TWI412394B - Purification of proteins - Google Patents
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Description
本發明係關於一種蛋白質之純化方法。具體而言,本發明係關於一種自以動物細胞培養液為代表的含有目標之蛋白質與雜質的混合液中簡便地除去雜質,高效率地純化目標之蛋白質之方法。
近年來,於生物技術產業中,可產生實效之蛋白質大量純化成為一大重要課題。尤其是藥品領域中對抗體藥品之需求激增,因而強烈要求確立一種可高效率地大量生產及大量純化蛋白質之技術。
蛋白質通常係使用來自動物之細胞株進行細胞培養而產生。為了將目標之蛋白質(以下,有時簡稱為"目標蛋白質")、尤其是用作藥物之抗體藥品應用於實際當中,必須自細胞培養液中除去作為懸濁物質成分之細胞碎片等、以及作為非懸濁物質成分之來自細胞之溶存蛋白質等,純化成滿足應用於人體治療用途之組成。
自細胞培養液中純化出目標蛋白質之通常之操作為,首先,對細胞培養液實施離心分離,使懸濁物質成分沈澱並將其除去。其次,使用微濾膜進行篩分過濾,除去懸濁物質成分中之未由離心分離完全除去的約1μm以下之細胞碎片。然後,為了滅菌而使用最大微孔徑為0.22μm以下之過濾膜實施滅菌過濾,從而獲得目標蛋白質之澄清溶液(收集步驟)。獲得含有目標蛋白質之澄清溶液後,利用以親和層析法(affinity chromatography)為代表之複數種層析技術之組合來進行純化製程,分離、純化出目標蛋白質(後處理步驟)。由培養液中之細胞所產生並溶存於該培養液中之雜質蛋白質係於後處理步驟中被除去。於先前之自細胞培養液中純化出目標蛋白質等之上述方法中,該培養液中之目標蛋白質之濃度通常為1g/L以下,且該培養液中所含有之細胞碎片及溶存之雜質蛋白質等之濃度亦與目標蛋白質之濃度相同。於該濃度範圍下,先前之收集步驟及後處理步驟之純化製程在純化目標蛋白質方面非常有效。
然而,由於抗體藥品之需求激增,要求大量生產作為抗體藥品之蛋白質,且由於培養技術飛速進步,近年來細胞培養液中之目標蛋白質之濃度增加,已快要達到10g/L之程度。該培養技術之飛速進步同時意味著細胞培養液中之雜質蛋白質亦同樣增加,因此預測其會對使用先前之蛋白質純化製程之純化帶來巨大負擔。
因此,作為用以大量純化蛋白質之技術,例如於專利文獻1及2中揭示有於多孔質膜中導入離子交換基而形成的具有蛋白質吸附能力之蛋白質吸附膜,該蛋白質吸附膜亦可於市場上購得。
又,作為蛋白質吸附膜之使用例,於專利文獻3中揭示有使用下述兩種蛋白質吸附膜自淋巴液中分離白蛋白之方法,上述兩種蛋白質吸附膜係導入有陰離子交換基之纖維素多孔膜與導入有陽離子交換基之纖維素多孔膜。
進而,於專利文獻4中,揭示有使用導入有陰離子交換基之纖維素多孔膜來分離核酸與內毒素之方法。
進而,於專利文獻5及6中,揭示有分別將陽離子交換基及陰離子交換基導入至聚醚碸多孔膜中而形成之蛋白質吸附膜。
於非專利文獻1中,揭示有使用含有離子交換基之多孔膜來分離核酸與單株抗體之方法。
[專利文獻1]美國專利第5,547,575號說明書
[專利文獻2]美國專利第5,739,316號說明書
[專利文獻3]美國專利第6,001,974號說明書
[專利文獻4]美國專利第6,235,892號說明書
[專利文獻5]美國專利第6,783,937號說明書
專利文獻6]美國專利第6,780,327號說明書
[非專利文獻1]Bioseparation 8:281-291,1999
但是,於藉由離心分離、微濾、進而滅菌過濾將含有高濃度之目標蛋白質之細胞培養液製成澄清液,使用作為親和層析管柱之蛋白質A親和管柱選擇性地吸附該澄清液中之目標蛋白質,其後用酸性溶出液進行溶出回收之情形時,常發現回收液中含有凝聚之雜質。並且,隨著蛋白質A親和管柱之反覆使用次數增加,存在該凝聚之雜質之量增加,並且所回收之目標蛋白質之量下降之傾向。
如上所述,雜質蛋白質之量越多,則親和層析步驟所承受之負擔越大,不僅因清洗管柱等而導致純化步驟需要較長時間,而且會使親和層析法中所使用之管柱珠粒之壽命、尤其是蛋白質A親和管柱之壽命縮短。由於蛋白質A親和管柱之價格昂貴,因此不希望該管柱之壽命縮短。
又,於專利文獻1~4所揭示之方法中,係預先使分離所使用之原液通過微濾膜而除去粒子狀不溶物,然後實施分離操作。此是因為,所使用之蛋白質吸附膜之最大微孔徑較大,為3μm~5μm,因此該蛋白質吸附膜無法除去粒子狀不溶物。
於專利文獻5及6中所揭示之方法中,蛋白質吸附膜之最大微孔徑為0.8μm~1.0μm,亦無法除去微細之粒子狀不溶物。
進而,細胞培養液中通常含有鹽,如非專利文獻1中之記載所示而使用離子交換膜時,自含有0.1M以上之鹽之溶液所吸附之蛋白質之量顯著減少,因此於實用上無法自細胞培養液中除去雜質蛋白質。
如上所述,現有之蛋白質吸附膜之最大微孔徑約為0.8μm以上,而且於鹽之存在下之吸附量較低,因此估計無法同時進行以自細胞培養液中除去細胞碎片等微細之不溶物為目的之除濁、以及溶存之雜質蛋白質之吸附,故不適用於該目的。
又,即便於溶液中不存在鹽之條件下,任一蛋白質吸附膜之動態吸附容量均為相對於膜之單位體積為30mg/mL以下,因此為了有效地吸附除去來自細胞培養液之雜質蛋白質,必須使用大量之蛋白質吸附膜。進而,由於該等現有之蛋白質吸附膜為平板膜形態,故而無法將大量之蛋白質吸附膜收納於小型容器內。因此,必須將大量之蛋白質吸附膜收納於大型容器內,故無法稱其實用。而且,若溶液中存在鹽,則現有之具有陰離子交換基之蛋白質吸附膜之吸附量顯著減少,因此更不實用。
鑒於上述狀況,本發明所欲解決之課題為提供一種可自以動物細胞培養液為代表的含有目標蛋白質與雜質之混合液中,簡便地除去雜質且高效率地純化目標蛋白質之方法。
本發明者等人為了解決上述課題而努力研究,結果驚異地發現藉由使用微孔表面具有接枝鏈,而且該接枝鏈上固定有陰離子交換基之多孔膜,可有效地達成上述目的。
即,本發明提供以下之蛋白質之純化方法及中空纖維多孔膜。
[1]一種蛋白質之純化方法,其用以自含有目標之蛋白質與雜質之混合液中除去上述雜質,並且,其包含使用微孔表面具有接枝鏈,而且上述接枝鏈上固定有陰離子交換基之多孔膜進行過濾之步驟。
[2]如上述[1]中所記載之蛋白質之純化方法,其中上述目標之蛋白質為選自由單株抗體、多株抗體、人類化抗體、人類抗體及免疫球蛋白所組成之群中之一種。
[3]如上述[1]或[2]中所記載之蛋白質之純化方法,其中上述雜質為選自由非懸濁物質成分及分散於上述混合液中之懸濁物質成分所組成之群中之至少一種。
[4]如上述[3]中所記載之蛋白質之純化方法,其中上述非懸濁物質成分為選自由溶存於上述混合液中之雜質蛋白質、HCP(Host Cell Protein,宿主細胞蛋白質)、DNA(deoxyribonucleic acid,去氧核糖核酸)、病毒、內毒素、蛋白酶及細菌所組成之群中之至少一種。
[5]如上述[3]或[4]中所記載之蛋白質之純化方法,其中分散於上述混合液中之懸濁物質成分為選自由細胞及細胞碎片所組成之群中之至少一種。
[6]如上述[1]至[5]中任一項所記載之蛋白質之純化方法,其中上述混合液之鹽濃度為0.01M以上、0.5M以下。
[7]如上述[1]至[5]中任一項所記載之蛋白質之純化方法,其中上述混合液之鹽濃度為0.1M以上、0.3M以下。
[8]如上述[1]至[7]中任一項所記載之蛋白質之純化方法,其中上述多孔膜之基材為聚乙烯或聚偏二氟乙烯,上述接枝鏈係甲基丙烯酸縮水甘油酯之聚合物,接枝率為10%以上、250%以下,並且上述接枝鏈所具有之環氧基之70%以上被上述陰離子交換基取代。
