするであることにより、タンパク質の吸着容量が著しく高くなり実用的である。また、グラフト率を２５０％以下とするであることにより、実用的な強度が得られる。

通常、吸着したタンパク質を溶出する際に、塩溶液を多孔膜に通液するが、それにより膜体積は膨張する特性があり、グラフト率が高いほど膨張率が高い。塩溶液通液による膜体積の膨張率は、多孔膜とグラフト鎖の構造にもよるが、グラフト率６０％では約２％以下、９０％では約３％以下、１５０％では約５％以下である。グラフト率が２５０％以下の多孔膜が、実用上、好適である。

本実施の形態において、基材に導入されるグラフト鎖は、導入反応後にジメチルホルムアミドなどの有機溶剤で洗浄しても、除去されない化学構造を有する。

本実施の形態に係る多孔質吸着膜は、上述した方法によって導入されたグラフト鎖を有する多孔質膜と、グラフト鎖が有する側鎖に固定されたイオン交換基と、を備える。多孔質膜への放射線照射後、グラフト鎖に導入及び固定されるアニオン交換基としては、タンパク質混合用液中に溶存する不純物タンパク質、ＤＮＡ、ＨＣＰ、ウイルス、及びエンドトキシンなどを吸着するアニオン交換基であれば、特に限定されないが、イソプロピルアミン、プロピルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、及びトリエチルアミンなどが挙げられる。グラフト鎖を形成するグリシジルメタクリレート重合体が有するエポキシ基を開環し、ジエチルアミンなどのアミン並びにジエチルアンモニウム又はトリメチルアンモニウムなどのアンモニウム塩を付加することにより、グラフト鎖にアニオン交換基を導入および固定することができる。

グラフト鎖に導入及び固定されるカチオン交換基としては、タンパク質混合用液中に溶存する抗体など高い等電点を有する目的タンパク質を吸着するカチオン交換基であれば、特に限定されないが、スルホン酸基、及びカルボキシル基などが挙げられる。カチオン交換基を導入する場合、グラフト鎖を形成するグリシジルメタクリレート重合体が有するエポキシ基を開環し、亜硫酸ナトリウムなどのスルホン化剤を反応させることによってスルホン酸基を導入及び固定することや、サルコシンナトリウム塩を反応させることによって、カルボキシル基を導入及び固定することができる。

次に、本実施の形態に係るタンパク質の精製方法は、目的とするタンパク質と、夾雑物と、を含む混合溶液から目的とするタンパク質を精製する方法であって、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いて混合溶液をろ過し、夾雑物を除去することを含む、タンパク質の精製方法である。

本実施の形態に係る多孔質吸着膜は、混合溶液中に含まれる１種類以上の夾雑物から、目的とするタンパク質を分離、精製する用途に用いることが有効である。

目的とするタンパク質を分離・精製する方法としては、混合溶液を本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いてろ過することにより、（ａ）夾雑物を多孔質吸着膜に吸着させ、精製された目的タンパク質を、非吸着の画分として回収するフロースルーモード、あるいは（ｂ）目的タンパク質を多孔質吸着膜に吸着した後、選択的に溶出回収する結合モード、の２種類の方法が挙げられる。

本実施の形態に係る多孔質吸着膜にろ過させる混合溶液としては、アフィニティークロマトグラフィー工程前の溶液や、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出された、抗体を含有する溶出液が適している。

アフィニティークロマトグラフィー工程前の溶液中に含まれる、除去すべき夾雑物としては、バクテリア、細胞デブリ、ＨＣＰ、ＤＮＡ、ウイルス、及びエンドトキシンなどが含まれる。

アフィニティークロマトグラフィーに用いられるカラムに充填する樹脂のリガンドは、通常プロテインＡのようなＦｃ結合タンパク質を含む。このようなアフィニティークロマトグラフィーの樹脂は市販されており、容易に入手することが可能である。溶出液中に含まれる、除去すべき夾雑物としては、ＨＣＰ、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、遊離プロテインＡ、プロテインＡと抗体との間で形成された複合体、並びに抗体の凝集体などが含まれる。

上述した（ａ）の方法のろ過形態であるフロースルーモードを実施する場合には、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いて混合溶液をろ過し、素通りした画分を精製された抗体の溶液として回収する。この場合、抗体の大半は、吸着されることなく素通りするが、夾雑物は吸着により除去される。

