CN113784973A - 过滤 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从进料流体中去除颗粒的方法，该方法包括：使所述流体通过具有5至20μm厚度的第一过滤介质，其中对于具有约10至约40nm直径的颗粒，使进料流体通过第一过滤介质提供大于或等于1的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于直径大于约40nm的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)；以及使所述流体通过具有20至70μm(例如20至45μm)20至45pm厚度的第二过滤介质，其中对于具有约10至约40nm直径的颗粒，使所述进料流体通过所述第二过滤介质提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于具有大于或等于约40nm直径的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)；以便在每种介质上保留至少一部分颗粒，以产生含有比进料流体低的颗粒浓度的滤液。

Description

过滤
技术领域
本发明涉及通过使用多种过滤介质从进料流体中去除颗粒的方法，包括多种过滤介质的组件，以及这种组件在从进料流体中去除颗粒的用途。
背景技术
蛋白质具有各种独特的生物活性功能，使它们成为有价值的治疗和营养品。然而，源自组织培养物、人血浆、动物或植物的所有基于蛋白质的产品都具有病毒污染的风险，这可能是内源性的或外源性的。因此，确保基于蛋白质的治疗产品的纯度以及进而安全性是其营销的先决条件。尤其是，病毒去除过滤是基于蛋白质的药物制造过程中的既定且关键的工艺。在某些情况下，病毒去除过滤是整个生物加工中单一最昂贵的单元操作。
可以通过若干种手段从流体中去除病毒，包括过滤(如深度过滤或表面筛选)、分配和分馏(例如离心)、以及层析法(例如离子交换、亲和或凝胶渗透层析)。或者，流体中的病毒可以通过化学手段(例如离液剂、低pH值环境、溶剂和洗涤剂)或物理手段(例如提供热量和/或辐射)灭活。然而，特别是物理手段的使用常常与流体中其他成分的不希望有的损坏相关联。此外，一些病毒很难通过化学手段灭活，并且变得对去活化具有抵抗力，例如呼肠孤病毒或SV40。特别具有挑战性的是小尺寸非包膜病毒，例如细小病毒。另外，即使病毒被化学去活化，病毒标志物仍保留在溶液中，这使得去活化过程的质量保证和验证变得麻烦。因此，过滤尤其是尺寸排除过滤是从流体中去除病毒的优选方式，因为它既是非破坏性的，即不损害感兴趣的生物样品的完整性，又是非干扰性的，即不会引起免疫反应。
大多数病毒具有的粒径在18到300nm之间。为方便起见，病毒通常分为两组：大型病毒(具有40nm以上直径的那些)和小型病毒(具有18至40nm范围内的直径的那些)。因此，大多数蛋白质通常具有低于18nm的粒径，即小于最小的病毒，尽管也存在一些非常大的蛋白质。从产业角度来看，大量有用的蛋白质(重组和血浆来源的)特征是粒径≤15nm。
病毒清除过滤器通常以非常窄且明确的孔径分布(pore size distribution)为特征，这允许它们排斥所有类型的病毒和其他微生物，同时确保蛋白质或多或少不受阻碍地通过。在nm范围内控制孔径分布在技术上是困难的。此外，病毒清除过滤器需要广泛的完整性测试和验证，因此它们的价格非常高，目前的上市价格高达8,000USD/m2。考虑到制造基于蛋白质的药物的成本，目前病毒清除过滤的价格约为30,000-40,000USD/kg重组蛋白。在这种情况下，生物加工中使用的病毒清除过滤器是一次性产品。
使用尺寸排除过滤器的主要缺点之一是它们在操作过程中容易结垢，这可导致产品回收率的损失和/或需要定期更换过滤器。
尺寸排除过滤器在结垢方面的行为很难预测，因为诸如缓冲液的pH值和离子强度、蛋白质特性和浓度、以及施加的跨膜压力的处理参数可能会极大地影响产品的收率。
尺寸排除过滤器的结垢大大缩小了过滤器的使用寿命，并可能要求过滤器尺寸过大，以应对生物过程。后者导致制造成本增加。
为试图减少结垢的影响，当前的过滤过程通常包括使用孔径为0.1至0.2μm的膜的(有时是多个)预过滤步骤，以便去除不希望有的高分子量蛋白质杂质、未折叠蛋白质和/或蛋白质聚集体。然而，使用这种预过滤步骤的缺点是低于0.1μm的杂质仍可能少量污染产品并导致过滤器结垢。在文献中，这些低于0.1μm的杂质有时被称为可溶性聚集体，与保留在灭菌级0.1至0.2μm膜上的不溶性蛋白质聚集体相对。通常认为去除少量可溶性聚集体是生物加工过程中最大的挑战之一。
或者，为了去除可溶性聚集体，通常还利用使用吸附性深度过滤器的预过滤步骤。这种预过滤器可由带有硅藻土的纤维素纤维构成。文献中有充分记载的是，这些预过滤器在病毒去除过滤过程中提高了产品收率。然而，由于它们以吸附原理工作，因此这些深度过滤器可能对pH值和缓冲强度变化很敏感。它们进一步依赖于接触时间并且它们很昂贵。
现有技术包括使用吸附性深度过滤器以及带电或表面改性的微滤(MF)膜从蛋白质溶液中去除高分子量杂质和/或聚集体，以提高病毒过滤器的性能。
然而，尽管使用了预过滤步骤，但由于少量可溶性聚集体、高分子量蛋白质杂质或未折叠蛋白质造成的过滤器结垢仍然是个主要问题，这会导致成本增加、材料使用增加和产品收率降低。还应该提到的是，这些不希望有的污染物可能具有免疫原性，从而导致不想要的不良临床反应。
