JP2010158624A - 多孔質吸着膜、及び当該多孔質吸着膜を用いたたんぱく質の精製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】リガンド構造の制御が容易であり、かつＨＣＰ、凝集体などの夾雑物を有効にかつ迅速に除去することのできる、混合リガンドを有する吸着体を提供すること。
【解決手段】細孔を有する基材からなる多孔質吸着膜であって、前記基材表面にリガンドとしてアニオン交換基と疎水性基とが、共に固定されている多孔質吸着膜。
【選択図】図１

Description

本発明は、多孔質吸着膜、及び当該多孔質吸着膜を用いたたんぱく質の精製方法に関する。本発明は、具体的には、混合リガンドとしてアニオン交換基と疎水性基とを共に有する多孔質吸着膜、及び当該多孔質吸着膜を用いたたんぱく質の精製方法に関する。

近年、バイオテクノロジー産業において、タンパク質の大量精製が重要な課題となっている。特に医薬の分野において、抗体医薬の需要が急速に拡大しており、効率的に大量のタンパク質を産生可能及び精製可能な技術の確立が強く望まれている。

一般的に、タンパク質は、動物由来の細胞株を用いる細胞培養によって産生される。細胞培養液からタンパク質を精製する通常の操作においては、最初に、細胞培養液を遠心分離し、濁質成分を沈降除去する。次いで、遠心分離で除去しきれない約１μｍ以下の細胞デブリを、精密ろ過膜を用いるサイズろ過により除去する。さらに無菌化するために、最大細孔径が０．２２μｍ以下のろ過膜を用いて無菌化ろ過を施して、目的タンパク質の清澄な溶液を得る（ハーベスト工程）。続いて、プロテインＡに代表されるアフィニティークロマトグラフィーを初めとする、複数のクロマトグラフィー技術の組み合わせによる精製プロセスを用いて、Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、目的たんぱく質の凝集物、エンドトキシン、ウィルス、カラムから脱離したプロテインＡなどの夾雑物を清澄な溶液から除去し、目的タンパク質を分離・精製する（ダウンストリーム工程）。

以上説明した従来のタンパク質の精製方法の対象となる細胞培養液中の目的タンパク質の濃度は、現状では通常１ｇ／Ｌ程度である。また、夾雑物の濃度も、目的タンパク質の濃度とほぼ同程度であると考えられ、かかる状況ではハーベスト工程及びダウンストリーム工程を含む従来のタンパク質の精製方法は充分有効である。

しかしながら、抗体医薬の需要が急速に拡大し、抗体医薬に用いられるタンパク質の大量生産が指向されたため、近年では細胞培養液中のタンパク質濃度を高める細胞培養技術が急速に発達している。そのため、近年では細胞培養液中の目的タンパク質の濃度が１０ｇ／Ｌあるいはそれ以上にまで到達しようとしている。しかし同時に、細胞培養液中の夾雑物の濃度も同様に増加しており、従来のタンパク質の精製方法では、目的タンパク質の精製が困難になりつつある。

抗体医薬品として使われる抗体たんぱく質、すなわちモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び免疫グロブリンなどを、精製することを目的としたクロマトグラフィー工程が多数報告されている。

近年では効率的に抗体を夾雑物から分離精製するために複数のリガンドを有する混合モードの樹脂を充填したクロマトグラフィーカラムを用いることが、広く検討されている。このようなクロマトグラフィーカラムに用いられるリガンドとしては、ミックスモードリガンドまたはマルチモーダルリガンドと呼ばれるリガンドが用いられている。
このようなモードのリガンドを用いるクロマトグラフィーでは電荷と疎水性の複数の相互作用の差を利用するため、より高精度な分離が可能になるだけでなく、複数の夾雑物を同時にかつ有効に除去できることが期待されている。

例えば、特許文献１には、アニオン交換基と疎水性基よりなるマルチモーダルリガンドのクロマトグラフィーを用いたフロースルーモードにより、夾雑物を吸着して抗体モノマーを回収する方法、特に遊離したプロテインＡリガンドと抗体モノマーよりなる凝集体を吸着除去する方法が記載されている。
また、特許文献２には、四級アンモニウム基、水素結合基及び疎水性基を有するマルチモーダルのクロマトグラフィーを用いて、ＤＮＡ、ウィルス、エンドトキシン、凝集体、ＨＣＰなどの殆どの夾雑物を吸着し、抗体モノマーをフロースルーにより回収する方法が記載されており、特にＨＣＰはほぼ完全に除去されることが記載されている。
さらに、特許文献３には、メルカプト基及び芳香族ピリジン環を有するミックスモードのクロマトグラフィーにより、抗体モノマーのみを吸着し、凝集体を非吸着画分として除去することにより、結合モードで抗体モノマーを精製する方法が記載されている。
凝集体を選択的にカラムに吸着させ、より有効に凝集体を除去することを目的としたフロースルーモードで抗体モノマーを精製回収する方法として、特許文献４には、ヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィーを適用した例が記載されている。
特許文献１−４に開示されているように、凝集体の除去の重要性は、投与時に、補体の活性またはアナフィラキシーをもたらすことによって、産物である抗体医薬の安全性に有害な影響を及ぼす可能性が指摘されていることによる。