[9]如上述[8]中所記載之蛋白質之純化方法,其中上述接枝率為10%以上、150%以下。
[10]如上述[8]中所記載之蛋白質之純化方法,其中上述接枝率為10%以上、90%以下。
[11]如上述[8]中所記載之蛋白質之純化方法,其中上述接枝率為30%以上、60%以下。
[12]如上述[1]至[11]中任一項所記載之蛋白質之純化方法,其中上述陰離子交換基為二乙胺基及/或三甲胺基。
[13]如上述[1]至[12]中任一項所記載之蛋白質之純化方法,其中上述陰離子交換基為二乙胺基。
[14]如上述[1]至[13]中任一項所記載之蛋白質之純化方法,其中上述多孔膜之最大微孔徑為0.1μm以上、0.8μm以下。
[15]如上述[1]至[14]中任一項所記載之蛋白質之純化方法,其使用上述多孔膜對上述混合液進行過濾,藉此除去包括非懸濁物質成分之一種以上之雜質。
[16]如上述[1]至[15]中任一項所記載之蛋白質之純化方法,其中上述混合液為動物細胞培養液。
[17]如上述[1]至[16]中任一項所記載之蛋白質之純化方法,其中上述多孔膜為中空纖維多孔膜。
[18]一種中空纖維多孔膜,其用於如上述[17]中所記載之蛋白質之純化方法中。
[19]一種模組,其具備如上述[18]中所記載之中空纖維多孔膜。
[20]一種中空纖維多孔膜,其微孔表面具有接枝鏈,而且上述接枝鏈上固定有陰離子交換基,上述中空纖維多孔膜之基材為聚乙烯或聚偏二氟乙烯,上述接枝鏈係甲基丙烯酸縮水甘油酯之聚合物,接枝率為10%以上、250%以下,且上述接枝鏈所具有之環氧基之70%以上被上述陰離子交換基取代。
[21]如上述[20]中所記載之中空纖維多孔膜,其中上述接枝率為10%以上、150%以下。
[22]如上述[20]中所記載之中空纖維多孔膜,其中上述接枝率為10%以上、90%以下。
[23]如上述[20]中所記載之中空纖維多孔膜,其中上述接枝率為30%以上、60%以下。
[24]如上述[20]至[23]中任一項所記載之中空纖維多孔膜,其中上述多孔膜之最大微孔徑為0.1μm以上、0.8μm以下。
[25]一種模組,其具備如上述[20]至[24]中任一項所記載之中空纖維多孔膜。
[26]如上述[1]~[17]中任一項所記載之蛋白質之純化方法,其進一步包含利用親和層析法進行純化之步驟。
利用本發明之蛋白質之純化方法,可藉由使用具有接枝鏈,且該接枝鏈上固定有陰離子交換基之多孔膜進行過濾,而簡便地實現先前藉由離心分離、微濾、滅菌過濾3步驟來進行的親和層析步驟之前的使細胞培養液變得澄清的處理。
又,亦可利用固定有陰離子交換基之多孔膜進行過濾而除去先前之方法所無法除去的溶存之雜質蛋白質。進而,可大幅減小親和層析步驟之負擔。
以下,就實施本發明之最佳之形態(以下稱為"本實施形態"。)加以詳細說明。再者,本發明並不限定於以下之本實施形態,可在其主旨之範圍內進行各種變形。
本實施形態之蛋白質之純化方法係自含有適用於藥物之目標蛋白質及雜質,以動物細胞培養液為代表之混合液中除去雜質者,其包含使用微孔表面具有接枝鏈,而且該接枝鏈上固定有陰離子交換基之多孔膜進行過濾之步驟。
本實施形態之蛋白質之純化方法可簡便地除去混合液中所含之雜質,獲得澄清之目標蛋白質之溶液。
本實施形態之蛋白質之純化方法較好的是,進一步包含利用親和層析法,對過濾步驟所獲得的澄清之目標蛋白質之溶液進行純化的步驟。
作為含有目標之蛋白質與雜質之混合液,並無特別限定,可列舉動物細胞培養液。
作為動物細胞培養液,只要為含有目標蛋白質之培養液則並無特別限定,可列舉包含於含有中國倉鼠卵巢(CHO)細胞之宿主細胞中進行細胞培養所獲得之重組蛋白質的培養液。
作為目標蛋白質,可列舉用作藥物之抗體,如可列舉單株抗體、多株抗體、人類化抗體、人類抗體及免疫球蛋白。
作為雜質,可列舉分散於混合液中之懸濁物質成分及非懸濁物質成分等。
作為懸濁物質成分及非懸濁物質成分,可列舉為了製造目標之蛋白質而進行動物細胞培養所獲得之培養液中,除所含之目標蛋白質以外之雜質。
作為分散於混合液中之懸濁物質成分,可列舉細胞及細胞碎片等,作為非懸濁物質成分,可列舉溶存於混合液中之雜質蛋白質、宿主細胞蛋白質(Host Cell Protein:HCP)、核酸(DNA,去氧核糖核酸)、病毒、內毒素、蛋白酶及細菌等。
本實施形態之蛋白質之純化方法較好的是,使用多孔膜對混合液進行過濾,藉此除去包括非懸濁物質成分之一種以上之雜質。
非懸濁物質成分可藉由使其吸附於多孔膜上而除去。較好的是於除去包括非懸濁物質成分之一種以上之雜質時,亦將懸濁物質成分除去。
作為目標蛋白質之抗體之等電點(pI)之範圍大致處於6~8之間。普通之CHO動物細胞培養液之pH值大概處於7~8之範圍,該培養液含有約1質量%(約0.17M)之鹽。根據動物細胞培養液之種類不同,上述pH值及鹽濃度可能有變動。
於水溶液中,蛋白質之胺基及羧基係以離子化之狀態而存在,蛋白質之胺基為-NH3 +
,羧基為-COO-
,水溶液中之蛋白質之總電荷依存於培養液之pH值。若為等電點(pI)之pH值,則蛋白質之總電荷為零。另外,若為pI以上之pH值,則蛋白質為帶負電之狀態,若為pI以下之pH值,則為帶正電之狀態。
由於動物細胞培養液之pH值為7~8,因此目標蛋白質之總電荷幾乎為零或帶少量正電之狀態,且由於目標蛋白質存在於該培養液中,故目標蛋白質實際上不會被陰離子交換基吸附。
相對於此,由於溶存於混合液中之雜質蛋白質、宿主細胞蛋白質(HCP)、核酸(DNA)及內毒素等之pI值大部分為6以下,因此即便溶解於動物細胞培養液中,亦以帶負電之狀態而存在於該培養液中。於不存在鹽之條件下,上述溶存於混合液中之雜質蛋白質等具有被陰離子交換基吸附之性質。
然而,實際上動物細胞培養液通常含有約1質量%(0.17M)左右之鹽,因此即便pI值為6以下,雜質蛋白質等亦幾乎不會被陰離子交換基吸附。即,即便使用普通之具有陰離子交換基之吸附膜或陰離子交換層析法,亦無法自動物細胞培養液中直接除去雜質。
藉由使用本實施形態之蛋白質之純化方法,即便鹽濃度為0.01M以上、0.5M以下之動物細胞培養液亦可進行純化。
於本實施形態中,可較好地進行純化之動物細胞溶液之鹽濃度為0.1M以上、0.3M以下。
於本實施形態中,使用微孔表面具有接枝鏈,而且該接枝鏈上固定有陰離子交換基之多孔膜對動物細胞培養液進行過濾時,驚異地發現儘管細胞培養液中含有鹽,溶存於混合液中之雜質蛋白質、宿主細胞蛋白質(HCP)、核酸(DNA)及內毒素等亦可被該多孔膜之陰離子交換基吸附。
若於過濾步驟中使用微孔表面具有接枝鏈,而且該接枝鏈上固定有陰離子交換基之多孔膜,則通常無法實現之對溶存於來自動物細胞培養液之混合液中之雜質蛋白質、宿主細胞蛋白質、核酸及內毒素等之吸附成為可能。其詳細原因尚不明確,但做如下之推測。
於普通之陰離子交換膜及陰離子交換層析儀中,陰離子交換基通常固定於多孔質膜微孔或者樹脂及其微孔之表面。蛋白質由表面之陰離子交換基吸附。陰離子交換基僅固定於多孔膜之微孔或者樹脂及其微孔之表面,呈平面地存在。因此,蛋白質以點接觸之方式吸附於多孔膜之微孔或者樹脂及其微孔之表面,故可參與吸附之陰離子交換基之數量較少。故而,若溶液中存在鹽,則蛋白質之吸附性顯著減小。
上述為關於陰離子交換膜之一般概念,基於該原理,在將所吸附之蛋白質溶出時使用鹽溶液係通常所採用之方法。
即,一般認為於溶液中存在鹽之情形時,陰離子交換膜不會吸附蛋白質,該觀點同樣適用於具有接枝鏈之陰離子交換膜。
本實施形態中所使用之多孔膜中,陰離子交換基固定於位於微孔表面之接枝鏈上。
本發明者等人發現以下事實,藉由使用陰離子交換基固定於接枝鏈上之陰離子交換膜即本實施形態之多孔膜,即便含有鹽之溶液,蛋白質之吸附性亦不會顯著減小。