因此，需要一种用于过滤进料流体的改进方法，其消除或显著减少可溶性蛋白质聚集体、高分子量杂质和未折叠蛋白质的量。
发明内容
本发明人惊奇地发现，通过首先使流体通过具有5至20μm厚度的第一过滤介质，例如具有20至70μm(例如20至45μm)厚度的更细的第二过滤介质的结垢被减小到超出预期并且第二过滤介质的寿命被延长，第一过滤介质为具有低于或等于约40nm直径的颗粒提供大于或等于1的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于直径大于或等于约40nm的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)；第二过滤介质为具有约10至约40nm直径的颗粒提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，对于具有大于或等于约40nm直径的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率对数减少值(LRV)。
本发明人还惊奇地发现，通过首先使流体通过具有5至20μm厚度和使得模态孔径在10到25nm范围内的孔径分布的第一过滤介质，更细的第二过滤介质的结垢被减小到超出预期并且第二过滤介质的寿命被延长，第二过滤介质例如是具有20到70μm(例如20到45μm)厚度和使得模态孔径在10至25nm范围内的孔径分布的过滤介质。虽然不完全清楚这种令人惊奇的效果如何是可能的，但与第一种过滤介质相比，由于第二种过滤介质中孔隙网络的弯曲度增强，因此发明人推测是在过滤器的深度中颗粒滞留的重要性。
发明详述
根据本发明的第一方面，提供一种从进料流体中去除颗粒的方法，该方法包括：
使所述流体通过具有5至20μm厚度的第一过滤介质，其中对于具有低于或等于约40nm直径的颗粒，使所述进料流体通过所述第一过滤介质提供大于或等于1的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于直径大于或等于约40nm的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率对数减少log10减少值(LRV)；以及
使所述流体通过具有20至70μm(例如20至45μm)厚度的第二过滤介质，其中对于具有约10至约40nm直径的颗粒，使所述进料流体通过所述第二过滤介质提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于具有大于或等于约40nm直径的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)；以便在每种介质上保留至少一部分颗粒，以产生含有比进料流体低的颗粒浓度的滤液。
在另一方面，本发明提供一种从进料流体中去除颗粒的方法，该方法包括：
使所述流体通过具有5至20μm厚度的第一过滤介质，其中对于具有低于或等于约40nm直径的颗粒，使所述进料流体通过所述第一过滤介质提供大于或等于1的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于直径大于或等于约40nm的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率对数减少log10减少值(LRV)；以及
使所述流体通过第二过滤介质，其中对于具有约10至约40nm直径的颗粒，使所述进料流体通过所述第二过滤介质提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于具有大于或等于约40nm直径的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)；以便在每种介质上保留至少一部分颗粒，以产生含有比进料流体低的颗粒浓度的滤液。在这个方面，第二过滤介质可包括多孔材料，例如合成或半合成聚合物(例如聚偏二氟乙烯(PVDF)、铜铵再生纤维素、醋酸纤维素、聚乙烯砜(PES)、聚碳酸酯)和多孔陶瓷材料。
优选地，第一过滤介质具有的孔径分布使得模态孔径在10至30nm(优选10至25nm)的范围内，以及第二过滤介质具有的孔径分布使得模态孔径在10至25nm的范围内。
根据本发明的另一个方面，提供一种从进料流体中去除颗粒的方法，所述方法包括使流体通过第一过滤介质，其具有5至20μm的厚度以及使得模态孔径在10至30nm(优选10至25nm)范围内的孔径分布；以及使所述流体通过第二过滤介质，其具有20至70μm(例如20至45μm)的厚度以及使得模态孔径在10至25nm范围内的孔径分布；以便在每种介质上保留至少一部分颗粒，以产生含有比进料流体低的颗粒浓度的滤液。
关于粒度，术语“直径”和“平均直径”在本文中可互换使用，意思是颗粒的平均直径在限定的极限范围内，其中颗粒可以通过任何常用方法测量，如动态光散射(DLS)、透射电子显微镜(TEM)、散射电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)等。
在本发明的上下文中，发现第一和第二过滤介质特别有用，它们可以单独地是纤维素基过滤器，更优选地，基于滤纸格式的那些。为避免疑问和排除混淆，这里的滤纸意思是由纤维素纤维构成的过滤介质，它们是通过湿法干燥而加工成最终形状，纤维素不会溶解在合适的溶剂或离子液体中。后者意在与通过相转化产生的那些过滤介质相对照，本文称为膜，包括再生纤维素膜。