特表２００８−５０５８５１号公報 特表２００８−５１７９０６号公報 特表２００８−５００９７２号公報 特表２００７−５３２４７７号公報

特許文献１−４に開示されているように、細胞培養液中の多種多様な夾雑物から抗体を高精度で分離する方法は、数多く提案、報告されている。
しかしながら、現実には全ての夾雑物を有効にかつ迅速に除去して抗体を精製することは、現状でも困難であり、特にアフィニティークロマトグラフィー後の中間精製において、微量に残存するＨＣＰ、凝集体などを医薬品として要求されるレベルにまで除去し、高精度な抗体モノマーを回収することは、細胞培養液中の目的タンパク質濃度が大幅に向上しつつある状況において、さらに困難になることが懸念されている。

特許文献１及び２に開示されたマルチモーダルのリガンドについても、クロマトグラフィーカラムに用いるビーズのみを対象としており、高流速で通液することが困難である。
また、特許文献３及び４に開示されたミックスドモードのリガンドについても、クロマトグラフィーカラムに用いるビーズのみを対象としており、高流速で通液することが困難である。

さらに、全ての夾雑物を有効にかつ迅速に除去して抗体を精製することの困難さは、フロースルーモード並びに結合モードの両方において、有効に抗体を分離精製するための有効なｐＨ、塩濃度、溶液組成などの条件、すなわちプロセスウィンドウが狭く、安定で汎用的な精製条件を決定することが容易ではないことに基づいている。この状況はより効率的に夾雑物を除去することを目的とした混合モードリガンドのクロマトグラフィーにおいても同様である。
加えて、中間精製において夾雑物を除去する工程は、高精度が要求されるために、高流速処理が可能な吸着膜ではなく、分解能が高いクロマトグラフィーカラムによるプロセスが指向される。特に凝集体、ＨＣＰのような、アフィニティーグロマトグラフィーにより低濃度にまで除去された状態から、さらに除去することが必要とされる夾雑物の除去においては、なおさらプロセスウィンドウが狭いために条件の設定がより困難となり、これまで吸着膜などを用いた迅速な精製は不可能であった。
また、特許文献１−４に開示された技術においても、多孔質膜を用いて夾雑物を除去する方法については報告されていない。

かかる状況に鑑み、本発明の解決しようとする課題は、プロセスウィンドウを広くすることを可能にすることを目的として、アニオン交換基と疎水性基によるたんぱく質との相互作用をより広い範囲で得るために、リガンド構造の制御が容易であり、かつＨＣＰ、凝集体などの夾雑物を有効にかつ迅速に除去することのできる、混合リガンドを有する吸着体を提供することである。また、本発明の解決しようとする課題は、プロセスウィンドウが広くなることで高速処理が可能となることから、そのような混合リガンドを有する多孔質吸着膜を提供することである。

本発明者らは、課題を解決するために鋭意検討した結果、アニオン交換基と疎水性基とが共に固定されている、混合リガンドである多孔質吸着膜を用いることが、抗体医薬品として使われるたんぱく質の精製において、夾雑物を除去することに有効であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］
細孔を有する基材からなる多孔質吸着膜であって、
前記基材表面にリガンドとしてアニオン交換基と疎水性基とが、共に固定されている多孔質吸着膜。
［２］
前記基材表面に、前記アニオン交換基と前記疎水性基とがグラフト鎖を介して共に固定されている、［１］に記載の多孔質吸着膜。
［３］
前記アニオン交換基と前記疎水性基とがグラフト鎖を介して共に固定されている構造が、
（１）前記アニオン交換基とそれに隣接する水酸基よりなる構造、及び
（２）前記疎水性基とそれに隣接する水酸基よりなる構造である、［２］に記載の多孔質吸着膜。
［４］
前記アニオン交換基が、ジエチルアミノ基及びトリメチルアンモニウム基からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］から［３］のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
［５］
前記疎水性基がフェニルアミノ基、フェノキシ基、ブチルアミノ基、及びブトキシ基からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］から［４］のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
［６］
前記グラフト鎖がメタクリル酸グリシジルの重合体である、［１］から［５］のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
［７］
前記多孔質吸着膜の基材がポリエチレン及びポリフッ化ビニリデンからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１］から［６］のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
［８］
前記多孔質吸着膜が中空糸多孔膜である、［１］から［７］のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
［９］
目的とするたんぱく質と夾雑物とを含む混合溶液から目的とするたんぱく質を精製する方法であって、
［１］から［８］のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜を用いてろ過し、夾雑物を除去する、たんぱく質の精製方法。

本発明の多孔質吸着膜を用いることにより、細胞培養液に含まれる目的たんぱく質の精製、特にアフィニティークロマトグラフィー工程後の中間精製において、夾雑物を有効にかつ迅速に除去することができる。

