CN110563796B - 青稞蛋白质的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种青稞蛋白质的分离纯化方法，其主要包括以下步骤：从青稞米中提取蛋白提取液；葡聚糖醛基化；醛基化的葡聚糖与聚烯丙胺反应制备微凝胶溶液；以异丙醇作为芯液，将制得的微凝胶溶液与芯液通过喷丝头共同挤出，浸入异丙醇凝固浴中进行非溶剂相转化取出干燥，获得中空纤维膜，将一束中空纤维膜制成中空纤维膜组件，利用中空纤维膜组件过滤，过滤完毕后用蒸馏水反向洗涤中空纤维膜组件，洗涤液离心，取沉淀真空冷冻干燥，得到纯化的青稞蛋白质。本发明所述青稞蛋白质的分离纯化方法，方便实用，适用性广，利用微凝胶溶液制成中空纤维膜，再加工成膜组件，对青稞蛋白质进行分离纯化，最终获得的蛋白质纯度高且提取率高。

Description

青稞蛋白质的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及蛋白质的分离纯化方法。更具体地说，本发明涉及一种青稞蛋白质的分离纯化方法。
背景技术
青稞作为我国藏族地区的第一大粮食作物，它不但产量高，而且营养丰富齐全，具有高蛋白质、高纤维、高维生素、低脂肪、低糖等特点，从青稞中分离提取出蛋白质，不仅能够拓宽蛋白质来源，而且还可以解决当地青稞剩余的难题，将当地的资源优势转化为经济优势。
目前，国内外关于植物蛋白质的提取方法有很多，主要有溶液提取法、物理提取法、离子交换法、超滤法和生物酶法等。在植物蛋白研究领域中，有关大豆分离蛋白、菜籽分离蛋白、花生分离蛋白等功能性质的研究文献比较广泛，而青稞作为一种优良的植物蛋白质资源，由于种植区域的限制，国内关于青稞蛋白提取工艺的研究主要集中在碱法提取和酶法提取。但传统的青稞蛋白质提取方法处理量小、能耗高、蛋白提取率较低，且强碱或过度酶解容易造成蛋白质某些功能特性减弱甚至完全丧失，因此在青稞蛋白质提取过程中仍需进一步提升工艺技术水平。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种青稞蛋白质的分离纯化方法，其处理量大，能耗低，利用微凝胶溶液制成的中空纤维膜过滤蛋白提取液，再反向洗涤，得到纯化的青稞蛋白质，使蛋白质保持原有功能活性的同时，最终获得的蛋白质纯度高且提取率高。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种青稞蛋白质的分离纯化方法，主要包括以下步骤：
步骤一、将洗净并浸泡后的青稞米绞碎，置于高压罐中加压至1.0～2.0MPa，加压完成后维持5～10min，瞬间泄压，过滤高压罐中混合物，取滤液得蛋白提取液；
步骤二、取葡聚糖和KIO4溶于水中混合，混合后的葡聚糖和KIO4溶液的浓度为0.3～0.5mol/L，25℃条件下避光搅拌10～12h，向体系中加入无水BaCl2，过滤，向滤液中加入Na2SO4，过滤得醛基化的葡聚糖溶液，其中所述葡聚糖，KIO4，BaCl2和Na2SO4的摩尔比为10～12:1:1:1；
步骤三、取聚烯丙胺溶于水中，溶液的浓度为0.01～0.25mol/L，调节pH值至9.5～10，搅拌的同时缓慢滴加步骤三中制得的醛基化的葡聚糖溶液，搅拌2h，向体系中加入NaBH4，反应8～10h，获得微凝胶溶液，其中所述聚烯丙胺，NaBH4与步骤二中所述葡聚糖的摩尔比为1.5:1.5:1；
步骤四、以异丙醇作为芯液，将步骤三中制得的微凝胶溶液与芯液通过喷丝头共同挤出，浸入异丙醇凝固浴中进行非溶剂相转化2～4h，取出干燥，获得中空纤维膜，所述中空纤维膜的内径为0.5～0.8mm，外径为1～1.5mm；
步骤五、将一束中空纤维膜装入由ABS材料制得的圆柱型壳体内，纤维束一端被密封，另一端用环氧树脂粘结在一起，制成中空纤维膜组件，利用中空纤维膜组件过滤，取所述步骤一中获得的蛋白提取液与水混合，经加压透过中空纤维膜，透过液从膜内芯流出，过滤完毕后用蒸馏水反向洗涤中空纤维膜组件，洗涤液离心，取沉淀真空冷冻干燥，得到纯化的蛋白质。