发明人惊奇地发现，使含有蛋白质的流体通过一连串具有不同厚度但具有可比模态孔径的两种过滤介质，极大地提高了进料流体通过第二过滤介质的吞吐量。特别地，具有5至20μm的厚度的所述第一过滤介质提供了一种特别有用的特性来排斥40nm以上的颗粒，包括未保留在0.1-0.2μm过滤器上的可溶性和不溶性颗粒，并且通常允许通过40nm以下的颗粒；具有20至70μm(例如20至45μm)之间厚度的第二过滤介质提供了一种特别有用的特性，排斥20nm以上的颗粒，包括未保留在第一滤纸上的可溶性和不溶性颗粒。可以通过检查动态光散射方法中的强度粒度分布曲线，来监测对大于等于40nm颗粒的排斥。通过在具有合适孔径的柱子上进行凝胶层析，可以发现额外的确认。更优选地，可以使用单分散微生物探针，例如噬菌体，通过颗粒去除概率log10减少值(LRV)来监测颗粒排斥效率。对于具有低于或等于约40nm直径的颗粒，第一过滤介质提供大于或等于1的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于直径大于或等于约40nm的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，优选在1bar和高达30L/m2负载下操作时；对于具有约15nm直径的颗粒，第二过滤介质提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，优选在1bar和高达30L/m2负载下操作时。
优选地，过滤介质独立地包括纤维素纤维。也就是说，第一和/或第二过滤介质可以包括纤维素纤维。
合宜地，第一和/或第二过滤介质是滤纸。
有利地，纤维素纤维包括直径大于或等于约10nm的初级原纤，例如大于约15nm，例如直径大于20nm，例如从20nm到30nm。
优选地，纤维素纤维源自绿色丝状藻类。更优选地，至少一半的纤维素纤维源自绿色的大型藻类，例如藻类刚毛藻目(algae Cladophorales)和/或藻类管枝藻目(algaeSiphonocladales orders)。甚至更优选地，至少一部分纤维素纤维源自藻类枝藻属(algaeCladophora)或黑孢藻属(Pithophora)物种。
合宜地，至少60％，例如至少70％、至少80％或至少90％的纤维素纤维具有大于15nm的直径，例如大于20nm的直径，例如从20nm到30nm。
优选地，至少一半，例如至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的纤维素具有大于90％的结晶度。
有利地，至少一半纤维素具有至少95％的结晶度。
合宜地，至少60％，例如至少70％、至少80％或至少90％的纤维素具有大于95％的结晶度。
优选地，第一过滤介质的模态孔径为15nm至25nm，例如约16nm、约17nm、约18nm、约19nm、约20nm、约21nm、约22nm、约23nm、或约24nm。有利地，第一过滤介质的小于5％的孔隙量包括大于约50nm的孔，优选地，第一过滤介质基本上不含直径大于约50nm的孔。
有利地，第二过滤介质的模态孔径为15nm至25nm，例如约16nm、约17nm、约18nm、约19nm、约20nm、约21nm、约22nm、约23nm、或约24nm。有利地，第二过滤介质的小于5％的孔隙量包括大于约40nm的孔，优选地，第二过滤介质基本上不含直径大于约40nm的孔。
合宜地，两种介质之间的模态孔径差为约1至约5nm，例如约3nm。
合宜地，第一和/或第二过滤介质的总孔隙率为至少10％，例如至少20％，例如至少大于30％，例如30％至60％，优选30％至50％。
优选地，第二过滤介质比第一过滤介质厚。
有利地，第一过滤介质具有约5至19μm范围的厚度，例如5至15μm。
合宜地，第二过滤介质具有约21至45μm范围的厚度，例如约21至40μm。在颗粒排斥性能比通量更关键的情况下，优选使用具有约35μm或更大厚度的第二过滤介质，例如35μm至45μm，例如35μm至40μm。类似地，在通量与颗粒排斥性能一样关键的情况下，优选使用具有21和35μm之间厚度的第二过滤介质。
令人惊讶地发现，在第二过滤介质的厚度较大的情况下，例如大于35μm，特别是包括在45μm与70μm之间，该膜既有效又具有通量，这使其非常适合部署在连续生物处理方法，其中低流速是优选的。
有利地，在1bar和高达30L/m2负载下操作时，基于模型大尺寸病毒(例如PR772噬菌体)的LRV高于4，第一过滤介质的标称上截止孔径为约90nm，例如约85nm、约80nm、约75nm，并且更优选约70nm。
合宜地，当在至少1bar和高达30L/m2负载下运行时，基于模型小尺寸病毒(例如
Figure BDA0003284722550000063
噬菌体)的LRV高于4，第二过滤介质的标称上截止孔径为约40nm，例如约35nm、约30nm、约25nm且更优选约20nm。
优选地，过滤介质的孔径分布源自Barett-Joiner-Halenda(BJH)N2气体解吸分析(Barrett，E.P.；Joyner，L.G.氮吸附-解吸等温线的测定—多孔固体总孔隙量的估算.Anal.Chem.1951,23,791-792)。
合宜地，log10减少值(LRV)源自
Figure BDA0003284722550000061
方法(G.