構造(１)と構造（２）のグラフト鎖での配列の模式図を示す。 構造(１)と構造（２）のグラフト鎖での配列の模式図を示す。 構造(１)と構造（２）のグラフト鎖での配列の模式図を示す。 構造(１)と構造（２）のグラフト鎖での配列の模式図を示す。

以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

本実施の形態の多孔質吸着膜は、細孔を有する基材からなる多孔質吸着膜であって、前記基材表面に、リガンドとしてアニオン交換基と疎水性基とが、共に固定されている、多孔質吸着膜である。

リガンドとしてのアニオン交換基としては、混合液中に溶存する目的たんぱく質及び／又は夾雑物、夾雑物として、特に、不純物たんぱく質、ＤＮＡ、ＨＣＰ、ウィルス及びエンドトキシンなどを吸着する能力のあるアニオン交換基であれば特に限定されないが、ジエチルアミノ基（ＤＥＡ、Ｅｔ_２Ｎ−）、四級アンモニウム基（Ｑ、Ｒ_３Ｎ^＋−）、四級アンモニウムエチル基（ＱＡＥ、Ｒ_３Ｎ^＋−（ＣＨ_２）_２−）、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ、Ｅｔ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−）、ジエチルアミノプロピル（ＤＥＡＰ、Ｅｔ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−）基などが挙げられる。
四級アンモニウムにおけるＲとしては、特に限定されないが、同一のＮに結合するＲが同一又は異なっていてもよく、好適には、アルキル基などの炭化水素基が挙げられる。Ｒとしては、アルキル基中に、エーテル結合またはエステル結合を有する基であってもよい。アルキル基の炭素数については特に限定されない。
四級アンモニウム基としては、例えば、トリメチルアンモニウム基（Ｍｅ_３Ｎ^＋−）などが挙げられる。
アニオン交換基としては、多孔質吸着膜に導入されたグラフト鎖への化学的な固定が容易であり、高い吸着容量が得られることから、ＤＥＡ及びＱが好ましく、ＤＥＡがより好ましい。

アニオン交換基とそれに隣接する水酸基よりなる構造（１）を、ＤＥＡ及びＱの場合について示すとそれぞれ下記化学式（Ｉ）及び（ＩＩ）のように表される。
水酸基がアニオン交換基に隣接することにより、構造（１）の親水性が増加し、その結果グラフト鎖が対象となる培養液中に広がりやすく、かつグラフト鎖が柔軟に動きやすくなるため、よりたんぱく質を吸着できる。

リガンドとしての疎水性基としては、混合液中に溶存する目的たんぱく質及び／又は夾雑物、夾雑物として、特に、目的たんぱく質の二量体、三量体などの凝集体、目的たんぱく質の誤って折りたたまれた種、脂質などを吸着する能力ある疎水性基であれば特に限定されないが、フェニル基、オクチル基、ブチル基、イソプロピル基などを含む構造が挙げられる。
疎水性基としては、多孔質吸着膜に導入されたグラフト鎖への化学的な固定が容易であり、高い吸着能が得られることから、フェニルアミノ基（Ｃ_６Ｈ_５−ＮＨ−）、フェノキシ基（Ｃ_６Ｈ_５−Ｏ−）、ブチルアミノ基（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−）、及びブトキシ基（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_３−Ｏ−）が好ましい。
疎水性基とそれに隣接する水酸基よりなる構造（２）を、フェニルアミノ基、フェノキシ基、ブチルアミノ基、及びブトキシ基の場合について示すとそれぞれ下記化学式（ＩＩＩ）から（ＶＩ）のように表される。
水酸基が疎水性基に隣接することにより、グラフト鎖が対象となる培養液中に広がりやすく、かつグラフト鎖が柔軟に動きやすくなるため、よりたんぱく質を吸着できる。この水酸基の効果は疎水性基の場合に特に有効である。
化学式（Ｉ）から（ＶＩ）において、リガンドは１位で結合している場合を例示したが、水酸基とリガンドとの位置は入れ替わってもよい。また、化学式（Ｉ）から（ＶＩ）においては、構造（１）と構造（２）とが、グラフト鎖の末端に位置する場合を例示したが、グラフト鎖の中間に位置していてもよい。

本実施の形態の多孔質吸着膜においては、アニオン交換基と疎水性基とがグラフト鎖を介して共に固定されていることが好ましく、アニオン交換基と疎水性基とがグラフト鎖を介して共に固定されている構造として、アニオン交換基を含む構造（１）と疎水性基を含む構造（２）であることが好ましい。
構造(１)と構造（２）の多孔質吸着膜における配列に、明確な規則性はなく、ほぼ均一にかつランダムに固定されている場合、グラフト鎖の上下位置によりリガンド密度に偏りがある場合、さらにはグラフト鎖ごとにリガンドが偏っている場合などがありうる。本実施の形態における一態様をＤＥＡ基とフェニルアミノ基の場合について模式的に例示すると図１から図４のように示される。
ここでグラフト鎖の長さ並びに、基材表面でのグラフト鎖の密度は特に限定されない。また、構造（１）と構造（２）の総数に対する、構造（１）の存在比率は、アニオン交換基と疎水性基の比率を制御することにより、精製の目的に応じて０％から１００％まで任意に制御することができるが、本実施の形態においては０．１％から９９．９％の範囲で制御する。図１から図４において、リガンドは１位で結合している場合を例示したが、水酸基とリガンドとの位置は入れ替わってもよい。