优选的是，所述步骤四中制得的中空纤维膜外表面孔径为0.1～0.5μm。
优选的是，所述步骤一中，高压罐中加压至1.5MPa，高压下维持10min。
优选的是，所述步骤二中混合后的葡聚糖和KIO4溶液的浓度为0.5mol/L，搅拌时间为12h，体系中所述葡聚糖，KIO4，BaCl2和Na2SO4的摩尔比为12:1:1:1。
优选的是，所述步骤三中聚烯丙胺溶液的浓度为0.2mol/L，pH值为9.8，体系中加入NaBH4后反应时间为10h。
优选的是，所述步骤四中非溶剂相转化时间为2h，所述中空纤维膜的内径为0.8mm，外径为1.5mm。
优选的是，所述步骤四中，微凝胶溶液与芯液通过喷丝头共同挤出的挤出速度为0.05m/s。
优选的是，所述步骤五中所述纤维束的长度为30cm。
优选的是，所述步骤五中，利用中空纤维膜组件过滤时加压至0.5MPa。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明利用瞬时爆破技术，将洗净的青稞置于高压中，并瞬时泄压，提高了细胞破碎率，处理时间短；
第二、本发明将葡聚糖羟基氧化为醛基，然后利用聚烯丙胺的胺基与醛基反应使二者交联，最后加入硼氢化钠还原，获得稳定的微凝胶，利用制得的微凝胶加工成中空纤维膜，再制成膜组件；利用微凝胶制得的膜，具有均匀的三维网络状骨架，膜结构均一，膜外表面孔径控制在0.1～0.5μm，能很好的截留青稞蛋白质，最终获得的蛋白质纯度高且提取率高。
第三、本发明与传统的青稞蛋白质提取方法相比，处理量大、能耗低，利用中空纤维膜对蛋白质进行纯化，分离过程不添加酶和强碱，使蛋白质保持原有功能活性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实例1>
步骤一、将洗净并浸泡后的青稞米绞碎，置于高压罐中加压至1.5MPa，加压完成后维持10min，瞬间泄压，过滤高压罐中混合物，取滤液得蛋白提取液；
步骤二、取葡聚糖和KIO4溶于水中混合，混合后的葡聚糖和KIO4溶液的浓度为0.5mol/L，25℃条件下避光搅拌12h，向体系中加入无水BaCl2，过滤，向滤液中加入Na2SO4，过滤得醛基化的葡聚糖溶液，其中所述葡聚糖，KIO4，BaCl2和Na2SO4的摩尔比为12:1:1:1；
步骤三、取聚烯丙胺溶于水中，溶液的浓度为0.2mol/L，调节pH值至9.8，搅拌的同时缓慢滴加步骤三中制得的醛基化的葡聚糖溶液，搅拌2h，向体系中加入NaBH4，反应10h，获得微凝胶溶液，其中所述聚烯丙胺，NaBH4与步骤二中所述葡聚糖的摩尔比为1.5:1.5:1；
步骤四、以异丙醇作为芯液，将步骤三中制得的微凝胶溶液与芯液通过喷丝头共同挤出，挤出速度为0.05m/s，浸入异丙醇凝固浴中进行非溶剂相转化2h，取出干燥，获得中空纤维膜，所述中空纤维膜的内径为0.8mm，外径为1.5mm，外表面孔径为0.2μm；
步骤五、将一束30cm长的中空纤维膜装入由ABS材料制得的圆柱型壳体内，纤维束一端被密封，另一端用环氧树脂粘结在一起，制成中空纤维膜组件，利用中空纤维膜组件过滤，取所述步骤一中获得的蛋白提取液与水混合，在压力0.5MPa下使蛋白提取液混合液透过中空纤维膜，透过液从膜内芯流出，过滤完毕后用蒸馏水反向洗涤中空纤维膜组件，洗涤液离心，取沉淀真空冷冻干燥，得到纯化的蛋白质。
<实例2>
步骤一、将洗净并浸泡后的青稞米绞碎，置于高压罐中加压至2MPa，加压完成后维持5min，瞬间泄压，过滤高压罐中混合物，取滤液得蛋白提取液；
步骤二、取葡聚糖和KIO4溶于水中混合，混合后的葡聚糖和KIO4溶液的浓度为0.3mol/L，25℃条件下避光搅拌10h，向体系中加入无水BaCl2，过滤，向滤液中加入Na2SO4，过滤得醛基化的葡聚糖溶液，其中所述葡聚糖，KIO4，BaCl2和Na2SO4的摩尔比为10:1:1:1；