Figure BDA0003284722550000062
Naunyn-Schmiedebergs Arch.Exp.Pathol.Pharmakol.,1931,162,480-483)。
有利地，第一和/或第二过滤介质包括载体，优选载体包括纸，例如由植物基纤维素制成的纸。例如，载体包括现有技术的滤纸。合宜地，将支撑层和过滤介质结合到单片多层结构中。
该方法可以包括使进料流体通过第一过滤介质之前通过至少一个预过滤膜的步骤，其中该至少一个预过滤膜具有的孔径分布使得模态孔径大于或等于约100μm，例如约100μm至约200μm，例如大于或等于约200μm。
相反地，该方法可以不包括如上详述的预过滤步骤。
合宜地，颗粒包括聚集体。
颗粒可以是希望有的颗粒或不希望有的颗粒。因此，从进料流体中去除颗粒可以是从不希望有的颗粒中纯化进料流体或从进料流体中分离出希望有的颗粒。
在任一情况下，优选地，该方法产生含有比进料流体更低颗粒浓度的滤液。
优选地，进料流体包括产品，例如蛋白质产品，例如血浆衍生的人蛋白质产品，并且在通过两种介质过滤后该方法产生大于约60％的产品收率，例如通过两种介质过滤后大于约65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的收率。更优选地，在通过两种介质过滤后该方法产生大于约96％、97％、98％或99％的收率。
合宜地，颗粒具有大于或等于约10nm的平均直径，例如大于约12nm、约15nm、约18nm、约20nm、约30nm、约40nm、约100nm或约200nm的平均直径。
优选地，颗粒具有约10nm至约200nm的平均直径，例如约10nm至约100nm。
合宜地，颗粒具有双模态分布或多重模态分布，具有约18nm至约50nm的第一平均直径，例如约20nm至约40nm，以及约50nm至约90nm的第二平均直径，例如约60nm至约80nm。
有利地，颗粒包括蛋白质，例如可溶性和不溶性蛋白质聚集体、高分子量蛋白质杂质(≥200kDa)、未折叠或错误折叠的蛋白质和其他不希望有的杂质，例如细胞碎片、核酸等。
优选地，可溶性蛋白质聚集体具有大于约40nm的平均直径，例如约50nm至约90nm，例如约60nm至约80nm。
有利地，不希望有的颗粒包括微生物，例如病毒。此外，不希望有的颗粒可能包括蛋白质，例如朊病毒(蛋白质)颗粒(PrPs)。例如，不希望有的病毒颗粒通常具有大于约18nm的平均直径，例如约18nm至约50nm，例如约20nm至约40。而不希望有的朊病毒颗粒通常具有约12nm的平均直径。
优选地，颗粒包括蛋白质聚集体、未折叠或错误折叠的蛋白质、PrPs和/或病毒、以及例如细胞碎片、核酸等其他不希望有的杂质的混合物。
在颗粒包括病毒的情况下，优选的是总体方法对于具有约10至约40nm直径的颗粒，提供大于或等于4的病毒去除概率log10减少值(LRV)，例如大于或等于5或6。
有利地，当使进料流体通过第一过滤介质时，这对于具有约10至约40nm直径的颗粒，提供大于或等于1的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，例如大于或等于2、3或4，例如1至4、或1至3、或1至2。
合宜地，当使进料流体通过第一过滤介质时，这对于直径大于或等于约40nm的颗粒，提供大于或等于3或4颗粒去除概率log10减少值(LRV)，例如对于大于或等于约40nm的颗粒，提供大于或等于5的LRV。
优选地，当使进料流体通过第一过滤介质时，这对于大于或等于约50nm、60nm或70nm的颗粒，例如具有50nm至100nm、50nm至90nm和/或50nm至80nm直径的颗粒，提供了大于或等于3或4的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，例如大于或等于5的LRV。
优选地，当使进料流体通过第二过滤介质时，这对于具有约10至约40nm直径的颗粒，提供大于或等于3或4的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，例如对于直径为约10至约40nm的颗粒，提供大于或等于5的LRV。
有利地，当使进料流体通过第二过滤介质时，这对于具有大于或等于约40nm直径的颗粒，提供大于或等于3或4的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，例如对于直径大于或等于约40nm的颗粒，提供大于或等于5的LRV。
合宜地，对于直径大于或等于10nm的颗粒，该方法整体来看提供大于或等于1的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，例如大于或等于2、3、4或5；和/或对于直径大于或等于18nm或20nm的颗粒，该方法提供大于或等于3、4或5的LRV；和/或对于直径大于或等于40nm的颗粒，该方法提供大于或等于5或6的LRV。对于小病毒，优选的是LRV大于或等于3。对于大型病毒，优选的是LRV大于或等于4。对于朊病毒颗粒，优选的是去除的LRV大于或等于1，更优选大于或等于3。