本実施の形態において、多孔質吸着膜の基材としては、特に限定されないが、機械的性質の保持のために、ポリオレフィン系重合体から構成されていることが好ましい。
ポリオレフィン系重合体としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン及びフッ化ビニリデンなどのオレフィンの単独重合体、該オレフィンの２種以上の共重合体、または１種もしくは２種以上のオレフィンとパーハロゲン化オレフィンとの共重合体などが挙げられる。
パーハロゲン化オレフィンとしては、テトラフルオロエチレン及び／又はクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。
これらの基材の中でも、機械的強度に特に優れ、かつたんぱく質などの夾雑物の高い吸着容量が得られる素材である点で、ポリエチレンまたはポリフッ化ビニリデンが好ましく、ポリエチレンがより好ましい。
ポリオレフィン系重合体を用いて多孔質膜を製造する方法は、当業者にとって公知のものであるが、例えば、特開平３−４２０２５号公報に開示される方法などが挙げられる。

多孔質吸着膜は、上記基材中に細孔を有する多孔質膜である。
細孔径は、特に限定されないが、夾雑物である溶存したたんぱく質などの吸着除去が有効になされ、かつ液中に含まれるサイズの大きな夾雑物である濁質成分が有効に除去される範囲であることが好ましい。
細孔径は、０．０１μｍ〜５μｍであることが好ましく、より好ましくは０．５μｍ〜３μｍであり、さらに好ましくは０．１μｍ〜１μｍである。
多孔質吸着膜中の細孔の占める体積である空孔率も、多孔質膜の形状を保持しかつ通液時の圧損が実用上問題のない程度であれば、特に限定されないが、好ましくは５％〜９９％であり、より好ましくは１０％〜９５％であり、さらに好ましくは３０％〜９０％である。
細孔径及び空孔率の測定は、Ｍａｒｃｅｌ Ｍｕｌｄｅｒ著「膜技術」（株式会社アイピーシー）などに記載されているような、当業者にとって公知の方法により行うことができるが、測定方法としては、例えば、電子顕微鏡による観察、バブルポイント法、水銀圧入法、透過率法などが挙げられる。

本実施の形態の多孔質吸着膜は、基材の表面にグラフト鎖が固定されていることが好ましい。
基材の表面にグラフト鎖が固定されているとは、基材からなる多孔質吸着膜の表面及び細孔にグラフト鎖が導入されていることを意味する。
本実施の形態において、グラフト鎖とは、多孔質吸着膜となる基材表面に基材と同種または異種の分子鎖が化学的に結合したものであることを意味する。
多孔質吸着膜にグラフト鎖を結合し、該グラフト鎖にアニオン交換基または疎水性基を結合させる方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、特開平２−１３２１３２号公報に開示される方法などが挙げられる。
本実施の形態において、基材に導入されるグラフト鎖とは、導入反応後にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの有機溶剤で洗浄しても、除去されない化学構造を有する鎖であることが好ましい。
グラフト鎖を構成する重合体としては、例えば、メタクリル酸グリシジル、酢酸ビニル及びヒドロキシプロピルアセテート等の単量体の重合体が挙げられるが、アニオン交換基及び疎水性基を導入しやすいことから、メタクリル酸グリシジルまたは酢酸ビニルの重合体が好ましく、メタクリル酸グリシジルの重合体がより好ましい。
グラフト鎖としては、メタクリル酸グリシジル（グリシジルメタクリレート）が基材表面にグラフト重合により導入された鎖であることが好適である。

多孔質吸着膜の形態は、多孔質体であれば特に限定されないが、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、キャピラリー、円板または円筒状などが挙げられる。これらの形態の中でも、製造のし易さ、スケールアップ性、モジュール成型した際の膜のパッキング性などから、多孔質吸着膜は、中空糸多孔膜であることが好ましい。
本実施の形態において、中空糸多孔膜とは、中空部分を有する円筒状または繊維状の多孔膜であり、中空糸の内層と外層が貫通孔である細孔によって連続しており、その細孔によって内層から外層、あるいは外層から内層に液体あるいは気体が透過する性質を有する多孔体を意味する。
中空糸の外径及び内径は、物理的に形状を保持することができ、かつモジュール成型可能であれば、特に限定されない。

本実施の形態の目的とするたんぱく質の精製方法は、目的とするたんぱく質と夾雑物とを含む混合溶液から目的とするたんぱく質を精製する方法であって、
前記多孔質吸着膜を用いてろ過し、夾雑物を除去する、たんぱく質の精製方法である。
本実施の形態の多孔質吸着膜は、混合溶液中に含まれる１種類以上の夾雑物から、目的とするたんぱく質である抗体を分離、精製する用途に用いることが有効である。
目的とするたんぱく質を分離・精製する方法としては、混合溶液を本実施の形態の多孔質吸着膜を用いてろ過することにより、（ａ）夾雑物を多孔質吸着膜に吸着させ、精製された抗体を、非吸着のフロースルーモードの画分として回収する、あるいは（ｂ）結合モードで抗体を多孔質吸着膜に吸着した後、選択的に溶出回収する、の２種類の方法が挙げられる。