上述した（ｂ）の方法のろ過形態である結合モードを実施する場合にも、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いて抗体を含む溶液をろ過する。この場合、抗体のみ、あるいは抗体と一部の夾雑物が、本実施の形態に係る多孔質吸着膜に吸着される。

以下、実施例及び比較例に基づいて本実施の形態をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例のみに限定されない。

（実施例１）溶媒に４０ｖｏｌ％の２−プロパノールを用いたときの同時照射法による多孔質中空糸へのグラフト鎖の導入
外径２．３ｍｍ、内径１．４ｍｍ、最小細孔径が０．４μｍである、ポリスルホン９７質量部、及びポリビニルピロリドン３質量部よりなる多孔質中空糸を、ポリビニルフルオライド製のフィルムバッグに入れて、容器内の空気を窒素で置換した。２−プロパノール４０体積部、純水６０体積部よりなる溶媒を調整後、溶媒９０体積部、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）１０体積部よりなる反応液を、多孔質中空糸１質量部に対し、１８質量部、フィルムバッグに注入した後、フィルムバッグを密閉した。なお、反応液は予め窒素でバブリングして、反応液内の酸素を窒素置換した。

その後、室温にてγ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させると共に、グラフト重合反応を施し、多孔質中空糸にグラフト鎖を導入した。

グラフト重合反応後、フィルムバッグ内の反応液を除去した。次いで中空糸を２−プロパノールで洗浄することにより、残存したＧＭＡ、そのオリゴマー及び多孔質中空糸膜に固定されなかったグラフト鎖を除去した。

洗浄液を除去した後、さらに２−プロパノールを入れて２回洗浄を行った。洗浄後の多孔質中空糸を乾燥し、重量を測定したところ、グラフト鎖が導入された多孔質中空糸の重量はグラフト鎖導入前の１４６％であり、下記式（１）で算出される、基材重量に対するグラフト鎖の重量比として定義されるグラフト率（ｄｇ）は４６％であった。
式（１） ｄｇ ＝ （ｗ₁ − ｗ₀） ／ ｗ₀
ここでｗ₀は反応前の多孔質中空糸の重量、ｗ₁はグラフト鎖が導入された多孔質中空糸の重量である。

（製造例１）イオン交換基が表面に固定された多孔膜モジュールの作製
（ｉ）アニオン交換基（ジエチルアミノ基）のグラフト鎖への固定
実施例１にて得られた、乾燥したグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。ジエチルアミン５０体積部、純水５０体積部の混合溶液よりなる反応液を、グラフト反応後の中空糸に対して２５質量部、ガラス反応管に入れ、３０℃に調整した。ここにグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２４時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をジエチルアミノ基に置換することにより、アニオン交換基としてジエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を得た。

得られた中空糸多孔膜は、外径２．３ｍｍ、内径１．４ｍｍであった。また、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基がジエチルアミノ基に置換された置換率は、６２％であった。

置換率Ｔはエポキシ基のモル数Ｎ₀のうち、ジエチルアミノ基に置換されたモル数Ｎ₁と
して下記式（２）を用いて算出した。
式（２） Ｔ ＝ １００ × Ｎ₁ ／ Ｎ₀
＝ １００ ×｛（ｗ₁−ｗ₀ ／ Ｍ₁｝ ／ ｛ｗ₀（ｄｇ ／ （ｄｇ ＋ １００）） ／ Ｍ₂｝
式（２）中、Ｍ₁はジエチルアミンの分子量（７３．１４）、ｗ₀はグラフト重合反応後の中空糸多孔膜の重量、ｗ₁はジエチルアミノ基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、ｄｇはグラフト率、Ｍ₂はＧＭＡの分子量（１４２．１５）である。

（ｉｉ）アニオン交換基（イソプロピルアミノ基）のグラフト鎖への固定
実施例１にて得られた、乾燥したグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。イソプロピルアミン５０体積部、純水５０体積部の混合溶液よりなる反応液を、グラフト反応後の中空糸に対して２５質量部、ガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。ここにグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、４８時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をイソプロピルアミノ基に置換することにより、アニオン交換基としてイソプロピルアミノ基を有する中空糸多孔膜を得た。