有利地，进料流体在大约3至600kPa的压差下通过过滤介质，从而不损害过滤介质的完整性。压差可以作为顶置压力(例如3至600kPa的顶置压力，例如100至300kPa)或作为吸入压力(例如在3至600kPa的吸入压力下)来施加。
合宜地，本发明的方法可用于纯化血浆来源的人蛋白质，例如但不限于人血清白蛋白(HSA)。
在某些实施例中，第一和第二介质可独立互换。
根据本发明的另一方面，提供一种组件，包括：具有5至20μm厚度的第一过滤介质的，其中对于具有约10至约40nm直径的颗粒，所述第一过滤介质提供大于或等于1的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于直径大于约40nm的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)；以及
第二过滤介质，对于具有约10至约40nm直径的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于具有大于约40nm直径的颗粒，提供大于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)。
优选地，第二过滤介质具有20至70μm(例如20至45μm)的厚度。
优选地，第一过滤介质具有的孔径分布使得模态孔径在10至30nm(优选10至25nm)的范围内，并且其中第二过滤介质具有的孔径分布使得模态孔径在10到25nm的范围内。
在本发明的另一个方面，提供第一过滤介质，其具有5至20μm的厚度以及使得模态孔径在10至25nm之间的孔径分布；以及第二过滤介质，其具有20至45μm的厚度以及使得模态孔径在10至25nm之间的孔径分布。
优选地，组件的过滤介质包括纤维素纤维，其中纤维素纤维可以具有如上文关于本发明的第一方面所描述的纤维素纤维的任何特征。
有利地，组件的第一和第二介质是可独立互换的。
上面关于该方法概述的任何实施方式都可以归于针对适用的组件的实施方式。
根据本发明的另一个方面，提供如上所描述的组件从进料流体中去除颗粒的用途。优选地，该组件用于纯化血浆来源的人蛋白质，例如人血清白蛋白(HSA)。
本发明提供一种从单体蛋白质溶液中去除不希望有的蛋白质聚集体和/或高分子量杂质的方法，导致增加的产品收率、稳定的通量和高的病毒去除效率。优选地，该方法包含使用基于纳米纤维素的过滤介质去除聚集体的两步过程。在本文中，第一过滤介质被设计成从单体蛋白质溶液中去除高分子量杂质，而第二过滤介质允许高的产品收率。
这种方法可以防止较细的第二过滤介质超预期的快速结垢。更详细地说，当使用孔径大小为0.1至0.2μm的常用预过滤器时，用于去除病毒的较细介质仍然会经历快速结垢。
然而，本发明人惊奇地发现，如上所概述的，使用第一过滤介质延长了第二过滤介质的寿命远远超过预期。这是令人惊讶的，因为第一过滤介质的模态孔径不足以不同到拒绝较大颗粒通过。因此，基于模态孔径分布，第一过滤介质有效地从不希望有的污染物中纯化进料溶液的能力是完全出乎意料的。然而，如下所详述，使用串联的第一过滤介质超出期望的显著延长了第二过滤介质的寿命，并且跨越所分析的负载容量证实了第二过滤介质的有限结垢。
因此，这种方法具有许多优点，其包括：
1.由于减少了对常用预过滤器的依赖，增加了产品回收率，而已知的是由于介质成分的非特异性吸附，常用预过滤器会导致产品损失；
2.进料液更快的处理时间；以及
3.由于延长的更细第二过滤介质的使用寿命，从而降低了成本；
4.减少了潜在免疫原性杂质的数量。
关于基于尺寸排除原理，从单体蛋白质中分离可溶性和不溶性蛋白质聚集体、高分子量杂质、未折叠或错误折叠的蛋白质和其他污染物，本发明的实施方式是有用的；从小分子尺寸的活性药物成分中去除病毒，包括与眼科使用相关；去除含有遗传物质的医疗用途的纳米颗粒，其对灭菌很敏感，不仅包括生物系统，例如病毒，还有人工制造的基因传递系统，例如聚合物纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒和/或脂质体。
附图说明
现将参考以下附图描述本发明的实施方式：
图1是显示在1bar下用11μm和22μm基于纳米纤维素的过滤器，在两步过滤过程中使用10g/L HSA溶液的过滤器通量的图。
图2是显示在1bar和3bar下用33μm基于纳米纤维素的过滤器，第二步过滤的比较的图。
图3是显示HSA溶液的动态光散射(DLS)分析的图，代表在1bar下的进料、预滤液11μm和滤液22μm。
图4是三张图，显示了在1bar下10mg/ml HSA进料、预滤液11μm和滤液22μm的尺寸排除凝胶层析
Figure BDA0003284722550000091
的结果。
图5是显示在3bar下用22μm过滤器，ΦX174噬菌体尖峰的10mg/ml HSA滤液的LRV的图。
图6是显示在1bar下用11μm和22μm基于纳米纤维素的过滤器，在两步过滤过程中使用50g/L HAS溶液的过滤器通量的图。
实施例
将参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1
