JP6730949B2 - 生体高分子ユニットおよびウイルスを液体から分離するための方法 - Google Patents
生体高分子ユニットおよびウイルスを液体から分離するための方法 Download PDFInfo
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Description
標的タンパク質を含むろ液への粒子の望ましくない放出に関して、該方法の第一工程における珪藻土の使用は問題となり得る。
特に、本発明は、以下の工程を含む、液体から生体高分子集合体およびウイルスを除去するための方法を提供する:
(b)工程(a)からの液体を100〜1000kDの分画分子量を有する少なくとも1つの膜を介してろ過すること、ここで液体中のウイルス含有量は、工程(a)を行う前のウイルス含有量に対して、少なくとも99.9%低減される。
例
以下の例において、ろ過容量Vmaxは、フィルターが100%詰まった時のろ過容量の漸近値であり、Ho et al., Journal of Colloid and Interface Science 232, 389-399 (2000)(式1):
式中、tはろ過時間、Vはろ過量、Vmaxはろ過容量およびQ0は定圧ろ過の場合の初期流量を指す。
タンパク質溶液中のモノクローナル抗体は、細胞株CHO dg44 ST1−C6由来であり、以下の方法により利用可能にした:
まず、標的タンパク質が産生された細胞培養を用意した。培養は、25Lの培養容量および密度5×105細胞/mLの接種細胞および増殖培地プロCHO5(Lonza BE12-766P)で、Biostat(登録商標) CultiBag RM single-use bioreactor (Sartorius Stedim Biotech GmbH)を使用して、当業者に公知の通常の条件下で行った。
比較例1のろ過は、工程(a)において、ポリエーテルスルホン膜Sartopore(登録商標)2(孔径0.1μm、面積17.5cm2、Sartorius Stedim Biotech GmbH)に置き換えて、0.2μmの孔径を有する微多孔ポリアミド膜を使用した例1と同様に行った。工程(b)において、工程(a)からのろ液を通常通り、すなわち1barで、1層のウイルス保持膜、Virosart(登録商標)CPV Minisart(面積5cm2、Sartorius Stedim Biotech GmbH)を通して全量ろ過方式でろ過した。
ろ過には、リン酸緩衝液、pH6.6(Sigma Aldrich、カタログ番号P8165)、およびEDTA(Sigma Aldrich、カタログ番号E6758)で、10g/Lのタンパク質濃度および10mM EDTAに希釈したヒトIgGタンパク質の溶液(5%強度溶液、SeraCare、カタログ番号HS−475−1L)を使用した。工程(a)において、溶液を、微多孔膜(孔径0.1μm、外部面積7cm2)形態のナイロン6から構成された多孔質のポリアミド表面と、外部表面に垂直なろ過によって接触させた。続いて、工程(b)において、工程(a)からのろ液を2barで、2層Virosart(登録商標)CPV Minisartウイルスフィルター(面積5cm2、Sartorius Stedim Biotech GmbH)を通して通常通りろ過した。
比較例2は、例2と同様に行ったが、工程(a)において、例2からの多孔質ポリアミド表面をポリエーテルスルホン膜Sartopore(登録商標)2(孔径0.1μm、面積17.5cm2、Sartorius Stedim Biotech GmbH)と置き換えた。
この媒体の場合において、第一工程におけるポリアミド表面の使用は、微多孔性ポリエーテルスルホン膜の使用に対して、ろ過容量を約2倍増大させる。
例1に記載されたとおりにタンパク質溶液を調整し、濃度を10g/Lに調整した。pHをクエン酸(Sigma Aldrich、カタログ番号C2404)およびトリス塩基(2−アミノ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオール、Sigma Aldrich、カタログ番号T1503)を用いて緩衝液組成を変化させて、pH=6.0および9.0にそれぞれ調整した。
例4はわずかに変更した形態で例1の繰り返しを示しており、加えて、本発明の方法によるウイルスの枯渇を実証している。
細胞株CHO dg44 ST1−C6由来のモノクローナル抗体のタンパク質溶液を例1に記載したとおり調製した。しかしながら、ろ過媒体として使用する前に、タンパク質溶液をPP7バクテリオファージ、小型の非エンベロープウイルスの認識モデル系、と混合し、10g/Lのタンパク質および4.5×107pfu/mLの(プラーク形成単位)のバクテリオファージを含有する溶液とした。ろ過は、実施例1と同様に2回行ったが、少なくとも2.0barの差圧で行った。
Claims (6)
- 液体から生体高分子集合体およびパルボウイルスを除去するためのシステムであって、
(a)微多孔膜を備える多孔質のポリアミド含有成形体(その内部表面および外部表面は、成形体のベース材料と同じ化学的および物理的特性を有し、0.5μmより小さい孔径を有する)を介して生体高分子集合体およびパルボウイルスを含む液体をろ過するための第一のろ過手段、ここでペプチド、タンパク質、核酸の二量体、三量体および多量体の群またはそれらの混合物から選択される生体高分子集合体は吸着によって液体から選択的に枯渇され、一方、パルボウイルスは成形体を透過する;および
(b)第一のろ過手段からの液体を100〜1000kDの分画分子量を有する少なくとも1つの膜を介してろ過するための第二のろ過手段、ここで液体中のパルボウイルス含有量は、第一のろ過手段を行う前のパルボウイルス含有量に対して、少なくとも99.9%低減される、
を含み、かつ前記パルボウイルスを凝集させる手段を含まない、前記システム。 - 多孔質のポリアミド含有成形体が、5種以下の異なる繰り返し単位を有する脂肪族および/または芳香族ポリアミドを含む、請求項1に記載のシステム。
- 多孔質のポリアミド含有成形体が、ナイロン−6および/またはナイロン−6,6を含む、請求項1または2に記載のシステム。
- 第二のろ過手段において使用される膜が、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエテン、ポリアミド、ポリイミド、ポリフッ化ビニリデン、セルロース、セルロース誘導体またはそれらの混合物を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のシステム。
- 第一および第二のろ過手段中の液体のpHが、5〜9である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のシステム。
- 液体が、血漿生成物、細胞培養から得られたタンパク質溶液、動物もしくは植物生産物の抽出から得られたタンパク質溶液、または微生物から得られたタンパク質溶液を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のシステム。
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