步骤三、取聚烯丙胺溶于水中，溶液的浓度为0.1mol/L，调节pH值至9.8，搅拌的同时缓慢滴加步骤三中制得的醛基化的葡聚糖溶液，搅拌2h，向体系中加入NaBH4，反应8h，获得微凝胶溶液，其中所述聚烯丙胺，NaBH4与步骤二中所述葡聚糖的摩尔比为1.5:1.5:1；
步骤四、以异丙醇作为芯液，将步骤三中制得的微凝胶溶液与芯液通过喷丝头共同挤出，挤出速度为0.05m/s，浸入异丙醇凝固浴中进行非溶剂相转化4h，取出干燥，获得中空纤维膜，所述中空纤维膜的内径为0.5mm，外径为1.0mm，外表面孔径为0.4μm；
步骤五、将一束30cm长的中空纤维膜装入由ABS材料制得的圆柱型壳体内，纤维束一端被密封，另一端用环氧树脂粘结在一起，制成中空纤维膜组件，利用中空纤维膜组件过滤，取所述步骤一中获得的蛋白提取液与水混合，在压力0.5MPa下使蛋白提取液混合液透过中空纤维膜，透过液从膜内芯流出，过滤完毕后用蒸馏水反向洗涤中空纤维膜组件，洗涤液离心，取沉淀真空冷冻干燥，得到纯化的蛋白质。
<实例3>
步骤一、将洗净并浸泡后的青稞米绞碎，置于高压罐中加压至1.0MPa，加压完成后维持10min，瞬间泄压，过滤高压罐中混合物，取滤液得蛋白提取液；
步骤二、取葡聚糖和KIO4溶于水中混合，混合后的葡聚糖和KIO4溶液的浓度为0.4mol/L，25℃条件下避光搅拌11h，向体系中加入无水BaCl2，过滤，向滤液中加入Na2SO4，过滤得醛基化的葡聚糖溶液，其中所述葡聚糖，KIO4，BaCl2和Na2SO4的摩尔比为11:1:1:1；
步骤三、取聚烯丙胺溶于水中，溶液的浓度为0.25mol/L，调节pH值至9.8，搅拌的同时缓慢滴加步骤三中制得的醛基化的葡聚糖溶液，搅拌2h，向体系中加入NaBH4，反应9h，获得微凝胶溶液，其中所述聚烯丙胺，NaBH4与步骤二中所述葡聚糖的摩尔比为1.5:1.5:1；
步骤四、以异丙醇作为芯液，将步骤三中制得的微凝胶溶液与芯液通过喷丝头共同挤出，挤出速度为0.05m/s，浸入异丙醇凝固浴中进行非溶剂相转化3h，取出干燥，获得中空纤维膜，所述中空纤维膜的内径为0.6mm，外径为1.3mm，外表面孔径为0.1μm；
步骤五、将一束30cm长的中空纤维膜装入由ABS材料制得的圆柱型壳体内，纤维束一端被密封，另一端用环氧树脂粘结在一起，制成中空纤维膜组件，利用中空纤维膜组件过滤，取所述步骤一中获得的蛋白提取液与水混合，在压力0.5MPa下使蛋白提取液混合液透过中空纤维膜，透过液从膜内芯流出，过滤完毕后用蒸馏水反向洗涤中空纤维膜组件，洗涤液离心，取沉淀真空冷冻干燥，得到纯化的蛋白质。
<对比例1>
步骤一、将洗净并浸泡后的青稞米绞碎，置于高压罐中加压至1.5MPa，加压完成后维持10min，瞬间泄压，过滤高压罐中混合物，取滤液得蛋白提取液；
步骤二、取葡聚糖和KIO4溶于水中混合，混合后的葡聚糖和KIO4溶液的浓度为0.5mol/L，25℃条件下避光搅拌12h，向体系中加入无水BaCl2，过滤，向滤液中加入Na2SO4，过滤得醛基化的葡聚糖溶液，其中所述葡聚糖，KIO4，BaCl2和Na2SO4的摩尔比为12:1:1:1；
步骤三、取聚烯丙胺溶于水中，溶液的浓度为0.2mol/L，调节pH值至9.8，搅拌的同时缓慢滴加步骤三中制得的醛基化的葡聚糖溶液，搅拌2h，向体系中加入NaBH4，反应14h，获得微凝胶溶液，其中所述聚烯丙胺，NaBH4与步骤二中所述葡聚糖的摩尔比为1.5:1.5:1；
步骤四、以异丙醇作为芯液，将步骤三中制得的微凝胶溶液与芯液通过喷丝头共同挤出，挤出速度为0.1m/s，浸入异丙醇凝固浴中进行非溶剂相转化5h，取出干燥，获得中空纤维膜，所述中空纤维膜的内径为0.8mm，外径为1mm，外表面孔径为1μm；
步骤五、将一束30cm长的中空纤维膜装入由ABS材料制得的圆柱型壳体内，纤维束一端被密封，另一端用环氧树脂粘结在一起，制成中空纤维膜组件，利用中空纤维膜组件过滤，取所述步骤一中获得的蛋白提取液与水混合，在压力0.5MPa下使蛋白提取液混合液透过中空纤维膜，透过液从膜内芯流出，过滤完毕后用蒸馏水反向洗涤中空纤维膜组件，洗涤液离心，取沉淀真空冷冻干燥，得到纯化的蛋白质。