可以通过最常见的血浆来源的人蛋白质其中之一即人血清白蛋白(HSA)来说明本发明。HSA在体内具有多种功能，其中各种疏水性物质的结合和输运特性是其中最重要的功能。HSA也是细胞培养基的重要补充剂，尤其是在细胞治疗中。它可用于细胞疗法的冷冻保存。因此，对于这些应用来说，人血清白蛋白不含病毒和其他病原体是至关重要的。白蛋白是由585个氨基酸组成的单一多肽链，分子量约为65-67kDa。由于大量的硫醇键，该结构紧密卷曲。已经确证，由于二巯基结合和各种疏水相互作用，HSA可能会经受广泛的聚集。为此，HSA是证明本发明的合适的模型蛋白。
市售可得的HSA样品(200mg/ml)购自当地药店。样品用磷酸盐缓冲溶液(PBS)pH7.4稀释至10g/L的浓度。
通过使起始纤维素材料通过高压微流化器(Microfluidics，MA，USA；LM20)以将纤维素纤维束分散成单个纳米纤维，来制备刚毛藻属纤维素分散体(Cladophora cellulosedispersion)。在1800bar的压力下，分散体3次通过200μm的格栅室，1次通过100μm的格栅室。
过滤器的制备如前所述(Manukyan等人，J Mem Sci，Vol.572,2019，464-474)。使用真空过滤装置(Advantec，日本)将稀释的分散体通过介质(Durapore；0.65μm DVPP；Merck Millipore，MA，USA)排出，直到在介质顶部形成纤维素饼。然后，取出湿滤饼，并使用热压机(Carver，IN，USA；4122CE)以取决于过滤器类型的所需温度和时间干燥。为了制备11μm厚的预过滤器，使用1mg/ml纳米纤维素悬浮液50ml，并使用热压机在140℃下将纳米纤维素滤饼干燥40分钟。为了制备22μm厚病毒清除过滤器，使用1mg/mL的纳米纤维素悬浮液100ml，并且使用热压机在80℃下干燥纳米纤维素滤饼24小时。取出干燥过滤器，切成直径为47mm的圆盘。
过滤设置
使用Advantec KST-47(日本)过滤器支架。将通用滤纸盘(直径47mm，Munktell)放置在纳米纤维素过滤器下方作为支撑。通过在连接至LabX软件(版本2.5，Mettler Toledo，瑞士)的分析天平(Mettler Toledo，瑞士)上以20秒的间隔收集流出的液体，以重量分析法监测流速。
预过滤
在第一过滤步骤中使用11μm过滤器。在单片过滤器上验证所述去除。进料溶液是在PBS中稀释的10g/L的HSA，并调节至pH 7.4。在过滤之前用PBS润湿过滤器。在1bar下通过11μm过滤器进行过滤。由于快速结垢，对于通过11μm过滤器的每次过滤，大约25mL通过每个11μm过滤器，对应于14-15L/m2负载容量(图1)。然后，使溶液通过22μm过滤器，观察到很少的污垢。收集渗透部分，混合在一起，并在使用前储存在4℃下。
对50g/L的HAS的进料溶液执行相同的程序。大约10ml通过每个11μm的过滤器，对应于大约7L/m2的负载容量。然后，使溶液通过22μm过滤器，观察到很少的污垢(图6)。
过滤器通量和结垢行为
图1、2和6显示了不同过滤器在不同压力或不同蛋白质浓度下的通量和结垢行为。图1显示，当HSA的10g/L溶液在1bar下通过时，11μm过滤器会迅速结垢。在1bar下的第二次过滤不会导致过滤器结垢并且通量稳定。图2显示，使用11μm预过滤的溶液，即使在3bar下操作，22μm过滤器也不会结垢。在两种压力下均未观察到结垢。图6显示，当HSA的浓度增加到50g/L时，11μm过滤器中的结垢甚至更快。但是，同一溶液通过22μm过滤器的第二次过滤不会导致过滤器结垢，并且在整个实验过程中通量是稳定的。第二次过滤后的蛋白质回收率很高，表明在两步过滤过程中只有轻微的蛋白质损失。
对于1％的HSA溶液，在通过11μm厚的过滤器过滤后获得87％的产物，并且通过22μm过滤的后续步骤回收了85％的产物。对于5％的HSA溶液，回收率分别为94％和93％。
监测粒度分布和去除聚集体
动态光散射
动态光散射(DLS)用于使用Nano ZS仪器(Malvern，UK)评估10g/L的HSA溶液在PBSpH 7.4中的粒度分布，见图3。
Figure BDA0003284722550000111
层析
使用尺寸排除层析(
Figure BDA0003284722550000113
START)仪器对HSA-PBS溶液进行蛋白质纯化。以1ml/min的流速，使用选定的层析柱(Mw 40-20,000kDa；HiPrep 26/60Sephacryl S-500HR，GE，Uppsala，瑞典)。用0.5cV的PBS缓冲液平衡所述柱，然后用3.2ml的1wt.％。在10ml猎鹰管(falcon tubes)中使用峰值分馏收集纯化的溶液，当吸光度≥5mAU时收集分馏物，见图4。
为了解释与第一过滤步骤相比在第二过滤步骤中观察到的提高的吞吐量，进行了DLS和
Figure BDA0003284722550000112
层析。图3显示了图1中呈现的样品的强度粒度分布的结果。可以看出，在通过11μm和22μm过滤器过滤后，无法检测到进料溶液中的第二个峰，其在30与200nm之间的区域中展开。