得られた中空糸多孔膜は、外径２．３ｍｍ、内径１．４ｍｍであった。また、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基がイソプロピルアミノ基に置換された置換率は、式（２）を用いて求めたところ、６１％であった。

（ｉｉｉ）アニオン交換基（トリエチルアミノ基）のグラフト鎖への固定
実施例１にて得られた、乾燥したグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液１７ｍＬと、メタノール１７ｍＬと、を混合撹拌し、ここにトリエチルアミン塩酸塩４．８１ｇを撹拌しながら添加し、反応液を作製した。次に、反応液を、グラフト反応後の中空糸に対して２５質量部、ガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。ここにグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、３６時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をトリエチルアミノ基に置換することにより、アニオン交換基としてトリエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を得た。

得られた中空糸多孔膜は、外径２．５ｍｍ、内径１．５ｍｍであった。また、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基がトリエチルアミノ基に置換された置換率は、式（２）を用いて求めたところ、６４％であった。

（ｉｖ）カチオン交換基（スルホン酸基）のグラフト鎖への固定
実施例１にて得られた、乾燥したグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。亜硫酸ナトリウム１０体積部、２−プロパノール１５体積部、純水７５体積部の混合溶液よりなる反応液を、グラフト反応後の中空糸に対して２０質量部、ガラス反応管に入れ、３０℃に調整した。ここにグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２１０分間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をスルホン酸基に置換した。さらに、未反応のエポキシ基を０．５ ｍｏｌ／Ｌ 硫酸中でジオール基に変換し、カチオン交換基としてスルホン酸基を有する中空糸多孔膜を得た。

得られた中空糸多孔膜は、外径２．３ｍｍ、内径１．４ｍｍであった。また、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基がスルホン酸基に置換された置換率は、式（２）を用いて求めたところ、５７％であった。

（ｖ）中空糸多孔膜モジュールの作製
（ｉ）で得られた、ジエチルアミノ基がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜１本の長手方向の両末端を、中空糸多孔膜の中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で、内径０．５ｃｍ、有効長９．２ｃｍのポリスルホン酸性モジュールケースに固定して、膜体積が０．２４ｍＬの中空糸多孔膜モジュールを作製した。これを、評価モジュールとして用いた。

（実施例２）中空糸多孔膜のタンパク質動的吸着容量の測定
２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を３０ｍＬ通液して平衡化した後、前記緩衝液にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を混合して、濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整したＢＳＡ溶液を用い、破過が開始するまで、製造例１で作製した中空糸多孔膜モジュールにＢＳＡ溶液を透過させた。溶液は、評価モジュール内の中空糸多孔膜の内側から外側に向かって、流速２ｍＬ／ｍｉｎにて通液した。評価はＧＥヘルスケアバイオサイエンス製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００を用いて実施した。具体的には、同装置において得られる透過液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度が、供給液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度（１５０ｍＡＵ）の１／１０（１５ｍＡＵ）となった時点を破過点とし、その時点までに供給したＢＳＡ溶液の体積から、動的吸着容量を算出した。ここで、ＢＳＡ溶液の濃度Ｑ、評価モジュールが破過した時までに透過させたＢＳＡ溶液の体積Ｖ_B、及び評価モジュール内の実施例に係る中空糸多孔膜の体積Ｖ_Mから、下記式（３）に基づいて動的吸着容量Ａは算出可能である。
式（３） Ａ ＝ Ｑ × Ｖ_B ／ Ｖ_M

中空糸多孔膜の体積とは、中空部分を除いた体積である。また破過とは、透過液中のＢＳＡ濃度が、供給されたＢＳＡ濃度の１０％である０．１ｍｇ／ｍＬを超えた時点のことをいう。

製造例１の（ｖ）で得られた中空糸多孔膜モジュールを用いて、ＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、４２ｍｇ／ｍＬであった。

（実施例３）溶媒に４０ｖｏｌ％のメタノールを用いたときの同時照射法による多孔質中空糸へのグラフト鎖の導入
実施例１における溶媒を、メタノール４０体積部、純水６０体積部とし、反応液を、溶媒９５体積部、ＧＭＡ５体積部とした。それ以外は、実施例１と同じ操作をした。

得られた中空糸多孔膜の重量は、グラフト鎖導入前の１２２％であり、式（１）で算出される、基材重量に対するグラフト鎖の重量比として定義されるグラフト率（ｄｇ）は２２％であった。