於陰離子交換基僅存在於微孔或樹脂之表面之普通多孔膜中,蛋白質之吸附為平面吸附,相對於此,藉由使陰離子交換基固定於接枝鏈上,陰離子交換基呈三維立體配置。一般認為,藉由使陰離子交換基固定於接枝鏈上,接枝鏈以纏繞蛋白質之方式吸附蛋白質,因此參與吸附之陰離子交換基之數量較多。業者推測,由於可參與吸附之陰離子交換基之數量較多,故即便溶液中存在鹽,蛋白質之吸附性之減小幅度亦較小,且亦可實現自實際使用之細胞培養液中藉由吸附除去溶存之雜質。
本實施形態中所使用之具有陰離子交換基之多孔膜,係指由多孔質體所形成之多孔膜,上述作為基材之多孔質體及其微孔之表面固定有接枝鏈,而且陰離子交換基以化學或物理方式固定於該接枝鏈上。
對多孔膜之基材並無特別限定,為了保持機械性質,較好的是由聚烯烴系聚合物所構成。
作為聚烯烴系聚合物,例如可列舉乙烯、丙烯、丁烯及偏二氟乙烯等烯烴之均聚物,兩種以上之該烯烴之共聚物,或者一種或兩種以上之烯烴與全鹵化烯烴之共聚物等。
作為全鹵化烯烴,可列舉四氟乙烯及/或三氟氯乙烯等。
該等基材之中,就機械強度特別優異,而且可獲得較高吸附容量之材料而言,較好的是聚乙烯或聚偏二氟乙烯,更好的是聚乙烯。
作為將接枝鏈導入至多孔膜之表面及微孔中,進而將陰離子交換基固定於該接枝鏈上之方法,並無特別限定,例如可列舉日本專利特開平2-132132號公報中所揭示之方法。
於本實施形態中,所謂接枝率係指,固定陰離子交換基之前的基材中所導入之接枝鏈之重量與基材之重量的比(百分率)。
接枝率較好的是10%以上、250%以下,更好的是10%以上、150%以下,進而更好的是10%以上、90%以下,進而更好的是30%以上、60%以下。
藉由使接枝率為10%以上,可顯著增大蛋白質之吸附容量,具有實用性。
藉由使接枝率為250%以下,可獲得具有實用性之強度。
通常,在將所吸附之蛋白質溶出時係使鹽溶液於多孔膜中通液,但多孔膜具有膜體積會藉此而膨脹之特性,且接枝率越高膨脹率越高。由於鹽溶液通液而引起之膜體積膨脹率亦根據多孔膜及接枝鏈之結構而有所不同,但若接枝率為60%則膨脹率約為2%以下,若接枝率為90%則膨脹率約為3%以下,若接枝率為150%則膨脹率約為5%以下。接枝率只要為250%以下,則可使膨脹率為10%以下,因此接枝率為250%以下之多孔膜於實用上較佳。
於本實施形態中,所謂導入至基材中之接枝鏈,係指具有即便於導入反應後使用二甲基甲醯胺(DMF)等有機溶劑進行清洗,亦不會被除去之化學結構之鏈。
作為接枝鏈,例如可列舉甲基丙烯酸縮水甘油酯、乙酸乙烯酯及乙酸羥基丙酯之聚合物,就易於導入陰離子交換基方面而言,較好的是甲基丙烯酸縮水甘油酯或乙酸乙烯酯之聚合物,更好的是甲基丙烯酸縮水甘油酯之聚合物。
作為陰離子交換基,只要為可將溶存於混合液中之雜質蛋白質、DNA、HCP、病毒及內毒素等吸附之陰離子交換基,則並無特別限定,可列舉二乙胺基(DEA、Et2
N-)、四級銨基(Q、R3
N+
-)、四級胺乙基(QAE、R3
N+
-(CH2
)2
-)、二乙胺乙基(DEAE、Et2
N-(CH2
)2
-)、二乙胺丙基(DEAP、Et2
N-(CH2
)3
-)等。對R並無特別限定,與相同N鍵結之R可相同亦可不同,較好的是表示烷基、苯基、芳烷基等烴基。
作為四級銨基,例如可列舉三甲胺基(導入於接枝鏈之三甲銨基,Me3
N+
-)等。
就能夠容易地以化學方式固定在導入於多孔膜之接枝鏈上,且可獲得較高吸附容量而言,較好的是DEA及Q,更好的是DEA。
可藉由使構成接枝鏈之甲基丙烯酸縮水甘油酯聚合物所具有之環氧基開環,並於其上加成二乙胺等胺以及二乙銨或三甲銨等銨鹽,而將陰離子交換基固定於接枝鏈上。
以莫耳比率計,較好的是接枝鏈之環氧基中之70%以上,較好的是75%以上,更好的是80%以上被陰離子交換基取代。藉由使被陰離子交換基取代之環氧基量在上述範圍內,可製成動態吸附容量優異之多孔膜。
為了截留懸濁物質成分及細菌,且獲得較高之透過流速,多孔膜之最大微孔徑較好的是0.1μm以上、0.8μm以下,更好的是0.1μm以上、0.6μm以下,進而更好的是0..2μm以上、0.5μm以下。
於本實施形態中,所謂多孔膜之最大微孔徑係指,如實施例中所示由泡點法所測定之值。
為了有效地減小利用親和層析法之純化步驟中的親和層析管柱之負擔,具有陰離子交換基之多孔膜自不含鹽之溶液吸附蛋白質之動態吸附容量較好的是30mg/mL以上,更好的是50mg/mL以上,進而更好的是70mg/mL以上。
緩衝液含有0.1mol/L之鹽時之動態吸附容量較好的是10mg/mL以上,更好的是20mg/mL以上,進而更好的是30mg/mL以上。
吸附於離子交換膜上之雜質之量與離子交換膜之體積成正比。因此,離子交換膜之動態吸附容量越大,越可縮小用於純化蛋白質之模組之尺寸。
於本實施形態中,所謂動態吸附容量係指,至失效為止單位體積之多孔膜所吸附之蛋白質之質量(單位[mg/mL])。可使用牛血清白蛋白(BSA,bovine serum albumin)作為評價吸附量之模型蛋白質,將BSA溶解於20mM之Tris-HCl(pH值為8.0)之緩衝液中,藉由以下之實施例中所記載之方法來評價動態吸附容量。
只要為多孔質體,則對多孔膜之形態並無特別限定,可列舉平板膜、不織布、中空纖維膜、獨塊體、毛細管、圓板或圓筒狀等。
就製造之容易性、規模放大性、模組成型時之膜之封裝性等方面而言,較好的是中空纖維膜。
於本實施形態中,於利用親和層析法之後處理步驟之前的收集步驟中,使用具有陰離子交換基之中空纖維多孔膜,對含有目標蛋白質之動物細胞培養液進行過濾,藉此可獲得澄清之含有目標蛋白質之溶液。藉由使用具有陰離子交換基之中空纖維多孔膜,不僅可除去以懸濁物質成分之形態而存在之細胞及細胞碎片等,亦可除去以非懸濁物質成分之形態並以溶解狀態而存在於培養液中之雜質蛋白質、HCP、DNA、病毒等,而且亦可除去細菌,從而獲得除去了雜質且經滅菌之澄清之含有目標蛋白質的溶液。
為了由細胞培養液獲得澄清之目標蛋白質之溶液,較好的是將具有陰離子交換基之中空纖維多孔膜內置於模組內。
中空纖維多孔膜模組係內置有由多孔質中空纖維所構成之中空纖維多孔膜之模組,於該多孔質中空纖維之表面及微孔之表面以化學或物理方式固定有陰離子交換基。藉由使動物細胞培養液透過該中空纖維多孔膜模組,可自該培養液中除去以懸濁物質成分之形態而存在之細胞及細胞碎片等,以及以非懸濁物質成分之形態存在之溶存之雜質蛋白質、HCP、DNA及細菌等。由於以懸濁物質成分之形態而存在於該培養液中之細胞及細胞碎片等之尺寸較大,因此無法通過多孔質中空纖維之微孔,故可藉由篩分過濾而除去。另外,溶解後存在於該培養液中之雜質蛋白質等,可由固定於多孔質中空纖維之表面及微孔之表面的陰離子交換基吸附除去。
於本實施形態中,為了除去動物細胞培養液中之懸濁物質成分及非懸濁物質成分等雜質,較好的是採用橫流過濾方法,使加壓之培養液於多孔質中空纖維之內側通液後,流動透過多孔質中空纖維到達其外側。
藉由以橫流之方式使培養液於多孔質中空纖維之內側通液,可抑制於使濾液透過多孔質中空纖維而到達其外側時懸濁物質在內側表面堆積,且可抑制透過流速大幅度降低。
於橫流過濾中,液體於多孔質中空纖維內流動時之線速度較好的是0.05m/s~5.0m/s,更好的是0.1m/s~2.0m/s。
於本實施形態中,所謂線速度係指液體通過多孔質中空纖維之內剖面之速度,以(每秒鐘於多孔質中空纖維內流動之液體之體積)/(多孔質中空纖維之內部剖面積)來表示。
濾液自多孔質中空纖維內側向外側之透過壓力較好的是0.01MPa~0.5MPa,更好的是0.05MPa~0.2MPa。