使用
Figure BDA0003284722550000121
的尺寸排除凝胶层析确认在通过11μm过滤器过滤后从进料溶液中去除了痕量的大分子量部分。
病毒去除过滤
为了进一步说明本发明并确认在预过滤后22μm过滤器保持高病毒去除能力，进行了PFU测试。图5显示了来自10g/L的HSA溶液的ΦX174噬菌体(28nm)的结果。
22μm和11μm过滤器被用于使用单片过滤器的病毒去除研究。在病毒去除过滤之前，病毒激增的进料溶液通过0.2μm过滤器(VWR)进行预过滤。将高度纯化的ΦX174储备溶液以0.1％在PBS中加入到预过滤的10mg/ml的HSA中，调整到具体的pH值。病毒稳定性由取自预过滤的激增的进料溶液的留样控制。在过滤之前用PBS润湿过滤器。
如前所述使用PFU测定法(Manukyan等人，J Mem Sci，Vol.572，2019，464-474)。大肠杆菌噬菌体ΦX174(ATCC 13706-B1TM)、大肠杆菌噬菌体PR772(
Figure BDA0003284722550000122
BAA769B1TM)和宿主细菌大肠杆菌(Migula)Castellani和Chalmers(大肠杆菌)(ATCC 13706)获自ATCC(Manassas,VA,USA)。噬菌体的滴度通过菌斑形成单位(PFU)测定来确定。在Luria-Bertani培养基(LBM)(去离子水中1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中连续稀释进料和渗透物样品，并将100μl稀释的噬菌体与200μl大肠杆菌原料混合。将所得悬浮液与1ml融化的软琼脂混合，倒在制备的硬琼脂平板(55×15mm)的表面上，并在37℃下孵育5小时。将进料滴度调整为约105至106个噬菌体ml-1。当前的实验设计的检出限，即≤0.7PFU ml-1，是指≤5个噬菌体ml-1，对应于一个平板中的单个可检测菌斑，用于未稀释的复样，假设在检出限下，每个菌斑由一个噬菌体产生。病毒保留表示为log10减少值(LRV)。
实施例2
过滤器的标称孔径
ΦX174噬菌体(28nm)和PR772噬菌体(70nm)被用作模型单分散探针以及使用11和33μm过滤器的病毒去除定量。使用对应于26L/m2负载容量的50mL的PBS，在1bar压力下进行测试。在PFU测定之前，收集渗透物样品和留样并在4℃下储存。图5显示了通过第二(33μm)过滤器过滤后获得的LRV值。
菌斑形成单位(PFU)和log10减少值(LRV)
如前所述使用PFU测定法(Manukyan等人，J Mem Sci，Vol.572，2019，464-474)。ΦX174噬菌体的滴度通过菌斑形成单位(PFU)测定来确定。在Luria-Bertani培养基(LBM)(去离子水中1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中连续稀释进料和渗透物样品，并将100μl稀释的噬菌体与200μl大肠杆菌原液混合。作为结果的悬浮液与1ml融化的软琼脂混合，并倒在制备的硬琼脂平板(55×15mm)的表面上，在37℃下孵育5个小时。将进料滴度调整为约105至106个噬菌体ml-1。当前实验设计的检出限，即≤0.7PFU ml-1，是指≤5个噬菌体ml-1，对应于未稀释复样的平板之一中的单个可检测菌斑，假设在检出限下，每个菌斑由一个噬菌体产生。病毒保留表示为log10减少值(LRV)。

Claims (21)

1.一种从进料流体中去除颗粒的方法，所述方法包括：
使所述流体通过具有5至20μm厚度的第一过滤介质，其中对于具有约10至约40nm直径的颗粒，使所述进料流体通过所述第一过滤介质提供大于或等于1的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于直径大于约40nm的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)；以及
使所述流体通过具有20至70μm(例如20至45μm)厚度的第二过滤介质，其中对于具有约10至约40nm直径的颗粒，使所述进料流体通过所述第二过滤介质提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于具有大于或等于约40nm直径的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)；以便在每种介质上保留至少一部分颗粒，以产生含有比所述进料流体低的颗粒浓度的滤液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一过滤介质具有的孔径分布使得模态孔径在10至30nm(优选10至25nm)范围内，以及其中所述第二过滤介质具有的孔径分布使得模态孔径在10和25nm的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述过滤介质包括纤维素纤维。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述纤维素纤维包括直径大于或等于约10nm的初级原纤。