さらに製造例１の（ｉ）及び（ｖ）と同じ操作を行い、ジエチルアミノ基が表面に固定された多孔膜モジュールを作製した。得られた中空糸多孔膜は、外径２．３ｍｍ、内径１．４ｍｍであった。また、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基がジエチルアミノ基に置換された置換率は、６１％であった。

さらに実施例２に従い、ＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、１９ｍｇ／ｍＬであった。

（実施例４）溶媒に６５ｖｏｌ％の２−プロパノールを用いたときの同時照射法による多孔質中空糸へのグラフト鎖の導入
実施例１における溶媒を、２−プロパノール６５体積部、純水３５体積部とし、反応液を、溶媒９０体積部、ＧＭＡ１０体積部とした。それ以外は、実施例１と同じ操作をした。

得られた中空糸多孔膜の重量は、グラフト鎖導入前の１４９％であり、式（１）で算出される、基材重量に対するグラフト鎖の重量比として定義されるグラフト率（ｄｇ）は４９％であった。

さらに製造例１の（ｉ）及び（ｖ）と同じ操作を行い、ジエチルアミノ基が表面に固定された多孔膜モジュールを作製した。得られた中空糸多孔膜は、外径２．３ｍｍ、内径１．４ｍｍであった。また、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基がジエチルアミノ基に置換された置換率は、６３％であった。

さらに実施例２に従い、ＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、４０ｍｇ／ｍＬであった。

（比較例１）溶媒に３０ｖｏｌ％の２−プロパノールを用いたときの同時照射法による多孔質中空糸へのグラフト鎖の導入
実施例１における溶媒を、２−プロパノール３０体積部、純水７０体積部とし、反応液を、溶媒９５体積部、ＧＭＡ５体積部とした。それ以外は、実施例１と同じ操作をした。

得られた中空糸多孔膜の重量は、グラフト鎖導入前の１１５％であり、式（１）で算出される、基材重量に対するグラフト鎖の重量比として定義されるグラフト率（ｄｇ）は１５％であった。

さらに製造例１の（ｉ）及び（ｖ）と同じ操作を行い、アニオン交換基が表面に固定された多孔膜モジュールを作製した。得られた中空糸多孔膜は、外径２．３ｍｍ、内径１．４ｍｍであった。また、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基がジエチルアミノ基に置換された置換率は、５９％であった。

さらに実施例２に従い、ＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、中空糸多孔膜が破断し、タンパク質吸着膜として機能しなかった。

このことから、比較例１に係る溶媒に３０ｖｏｌ％の２−プロパノールを用いたグラフト鎖の導入方法は、非晶性高分子を基材とする多孔質膜に、吸着膜として適したグラフト鎖を形成させる方法として、不適であることが分かった。

（比較例２）溶媒に８０ｖｏｌ％の２−プロパノールを用いたときの同時照射法による多孔質中空糸へのグラフト鎖の導入
実施例１における溶媒を、２−プロパノール８０体積部、純水２０体積部とし、反応液を、溶媒９５体積部、ＧＭＡ５体積部とした。それ以外は、実施例１と同じ操作をした。

グラフト重合反応後、フィルムバッグが破断しており、反応液が漏れていた。得られた中空糸多孔膜の重量は、グラフト鎖導入前の１０２％であり、式（１）で算出される、基材重量に対するグラフト鎖の重量比として定義されるグラフト率（ｄｇ）は２％であった。

このことから、比較例１に係る溶媒に８０ｖｏｌ％の２−プロパノールを用いたグラフト鎖の導入方法は、非晶性高分子を基材とする多孔質膜に、吸着膜として適したグラフト鎖を形成させる方法として、不適であることが分かった。

（比較例３）前照射法による多孔質中空糸へのグラフト鎖の導入
外径２．３ｍｍ、内径１．４ｍｍ、最小細孔径が０．４μｍの、ポリスルホン多孔質中空糸を、密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有する多孔質中空糸をガラス反応管に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。ここに４０℃に調整したグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）３体積部、メタノール９７体積部よりなる反応液を、多孔質中空糸１質量部に対し２０質量部注入した後、１２分間密閉状態で静置してグラフト重合反応を施し、多孔質中空糸にグラフト鎖を導入した。反応液は予め窒素でバブリングして、反応液内の酸素を窒素置換した。