<对比例2>
步骤一、将洗净并浸泡后的青稞米绞碎，置于高压罐中加压至1.5MPa，加压完成后维持10min，瞬间泄压，过滤高压罐中混合物，取滤液得蛋白提取液；
步骤二、取葡聚糖和KIO4溶于水中混合，混合后的葡聚糖和KIO4溶液的浓度为0.5mol/L，25℃条件下避光搅拌12h，向体系中加入无水BaCl2，过滤，向滤液中加入Na2SO4，过滤得醛基化的葡聚糖溶液，其中所述葡聚糖，KIO4，BaCl2和Na2SO4的摩尔比为12:1:1:1；
步骤三、取聚烯丙胺溶于水中，溶液的浓度为0.2mol/L，调节pH值至9.8，搅拌的同时缓慢滴加步骤三中制得的醛基化的葡聚糖溶液，搅拌2h，向体系中加入NaBH4，反应10h，获得微凝胶溶液，其中所述聚烯丙胺，NaBH4与步骤二中所述葡聚糖的摩尔比为1.5:1.5:1；
步骤四、将步骤三制得的微凝胶溶液置于无纺布上，刮涂成平板膜，随后将刮涂有平板膜的无纺布置于异丙醇凝固浴中进行非溶剂相转化4h，取出后干燥，获得复合平板膜，所述复合平板膜的厚度为0.5mm，平均孔径为0.3微米；
步骤五、在0.5MPa下，利用步骤四制得的复合平板膜对蛋白提取液进行过滤，过滤完毕后冲洗复合平板膜的表面，收集冲洗液，离心，取沉淀真空干燥，获得纯化蛋白质。
<对比例3>
采用传统酶解法，对青稞蛋白质进行提取并纯化，具体步骤如下所示：
取青稞米加蒸馏水浸泡，磨碎并均质，按15EGU/g的添加量添加纤维素酶，酶解时间4h，酶解温度45℃，酶解pH 7.0的条件下进行蛋白质提取并纯化。
<提取率和纯度试验>
取等量的绞碎后的青稞米作为样品，分别通过各实例与对比例所述方法对样品进行提取和纯化，制得相应各个产品，随后按照下列公式，计算其蛋白质的提取率和纯度，其中蛋白质的质量采用微量凯氏定氮法测定。
蛋白质提取率(％)＝(产品中蛋白质的质量/样品中蛋白质的质量)×100％；
蛋白质纯度(％)＝(产品中蛋白质的质量/产品的质量)×100％。
具体提取率和纯度试验结果如表1所示，试验结果表明，利用本发明所述方法制备的青稞蛋白质产品的平均提取率在78.38％，产品平均纯度达到92.55％，相较于对比例1～对比例3，蛋白质的提取率和纯度均有显著的提高。
表1
Figure BDA0002231357080000071
<膜孔隙率试验>
采用压汞法对对上述实例1，实例2，实例3以及对比例1，对比例2制得的各中空纤维膜和复合平板膜的孔隙率进行测定，测定结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002231357080000072
<膜通量试验>
在压力为0.5MPa下，对上述实例1，实例2，实例3以及对比例1，对比例2制得的各中空纤维膜和复合平板膜的纯水通量进行测定，试验结果如表3所示：
表3
Figure BDA0002231357080000081
实验结果表明，实例1，实例2和实例3，利用微凝胶溶解制成中空纤维膜，对蛋白质进行分离纯化的方法，利用微凝胶制得中空纤维膜，膜的孔隙率高，通量大，且膜外表面孔径控制在0.1～0.5μm，能很好的截留青稞中的蛋白质，最终获得的蛋白质纯度高且提取率高，另外利用中空纤维膜对蛋白质进行纯化，分离过程不添加强酸和强碱，使蛋白质保持原有功能活性，处理量大、能耗低，使加工过程节能环保。对比例1中由于微凝胶溶液放应时间过长，中空纤维膜挤出速度快，导致制得的中空纤维膜内外径较小，膜表面孔径增大，因此膜通量最大，但膜的孔隙率低，导致对蛋白质的截留率降低，最终提取率低。对比例2与实例1相比，将中空纤维膜替换为复合平板膜，对蛋白提取液进行分离，最终提取率和纯度与实例1，实例2和实例3相比均较低，这主要是因为由于分离过程中平板膜与蛋白提取液接触面积有限，相较于中空纤维膜分离效率低，膜的通量低，处理过程中膜容易堵塞，从而对蛋白质的截留产生影响，使最终制得的蛋白质纯度变低。对比例3采用传统的酶解法提取，最终蛋白质的提取率受酶解温度和pH的影响较大，且提取率低于本发明所述分离纯化方法。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (7)