本実施の形態の多孔質吸着膜にろ過させる混合溶液としては、アフィニティークロマトグラフィー工程からの抗体を含有する溶出液を用いることが好適である。アフィニティークロマトグラフィーに用いられるカラムに充填する樹脂のリガンドは、通常プロテインＡのような、Ｆｃ結合たんぱく質を含む。このようなアフィニティークロマトグラフィーの樹脂は市販されており、容易に入手することが可能である。溶出液中に含まれる、除去すべき夾雑物としては、ＨＣＰ、ＤＮＡ、ウィルス、エンドトキシン、遊離プロテインＡ、プロテインＡと抗体との間で形成された複合体、抗体の凝集体などが含まれる。
アフィニティークロマトグラフィー工程前の溶液を、本実施の形態の多孔質吸着膜を用いてろ過してもよい。

（ａ）のろ過形態であるフロースルーモードを実施する場合には、混合溶液を本実施の形態の多孔質吸着膜によりろ過を行うが、素通りした画分を精製された抗体の溶液として回収する。この場合、抗体の大半は、吸着されることなく素通りするが、夾雑物は吸着により除去される。フロースルーを得るための条件は、精製すべき抗体の性質、例えば電荷及び電荷分布に依存するが、本実施の形態の多孔質吸着膜を用いることにより、リガンド比率を任意に制御することができるため、混合溶液のｐＨや電気伝導度などの調節によって、当業者が容易に条件を設定することができる。

（ｂ）のろ過形態である結合モードを実施する場合にも、抗体を含む溶液を本実施の形態の多孔質吸着膜によりろ過を行うが、この場合には、抗体のみあるいは、抗体と一部の夾雑物が吸着される。この場合も、所望の物質を結合させるための条件は、本実施の形態の多孔質吸着膜を用いることにより、リガンド比率を任意に制御することができるため、例えば溶液のｐＨや電気伝導度などの調節によって、当業者が容易に条件を設定することができる。
抗体のみを吸着した場合には、溶液を通液した後に多孔質吸着膜から吸着物を除去しない緩衝液によって洗浄し、その後に吸着物に対する溶出緩衝液を通液することにより、精製された目的の抗体を溶出画分として得る。
吸着物として、抗体と夾雑物を共に吸着した場合には、それらの溶出条件の違いを利用して、抗体のみを溶出した画分を得ることにより、精製された目的の抗体を得る。

本実施の形態の多孔質吸着膜はアニオン交換基と疎水性基を共にグラフト鎖に導入するため、アニオン交換基と疎水性基の比率を任意に制御することができる。従って、既存のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に比べて、当業者にとっては目的とする用途に応じて、溶液並びに緩衝液のｐＨや電気伝導度の調整が容易である。また、樹脂を充填するカラムプロセスに比べて、高流速で溶液を通液できるため、精製に要する処理時間を大幅に短縮することが可能である。

以下、実施例及び比較例に基づいて本実施の形態をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例のみに限定されない。

フェニルアミノ基とＤＥＡ基が固定された多孔質吸着膜
(実施例１）
（ｉ）多孔質中空糸へのグラフト鎖の導入
外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、最大細孔径が０．３μｍのポリエチレン多孔質中空糸を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス反応管に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。ここに４０℃に調整したグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）３体積部、メタノール９７体積部よりなる反応液を多孔質中空糸１質量部に対し２０質量部注入した後、１２分間密閉状態で静置してグラフト重合反応を施し、多孔質中空糸にグラフト鎖を導入した。
反応液は予め窒素でバブリングして、反応液内の酸素を窒素置換した。
グラフト重合反応後、反応管内の反応液を除去した。次いで、反応管内にジメチルスルホキシドを入れて多孔質中空糸を洗浄することにより、残存したグリシジルメタクリレート、そのオリゴマー及び多孔質中空糸に固定されなかったグラフト鎖を除去した。
洗浄液を除去した後、さらにジメチルスルホキシドを入れて２回洗浄を行った。メタノールを用いて同様にして洗浄を３回行った。洗浄後の多孔質中空糸を乾燥し、重量を測定したところ、グラフト鎖が導入されたポリエチレン多孔質中空糸の重量はグラフト鎖導入前の１５０％であり、下記式（１）で算出される、基材重量に対するグラフト鎖の重量の比として定義されるグラフト率（ｄｇ）は５０％であった。

ここでｗ_０は反応前のポリエチレン多孔質中空糸の重量、ｗ_１はグラフト鎖が導入されたポリエチレン多孔質中空糸の重量である。
５０％のグラフト率は下記式（２）によって算出される、基材ポリエチレンの骨格単位であるＣＨ_２基（分子量１４）のモル数に対する導入されたＧＭＡ（分子量１４２）のモル数が４．９２％であることに相当する。