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述颗粒包括聚集体、高分子量蛋白质杂质、未折叠或错误折叠的蛋白质。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述颗粒包括蛋白质，例如可溶性和不溶性蛋白质聚集体、高分子量蛋白质杂质、未折叠或错误折叠的蛋白质，和/或蛋白质朊病毒颗粒。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述颗粒包括微生物，例如病毒。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述颗粒具有大于或等于约10nm的直径，例如大于或等于约12nm、约15nm、约18nm、约20nm、约30nm、约40nm、约100nm、或约200nm的直径。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对于具有约10至约40nm直径的颗粒，使所述进料流体通过所述第一过滤介质提供大于或等于2的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，例如大于或等于3或4。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对于直径大于或等于约40nm的颗粒，使所述进料流体通过所述第一过滤介质提供大于或等于4的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，例如对于直径大于或等于约40nm的颗粒提供大于或等于5的LRV。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对于具有约10至约40nm直径的颗粒，使所述进料流体通过所述第二过滤介质提供大于或等于4的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，例如对于直径为约10至约40nm的颗粒提供大于或等于5的LRV。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对于具有大于或等于约40nm直径的颗粒，使所述进料流体通过所述第二过滤介质提供大于或等于4的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，例如对于直径大于或等于约40nm的颗粒提供大于或等于5的LRV。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述流体在大约3至600kPa的压差下通过所述过滤介质。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一介质和所述第二介质是可独立互换的。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在通过所述第一过滤介质之前使所述进料流体通过至少一个预过滤膜的步骤，其中所述至少一个预过滤膜具有的孔径分布使得模态孔径大于或等于约100μm，例如约100μm至约200μm，例如大于或等于约200μm。
16.一种组件，包括：
具有5至20μm厚度的第一过滤介质，其中对具有约10至约40nm直径的颗粒，所述第一过滤介质提供大于或等于1的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于直径大于或等于约40nm的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)；以及
具有20至70μm(例如20至45μm)厚度的第二过滤介质，其中对于具有约10至约40nm直径的颗粒，所述第二过滤介质提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)，并且对于具有大于约40nm直径的颗粒，提供大于或等于3的颗粒去除概率log10减少值(LRV)。
17.根据权利要求16所述的组件，其中所述第一过滤介质具有的孔径分布使得模态孔径在10至30nm(优选10至25nm)的范围内，以及其中所述第二过滤介质具有的孔径分布使得模态孔径在10至25nm的范围内。
18.根据权利要求16或17所述的组件，其中所述过滤介质包括纤维素纤维。
19.根据权利要求18所述的组件，其中所述纤维素纤维包括直径大于约10nm的初级原纤。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的组件，其中所述组件的第一和第二介质是可独立互换的。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的组件用于从进料流体中去除颗粒的用途。
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