グラフト重合反応後、反応管内の反応液を除去した。次いで、反応管内に２−プロパノールを入れて多孔質中空糸を洗浄することにより、残存したグリシジルメタクリレート、そのオリゴマー及び多孔質中空糸に固定されなかったグラフト鎖を除去した。

洗浄液を除去した後、さらに２−プロパノールを入れて２回洗浄を行った。洗浄後の多孔質中空糸を乾燥し、重量を測定したところ、グラフト鎖が導入された多孔質中空糸の重量はグラフト鎖導入前と変化がなく、グラフト鎖が導入されていなかった。

このことから、比較例２に係る前照射法によるグラフト鎖の導入方法は、非晶性高分子を基材とする多孔質膜に対して、不適であることが分かった。

（実施例５）フロースルーモードによる夾雑物の吸着除去
（ｖｉ）抗体含有細胞培養液の調製
無血清培地にて培養したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養液（電気伝導度８．７ｍＳ／ｃｍ、細胞密度１．１×１０⁷／ｍＬ）１９６ｍＬに抗体５０ｍｇ／ｍＬを含むヒトγ−グロブリン溶液（ベネシス社、ヴェノグロブリン）４ｍＬを添加し、０．４５μｍ精密ろ過膜（ザルトリウス製、ミニザルト１６５５５Ｋ）を透過させることにより、ｐＨ７．４で抗体１ｍｇ／ｍＬを含有する細胞培養液を調製した。

得られた細胞培養液中の代表的な夾雑物であるＨＣＰ濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＣＨＯ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔの９６ウェルプレートに細胞培養液を滴下し、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩ９６のプレートリーダーを用いてＨＣＰ濃度を測定した。その結果、細胞培養液中のＨＣＰ濃度は、３５４μｇ／ｍＬであった。

他の代表的な夾雑物であるＤＮＡの定量は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて評価する細胞培養液を処理した後、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）フルオロメーターを用いて行った。その結果、細胞培養液中のＤＮＡ濃度は７５６０ｎｇ／ｍＬであった。

（ｖｉｉ）多孔質吸着膜による抗体含有細胞培養液からの夾雑物除去
製造例１の（ｖ）で得られた中空糸多孔膜モジュールに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を２０ｍＬ通液して平衡化した後、（ｖｉ）で得られた抗体含有細胞培養液を膜体積の１００倍である２４ｍＬ通液し、フロースルーにて得られる画分を回収した。

得られたフロースルー回収液中のＨＣＰ濃度を（ｖｉ）と同様にして測定した結果、８２μｇ／ｍＬであり、ＨＣＰ含有量は大きく低下した。また、（ｖｉ）と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、７９４ｎｇ／ｍＬであり、ＤＮＡ含有量は大きく低下した。

また、中空糸多孔膜モジュール透過液中の抗体タンパク質の回収率は、アフィニティークロマトグラフィーによって評価した。島津製作所株式会社製高速液体クロマトグラフＬＣ−２０Ａシステムに、アフィニティーカラムとしてＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製ＰＯＲＯＳ Ｇ（ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム）を取り付け、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸に０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含むバッファー（ｐＨ７．０）を用い、室温において流速２ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、ここにサンプルを１００μＬ添加した。また溶出には１２ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸バッファーを用いた。その後、システムに、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに吸着・溶出した抗体タンパク質の溶出ピークを表示させた。さらに、抗体タンパク質の溶出ピーク面積から、溶液中の抗体タンパク質の回収率を算出した。その結果、抗体タンパク質の回収率は、９８％であった。

本実施の形態に係る中空糸多孔膜を用いることにより、夾雑物を有効に除去し、速やかに抗体を精製することが可能であった。

（ｖｉｉｉ）プロテインＡカラムを用いた抗体精製
（ｖｉ）で得られた抗体含有細胞培養液２５ｍＬを０．２μｍ除菌膜（ザルトリウス製、Ｍｉｎｉｓａｒｔ ｐｌｕｓ）に通液した後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬで平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰ １ｍＬ）に１０ｍＬ添加し、抗体を吸着させた。カラムに上記緩衝液２０ｍＬを通液して洗浄した後、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を１０ｍＬ通液して、抗体を溶出回収した。得られた溶出回収液に、ほぼ等量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し中和した後、少量の１．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出回収液をｐＨ８．０に調整し、抗体の精製液２０ｍＬを得た。精製液はプロテインＡカラムに通液する前に対して２倍希釈されている。