固体ＮＭＲ法により、グラフト反応後の多孔質中空糸中のポリエチレン骨格単位ＣＨ_２基のモル数と、グラフト鎖を構成するＧＭＡに特有なエステル基（ＣＯＯ基）のモル数の比を測定した。
測定はグラフト反応後の多孔質中空糸を凍結粉砕した粉末サンプル０．５ｇを用いて、Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ社製ＤＳＸ４００を使用し、核種を^１３Ｃとして、Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ法（ＨＰＤＥＣ法）の定量モードにより、待ち時間１００ｓ、積算１０００回の条件で、室温下で測定を行った。
得られたＮＭＲスペクトルのエステル基に対応するピーク面積と、ＣＨ_２基に対応するピーク面積との比が、ＧＭＡとＣＨ_２基のモル数の比に対応することから、測定結果よりＣＨ_２基のモル数に対する導入されたＧＭＡのモル数を算出したところ、４．９％と得られた。これはグラフト率４９．７％に相当し、グラフト反応後のサンプルを固体ＮＭＲ法で測定することにより、グラフト率が得られることが示された。

（ｉｉ）疎水性基（フェニルアミノ基）のグラフト鎖への固定
乾燥した、グラフト鎖を導入した多孔質中空糸をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水で置換した。０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液９７質量部、アニリン３質量部の混合溶液を調整し、フェニルアミノ基導入の反応原液を作成した。ガラス反応管にグラフト反応後の多孔質中空糸を乾燥重量で１質量部、さらにフェニルアミノ基導入のための反応原液２０質量部、純水２０質量部を入れ、攪拌後３０℃に調整した。ガラス反応管を密閉して２５時間静置し、グラフト鎖のエポキシ基を開環し、フェニルアミノ基を導入した。
反応後の多孔質中空糸を純水で十分洗浄し、真空乾燥後の重量を測定することにより、多孔質中空糸においてグラフト鎖の有するエポキシ基の４０％が反応し、フェニルアミノ基が導入されていることが示された。
ここで、フェニルアミノ基の置換率Ｔ_ｐは導入反応前のエポキシ基のモル数Ｎ_０のうち、フェニルアミノ基に置換されたモル数Ｎ_ｐとして下記式（３）で算出した。

Ｍ_１はアニリンの分子量（９３．１３）、ｗ_０はグラフト重合反応後の多孔質中空糸の重量、ｗ_１はフェニル基置換反応後の多孔質中空糸の重量、ｄｇはグラフト率、Ｍ_０はＧＭＡの分子量（１４２）である。

（ｉｉｉ）アニオン交換基（ＤＥＡ基）のグラフト鎖への固定
乾燥した、疎水性基を固定した多孔質中空糸をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。ジエチルアミン５０体積部、純水５０体積部の混合溶液よりなる反応液を調整した。ガラス反応管に（ｉｉ）で疎水性基を導入した後水置換した多孔質中空糸、及び疎水性基導入後の多孔質中空糸の乾燥重量に対して４０質量部の反応液を入れ、３０℃に調整した。ガラス反応管を２０時間静置して、多孔質中空糸のグラフト鎖の残存するエポキシ基を開環して、ジエチルアミノ基と水酸基に置換することにより、アニオン交換基としてジエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を得た。
反応後の中空糸多孔膜を純水で十分洗浄し、真空乾燥後の重量を測定することにより、中空糸多孔膜においてグラフト反応直後のグラフト鎖の有するエポキシ基の４６％がジエチルアミノ基によって置換されていることが示された。
ここで置換率ジエチルアミノ基の置換率Ｔ_ｄはエポキシ基のモル数Ｎ_０のうち、ジエチルアミノ基に置換されたモル数Ｎ_ｄとして下記式（４）で算出した。

Ｍ_２はジエチルアミンの分子量（７３．１４）、ｗ_０はグラフト重合反応後の中空糸多孔膜の重量、ｗ_１はフェニル基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、ｗ₂はジエチルアミノ基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、ｄｇはグラフト率、Ｍ_０はＧＭＡの分子量（１４２）である。

疎水性基であるフェニルアミノ基とアニオン交換基であるジエチルアミノ基を共に固定したグラフト鎖を有する中空糸多孔膜において、導入されたリガンドの内、ジエチルアミノ基の占める比率Ｌ_ｄは、下記式（５）で算出され、５３％であった。

（実施例２）
実施例１の（ｉｉ）において、ガラス反応管に入れるフェニルアミノ基導入の反応原液を４０質量部、純水を０質量部とした以外は、実施例１と同じ操作を実施した。得られた中空糸多孔膜のＴ_ｐは７６％、Ｔ_ｄは１２％であり、Ｌ_ｄは１４％であった。

（実施例３）
実施例１の（ｉｉ）において、ガラス反応管に入れるフェニルアミノ基導入の反応原液を２８質量部、純水を１２質量部とした以外は、実施例１と同じ操作を実施した。得られた中空糸多孔膜のＴ_ｐは５９％、Ｔ_ｄは２９％であり、Ｌ_ｄは３３％であった。