於本實施形態中,為了於較短時間內由動物細胞培養液獲得澄清之目標蛋白質之溶液,作為較佳之方法亦可列舉:對動物細胞培養液僅進行除濁處理後,使用具有陰離子交換基之中空纖維多孔膜進行過濾。藉由在利用具有陰離子交換基之中空纖維多孔膜進行過濾之前,預先對動物細胞培養液僅進行除濁處理,於過濾步驟中可獲得較大之透過流速,而且可利用擠壓式過濾來進行中空纖維多孔膜之過濾步驟。
由於具有陰離子交換基之中空纖維多孔膜所進行之過濾僅可除去殘存之細胞碎片以及溶存之雜質蛋白質、HCP、DNA、細菌等非懸濁物質成分,因此較好的是預先進行除濁處理。
動物細胞培養液之除濁處理,可列舉利用離心分離之方法、使用矽藻土過濾膜等深度過濾器進行擠壓式過濾之方法、或使用微濾膜進行橫流過濾之方法等,但並不限定於該等。
就可將經除濁處理之處理液直接送至具有陰離子交換基之中空纖維多孔膜上進行過濾而言,較好的是使用微濾膜之橫流過濾,更好的是使用微濾中空纖維膜模組之橫流過濾。
用於除濁處理之微濾中空纖維膜模組之多孔質中空纖維之最大微孔徑較好的是0.1μm~0.8μm,更好的是0.2μm~0.6μm。
若最大微孔徑較小,則無法獲得充分之透過流速,若最大微孔徑較大,則於下一階段實施本實施形態之由具有陰離子交換基之多孔質中空纖維所構成的中空纖維膜模組進行的擠壓式過濾時,容易產生堵塞,導致透過壓力增大。
使用微濾中空纖維膜模組,以橫流過濾方式來進行除濁處理時,動物細胞培養液於多孔質中空纖維內表面流動時之線速度較好的是0.05m/s~5.0m/s,更好的是0.1m/s~2.0m/s。
濾液自多孔質中空纖維內側向外側之透過壓力較好的是0.01MPa~0.5MPa,更好的是0.05MPa~0.2MPa。
本實施形態之蛋白質之純化方法,較好的是進一步包含利用親和層析法進行純化之步驟。
利用親和層析法之純化,可藉由先前公知之方法進行,如可使用蛋白質A親和管柱來進行。
於該製程中,首先將使用具有陰離子交換基之多孔膜加以過濾後所獲得的含有目標蛋白質之澄清溶液,用於蛋白質A親和管柱中,使該管柱選擇性地吸附目標蛋白質。
澄清溶液中所含之溶存雜質蛋白質會流出而被除去,而不會由蛋白質A親和管柱所吸附。接著,用pH值與澄清溶液相同之緩衝液清洗管柱,除去殘存於管柱內之雜質,其後,使用酸性溶出液對所吸附之目標蛋白質進行溶出回收,藉此可進一步將大部分雜質蛋白質除去,從而獲得含有經純化之目標蛋白質之溶液。
即便所使用之含有目標蛋白質之溶液中溶存有雜質蛋白質,藉由使用蛋白質A親和管柱,亦可對目標蛋白質進行純化。
於藉由親和層析法進行純化之步驟中,若溶存之雜質蛋白質較多,則自管柱回收之液體中會存在凝聚之雜質,或者會因對管柱帶來負擔而導致管柱之壽命縮短。較好的是,於使用該管柱之前,預先使用具有陰離子交換基之中空纖維多孔膜儘可能多地除去溶存之雜質蛋白質,因此較好的是使用本實施形態中所使用之多孔膜進行過濾。
作為於本實施形態中所使用之親和層析管柱,可列舉具有蛋白質A、肝素、深藍A、紅色染料(Procion Red HE-3B)、藍色染料(Cibacron Blue 3GA)、離胺酸、精胺酸及苯甲脒等作為配位體之管柱,但抗體為目標蛋白質之情形時,多使用蛋白質A親和層析管柱。
將使用具有陰離子交換基之多孔膜加以過濾後所獲得之含有目標蛋白質的澄清溶液用於親和層析管柱而進行吸附之方法,可藉由對平衡化後之管柱使用泵或靜水壓,而將澄清之溶液供給至管柱等之方法來進行。
對吸附有目標蛋白質之親和層析管柱之清洗,只要使用pH值與含有目標蛋白質之澄清溶液相同之緩衝液,則並無特別限定,例如可列舉磷酸鈉(sodium-phosphate)緩衝液等緩衝液。
緩衝液清洗可藉由使體積為管柱體積之2~10倍左右之緩衝液於管柱中通液來進行。
自吸附有目標蛋白質之親和層析管柱回收目標蛋白質時,只要使用酸性溶液之緩衝液作為溶出緩衝液,則並無特別限定,例如可列舉pH值為3~4之檸檬酸鹽-氫氧化鈉(Citrate-NaOH)緩衝液等酸性溶液。
使用酸性溶液來回收目標蛋白質,可藉由使體積為管柱體積之2~10倍之溶出緩衝液於管柱中通液來進行。
藉由使用具有陰離子交換基之多孔膜對含有目標蛋白質之動物細胞培養液進行過濾,獲得澄清之含有目標蛋白質之溶液,然後利用親和層析法,對澄清之含有目標蛋白質之溶液進行純化後回收目標蛋白質,可抑制先前於親和層析法儀中使用酸性溶液回收蛋白質時所出現的生成凝聚雜質之問題。藉由使用本實施形態中所使用之多孔膜對含有目標之蛋白質之混合液進行過濾,可減小親和管柱所承受之負擔,並且可回收獲得高度純化之目標蛋白質。
以下,藉由實施例及比較例對本實施形態進行更具體之說明,但本實施形態並不僅限於該等實施例。再者,本實施形態中所使用之評價方法及測定方法如下。
為了測定多孔質中空纖維之最大微孔徑而使用泡點法。將長度為8cm之多孔質中空纖維之一末端堵塞,將另一末端經由壓力計與氮氣供給管連接。於連接狀態下供給氮氣,將管內部置換成氮氣之後,將多孔質中空纖維浸漬於乙醇中。此時,係於以極少量之氮氣施加壓力之狀態下浸漬多孔質中空纖維,以使乙醇不會逆流至管內。於多孔質中空纖維之浸漬狀態下,緩緩增大氮氣之壓力,記錄氮氣氣泡開始穩定地自多孔質中空纖維中排出時之壓力(p)。
設最大微孔徑為d,設乙醇與空氣之界面之表面張力為γ,藉由下述式(I)計算出多孔質中空纖維之最大微孔徑。
d=Cγ/p …(I)
其中,C為常數。由於浸漬液為乙醇,因此Cγ=0.632(kg/cm),將p(kg/cm2
)代入至上式中,藉此求得最大微孔徑d(μm)。
為了確認實施例1、2及6中所製作之迷你模組之滅菌性能而實施細菌挑戰試驗。
首先,按照橫流之要領,一邊使次氯酸鈉為100ppm之水溶液200mL於模組內通液,一邊使其透過模組而對模組進行殺菌,然後,同樣地一邊使500mL之超純水通液,一邊使其透過模組而清洗模組。使用缺陷假單胞菌(Pseudomonas dimunuta)作為孔徑為0.22μm之指標菌,同樣地按照橫流之要領,一邊使200mL之含有濃度為106
個/mL之指標菌的水溶液進行通液,一邊使其透過模組。計測透過液中所含之缺陷假單胞菌之量,結果為10個/100mL以下,該模組的0.22μm之指標菌之LRV(Log reduction value,對數減少值)為7以下,確認其幾乎可完全滅菌。
準備鹽濃度約為0.9質量%(0.15M)、蛋白質濃度約為1g/L、細胞密度為3.0×107
/mL的不含抗體蛋白質之CHO細胞無血清細胞培養液,於其中添加作為目標蛋白質之γ-球蛋白(SIGMA製造),使濃度達到1g/L,製作含有目標蛋白質且未除去懸濁物質之動物細胞培養液之模型液。
於該模型液中,γ-球蛋白為目標蛋白質,來自含有懸濁物質成分之細胞培養液之全部蛋白質均為雜質蛋白質。
利用SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳),對透過實施例1、2及6所製作之迷你模組的培養液中之蛋白質進行分析。將10μL之用於分析之透過液與等量之樣品處理液(第一化學藥品股份有限公司製造,Tris SDS樣品處理液或Tris SDS β-ME樣品處理液)混合,於100℃下進行5分鐘熱處理。使用微量吸管,將所獲得之樣品以每個孔10μL之方式滴加於電泳用凝膠培養盤(第一化學藥品股份有限公司製造,multi-gel II mini)中,且將該凝膠培養盤插入至充滿泳動用緩衝液(第一化學藥品股份有限公司製造,將SDS-Tris-Glycine泳動緩衝液稀釋10倍後使用)之電泳槽(和光純藥股份有限公司製造,Easy SeparatorTM
)中。於30mA之恆定電流下使其泳動1小時後,分離出透過液中之蛋白質。使用染色試劑(Funakoshi股份有限公司製造之Instant Blue、或者第一化學藥品股份有限公司製造之2D-銀染色試劑-II)對泳動後之凝膠培養盤進行染色,確認蛋白質之色帶。