得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度を（ｖｉ）と同様にして測定した結果、３．１μｇ／ｍＬであった。また、（ｖｉ）と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、６７．５ｎｇ／ｍＬであった。さらに、得られた溶出回収液の抗体タンパク質濃度を、（ｖｉｉ）と同様の方法にして測定した結果、０．４６ｇ／Ｌであり、２倍希釈されていることから、得られた抗体のアフィニティークロマトグラフィー後の回収率は９２％であった。

（ｉｘ）多孔質吸着膜によるプロテインＡ溶出液からの夾雑物除去
製造例１の（ｖ）で得られた中空糸多孔膜モジュールに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を２０ｍＬ通液して平衡化した後、（ｖｉｉｉ）で得られたアフィニティークロマトグラフィー後の抗体の精製液を２０ｍＬ通液し、フロースルーにて得られる画分を回収した。

得られたフロースルー回収液中のＨＣＰ濃度を（ｖｉ）と同様にして測定した結果、３０ｎｇ／ｍＬであり、フロースルーによりＨＣＰ含有量は約１００分の１に低下した。また、（ｖｉ）と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、検出限界（１０ｎｇ／ｍＬ）以下であった。

さらに、中空糸多孔膜モジュール透過液中の抗体タンパク質の回収率を、（ｖｉｉ）と同様の方法にして測定した結果、９８％であった。

本実施の形態に係る中空糸多孔膜を用いることにより、夾雑物を有効に除去し、速やかに抗体を精製することが可能であった。

本発明により、主として非晶性高分子を基材とした多孔質膜に、放射線を用いた同時照射法によって、吸着膜として適したグラフト鎖を簡便に形成させることが可能となる。また、本発明の方法を用いて作製された多孔質吸着膜は、抗体精製において、ＨＣＰ、ＤＮＡなどの夾雑物を有効に且つ迅速に除去できるので、細胞培養液に含まれる目的タンパク質の精製において、産業上の利用可能性を有する。

Claims (10)

1. 高分子を含む多孔質基材にグラフト鎖を導入する方法であって、
   前記多孔質基材を、ラジカル重合性モノマーを含む溶液中に浸漬させる浸漬工程と、
   前記浸漬状態のまま、前記多孔質基材に放射線照射を行い、前記多孔質基材に前記ラジカル重合性モノマーをグラフト重合させて、前記多孔質基材にグラフト鎖を形成させる照射グラフト工程と、
   を含み、
   前記ラジカル重合性モノマーを含む溶液が、第１級又は第２級の１価の低級アルコールを４０〜７０ｖｏｌ％含む溶媒を含む、
   多孔質基材にグラフト鎖を導入する方法。
2. 前記多孔質基材が非晶性高分子を含む、請求項１に記載のグラフト鎖の導入方法。
3. 前記非晶性高分子がポリスルホンである、請求項１又は２に記載のグラフト鎖の導入方法。
4. 前記多孔質基材の細孔径が、０．０１μｍから５μｍの範囲である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のグラフト鎖の導入方法。
5. 前記多孔質基材が中空糸多孔膜である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のグラフト鎖の導入方法。
6. 前記ラジカル重合性モノマーがグリシジルメタクリレートである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のグラフト鎖の導入方法。
7. 請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法によって導入されたグラフト鎖を有する多孔質膜と、
   前記グラフト鎖が有する側鎖に固定されたイオン交換基と、
   を備える多孔質吸着膜。
8. 前記イオン交換基がアニオン交換基であって、イソプロピルアミン、プロピルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、及びトリエチルアミンからなる群より選択される少なくとも１種類である、請求項７に記載の多孔質吸着膜。
9. 前記イオン交換基がカチオン交換基であって、スルホン酸基、及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種類である、請求項７に記載の多孔質吸着膜。
10. 精製対象タンパク質と、夾雑物と、を含む混合溶液から前記精製対象タンパク質を精製する方法であって、
    請求項７乃至９のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜を用意することと、
    前記多孔質吸着膜に、前記混合液を通液して前記夾雑物を除去し、前記精製対象タンパク質を得ることと、
    を含むタンパク質の精製方法。