（実施例４）
実施例１の（ｉｉ）において、ガラス反応管に入れるフェニルアミノ基導入の反応原液を１６質量部、純水を２４質量部とした以外は、実施例１と同じ操作を実施した。得られた中空糸多孔膜のＴ_ｐは３２％、Ｔ_ｄは５５％であり、Ｌ_ｄは６３％であった。

（実施例５）
実施例１の（ｉｉ）において、ガラス反応管に入れるフェニルアミノ基導入の反応原液を１２質量部、純水を２８質量部とした以外は、実施例１と同じ操作を実施した。得られた中空糸多孔膜のＴ_ｐは２１％、Ｔ_ｄは６７％であり、Ｌ_ｄは７６％であった。

（実施例６）
実施例１の（ｉｉ）において、ガラス反応管に入れるフェニルアミノ基導入の反応原液を８質量部、純水を３２質量部とした以外は、実施例１と同じ操作を実施した。得られた中空糸多孔膜のＴ_ｐは１３％、Ｔ_ｄは７７％であり、Ｌ_ｄは８６％であった。

（実施例７）
実施例１の（ｉｉ）において、ガラス反応管に入れるフェニルアミノ基導入の反応原液を４質量部、純水を３６質量部とした以外は、実施例１と同じ操作を実施した。得られた中空糸多孔膜のＴ_ｐは６％、Ｔ_ｄは８５％であり、Ｌ_ｄは９４％であった。

（実施例８）
実施例１の（ｉｉ）において、ガラス反応管に入れるフェニルアミノ基導入の反応原液を２質量部、純水を３８質量部とした以外は、実施例１と同じ操作を実施した。得られた中空糸多孔膜のＴ_ｐは３％、Ｔ_ｄは８６％であり、Ｌ_ｄは９６％であった。

実施例１から８の結果を表１に示す。このように反応条件により、アニオン交換基と疎水性基の比率を任意に制御することができることが示された。

フェノキシ基とＤＥＡ基が固定された多孔質吸着膜
（実施例９）
実施例１の（ｉ）で作成したグラフト鎖を導入した多孔質中空糸をガラス反応管に入れ、ここに実施例１の（ｉｉｉ）で用いたＤＥＡ基導入のための反応液を、多孔質中空糸の乾燥重量に対して３０質量部入れて密閉し、３０℃に保持したままの状態で４時間静置した。その後、多孔質中空糸を純水で十分洗浄したのち、乾燥し重量を測定した。実施例１と同様にして反応前後の多孔質中空糸の重量から算出したところ、グラフト鎖の有するエポキシ基の７７％がＤＥＡ基に置換されていた。この多孔質中空糸をメタノールを用いて膨潤後に純水で置換した。０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液中９０．６質量部、フェノール９．４質量部の混合溶液を調整してフェノキシ基導入反応液とし、ガラス反応管にＤＥＡ基を導入した多孔質中空糸と、この反応液を多孔質中空糸の乾燥重量の３０質量部入れて、容器を閉じ、８０℃にて２０時間静置した。反応後中空糸多孔膜を取り出し、純水で十分洗浄した後に乾燥重量を測定し、実施例１と同様にして反応前後の中空糸多孔膜の重量から算出したところ、グラフト反応直後のグラフト鎖の有するエポキシ基の１４％が、フェノキシ基に置換されていた。これによりグラフト鎖を有する中空糸多孔膜にＤＥＡ基とフェノキシ基の両方を固定した。導入されたリガンドの内、ＤＥＡ基の占める比率Ｌ_ｄは８４％であった。

ブチルアミノ基とＤＥＡ基が固定された多孔質吸着膜
(実施例１０)
ｎ−ブチルアミン７．３質量部、純水９２．３質量部からなる混合溶液を調整してブチルアミノ基導入反応溶液とした。実施例９において、フェノキシ基導入反応液に替えてこのブチルアミノ基導入反応液を用い、３０℃にて２０時間静置した以外は、実施例９と同様にして、多孔質中空糸に反応を行った。得られた中空糸多孔膜はグラフト鎖の有するエポキシ基の８０％がＤＥＡ基に、１４％がブチルアミノ基に置換されており、導入されたリガンドの内、ＤＥＡ基の占める比率Ｌ_ｄは８５％であった。

フロースルーモードによる夾雑物の吸着除去
（実施例１１）
（ｉｖ)抗体含有細胞培養液の調製
無血清培地にて培養したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養液（電気伝導度８．７ｍＳ／ｃｍ、細胞密度１．１×１０^７／ｍＬ）１９６ｍＬに抗体５０ｍｇ／ｍＬを含むヒトγ−グロブリン溶液（ベネシス社、ヴェノグロブリン）４ｍＬを添加し、０．４５μｍの精密ろ過膜（ザルトリウス製、ミニザルト１６５５５Ｋ）を透過させることにより、ｐＨ７．４で抗体１ｍｇ／ｍＬを含有する細胞培養液を調製した。
得られた細胞培養液中の代表的な夾雑物であるＨＣＰ濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＣＨＯ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔの９６ウェルプレートに細胞培養液を滴下し、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩ９６のプレートリーダーを用いてＨＣＰ濃度を測定した。その結果、細胞培養液中のＨＣＰ濃度は、３４６μｇ／ｍＬであった。
他の代表的な夾雑物であるＤＮＡの定量は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて評価する細胞培養液を処理した後、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）フルオロメーターを用いて行った。その結果、細胞培養液中のＤＮＡ濃度は７３４０ｎｇ／ｍＬであった。