將用於評價之液體置於Cygnus Technologies製造之CHO Host Cell Protein ELISA Kit之96孔培養盤中,使用GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES製造之Ultrospec Visible Plate Reader II96之培養盤判讀器對作為雜質之HCP進行定量。
使用invitrogen製造之Quant-iTTM
dsDNA HS Assay Kit對用於評價之液體進行處理後,使用QubitTM
螢光計對作為雜質之DNA進行定量。
將透過實施例1、2及6所製作之迷你模組後所獲得的澄清之培養液作為樣品液,對利用蛋白質A親和管柱自該樣品液吸附回收目標蛋白質進行評價。將蛋白質A親和管柱(GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES製造,HiTrap Protein A HP 1mL)與市售之層析系統(GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES製造,AKTA explorer 100)連接,並進行通液。在使管柱平衡且應用樣品之後進行清洗時所使用的緩衝液為20mM之磷酸鈉(pH值為7.0),被吸附之目標蛋白質之溶出緩衝液係使用0.1M之檸檬酸-氫氧化鈉(pH值為3.0)。於吸附評價中,將以下五階段之步驟作為一次循環而實施操作,並對目標蛋白質之吸附量進行評價:1)為了使管柱平衡而使10mL之緩衝液於管柱中通液;2)使含有目標蛋白質之澄清液於管柱中通液,從而使管柱吸附目標蛋白質;3)使10mL之緩衝液於管柱中通液,以清洗掉管柱內之雜質蛋白質;4)使10mL之溶出緩衝液進行通液,以將被吸附之目標蛋白質溶出回收;5)使10mL之緩衝液進行通液,再次清洗管柱。此時,於全部步驟中係以1.0mL/min之流速而進行通液。連續地進行該循環,以對目標蛋白質之吸附回收進行反覆評價。又,吸附量係將回收液稀釋10倍後,測定280nm之紫外線吸光度,利用由已知濃度下之紫外線吸光度測定所獲得之校準曲線來求得。
捆綁11根外徑為2.0mm,內徑為1.4mm,最大微孔徑為0.4μm之聚磺酸微濾中空纖維,使用環氧系灌封劑,以不堵塞該中空纖維之中空部之方式將中空纖維之兩末端固定於聚碳酸酯製之模組盒中,製作用於除去懸濁物質之迷你模組。所獲得之迷你模組之內徑為0.9cm,長度約為8cm,模組內之該中空纖維內面之有效膜面積為39cm2
。
使用於20mmol/L之Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝液中以1g/L之濃度溶解BSA所形成之BSA溶液,使BSA溶液透過評價模組,直至模組開始失效為止。此處,由BSA溶液之濃度Q、至評價模組失效時為止所透過之BSA溶液之體積VB
、及評價模組內之實施例之離子交換膜VM
之體積,根據下述式(II)計算出動態吸附容量A。
A=Q×VB
/VM
...(II)
所謂離子交換膜之體積,係指除去中空部分之體積。又,所謂失效,係指透過液中之BSA濃度超過所供給之BSA溶液之濃度10%即0.1g/L之時刻。又,溶液係自評價模組內之中空狀離子交換膜之內側向外側通液。藉由該方法所測定的實施例1、2及6中所製作之陰離子交換膜之動態吸附容量,分別為70mg/mL、35mg/mL及75mg/mL。
將外徑為3.0mm,內徑為2.0mm,以上述(1)中所記載之泡點法所測定之最大微孔徑為0.3μm的聚乙烯多孔質中空纖維放入至密閉容器內,並用氮氣置換容器內之空氣。其後,自容器之外側一邊用乾冰進行冷卻,一邊照射200kGy之γ射線,使上述中空纖維產生自由基。將所獲得之具有自由基之聚乙烯多孔質中空纖維放入至玻璃反應管內,減壓至200Pa以下,藉此除去反應管內之氧氣。於該玻璃反應管內,將調節至40℃之由3體積份之甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、97體積份之甲醇所構成之反應液注入至20質量份之中空纖維中後,於密閉狀態下靜置12分鐘,實施接枝聚合反應,從而對多孔質中空纖維導入接枝鏈。
混合溶液係預先用氮氣使之起泡,將混合溶液內之氧氣以氮氣置換。
接枝聚合反應後,倒掉反應管內之反應液。繼而,於反應管內加入二甲亞碸來清洗中空纖維,藉此將殘存之甲基丙烯酸縮水甘油酯、其寡聚物及未固定於中空纖維多孔膜上之接枝鏈除去。
倒掉清洗液後,再加入二甲亞碸清洗兩次。使用甲醇以相同之方式清洗三次。對清洗後之中空纖維進行乾燥,測定其重量,結果中空纖維多孔膜之重量為導入接枝鏈前之138%,定義為接枝鏈之重量相對於基材重量之比的接枝率為38%。
上述接枝率為38%,相當於藉由下述式(III)所計算出的所導入之GMA(分子量為142)的莫耳數相對於聚乙烯基材之骨架單位即CH2
基(分子量為14)之莫耳數為3.75%。
所導入之GMA之莫耳數%=(接枝率/142)/(100/14)×100...(III)
藉由固體NMR法(nuclear magnetic resonance,核磁共振法),測定接枝反應後中空纖維多孔膜中之聚乙烯骨架單位CH2
基之莫耳數、與構成接枝鏈之GMA所特有之酯基(COO基)之莫耳數的比。
使用Bruker Biospin公司製造之DSX400,將核種設為13
C,利用高功率去偶法(HPDEC法,High Power Decoupling法)之定量模式,以等待時間為100s、累計次數為1000次之條件,於室溫下對0.5g之將接枝反應後之中空纖維冷凍粉碎所獲得之粉末樣品進行測定。
由於所獲得的NMR光譜中酯基所對應之峰面積與CH2
基所對應之峰面積的比,與GMA與CH2
基之莫耳數的比相對應,因此根據測定結果來計算所導入之GMA的莫耳數與CH2基之莫耳數的比,結果為3.8%。此相當於38.5%之接枝率,表明可藉由利用固體NMR法測定接枝反應後之樣品,而得出接枝率。
將乾燥之導入有接枝鏈之中空纖維於甲醇中浸漬10分以上而使其膨潤,然後將其浸漬於純水中以水置換。於玻璃反應管中,將由50體積份之二乙胺、50體積份之純水的混合溶液所構成之反應液加入20質量份之接枝反應後之中空纖維中,調節為30℃。於其中插入導入有接枝鏈之多孔質中空纖維,靜置210分鐘,將接枝鏈之環氧基取代成二乙胺基,藉此獲得具有二乙胺基作為陰離子交換基之中空纖維多孔膜。
所獲得之中空纖維多孔膜之外徑為3.3mm,內徑為2.1mm,於中空纖維多孔膜中,接枝鏈所具有之環氧基之80%被二乙胺基取代。
取代率T作為環氧基之莫耳數N2
之中被二乙胺基所取代之莫耳數N1
,由下述式(IV)計算出。
T=100×N1
/N2
=100×((w2
-w1
)/M1
}/{w1
(dg/(dg+100))/M2
}...(IV)
M1
為二乙銨之分子量(73.14),w1
為接枝聚合反應後之多孔質中空纖維膜之重量,w2
為二乙胺基取代反應後之多孔質中空纖維膜之重量,dg為接枝率,M2
為GMA之分子量(142)。
以與上述方法相同之方式,利用固體NMR法測定導入有二乙胺基之中空纖維多孔膜之中,聚乙烯骨架單位CH2
基之莫耳數與GMA所特有之酯基之莫耳數與之比,獲得3.75%之結果。該結果與38%之接枝率相對應,由該結果可確認,接枝率並未因導入二乙胺基而產生變化。
捆綁3根具有二乙胺基作為陰離子交換基之多孔質中空纖維,使用環氧系灌封劑,以不堵塞多孔質中空纖維之中空部之方式將其兩末端固定於聚磺酸製之模組盒中,製作陰離子交換膜之中空纖維模組。
所獲得之模組之內徑為0.9cm,長度約為3.3cm,模組之內部容積約為2mL,多孔質中空纖維在模組內所占之有效體積為0.85mL,除去中空部分之中空纖維多孔膜單獨之體積為0.54mL。