1.青稞蛋白质的分离纯化方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
步骤一、将洗净并浸泡后的青稞米绞碎，置于高压罐中加压至1.0～2.0 MPa，加压完成后维持5～10 min，瞬间泄压，过滤高压罐中混合物，取滤液得蛋白提取液；
步骤二、取葡聚糖和KIO4溶于水中混合，混合后的葡聚糖和KIO4溶液的浓度为0.3~0.5mol/L，25℃条件下避光搅拌10~12 h，向体系中加入无水BaCl2，过滤，向滤液中加入Na2SO4，过滤得醛基化的葡聚糖溶液，其中所述葡聚糖，KIO4，BaCl2和Na2SO4的摩尔比为10~12:1:1:1；
步骤三、取聚烯丙胺溶于水中，溶液的浓度为0.01~0.25 mol/L，调节pH值至9.5~10，搅拌的同时缓慢滴加步骤二中制得的醛基化的葡聚糖溶液，搅拌2 h，向体系中加入NaBH4，反应8~10 h，获得微凝胶溶液，其中所述聚烯丙胺，NaBH4与步骤二中所述葡聚糖的摩尔比为1.5:1.5:1；
步骤四、以异丙醇作为芯液，将步骤三中制得的微凝胶溶液与芯液通过喷丝头共同挤出，浸入异丙醇凝固浴中进行非溶剂相转化2~4 h，取出干燥，获得中空纤维膜，所述中空纤维膜的内径为0.5~0.8 mm，外径为1~1.5 mm，所述中空纤维膜的外表面孔径为0.1~0.5 μm，微凝胶溶液与芯液通过喷丝头共同挤出的挤出速度为0.05 m/s；
步骤五、将一束中空纤维膜装入由ABS材料制得的圆柱型壳体内，纤维束一端被密封，另一端用环氧树脂粘结在一起，制成中空纤维膜组件，利用中空纤维膜组件过滤，取所述步骤一中获得的蛋白提取液与水混合，经加压透过中空纤维膜，透过液从膜内芯流出，过滤完毕后用蒸馏水反向洗涤中空纤维膜组件，洗涤液离心，取沉淀真空冷冻干燥，得到纯化的蛋白质。
2.如权利要求1所述的青稞蛋白质的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤一中，高压罐中加压至1.5 MPa，高压下维持10 min。
3.如权利要求1所述的青稞蛋白质的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤二中混合后的葡聚糖和KIO4溶液的浓度为0.5 mol/L，搅拌时间为12 h，体系中所述葡聚糖，KIO4，BaCl2和Na2SO4的摩尔比为12:1:1:1。
4.如权利要求1所述的青稞蛋白质的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤三中聚烯丙胺溶液的浓度为0.2 mol/L， pH值为9.8，体系中加入NaBH4后反应时间为10 h。
5.如权利要求1所述的青稞蛋白质的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤四中非溶剂相转化时间为2 h，所述中空纤维膜的内径为0.8 mm，外径为1.5 mm。
6.如权利要求1所述的青稞蛋白质的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤五中所述纤维束的长度为30 cm。
7.如权利要求1所述的青稞蛋白质的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤五中，利用中空纤维膜组件过滤时加压至0.5 MPa。
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