（ｖ）プロテインＡカラムを用いた抗体精製
（ｉｖ）で得られた抗体含有細胞培養液２５ｍＬを０．２μｍ除菌膜（ザルトリウス製、Ｍｉｎｉｓａｒｔ ｐｌｕｓ）に通液した後、２０ｍｍｏｌ／Lのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬで平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰ １ｍｌ）に１０ｍＬ添加し、抗体を吸着させた。カラムに上記緩衝液２０ｍＬを通液して洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Lのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を１０ｍＬ通液して、抗体を溶出回収した。得られた溶出回収液に、ほぼ等量の１０ｍｍｏｌ／Lリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し中和した後、少量の１．５ｍｏｌ／LのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出回収液をｐＨ８．０に調整し、抗体の精製液２０ｍｌを得た。精製液はプロテインＡカラムに通液する前に対して２倍希釈されている。
得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度を（ｉｖ）と同様にして測定した結果、２．９３μｇ／ｍＬであった。また、（ｉｖ）と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、６３．２ｎｇ／ｍＬであった。さらに、得られた溶出回収液を、２０ｍＭ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体の吸光係数１．３を用いてＬａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則に従って濃度を求めたところ、０．４５ｇ／Ｌであり、２倍希釈されていることから、得られた抗体のアフィニティークロマトグラフィー後の回収率は９０％であった。

（ｖｉ）ＤＥＡ基とフェニルアミノ基が固定された多孔質吸着膜による夾雑物除去
実施例１で得られた中空糸多孔膜を用いて、膜体積０．５４ｍｌ、膜面積６．４ｃｍ^２のモジュールを作成した。このモジュールに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を２０ｍｌ通液して平衡化した後、（ｖ）で得られたアフィニティークロマトグラフィー後の抗体の精製液を２０ｍｌ通液し、フロースルーにて得られる画分を回収した。得られたフロースルー回収液中のＨＣＰ濃度を（ｉｖ）と同様にして測定した結果、３０ｎｇ／ｍＬであり、フロースルーによりＨＣＰ含有量は約１００分の１に低下した。また、（ｉｖ）と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、検出限界（１０ｎｇ／ｍＬ）以下であった。さらに、得られた回収液を２０ｍＭ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体の吸光係数１．３を用いてＬａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則に従って濃度を求めたところ、０．８９ｇ／Ｌであり、抗体が中空糸多孔膜には吸着されないことを示していた。
中空糸多孔膜を用いることにより、夾雑物を有効に除去し、速やかに抗体を精製することが可能であった。

本発明により、アニオン交換基と疎水性基によるたんぱく質との相互作用をより広い範囲で得るための、リガンド構造の制御が容易な混合リガンドを有する多孔質吸着膜を得ることができる。アフィニティークロマトグラフィー工程後の中間精製において、ＨＣＰ、凝集体などの夾雑物を有効にかつ迅速に除去することができるので、本発明は、細胞培養液に含まれる目的たんぱく質の精製において産業上の利用可能性を有する。

Claims (9)

1. 細孔を有する基材からなる多孔質吸着膜であって、
   前記基材表面にリガンドとしてアニオン交換基と疎水性基とが、共に固定されている多孔質吸着膜。
2. 前記基材表面に、前記アニオン交換基と前記疎水性基とがグラフト鎖を介して共に固定されている、請求項１に記載の多孔質吸着膜。
3. 前記アニオン交換基と前記疎水性基とがグラフト鎖を介して共に固定されている構造が、
   （１）前記アニオン交換基とそれに隣接する水酸基よりなる構造、及び
   （２）前記疎水性基とそれに隣接する水酸基よりなる構造である、請求項２に記載の多孔質吸着膜。
4. 前記アニオン交換基が、ジエチルアミノ基及びトリメチルアンモニウム基からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１から３のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
5. 前記疎水性基がフェニルアミノ基、フェノキシ基、ブチルアミノ基、及びブトキシ基からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１から４のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
6. 前記グラフト鎖がメタクリル酸グリシジルの重合体である、請求項１から５のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
7. 前記多孔質吸着膜の基材がポリエチレン及びポリフッ化ビニリデンからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１から６のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
8. 前記多孔質吸着膜が中空糸多孔膜である、請求項１から７のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
9. 目的とするたんぱく質と夾雑物とを含む混合溶液から目的とするたんぱく質を精製する方法であって、
   請求項１から８のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜を用いてろ過し、夾雑物を除去する、たんぱく質の精製方法。

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