與實施例1相同,將乾燥之導入有接枝鏈之中空纖維於甲醇中浸漬10分以上使其膨潤,然後將其浸漬於純水中以水進行置換。準備由50體積份之純水與50體積份之二甲亞碸所構成之混合溶液,於該溶液中以使濃度達到0.5M之方式添加三甲基氯化銨,並混合而獲得均一之反應液。於玻璃反應管中,將該反應液加入於20質量份之接枝反應後之中空纖維中,調節至60℃。其後,於其中插入導入有接枝鏈之多孔質中空纖維,並靜置200分鐘,藉此將接枝鏈之環氧基取代成三甲胺基,從而獲得具有三甲胺基作為陰離子交換基之中空纖維多孔膜。
所獲得之中空纖維多孔膜之外徑為3.2mm,內徑為2.1mm,於中空纖維多孔膜中,接枝鏈所具有之環氧基之80%被三甲胺基取代。與二乙胺基相同地,將三甲基氯化銨之分子量95.57代入於上述式(IV)之M1
中,計算出取代率。
以與實施例1相同之方式,製成具有三甲胺基作為陰離子交換基之多孔質中空纖維膜模組,獲得多孔質中空纖維之有效體積為0.75mL,除去中空部分之中空纖維多孔膜單獨之體積為0.46mL的模組。
於20mM之Tris-HCl(pH值為8.0)中,以使濃度達到0.17M之方式添加NaCl,製成含有金屬鹽之緩衝液。於該緩衝液中,以1g/L之濃度分別溶解BSA(pI為5.6)及γ-球蛋白(pI為6~7),製成蛋白質混合溶液。使該蛋白質混合溶液,以2mL/min之流速於實施例1中所製作之具有二乙胺基之陰離子交換膜模組中通液,以5mL之餾份為單位收取透過液。使用SDS-PAGE對透過模組之餾份中之蛋白質加以分析。將10μL之用於分析之透過液與等量之樣品處理液(第一化學藥品股份有限公司製造,Tris SDS樣品處理液)混合,於100℃下進行5分鐘熱處理。使用微量吸管將所獲得之樣品以每孔10μL之方式滴加於電泳用凝膠培養盤(第一化學藥品股份有限公司製造,multi-gel II mini)中,且將該凝膠培養盤插入至充滿泳動用緩衝液(第一化學藥品股份有限公司製造,將SDS-Tris-Glycine泳動緩衝液稀釋10倍後使用)之電泳槽(和光純藥股份有限公司製造,Easy SeparatorTM
)中,於30mA之恆定電流下使其泳動1小時,藉此分離出透過液中之蛋白質。使用染色試劑(Funakoshi股份有限公司製造,Instant Blue)對泳動後之凝膠培養盤進行染色。
將所得之結果示於圖1。區帶1為BSA,區帶2僅為γ-球蛋白,區帶3為BSA與γ-球蛋白之混合液,區帶5至12為透過液之餾份,區帶13為吸附物之溶出液。於20mL為止之透過液(區帶5至8)中幾乎僅存在γ-球蛋白,BSA全部被吸附。而且,吸附後由將1M之NaCl溶解於緩衝液中所形成之鹽溶液溶出。於溶出液中(區帶13)中僅存在BSA,模組僅選擇性地吸附BSA,而不吸附γ-球蛋白。由圖1所示之結果可知,本實施形態之方法可有效地自含有鹽之溶液中分離出目標蛋白質。
使用微濾中空纖維膜模組,對含有0.5g/L之作為目標蛋白質之γ-球蛋白的CHO無血清細胞培養液進行端點過濾,獲得除去懸濁物質之上清液。使54mL(相當於中空纖維膜體積之100倍)之該上清液,以2mL/min之流速於實施例1中所製作之具有二乙胺基之陰離子交換膜模組中通液,收取全部透過液。使用SDS-PAGE對透過模組之餾份中之蛋白質加以評價。將10μL之用於分析之透過液與等量之樣品處理液(第一化學藥品股份有限公司製造,Tris SDS β-ME樣品處理液)混合,於100℃下進行5分鐘還原熱處理。使用微量吸管,將所獲得之樣品以每孔10μL之方式滴加於電泳用凝膠培養盤(第一化學藥品股份有限公司製造,multi-gel II mini)中,且將該凝膠培養盤插入至充滿泳動用緩衝液(第一化學藥品股份有限公司製造,將SDS-Tris-Glycine泳動緩衝液稀釋10倍後使用)之電泳槽(和光純藥股份有限公司製造,Easy SeparatorTM
)中。於30mA之恆定電流下使其泳動1小時,藉此分離出透過液中之蛋白質。
使用染色試劑(第一化學藥品股份有限公司製造,2D-銀染色試劑-II)對泳動後之凝膠培養盤進行染色。
所得之結果示於圖2。區帶2僅為γ-球蛋白,區帶3僅為CHO無血清細胞培養上清液,區帶4及區帶9為含有γ-球蛋白之CHO無血清細胞培養上清液,區帶10為該評價中之透過液。以上結果表明,藉由使含有鹽之細胞培養液透過陰離子交換膜模組,可將其中之大部分雜質除去,獲得經純化之目標蛋白質。另外,於透過陰離子交換膜模組前之細胞培養上清液中,具有代表性之雜質HCP及DNA之濃度分別為346μg/mL及7200ng/mL,於透過液中則大幅降低,分別為39μg/mL及52ng/mL,由此可知陰離子交換膜模組對於該等以溶存之方式存在之雜質蛋白質之除去性優異。
以與實施例4相同之方式,使46mL(相當於膜體積之100倍)之含有0.5g/L之作為目標蛋白質之γ-球蛋白的相同之CHO無血清細胞培養的上清液,於實施例2中所製作之具有三甲胺基之陰離子交換膜模組中通液,從而除去雜質。以與實施例4相同之方式利用SDS-PAGE進行評價。將結果與實施例4同樣地示於圖2。區帶12為該評價中之透過液。該結果表明,藉由使含有鹽之細胞培養液透過陰離子交換膜模組,可將其中之大部分雜質除去,獲得經純化之目標蛋白質。另外,於透過陰離子交換膜模組前之細胞培養上清液中,具有代表性之雜質HCP及DNA的濃度分別為346μg/mL及7200ng/mL,於透過液中則大幅降低,分別為73.8μg/mL及32.8ng/mL,由此可知陰離子交換膜模組對於該等以溶存之方式存在之雜質蛋白質之除去性優異。
除反應液之組成為10體積份之甲基丙烯酸縮水甘油酯、90體積份之甲醇以外,以與實施例1相同之方式導入接枝鏈,以及將二乙胺基固定於接枝鏈上,獲得具有二乙胺基作為陰離子交換基、接枝率為140%之中空纖維多孔膜。又,使用(IV)式進行計算,結果接枝鏈所具有之環氧基之93%被二乙胺基取代。所獲得之中空纖維多孔膜之外徑為4.0mm,內徑為2.5mm,使用該中空纖維多孔膜,以與實施例1相同之方式,製作多孔質中空纖維之有效體積為1.53mL,除去中空部分之中空纖維多孔膜單獨之體積0.92mL的中空纖維模組。
圖2之區帶11表示使用該中空纖維模組,進行與實施例4相同之操作所獲得之結果。該結果表明,藉由使含有鹽之細胞培養液透過該模組,可將其中之大部分雜質除去,獲得經純化之目標蛋白質。另外,於透過陰離子交換膜模組前之細胞培養上清液中,具有代表性之雜質HCP及DNA之濃度分別為346μg/mL及7200ng/mL,於透過液中則大幅降低,分別為42.6μg/mL及32.8ng/mL,由此可知陰離子交換膜模組對於該等以溶存之方式存在之雜質蛋白質之除去性優異。
使用Sartorius製造之SartobindQ MA75(膜體積為2.06mL)、Pall製造之MustangQ Acrodisc(膜體積為0.18mL)及Cuno製造之BioCap 25 Filter 90ZA(膜體積為5mL以上)3種市售之具有陰離子交換基之膜,以與實施例4相同之方式,使相當於各膜體積之100倍之體積份的含有0.5g/L之作為目標蛋白質之γ-球蛋白的CHO無血清細胞培養的上清液進行通液,從而除去雜質。以與實施例4相同之方式利用SDS-PAGE進行評價。結果與實施例4同樣地示於圖2。區帶6為SartobindQ MA75之透過液、區帶7為MustangQ Acrodisc之透過液、區帶8為BioCap 25 Filter 90ZA之透過液。由此表明,即便使用市售之具有陰離子交換基之膜,亦無法有效地自含有鹽之細胞培養液中除去雜質。於透過陰離子交換膜模組前之細胞培養上清液中,HCP及DNA之濃度分別為346μg/mL及7200ng/mL,於透過SartobindQ MA75後之液中,分別為269μg/mL及492ng/mL,於透過MustangQ Acrodisc後之液中,分別為248μg/mL及3916ng/mL,於透過BioCap 25 Filter 90ZA後之液中,分別為310μg/mL及7600ng/mL,由此可知其雜質除去性低於本實施形態之方法。
DEA陰離子交換膜透過液之蛋白質A純化
使用實施例4中所獲得之具有二乙胺基之中空纖維膜模組的透過液作為已除去溶存之雜質之細胞培養液,利用蛋白質A親和管柱進行吸附回收,以此來純化γ-球蛋白。根據上述(7)之方法,使30mL之實施例4之透過液於蛋白質A親和管柱中進行通液,使管柱吸附γ-球蛋白,並使用溶出緩衝液進行純化回收。將回收液稀釋10倍後測定紫外線吸收強度,評價回收量,結果回收液中含有14.2mg之γ-球蛋白,回收率為95%。又,回收液中所含有之HCP及DNA之濃度分別為0.162μg/mL及11.8ng/mL,顯示出本實施形態之方法之高回收率及高雜質除去性。
TMA陰離子交換膜透過液之蛋白質A純化
使用實施例5中所獲得之具有三甲胺基之中空纖維膜模組之透過液,作為已除去溶存之雜質之細胞培養液,與實施例7同樣地利用蛋白質A親和管柱進行吸附回收,以此來純化γ-球蛋白。根據上述(7)之方法,使30mL之實施例5之透過液於蛋白質A親和管柱中進行通液,使管柱吸附γ-球蛋白,並使用溶出緩衝液進行純化回收。將回收液稀釋10倍後測定紫外線吸收強度,評價回收量,結果回收液中含有13.8mg之γ-球蛋白,回收率為92%。又,回收液中所含有之HCP及DNA之濃度分別為0.289μg/mL及19.1ng/mL,顯示出本實施形態之方法之高回收率及高雜質除去性。
DEA陰離子交換膜透過液之蛋白質A純化(2)
使用實施例6中所獲得之具有二乙胺基之中空纖維膜模組之透過液,作為已除去溶存之雜質之細胞培養液,利用蛋白質A親和管柱進行吸附回收,以此來純化γ-球蛋白。根據上述(7)之方法,使30mL之實施例6之透過液於蛋白質A親和管柱中進行通液,使管柱吸附γ-球蛋白,並使用溶出緩衝液進行純化回收。將回收液稀釋10倍後測定紫外線吸收強度,評價回收量,結果回收液中含有13.9mg之γ-球蛋白,回收率為93%。又,回收液中所含有之HCP及DNA之濃度分別為0.186μg/mL及13.8ng/mL,顯示出本實施形態之方法之高回收率及高雜質除去性。
使用實施例4中之僅使用微濾膜除去懸濁物質、含有0.5mg/mL之γ-球蛋白的細胞培養液,作為未將溶存之雜質除去之細胞培養液,以與實施例7相同之方式進行純化評價。將蛋白質A親和管柱之回收液稀釋10倍後測定紫外線吸收強度,評價回收量,結果回收液中含有14.5mg之γ-球蛋白,回收率為97%。又,回收液中所含有之HCP及DNA之濃度分別為2.93μg/mL及63.2ng/mL,儘管目標蛋白質之回收率較高,但與經實施本實施形態之利用具有陰離子交換基之中空纖維膜模組而除去雜質之處理的情形相比,回收液中含有較多雜質。
使用比較例1中所獲得的市售之陰離子交換膜之透過液,以與實施例7相同之方式,利用蛋白質A親和管柱進行吸附回收,以此來純化γ-球蛋白。將蛋白質A親和管柱之回收液稀釋10倍後測定紫外線吸收強度,對各陰離子交換膜之透過液之回收率進行評價,結果SartobindQ MA75為97%,MustangQ Acrodisc為93%,BioCap 25 Filter 90ZA為95%,回收率均較高。又,回收液中之HCP及DNA之濃度,SartobindQ MA75分別為3.83μg/mL及32.6 ng/mL,MustangQ Acrodisc分別為2.54μg/mL及46ng/mL,BioCap 25 Filter 90ZA分別為3.27μg/mL及88.2ng/mL,其除去性低於本實施形態之方法,僅獲得與比較例2之未使用陰離子交換膜進行透過處理之情形大致相同之純化度。
將實施例4-9及比較例1-3中顯示出之HCP及DNA之濃度示於表1。表1之結果表明,實施例4-9中可獲得較高之雜質除去性。
組裝圖3中所示之橫流過濾評價裝置,將300mL上述(3)中所製備的含有目標蛋白質之細胞培養液加入至細胞培養液槽1內,使用蠕動泵2,使培養液自該細胞培養液槽1以0.5m/s之線速度,於實施例1中所製作之內置有具有二乙胺基作為陰離子交換基之中空纖維多孔膜的中空纖維膜模組(以下,稱為陰離子交換中空纖維膜模組)4中進行通液,以此進行橫流過濾。此處係採用使透過液自多孔質中空纖維內側向外側移動之內壓式過濾。使用流量調節栓6來調節透過壓力,以使壓力計(進模組側)3與壓力計(出模組側)5之平均值達到0.1MPa,進行橫流過濾時,以每次30mL之方式收取透過模組之液體,直至210mL為止,最後收取40mL,使總透過液量達到250mL。此期間之平均透過流速為21L/m2
/hr(21LMH)。又,目視觀察所收取之全部透過液,均為澄清之液體。
根據上述(4)中所記載之方法,利用SDS-PAGE分析透過液及溶出液,結果示於圖4。該結果表明,對於所收取之全部透過液,與原液濃度相同之目標蛋白質順利通過陰離子交換中空纖維膜模組而到達透過液中,而雜質蛋白質則明顯地被陰離子交換中空纖維膜模組吸附。使用20mM之Tris-HCl(pH值為8.0)之緩衝液,對經橫流過濾評價後之陰離子交換中空纖維膜模組進行反洗,將堆積於多孔質中空纖維內側之懸濁物質成分除去後,使用含有1M之NaCl之緩衝液將被吸附之成分溶出,並利用SDS-PAGE對其進行分析。結果表明,大量之雜質蛋白質吸附於陰離子交換中空纖維膜模組中,但目標蛋白質並未吸附於該模組中。
將藉由透過所獲得之所有澄清之培養液裝入至同一容器內,製成均一之溶液,使其於未使用過之蛋白質A親和管柱中進行通液,根據上述(7)中所記載之方法,對蛋白質A親和管柱中之目標蛋白質之吸附量進行評價。此處,使透過管柱之培養液為10mL。評價期間不更換管柱,反覆實施上述(7)中所記載之吸附評價之循環10次,測定吸附量之變化,結果第一次之吸附量為9.8mg,第十次之吸附量為9.8mg,10次反覆間未見吸附量減少。又,目視觀察溶出液,結果於所有評價中溶出液均澄清,且未確認到任何凝聚物。評價結束後,將蛋白質A親和管柱拆開,使用光學顯微鏡觀察內部之珠粒,結果於珠粒上亦未觀察到附著有任何雜質。藉此可確認,使用陰離子交換中空纖維膜模組,可同時自細胞培養液除去懸濁物質及溶存之雜質蛋白質,其結果可大幅減小蛋白質A親和管柱所承受之負擔。
使用內徑為3.0mm,外徑為2.0mm,最大微孔徑為0.2μm之未賦予陰離子交換基之聚乙烯多孔質中空纖維,以與實施例1中所記載之陰離子交換中空纖維膜模組相同之方法製作迷你模組。使用該迷你模組,以與實施例3相同之方法收取含有目標蛋白質之細胞培養液的透過液。目視觀察為所獲得之透過液為澄清之液體,但根據上述(4)中所記載之方法利用SDS-PAGE進行分析可確認,與實施例10之透過液相比,有極大量之雜質蛋白質溶存於該透過液中。進而,以與實施例10相同之方式,藉由緩衝液對該評價後之迷你模組進行反洗,然後用1M之NaCl緩衝液進行溶出,結果表明,雜質蛋白質、目標蛋白質均未吸附於該迷你模組中。
以與實施例10相同之方式,使藉由透過所獲得之澄清之培養液於未使用過之蛋白質A親和管柱中進行通液,評價目標蛋白質之吸附量。不更換管柱,反覆實施10次評價,測定吸附量之變化,第一次之吸附量為9.8mg,但隨著反覆次數增加吸附量下降,第十次之吸附量變為9.4mg。又,目視觀察溶出液,結果確認有少許由凝聚物所引起之白色渾濁。評價結束後,將蛋白質A親和管柱拆開,使用光學顯微鏡觀察內部之珠粒,結果觀察到珠粒之間附著有凝聚之雜質。由此表明,除去溶存之雜質蛋白質對於減小蛋白質A親和管柱所承受之負擔十分重要,從而證實了具有陰離子交換基之中空纖維多孔膜之效果。
組裝圖5中所示之橫流過濾評價裝置,將300mL之上述(3)中所製備之含有目標蛋白質之細胞培養液加入至細胞培養液槽1內,使用蠕動泵2,使培養液自該細胞培養液槽1於上述(8)中所記載之除濁用微濾中空纖維膜模組7中,以0.5m/s之線速度橫流通液,以此來進行過濾。使用流量調節栓6來調節透過壓力,以使壓力計(進模組側)3與壓力計(出模組側)5之平均值達到0.1MPa。將透過用以除去懸濁物質之微濾中空纖維膜模組7之液體,直接送入至與實施例10相同之陰離子交換中空纖維膜模組4中進行擠壓式過濾,以每次30mL之方式收取所獲得之透過液。總透過液量達到250mL為止所需之時間為160分鐘,其平均透過流速為120L/m2
/hr(120LMH)。又,目視觀察所收取之全部透過液,均為澄清之液體。
根據上述(4)中所記載之方法,利用SDS-PAGE對所收取之透過液進行分析,結果顯示對於所收取之全部透過液,與原液濃度相同之目標蛋白質順利通過陰離子交換中空纖維膜模組而到達透過液中,而雜質蛋白質則明顯地被陰離子交換中空纖維膜模組吸附。
使用上述(8)中所記載之微濾中空纖維膜模組,對上述(3)中所製備之含有目標蛋白質之細胞培養液進行過濾,獲得300mL之經除去懸濁物質之澄清液體。將圖3之評價裝置中之流量調節栓6完全關閉後,將所獲得之澄清液加入至圖3之細胞培養液槽1內,使用蠕動泵2,自細胞培養液槽1以10mL/min之送液速度,將該液體送入至與實施例10相同之陰離子交換中空纖維膜模組4中進行擠壓式過濾,以每次30mL之方式收取藉由所獲得之透過液。總透過液量達到250mL為止所需之時間為25分鐘,其平均透過流速為816L/m2
/hr(816LMH)。又,目視觀察所收取之全部透過液,均為澄清之液體。由此可確認,即便培養液中含有溶存之雜質蛋白質,亦可藉由於使用陰離子交換中空纖維膜模組進行過濾之前進行微濾,而以極快之處理速度將雜質蛋白質除去。
根據上述(4)中所記載之方法,利用SDS-PAGE對所收取之透過液進行分析,結果表明,對於所收取之全部透過液,與原液濃度相同之目標蛋白質順利通過陰離子交換中空纖維膜模組而到達透過液中,而雜質蛋白質則明顯地被陰離子交換中空纖維膜模組吸附。
如上所述,與使用未賦予陰離子交換基之聚乙烯中空纖維膜模組之比較例1、3及4,以及未使用陰離子交換中空纖維膜模組之比較例2相比,使用實施例1、2及6中所製作之內置有具有陰離子交換基之中空纖維多孔膜的陰離子交換中空纖維膜模組進行過濾的實施例3~12中,可顯著地除去溶存之雜質蛋白質,而且,利用親和層析法進行純化時,可獲得含有更高純度之目標蛋白質之溶液。尤其是於實施例10中,即便將經該過濾後所獲得之溶液反覆供給於蛋白質A親和管柱中,亦不會使該管柱之純化能力下降,而且,可防止雜質附著於該管柱內,並且可充分地減輕該管柱所承受之負擔。
進而,藉由於使用陰離子交換中空纖維膜模組進行過濾之前,使用微濾中空纖維膜模組進行過濾,可使得於使用陰離子交換中空纖維膜模組之過濾步驟中,能夠以極快之處理速度進行該過濾步驟。又,即便使用陰離子交換中空纖維膜模組之過濾係藉由擠壓式過濾來進行,亦可顯著地除去溶存之雜質蛋白質。
本申請案係基於2007年10月26日申請之日本專利申請案(日本專利特願2007-279406號),該申請案之內容併入本文以做參照。
使用本實施形態之蛋白質之純化方法,可藉由使用具有陰離子交換基之中空纖維多孔膜進行過濾該一個步驟,而完成通常係藉由離心分離、微濾、滅菌過濾三步驟於親和層析步驟之前使細胞培養液澄清之處理。其結果,可使步驟簡便化、減少所需之設備,從而削減成本。另外,可大幅減小親和層析步驟之負擔,將目標之蛋白質純化成更高之純度,並且可降低純化成本。
1...細胞培養液槽
2...蠕動泵
3...壓力計(進模組側)
4...陰離子交換中空纖維膜模組
5...壓力計(出模組側)
6...流量調節栓
7...除濁用微濾中空纖維膜模組
圖1表示於實施例3中,使用陰離子交換中空纖維膜模組對BSA與γ-球蛋白之混合液進行過濾後,利用SDS-PAGE對順利通過成分與吸附成分加以分析之分析結果。
圖2表示於實施例4~6及比較例1中,各種陰離子交換膜之過濾對含有γ-球蛋白之細胞培養液之純化的SDS-PAGE分析結果。
圖3表示於實施例10中,使用陰離子交換中空纖維膜模組以一個步驟來除去懸濁物質、除去雜質蛋白質及滅菌的評價裝置之概略圖。
圖4表示於實施例10中,使用陰離子交換中空纖維膜模組進行過濾後,利用SDS-PAGE對順利通過成分與吸附成分加以分析之分析結果。
圖5表示於實施例11中,以兩個步驟即使用微濾中空纖維膜模組除去懸濁物質之後,使用陰離子交換中空纖維膜模組來除去雜質蛋白質及滅菌的評價裝置之概略圖。
1...細胞培養液槽
2...蠕動泵
3...壓力計(進模組側)
4...陰離子交換中空纖維膜模組
5...壓力計(出模組側)
6...流量調節栓
Claims (16)
- 一種蛋白質之純化方法,其係用以自含有目標蛋白質與雜質之動物細胞培養液中除去上述雜質,其中包含使用微孔表面具有接枝鏈且上述接枝鏈上固定有陰離子交換基之多孔膜進行過濾之步驟;且上述接枝鏈之接枝率為10%以上、90%以下;上述動物細胞培養液之鹽濃度為0.01 M以上、0.5 M以下。
- 如請求項1之蛋白質之純化方法,其中上述目標蛋白質係選自由單株抗體、多株抗體、人類化抗體、人類抗體及免疫球蛋白所組成之群中之一種。
- 如請求項1之蛋白質之純化方法,其中上述雜質係選自由非懸濁物質成分及分散於上述動物細胞培養液中之懸濁物質成分所組成之群中之至少一種。
- 如請求項2之蛋白質之純化方法,其中上述雜質係選自由非懸濁物質成分及分散於上述動物細胞培養液中之懸濁物質成分所組成之群中之至少一種。
- 如請求項3或4之蛋白質之純化方法,其中上述非懸濁物質成分係選自由溶存於上述動物細胞培養液中之雜質蛋白質、HCP、DNA、病毒、內毒素、蛋白酶及細菌所組成之群中之至少一種。
- 如請求項3或4之蛋白質之純化方法,其中分散於上述動物細胞培養液中之懸濁物質成分係選自由細胞及細胞碎片所組成之群中之至少一種。
- 如請求項5之蛋白質之純化方法,其中分散於上述動物細胞培養液中之懸濁物質成分係選自由細胞及細胞碎片所組成之群中之至少一種。
- 如請求項1至4中任一項之蛋白質之純化方法,其中上述動物細胞培養液之鹽濃度為0.1 M以上、0.3 M以下。
- 如請求項1至4中任一項之蛋白質之純化方法,其中上述多孔膜之基材為聚乙烯或聚偏二氟乙烯,上述接枝鏈係甲基丙烯酸縮水甘油酯之聚合物,且上述接枝鏈所具有之環氧基之70%以上被上述陰離子交換基取代。
- 如請求項9之蛋白質之純化方法,其中上述接枝率為30%以上、60%以下。
- 如請求項1至4中任一項之蛋白質之純化方法,其中上述陰離子交換基為二乙胺基及/或三甲胺基。
- 如請求項1至4中任一項之蛋白質之純化方法,其中上述陰離子交換基為二乙胺基。
- 如請求項1至4中任一項之蛋白質之純化方法,其中上述多孔膜之最大微孔徑為0.1 μm以上、0.8 μm以下。
- 如請求項1至4中任一項之蛋白質之純化方法,其使用上述多孔膜過濾上述動物細胞培養液,藉此除去包括非懸濁物質成分之一種以上之雜質。
- 如請求項1至4中任一項之蛋白質之純化方法,其中上述多孔膜為中空纖維多孔膜。
- 如請求項1至4中任一項之蛋白質之純化方法,其進而包含以親和層析法進行純化之步驟。
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